Summary
Floresan-Aktif Hücre Sıralama-Radyoligand Tedavi Edilen Doku (FACS-RTT), Alzheimer Hastalığında 18 kDa translokatör proteininin veya Serotonin 5HT2A-reseptör ekspresyonunun hücresel ölçekte rolünü incelemek için güçlü bir araçtır. Bu protokol, TgF344-AD sıçan modelinde FACS-RTT'nin ex-vivo uygulamasını açıklar.
Abstract
Glial hücreler muhtemelen Alzheimer hastalığı (AD) gibi nörodejeneratif bozuklukların patofizyolojisinde önemli bir etkiye sahiptir. Değişiklikleri belki de pro-inflamatuar bir durumla ilişkilidir. TgF344-AD sıçan suşu, insan APP ve insan PS1ΔE9 genlerini ifade etmek, amiloid proteinleri Aβ-40 ve Aβ-42'yi kodlamak ve yaşlanma ile birlikte amiloid patolojisini ve bilişsel eksiklikleri göstermek için tasarlanmıştır. Bu çalışmada TgF344-AD sıçan modeli, 18 kDa translokatör proteininin (TSPO, glial hücre aktivasyonunun bir belirteci) bağlanmasının hücresel kökenini ve AD'de muhtemelen bozulmuş olan 5HT2A-reseptörü (5HT2AR) serotonin reseptör seviyelerini değerlendirmek için kullanılmıştır. Burada sunulan teknik, in vivo PET veya SPECT veya ex vivo / in vitro otoradyografi tekniklerini tamamlayan kantitatif hücre tipine özgü bir teknik olan Radyoligand ile Tedavi Edilen Dokuya Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS-RTT) 'dir. Sitometri hücre sıralamadan sonra bir γ sayacı kullanarak, görüntüleme için daha önce kullanılan aynı radyoaktif etiketli izleyiciyi ölçer. Bu, radyoaktif etiketli proteinin hücresel kökeninin yüksek hücresel özgüllük ve hassasiyetle belirlenmesini sağlar. Örneğin, FACS-RTT ile yapılan çalışmalar, (i) TSPO bağlanmasındaki artışın, lipopolisakkarit (LPS) kaynaklı nöroinflamasyonun bir sıçan modelinde mikroglia ile ilişkili olduğunu, (ii) 12 ve 18 aylarda TSPO bağlanmasındaki bir artışın önce astrositlerle ilişkili olduğunu ve daha sonra TgF344-AD sıçanlarında vahşi tip (WT) sıçanlara kıyasla mikroglia ve (iii) 5HT2A'nın striatal yoğunluğunun ilişkili olduğunu göstermiştir. R, aynı sıçan AD modelinde astrositlerde 18 ayda azalır. İlginç bir şekilde, bu teknik neredeyse tüm radyotracerlere genişletilebilir.
Introduction
Alzheimer Hastalığı (AD) gibi nörodejeneratif hastalıklar, artan semptomlarla ilişkili nöronal bir kayıp ile karakterizedir. Demansın en sık nedeni olan ve vakaların %60-%70'ini oluşturan AD, dünya çapında yaklaşık 50 milyon insanı etkilemektedir1. Nöropatolojik düzeyde, AH'nin iki ana özelliği, hücre dışı amiloid-β (Aβ) plaklarının ve hücre içi Tau nörofibriler yumakların birikmesidir. Glial hücre değişiklikleri ayrıca AD2 ve çeşitli nörotransmitter sistemlerin olası bozulması ile ilişkilendirilmiştir 3,4.
TgF344-AD sıçan hattı, insan APP ve PS1 ΔE9 transgenlerini eksprese ederekAD'yi modellemek için modifiye edilmiştir, bu da çözünür ve çözünmez Aβ-40 ve Aβ-42 ekspresyonuna ve amiloid plak oluşumuna yol açmıştır5. Aynı zamanda Tau proteininin hiperfosforile formlarının birikmesini ve tauopatiye yol açmasını sağlar. 9-24 aylıktan itibaren, sıçanlar giderek AD'nin patolojik özelliklerini ve bilişsel bir bozukluk 5,6,7,8,9'u geliştirir.
Pozitron Emisyon Tomografisi (PET), Tek Foton Emisyon bilgisayarlı Tomografi (SPECT) ve otoradyografi, γ ışınlarının emisyonuna ve nicelleştirilmesine dayanan tekniklerdir. Radyotracerler in vivo (PET ve SPECT) veya ex vivo/in vitro (otoradyografi) olarak ölçülür. Bu hassas teknikler, AD gibi çeşitli beyin hastalıklarının mekanizmalarının anlaşılmasına katkıda bulunmuştur. Gerçekten de, nöroinflamasyon açısından, bir in vivo nöroinflamasyon belirteci olan 18 kDa Translokatör Proteinini (TSPO), [11 C]-(R)-PK11195 veya [11 C] PBR28 gibi radyoaktif etiketli izleyicilerle değerlendiren birçok çalışma vardır (gözden geçirme için bkz.10). Ek olarak, nörotransmitter sistemlerinin değişiklikleri radyotracer11,12,13 kullanılarak incelenmiştir.
Bununla birlikte, bu teknikler radyoaktif sinyalin hücresel kökenini belirlemez. Bu, PET / SPECT'de bir radyoligandın bağlanmasındaki değişikliğin biyolojik temellerinin yorumlanmasını engelleyebilir. Örneğin, TSPO'nun nöroinflamasyon çalışmaları söz konusu olduğunda, TSPO'nun artmasının veya azalmasının astrositik veya mikroglial değişikliklerden kaynaklanıp kaynaklanmadığını anlamak çok önemlidir. Radyoligand ile Tedavi Edilen Dokuya Floresan Aktive Hücre Sıralama (FACS-RTT) tekniği, bu sorunların üstesinden gelmek için geliştirilmiştir ve her hücre tipinde radyoligand bağlanmasının ayrı ayrı değerlendirilmesine ve hücre başına hedef-protein yoğunluğunun miktarına izin verir. Bu yenilikçi teknik sonuç olarak tamamlayıcıdır ve PET ve SPECT görüntüleme ile son derece uyumludur.
Burada, bu teknik iki eksen boyunca uygulandı: TSPO'ya özgü radyoligandlar kullanılarak nöroinflamasyonun incelenmesi ve serotonerjik sistemin değerlendirilmesi. İlk eksende amaç, akut inflamatuar reaksiyona yanıt olarak TSPO sinyalinin hücresel kökenini anlamaktı. Bu nedenle, FACS-RTT, bir lipopolisakkarit (LPS) enjeksiyonu yoluyla nöroinflamasyonun indüklenmesinden sonra ve in vivo [125I] CLINDE SPECT görüntüleme çalışmasının ardından sıçanların beyin dokularında kullanılmıştır. Ayrıca, aynı görüntüleme ve FACS-RTT protokolü 12 ve 24 aylık TgF344-AD sıçanlarına ve eşleşen vahşi tip (WT) sıçanlara uygulandı. İkinci eksen, bu sıçan modelindeki serotoninerjik sistem değişikliklerinin kökenini, hücre tipine göre ex vivo 5-HT2A Ryoğunluk değerlendirmesi yoluyla belirlemeyi amaçlamıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneysel prosedürler, sırasıyla Cenevre Kantonu İnsan ve Hayvan Deneyleri Etik Komitesi, Kanton Araştırma Etiği Komisyonu (CCER) ve Cenevre Kantonu Sağlığının Genel Yönü (İsviçre) ile mutabık kalınarak yürütülmüştür. Veriler, Hayvan Araştırması: In-vivo Deneylerin Raporlanması (ARRIVE) yönergelerini izleyerek bildirilmiştir.
1. SPECT kamera hazırlığı ve kalibrasyonu
- Fotoğraf makinesini açın, işletim yazılımını yükleyin (bkz. Yönlendirme gerçekleştirmek için Ana Sayfa XYZ Sahne Alanı düğmesine tıklayın.
- Denemeyi 10 dakikalık bir tarama alımından oluşan şekilde ayarlayın. Adım modunu İyi ve Edinme modunu Listmode olarak ayarlayın (tüm emisyon spektrumunu kaydetmek için).
- Yatağı kurun ve ısıtma sisteminin, solunum sensörünün ve anestezinin işlevsel ve güvenli olduğundan emin olun (Şekil 1A-D). Daha sonra, hayvanın başının yerleştirileceği yere bir hayalet (yani, 2 mL'lik bir mikrofüj tüpüne bilinen 125I'lik bir konsantrasyonun 2 mL'si) yerleştirin (alanın ortalanmış, Şekil 1E).
- Ekranın alt kısmındaki üç görüntünün yardımıyla üç boyut için imleçleri kaydırarak tarama alanını ayarlayın. Fantomun ve hayvanın tarama hacminin aynı olduğundan emin olun.
- Adım 1.2-1.4'te belirlenen parametrelerle sonraki kalibrasyon için fantom taramasını başlatın.
2. SPECT görüntüleme için çalışma alanı kurulumu
- Çalışma alanını dezenfektan virüsit ile temizleyin ve tüm yüzeylere yumuşak kağıtlar yerleştirin.
- İlgili tanklarında yeterli izofluran ve oksijen bulunduğundan emin olun.
- Sıçan kuyruğu damarının daha net bir görünümünü elde etmek için kelebek kateterinin yüzgeçlerini keserek 24 G'lik bir kateter hazırlayın.
- İğneyi çıkardıktan sonra kateteri heparin çözeltisi (25000 U/mL) ile tamamen doldurarak kaplayın. Daha sonra, kateter yerleştirildikten sonra kan pıhtılaşması oluşumunu önlemek için iğneyi tekrar içine yerleştirin.
3. [125I]CLINDE radyotracer sentezi
DİKKAT: Radyoaktivite, canlı hücrelerin atomlarını etkilemek ve genetik materyallerine (DNA) zarar vermek için yeterli iyonlaştırıcı enerjiye sahip olabilir.
- Radyoaktivite içeren deneyler için yetkilendirilmiş uygun bir ortamda çalıştığından emin olun.
NOT: Parmak ve vücut dozimetreleri de dahil olmak üzere radyoaktivite kullanımı için uygun kişisel koruyucu ekipmanı (KKD) giyin. Herhangi bir radyoaktivite kaynağından güvenli bir mesafede kalmaya çalışın. - Bir torpido gözüne yerleştirilmiş bir termosikler içinde 20 dakika boyunca sodyum iyodür (Na125I) ile 100 μL asetik asit içinde 100 μL tributilin öncüsünü ve 70 ° C'de 5 μL% 37 perasetik asit inkübe edin.
- 500 μL'lik bir hacme ulaşmak için reaksiyonu suda% 50 asetonitril (ACN) kullanarak seyreltin. seyreltilmiş reaksiyonun 500 μL'sini ters fazlı bir kolona enjekte edin (bkz.
- [125I]CLINDE'yi 7 mM H3PO4'te 10 dakika boyunca %5-%95 ACN aralığında çalışan doğrusal gradyan HPLC ile izole edin. 10 mL'lik bir son hacme ulaşmak için izolatıH2O'da seyreltin ve ardından seyreltilmiş reaksiyonu bir konsantrasyon sütununa enjekte edin (bkz.
- [125I] CLINDE'yi sütundan 300 μL mutlak etanol ile süzün ve daha sonra etanol'ü RT'de 40 dakika boyunca vakumlu bir santrifüjde inkübe ederek buharlaştırın.
- Bir stok çözeltisi oluşturmak için [125I] CLINDE içeren kalıntıyı 300 μL steril salin içinde seyreltin.
- Radyoaktivitesini ölçtükten sonra, 500 μL'de 0.037 MBq'luk bir çözelti elde etmek için stok çözeltisini steril salin içinde seyreltin.
- İzleyiciyi HPLC (Yüksek performanslı sıvı kromatografisi) ile saflaştırın. 450 nm'de standart bir kalibrasyon kullanarak elüsyon süresini belirleyin ve tek radyoaktif tepe noktasını izole edin. Standart kalibrasyon eğrisini yedi standart soğuk (radyoaktif olmayan) CLINDE konsantrasyonu kullanarak gerçekleştirin (% 50 ACN'lik bir çözeltinin 400 μL'sinde 0,1 μg, 0,5 μg, 0,75 μg, 1 μg, 1 μg, 2 μg ve 5 μg). Radyo TLC'de (İnce tabaka kromatografisi) tek bir tepe noktasını ölçerek radyokimyasal saflığı oluşturun. Radyokimyasalın saflığının% 60'ın üzerinde olduğundan emin olun.
- 450 nm'de ultraviyole absorbansını ölçen radyoligandın spesifik aktivitesini ve soğuk referans bileşikleriyle oluşturulan kalibrasyon eğrilerini kontrol edin. Belirli aktivitenin 1000 GBq/μmol'den büyük olduğundan emin olun.
4. [125I]R91150 radyotracer sentezi
NOT: CLINDE sentezi bölümünde belirtilenlerle aynı güvenlik kurallarına uyduğunuzdan emin olun.
- 300 μg R91150 öncüsünü, 3 μL mutlak etanol, 3 μL buzul asetik asit, 15 μL taşıyıcısız Na125I (bkz. Malzeme Tablosu) (10 mCi) çözeltisi içinde 0,05 M NaOH ve 3 μL% 30 H2 O 2'dekarıştırın. Bir torpido gözünde 30 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
- Tüm reaksiyonu ters fazlı bir sütuna enjekte edin (bkz.
- [125I]R91150'yi izokratik HPLC çalışması (ACN/su 50/50, 10 mM asetik asit tamponu) ile 3 mL/dak akış hızıyla izole edin.
- [125I]R91150'yi H2O'da 10 mL'lik son bir hacim için seyreltin.
- Seyreltilmiş reaksiyonun 10 mL'sini bir konsantrasyon kolonuna enjekte edin (bkz.
- Elute [125I]R91150 sütundan 300 μL mutlak etanol ile.
- Etanol, RT'de vakum santrifüjünde 40 dakika boyunca inkübe ederek buharlaştırın.
- [125 I]R91150içeren kalıntıyı 300 μL salin içinde seyreltin.
- İzleyiciyi HPLC ile saflaştırın. 450 nm'de standart bir kalibrasyon kullanarak elüsyon süresini belirleyin ve tek radyoaktif tepe noktasını izole edin. Radyo TLC'de tek bir tepe noktasını ölçerek radyokimyasal saflığı oluşturun. Radyokimyasalın saflığının% 98'in üzerinde olduğundan emin olun.
5. Hayvan hazırlığı
- TgF344-AD sıçanını (erkek veya dişi, 2-24 aylıkken) % 3 izofluran içeren bir indüksiyon odasında tartın ve anestezi uygulayın. Derin anestezi uygulandıktan sonra, izofluran akışını odada% 2'ye (0.4 L / dak,% 100 O2) düşürün.
- Hayvanı, anestezi burun konisi ile donatılmış önceden ısıtılmış bir yatağa yerleştirin. İzofluranı% 2'de (0.4 L / dak,% 100O2) koruyun.
- Hayvanın gözlerine göz jeli kayganlaştırıcısı uygulayın ve solunum monitörizasyonu yoluyla anestezi derinliğini onaylayın; gerekirse anesteziyi ayarlayın.
- Kuyruk damarına 24 G kateter yerleştirme işlemini gerçekleştirin.
6. SPECT satın alımı
- Hayvanı, 38°C'ye ayarlanmış sıcaklık kontrollü bir ısıtma yastığı ile donatılmış kamera yatağına aktarın (Şekil 1E).
- Hayvanın başını ısırık çubuğuna sabitleyin ve baş desteklerini sabitleyin.
- Denemeyi, 1 dakikalık 60 karelik 60 karelik 60 dakikalık bir taramada ayarlayın. 1. adımda ayarlanan diğer tüm parametreleri yeniden kullanın. Hayvan konumunu güncellemek için Resmi Güncelle düğmesine tıklayın.
- Üç boyut için ekranın alt kısmındaki üç görüntünün yardımıyla imleçleri kaydırarak tarama alanını ayarlayın.
- 500 μL radyoaktif radyotracer ([125I]CLINDE veya [125 I]R91150) enjekte edin ve ardından tüpü 300 μL steril% 0.9 NaCl ile yıkayın. Aynı anda taramayı başlatmak için Edinimi Başlat'a tıklayın.
- Tarama süresi boyunca, solunum hızı izleme ile hayvanı sürekli anestezi altında tuttuğunuzdan emin olun. Gerekirse izofluran akışını ayarlayın.
- Tarama bittikten sonra, anestezi uygulanan hayvanı dekapitasyon yoluyla hızlı bir şekilde ötenazi yapın.
7. Tarama yeniden yapılandırması
- Tarama yeniden yapılandırma yazılımını açın (bkz. Malzeme Tablosu) ve ardından tarama klasöründe oluşturulan [dosyaadı].parameters dosyasını arayarak veri kümesini açın.
- İlgilendiğiniz izotopu seçin. Listmode parametresinin bu adımda birden çok izotop seçimine izin verdiğini unutmayın.
- Aşağıdaki parametreleri seçin: 0,4 mm Voksel boyutu, 4 (POS-EM) alt kümesi, 6 yineleme (24ME-EM eşdeğeri), filtre sonrası yok ve Bozunma Düzeltmesine karşılık gelen izotop. NIfTI çıkış formatını seçin ve ardından SPECT rekonstrüksiyonunu başlat'ı seçin.
8. Sıçan beyni ekstraksiyonu
- Tarama prosedürü ile aynı anestezik olayda ve solunum hızını izleyerek hayvanın derin anestezi durumunu sağladıktan sonra, giyotin ile dekapitasyona devam edin ve kafayı hızlı bir şekilde diseksiyon tezgahına aktarın.
- Makasla, başın üstündeki cildi arkadan öne doğru gözlerin ortasına kadar dikkatlice kesin.
- Kafatasının tabanı ve servikal omurların etrafındaki fazla kasları kesin.
- Daha sonra, makasın bir bıçağını kafatasının arkasındaki deliğe, foramen magnumuna dikkatlice yerleştirin ve kafatasının arka kısmını cerrahi pense ile çıkarın.
- Daha sonra, cerrahi pense ile, kafatasının üst kısmını dikkatlice çıkarın. Yaşlı erkek sıçanların kafatası kalın olabilir, beyne zarar vermemek için küçük parçalar halinde çıkarılabilir.
- Meninksleri makasla dikkatlice kesin. Meninksler ekstraksiyon işlemi sırasında beyne zarar verebilir; önlem olarak kaldırın.
- Kafatasının üst kısmını çıkardıktan sonra, hayvanın başını çevirin ve küçük bir düz spatula ile, optik ve trigeminal sinirleri keserek beyni dikkatlice çekin.
- Buz üzerinde diseksiyon için beyni düz, temiz bir cam yüzeye dikkatlice aktarın.
- Beynin ilgi alanlarını incelemek için düz bir metal spatula ve bir tıraş bıçağı kullanın. Dokuları 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirin ve elde edilen dokuyu tartın. Beyin bölümünü doğrudan hücre izolasyonu için kullanın veya daha sonra kullanmak üzere sıvı azotta hızlı bir şekilde dondurun.
9. Hücre izolasyonu
- Temiz ve steril bir ortamda çalıştığınızdan emin olun. II. Sınıf biyogüvenlik kabini (BSC) altında çalışılması tavsiye edilir. BSC'ye eklenen eldivenlerin ve her ekipman parçasının steril olduğundan emin olun.
- Hücreleri hücre sıralamaya hazırlamak için, Jaclyn M. Schwarz14'ün protokolünü izleyin.
NOT: Bu deneyde, hücre hazırlığı için ticari olarak temin edilebilen bir Nöral ayrışma kiti (bakınız Malzeme Tablosu) kullanılmıştır.- Numuneleri 1 mL HBSS (Ca- ve Mg-içermeyen) içeren 2 mL'lik bir santrifüj tüpüne koyun ve ardından santrifüj (300 x g, 2 dakika, oda sıcaklığı = RT) ve peleti rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın.
- 1900 μL enzim karışımı-1 ekleyin ve tüpleri her 5 dakikada bir ters çevirerek çalkalarken 37 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
- 30 μL enzim karışımı-2 ekleyin, pipet 1 ile nazikçe çalkalayın ( bkz. Malzeme Tablosu) ileri geri 30 kez. Daha sonra, tüpleri her 5 dakikada bir ters çevirerek çalkalarken 37 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
- Dokuları ayırmak için 37 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatmadan önce pipet 2 ile hafifçe ileri geri karıştırın ve ardından pipet 3'ü karıştırın.
- Hücreleri 80 μm hücre süzgeci ile filtreleyin, 10 mL HBSS (Ca ve Mg içermeyen) ekleyin. Santrifüj (300 x g, 10 dakika, RT) ve peleti rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın.
- Miyelin tükenmesi için, peleti 400 μL miyelin giderme tamponu ile yeniden askıya alın (Malzeme Tablosuna bakınız) ve daha sonra 4 ° C'de 15 dakika kuluçkaya yatmadan önce 100 μL miyelin giderme boncukları ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız).
- 5 mL miyelin giderme tamponu, santrifüj (300 x g, 10 dakika, RT) ekleyin ve peleti rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın.
- 500 μL miyelin giderme tamponu ekleyin ve tüpü manyetik alan sütununa yerleştirin. Kolonu dört kez 1 mL miyelin giderme tamponu ile yıkayın.
- Santrifüj (300 x g, 2 dakika, RT) ve peleti rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın. Vorteks, hücreleri ayırmak ve 5 μL Fc blok CD32 eklemek için kısaca (2 s). Tekrar vorteks yapın ve 4 ° C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
- İlgilenilen birincil antikorların karışımından 100 μL ekleyin; 4 ° C'de 20 dakika kuluçkaya yatırın.
- Santrifüj (350 x g, 5 dakika, 4 °C) ve peleti rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın. Tüpleri yumuşak kağıt üzerinde baş aşağı boyayın.
- Kısa bir girdaptan (2 sn) sonra, sekonder antikor karışımından 100 μL ekleyin ve 4 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
- 2 mL miyelin giderme tamponu, santrifüj (350 x g, 5 dakika, 4 °C) ekleyin ve peleti rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın. Tüpleri yumuşak kağıt üzerinde baş aşağı boyayın. Hücreleri 250 μL steril PBS'de yeniden askıya alın ve doğrudan hücre sıralamasına geçin.
10. Hücre sıralama
- Mikrofüj tüpünü, sıralanmış hücreleri toplamak için 500 μL steril PBS ile hazırlayın.
- Canlı hücrelerin çekirdeklerini renklendirmek ve ölü hücrelerden ayırt etmek için 1000 μL hücre çözeltisi başına 10 μL Hoechst ekleyin.
- Hücreleri mümkün olan en kısa sürede 4 °C'de hücre sıralama makinesine aktarın.
- İlk olarak, hücreleri öne ve yana doğru saçılmaya göre sıralayın ve ardından Hoechst pozitif hücrelerini sıralayın. Ardından, hücreleri ilgilenilen antikorlara göre sıralayın. Pozitif boyanmış hücreleri ayrı ayrı toplayın. Pozitif hücreleri otofloresan olanlardan ayırt ettiğinizden emin olun.
- Her ilgi alanı havuzu için sıralanmış hücrelerin sayısını sayın.
11. Gama sayımı
- γ sayma sistemini, SPECT kalibrasyonu için kullanılan aynı fantom çözeltisinden 10 μL ile kalibre edin, ancak 1 mL suda seyreltin.
NOT: Fantom çözeltisi, γ sayma sisteminin gelişmiş hassasiyeti nedeniyle seyreltilir. - Sıralanmış hücrelerin tüpünü γ sayım sistemine yerleştirin ve üreticinin protokolüne göre γ sayımına devam edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
WT sıçanları, tek taraflı LPS enjeksiyonundan sonra [125I] CLINDE radyotracer ile in vivo SPECT taraması yaşadı (Şekil 2). Bu tarama (radyotracer enjeksiyon sonrası 45-60 dakikalık görüntülerden elde edilen toplam verileri kullanarak), LPS enjeksiyonu bölgesinde (Şekil 2A) beynin kontralateral bölgesinden daha yüksek [125I] CLINDE bağlanmasını göstermiştir (Şekil 2B). FACS-RTT uygulanan ex vivo örnekler bu sonuçları doğruladı ve beynin ipsilateral tarafındaki [125 I] CLINDE sinyalinin hücresel kökeninin mikroglial olduğunu göstererek, sadece mikroglia'da daha fazla sayıda [125I] CLINDE bağlanma bölgesinin varlığını ortaya koydu (Şekil 3A)15.
Aynı [125I] CLINDE radyotracer kullanılarak, protokol daha sonra eski TgF344-AD Sıçanlarının (12 ve 24 aylık) hipokampüsünde gerçekleştirildi ve 24 aylık WT ile karşılaştırıldı. Sonuçlar, TgF344-AD sıçanlarında 12 ayda TSPO bağlanmasındaki artışın astrositlerle sınırlı olduğunu göstermiştir. 24 aylık sıçanlarda, TSPO bağlanmasındaki artış hem astrositik hem de mikroglial değişikliklerden kaynaklanıyordu (Şekil 3B). Sonuçlar, astrositlerdeki TSPO aşırı ekspresyonunun muhtemelen mikroglial olandan önce gözlendiğini gösterdi. Bağımsız olarak, radyotracer [125I] R91150 kullanılarak, bu teknik, eski TgF344-AD sıçanlarında, striatal astrositlerin WT ile karşılaştırıldığında azalmış bir 5HT2A Ryoğunluğu gösterdiğini göstermek için hücresel ölçekte kullanılmıştır (Şekil 3C)16.
Son olarak, FACS-RTT, insan AD post-mortem örneklerinde uygulandı. Dissosiyasyondan sonra, hücreler boyama ve FACS prosedüründen önce [125I] CLINDE ile inkübe edildi. Bu, TSPO'nun hem astrositlerde hem de AD deneklerin mikroglialarında yaşla eşleşen kontrollerle karşılaştırıldığında kortikal bir aşırı ekspresyonunun keşfedilmesine izin verdi (Şekil 3D).
Resim 1: SPECT Kamera Kurulumu . (A) SPECT kamera genel sunumu. (B) Isıtıcı ve solunum hızı izleme ile yatak sunumu. (C) Anestezi tüpü tıkaçları. (D) Isıtma yatağı ve solunum probu soketi. (E) Yazılımdan hayalet konumlandırma izleme görünümü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: [125I] CLINDE radyotracer ile SPECT kullanarak TSPO beyin görüntüleme. Hipokampusun temsili görüntüleri ([125I]CLINDE'nin enjeksiyonundan 45-60 dakika sonra) (A) LPS veya (B) beynin ipsilateral (beyaz) ve kontralateral (kırmızı) tarafına salin enjeksiyonundan sonra. İlgi hacminde ölçülen in vivo zaman-aktivite eğrileri sağ panelde temsil edilir. SPECT: tek foton emisyonlu bilgisayarlı tomografi; TSPO: translokatör protein; LPS: lipopolisakkarit. n = koşul başına 7 hayvan. Bu rakam Tournier ve ark.15'ten değiştirilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: TSPO ve 5HT2AR. (A) Tek taraflı bir beyin LPS enjeksiyonundan sonra TSPO aşırı ekspresyonunun hücresel kökeni. Radyoaktivite, enjeksiyonun kontralateral (gri, n = 7) ve ipsilateral (yeşil, n = 7) tarafındaki her hücre popülasyonunda (% enjekte edilen doz / g doku) ölçüldü. Kullanılan istatistiksel test: eşleştirilmiş t-testi. (B) Eski TgF344-AD sıçanlarında TSPO. [125I] CLINDE konsantrasyonları (% enjekte edilen doz / g doku) 24 aylık vahşi tip hayvanlarda (gri, n = 9) ve 12- (yeşil, n = 8) ve 24 aylık (mor, n = 7) TgF344- AD sıçanlarında belirlendi. Kullanılan istatistiksel test: iki yönlü ANOVA. (C) 5HT2AR, eski TgF344-AD sıçanlarında striatumun astrositlerinde azalır. [125I] R91150 konsantrasyonu, WT (gri, n = 7) ve eski TgF344-AD (yeşil, n = 11) sıçanlarında astrositlerde ve mikroglialarda hücresel düzeyde (% enjekte edilen doz / hücre) belirlendi. Kullanılan istatistiksel test: tek yönlü ANOVA. (D) Alzheimer hastalığında (AD) frontal kortekste TSPO aşırı ekspresyonunun hücre kökeni. Her hücre popülasyonunda, radyoaktivite AD deneklerinde (yeşil, n = 9) ve kontrolde (gri, n = 9) ölçülür (% enjekte edilen doz / g doku). Kullanılan istatistiksel test: eşlenmemiş t-testi. Tüm veriler aşağıdaki ek açıklama ile ortalama ±% 95 CI olarak temsil edilir: * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 . Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bildiğimiz kadarıyla, bu teknik, hücresel düzeyde bir radyotracer'in in vivo bağlanma değişikliklerinin daha iyi anlaşılmasını sağlayan bir yaklaşımı tanımlayan ilk tekniktir. Protokol, örnek olarak [125 I]CLINDE (TSPO) veya [125 I]R91150(5HT 2AR) kullanarak hücresel düzeyde radyotracer bağlanmasını ölçmek için çok ölçeklibiryöntemi açıklar.
Bu teknik, LPS tarafından indüklenen yoğun bir enflamatuar reaksiyondan, AD'nin bir sıçan modelinde gözlenen daha ince glial hücre değişikliklerine kadar geniş bir glial hücre değişikliği spektrumunun hücresel kökenini kesin olarak tespit etmek için yeterince sağlam ve hassastır ve SPECT ile elde edilen sinyalin mikroglial kökeni olarak in vivo nükleer nörogörüntülemeye önemli tamamlayıcı bilgiler getirir. Çalışma ayrıca FACS-RTT'nin hücresel ölçekte nöroreseptör yoğunluğu değişikliklerini 5HT2A Rörneği ile ayırt edebildiğini göstermiştir (Şekil 3C). Son olarak, tekniğin insan post-mortem dokularında kullanılmasına ilişkin kanıtlar sağlandı ve astrositlerde ve AD deneklerin mikroglialarında TSPO konsantrasyonunun arttığını gösterdi.
Bu tekniğin temel avantajı, PET ve SPECT görüntüleme ile tamamlayıcılığıdır. Gerçekten de, nükleer görüntüleme bir beyin bölgesinden veya voksel seviyesinden bilgi alabilen güçlü bir tekniktir. Bununla birlikte, sınırı hücresel ölçekte bulunur; Her hücre tipinin sinyale katkısını ayırt etmek imkansızdır. FACS-RTT, her hücre tipinde bir radyotracer konsantrasyonu ortaya çıkararak daha ileri gitmeye izin verir. İlginçtir ki, teoride, sınırsız bir hedef kümesi bu teknikle değerlendirilebilir; sınırlama, ilgilenilen hedef için bir radyotracer'in mevcudiyetidir.
Protokolün kritik adımları, nitelikli personel ile güvenli bir ortamda gerçekleştirilmesi gereken radyoaktivite kullanımını içermektedir. Ayrıca, radyoaktif bozunmayı düşünmek çok önemlidir. FACS hazırlığı için, hücre tipine bağlı olarak farklılık gösteren ve verimli hücre sıralaması için optimizasyona ihtiyaç duyan antikor özgüllüğü, dalga boyu, ışık yoğunluğu sağlanmalıdır.
Burada sunulan çalışmalarda altı çizilen bu tekniğin sınırlamalarından biri, otofloresan hücreler nedeniyle yaşlı hayvanların ve insan ölüm sonrası beyin örneklerinin kullanılmasında yatmaktadır. Lipofuscin, yani lizozomal sindirimin bir kalıntısı, floresandır ve yaşlanan nöronlarda, mikroglialarda ve astrositlerde birikir. FACS, önceden optimizasyonla, otofloresan hücreleri pozitif etiketli olanlardan ayırt edebilir, bu da yaşlı hayvanlar incelenirse önemli bir adımdır. Tekniğin bir başka sınırlaması, farklı hayvanlar arasında farklı sıralanmış hücre tipleri arasındaki radyotracer konsantrasyonunu doğrudan karşılaştırmanın imkansızlığıdır. Bu, kandaki metabolize edilmemiş, proteine bağlı olmayan radyotracerlerin konsantrasyonunun hayvanlar arasında normalleşme için düşünülmesi durumunda gerçekleştirilebilir.
Son bir sınırlama, siklotron, PET / SPECT kamera, FACS ve γ sayacı gibi kullanılan tüm ekipmanın, özellikle de in vivo görüntüleme ve FACS-RTT için kısa yarı ömürlü izotoplar kullanılıyorsa, birbirine yakın fiziksel yakınlıkta olma ihtiyacıdır.
FACS-RTT bağımsız bir yaklaşım olarak da kullanılabilir, yani mutlaka bir in vivo nükleer görüntüleme çalışması15'i takip etmek zorunda değildir. Beyin hastalığının karmaşıklığı, hücresel düzeyde veya tek hücreli ölçekte mekanizmaların incelenmesini gerektirir. FACS-RTT, in vivo görüntüleme yaklaşımlarını geniş bir ex vivo veya in vitro hücresel ve moleküler biyoloji yaklaşımları yelpazesiyle birleştiren translasyonel bir araç olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenmiştir (hibe no. 320030-184713). Yazarlar BBT ve KC, Velux Vakfı tarafından desteklenmektedir (proje n. 1123). Yazar ST, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı'ndan destek aldı (Early Post-Doc Mobility Scholarship, no. P2GEP3_191446), Prof. Dr. Max Cloetta Vakfı (Klinik Tıp Plus bursu) ve Jean ve Madeleine Vachoux Vakfı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | ||
| BioVet | BioVet | Software for vitals check | |
| Bondclone C18 reverse-phase column | Phenomenex, Schlieren, Switzerland | ||
| Des-Sur | University Hospital of Geneva | Virucide | |
| Fc Block / anti-CD32 | BD Biosciences | BDB550270 | Reactivity for rat |
| FITC-conjugated anti-rat CD90 | Biolegend | 202504 | Reactivity for rat |
| Heparin | B. Braun | B01AB01 | |
| HPLC | Knauer | ||
| Insyte-W 24 GA 0.75 IN 0.7 x 19 mm | BD Biosciences | 321312 | 24 G catheter |
| Isoflurane | Baxter | ZDG9623 | |
| Lacryvisc | Alcon | 2160699 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| Micropore soft tape | 3M | F51DA01 | |
| MILabs-Uspect II | MILabs | Software for SPECT Camera | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | Cell sorter | |
| Myelin Removal Beads II | Miltenyi Biotec | 130-096-733 | Contains beads and myelin removal buffer. |
| NaCl 0.9% Sterile solution | B. Braun | 395202 | |
| Neural Dissociation Kit (P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 | Contains the enzyme mixes, pipets 1, 2 and 3. |
| Nylon Mesh Sheet | Amazon | CMN-0074-10YD | 40 inch width, 80 micron size mesh |
| Peracetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| R91150 précursor | CERMN | ||
| Sep-Pak C18 Column | Waters | Concentration column | |
| Sodium iodide Na125 | PerkinElmer | ||
| Tributylin precursor | CERMN | ||
| U-SPECT Rec2.38c | MILabs | Version Rec2.38c | Software for SPECT images reconstruction |
| USPECT II | MILabs | Spect Camera | |
| Wizard 3" | PerkinElmer | Gamma counter |
References
- Nichols, E., et al. regional, and national burden of Alzheimer's disease and other dementias, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. The Lancet Neurology. 18 (1), 88-106 (2019).
- Kinney, J. W., et al. Inflammation as a central mechanism in Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia. 4, New York, N. Y. 575-590 (2018).
- D'Amelio, M., Puglisi-Allegra, S., Mercuri, N. The role of dopaminergic midbrain in Alzheimer's disease: Translating basic science into clinical practice. Pharmacological Research. 130, 414-419 (2018).
- D'Amelio, M., Serra, L., Bozzali, M. Ventral tegmental area in prodromal Alzheimer's disease: Bridging the gap between mice and humans. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 63 (1), 181-183 (2018).
- Cohen, R. M., et al. A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric aβ, and frank neuronal loss. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (15), 6245-6256 (2013).
- Morrone, C. D., et al. Regional differences in Alzheimer's disease pathology confound behavioural rescue after amyloid-β attenuation. Brain: A Journal of Neurology. 143 (1), 359-373 (2020).
- Berkowitz, L. E., Harvey, R. E., Drake, E., Thompson, S. M., Clark, B. J. Progressive impairment of directional and spatially precise trajectories by TgF344-Alzheimer's disease rats in the Morris Water Task. Scientific Reports. 8 (1), 16153 (2018).
- Koulousakis, P., vanden Hove, D., Visser-Vandewalle, V., Sesia, T. Cognitive improvements after intermittent deep brain stimulation of the nucleus basalis of meynert in a transgenic rat model for Alzheimer's disease: A preliminary approach. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 73 (2), 461-466 (2020).
- Tournier, B. B., et al. Spatial reference learning deficits in absence of dysfunctional working memory in the TgF344-AD rat model of Alzheimer's disease. Genes, Brain, and Behavior. , 12712 (2020).
- Tournier, B. B., Tsartsalis, S., Ceyzériat, K., Garibotto, V., Millet, P. In vivo TSPO signal and neuroinflammation in Alzheimer's disease. Cells. 9 (9), (2020).
- Backes, H. [11C]raclopride and extrastriatal binding to D2/3 receptors. NeuroImage. 207, 116346 (2020).
- Millet, P., et al. Quantification of dopamine D(2/3) receptors in rat brain using factor analysis corrected [18F]Fallypride images. NeuroImage. 62 (3), 1455-1468 (2012).
- Tsartsalis, S., et al. A modified simplified reference tissue model for the quantification of dopamine D2/3 receptors with [18F]Fallypride images. Molecular Imaging. 13 (8), (2014).
- Schwarz, J. M. Using fluorescence-activated cell sorting to examine cell-type-specific gene expression in rat brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52537 (2015).
- Tournier, B. B., et al. Fluorescence-activated cell sorting to reveal the cell origin of radioligand binding. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (6), 1242-1255 (2020).
- Tournier, B. B., et al. Astrocytic TSPO upregulation appears before microglial TSPO in Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease: JAD. 77 (3), 1043-1056 (2020).
