Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Antimikrobiyal Bileşiklerin Staphylococcus aureus Internalization ve Hücre İçi Etkinliğini İncelemek için Geliştirilmiş Enzim Koruma Tahlilleri

Published: September 8, 2021 doi: 10.3791/62903
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1,3, 4,5, 4,5, 1, 1,2
1CIRI, Centre International de Recherche en Infectiologie, GIMAP team, University of Lyon, INSERM U1111, CNRS, UMR5308, ENS Lyon, UCBL1, University of St-Etienne, France, 2Department of Infectious Agents and Hygiene, University Hospital of St-Etienne, St-Etienne, France, 3Department of Infectious Diseases, University Hospital of St-Etienne, St-Etienne, France, 4CIRI, Centre International de Recherche en Infectiologie, Staphylococcal Pathogenesis team, University of Lyon, INSERM U1111, CNRS UMR5308, ENS Lyon, UCBL1, University of Lyon, Lyon, France, 5Department of Bacteriology, Institute for Infectious Agents, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Bu protokol, Staphylococcus aureus içselleştirmesinin kapsamının ve insan konak hücre içinde hayatta kalma yeteneğinin yanı sıra antimikrobiyal bileşiklerin hücre içi etkinliğinin nasıl incelenerek incelenebilmesini tanımlamayı amaçlamaktadır.

Abstract

Staphylococcus aureus , ökaryot hücrelerine içselleşmesini tetiklemek ve farklı hücre altı bölmelerde hayatta kalmak için virülans faktörlerini ifade eder. Bu makalede, S. aureus içselleştirmesinin kapsamını ve profesyonel olmayan fagositik hücrelerde (NPPC' ler) hücre içi sağkalımını ve antimikrobiyal bileşiklerin hücre içi etkinliğini incelemek için bir enzim koruma tahlili açıklanmaktadır. NPPC'ler% 100 birliğe ulaşana kadar çok kuyulu bir tabakta yetiştirilir. S. aureus kültürleri hücre kültürü ortamında bir gecede yetiştirilir. Bakteriyel süspansiyon, kontrollü bir enfeksiyon çokluğunda hücreleri aşılamak için kuyu başına hücre sayısına göre seyreltilir. Aşılanmış hücreler, bakterilerin NPPC'ler tarafından içselleştirilmesine izin vermek için 2 saat boyunca inkübe edilir, ardından hücre dışı bakterileri seçici olarak öldürmek için kültür ortamına lysostaphin eklenir. Lysostaphin, deneyin geri kalanında kültür ortamında mevcuttur.

Bu noktada, enfekte hücreler S. aureus'a karşı hücre içi aktivitelerini değerlendirmek için antimikrobiyal bileşiklerle inkübe edilebilir. Daha sonra, hücreler ilaçları çıkarmak için üç kez yıkanır ve hücre içi S. aureus yükü daha sonra agar plakaları üzerinde kültleme ile ölçülür. Alternatif olarak, hücre içi sağkalım ve hücre toksisitesinde rol oynayan stafilokok virülans faktörlerini incelemek için, yıkama adımları ihtiyacını ortadan kaldırmak için proteinaz K ile lysostaphin inaktive edilebilir. Bu ipucu hücre içi bakteri yükü nicelemesinin güvenilirliğini artırır, özellikle hücreler hücre içi S. aureus'un çoğalması nedeniyle ağır enfekte olduklarında kültür plakasından kopma eğilimindedir. Bu protokoller hemen hemen her türlü yandaş NPPC ile ve organoidler gibi 3D hücre kültürü modelleriyle kullanılabilir.

Introduction

Staphylococcus aureus hem hayatı tehdit eden bir patojen hem de cildin ve dünyadaki iki milyar kişiyi kolonizleştiren mukozanın kommensal bir bakterisi1. İnsanlarda, S. aureus'un burun taşıyıcıları kendi taşıma suşu ile enfeksiyon riskine sahiptir; ancak S. aureus mukozal taşıyıcının çok yönlü belirleyicileri hala belirsizdir1,2. Akut enfeksiyonlara ek olarak, hastalar genellikle tedavisi zor olan kronik S. aureus enfeksiyonları da geliştirebilirler3. Kolonizasyon ve enfeksiyon sırasında konak-patojen etkileşimlerinin daha iyi anlaşılması, yeni terapötik stratejiler geliştirmek ve hasta yönetimini iyileştirmek için çok önemlidir.

In vitro, S. aureus α5β1 integrin4 ifade konak hücreleri içine içselleştirme tetikleyebilir. Stafilokok fibronektin bağlayıcı proteinler arasındaki üçlü etkileşim S hücre duvarına tutturuldu. aureus, fibronektin ve konak hücre yüzeyinde ifade edilen β1 integrin, keratinositler, osteoblastlar, fibroblastlar ve epitel ve endotel hücreleri gibi NPPC'lerde S. aureus internalizasyonunun ana yolu olarak bilinir4. Son çalışmalar, S. aureus'un burun kolonizasyonu5,6 ve enfeksiyon sırasında insan hücrelerinin içinde bulunabileceğini göstermektedir7. Bununla birlikte, hücre içi rezervuarın S. aureus enfeksiyonunun patogenezindeki rolü belirsizliğini korumaktadır. Konak hücreler, hem bağışıklık sisteminden hem de çoğu antimikrobiyal bileşikten korunan S. aureus için bir sığınak görevi görebilmektedir6,9.

1980'lerin başlarında Proctor10 tarafından tanımlanan lysostaphin koruma tahlili, S. aureus izolelerinin içselleştirilmesinde rol oynayan bakteriyel ve konak faktörlerin incelenmesini sağlar. Lysostaphin, Staphylococcus simulans tarafından üretilen ve antibiyotiğe dirençli suşlar da dahil olmak üzere hemen hemen tüm S. aureus izolatlarına karşı güçlü aktivite gösteren bir bakteriyosindir11. Lysostaphin, sadece hücre dışı bakterilerin sayılabilmesi için sadece hücre dışı S. aureus'u yok etmek için kullanılmıştır12. Bu teknik yaygın olarak kullanılmış ve S. aureus'un çeşitli virülans faktörlerinin keşfine katkıda bulunmuştur. Gentamycin, yalnız ve lysostaphin ile birlikte hücre içi bakterileri incelemek için de yaygın olarak kullanılmaktadır.

Bununla birlikte, yeni bir çalışma, gentamycin'in ökaryotik hücrelere girdiğini ve zaman ve konsantrasyona bağlı bir şekilde içselleştirilmiş bakterilere ulaştığını göstermiştir13. Bu çalışma ayrıca lisostaphin'in ökaryotik hücrelere girmediğini göstererek, lisostafin bazlı enzim koruma testinin (EPA) hücre içi S. aureus yükünü kültüre göre ölçmek için en doğru test olduğunu doğruladı13. Hücre dışı bakterileri (örneğin, lisostafin veya gentamycin) yok etmek için hangi bileşiğin kullanıldığına bakılmaksızın, hücre içi S. aureus'u agar plakalarına kaplamadan önce hücreler yıkanarak çıkarılmalıdır. Ardışık yıkamalar, hücrelerin, özellikle de kötü yapışan hücrelerin (örneğin, ağır enfekte hücreler) kopmasıyla sonuçlanabilir ve bu da hücre içi S. aureus yükünün hafife almasına neden olur. Bu makalede, EPA'nın hücre içi S. aureus yükünü ölçmek ve bir in vitro model kullanarak antimikrobiyal bileşiklerin hücre içi etkinliğini ölçmek için nasıl kullanılabileceği ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Not olarak, yoğun yıkamalardan kaçınarak hücre içi yük nicelemesinin güvenilirliğini artırmak için basit bir yöntem önerilmiştir.

Protocol

1. İnsan epitel hücrelerinin kültürü

  1. Dulbecco'nun modifiye Eagle medium (DMEM) yüksek glikoz ile fenol kırmızısı, antibiyotiksiz % 10 fetal sığır serumu (FBS) ile desteklenmiş tam kültür ortamı hazırlayın.
  2. A549 epitel hücrelerini %5 CO2'de 36 ± 1 °C'de tam kültür ortamında büyütün. Sonraki adımlar için yeterli hücreye sahip olmak için uygun boyutta bir kültür gemisinin kullanılmasını sağlayın (bkz. adım 1.10).
    NOT: İki adet 24 kuyu plakasının tohumlayıp hücreleri alt kültüre etmesi için bir adet 75 cm2 (T-75) matara yeterlidir.
  3. Enfeksiyondan iki gün önce, tek bir 24 kuyu plakası hazırlayın.
  4. Harcanan kültür ortamını T-75 şişesinden çıkarın ve atın ve hücreleri bir kez 10 mL Dulbecco′s fosfat tamponlu salin (DPBS) ile yıkayın.
  5. 5 mL tripsin-EDTA ekleyin ve hücreleri% 5 CO2'de 36 ± 1 °C'de 5 dakika kuluçkaya yatırın.
  6. 5 mL tam kültür ortamı ekleyin ve hücreleri bir tüpe aktarın.
  7. Hücreleri 300 × g'da 5 dakika santrifüj edin.
  8. Süpernatant atın ve hücreleri 10 mL taze tam kültür ortamında yeniden biriktirin.
  9. Hücreleri otomatik hücre sayacı (veya sayım odası) ile sayın.
  10. 2,0 × 105 hücre/mL konsantrasyonda 30 mL hücre süspansiyonu hazırlamak için hücreleri tam kültür ortamında seyreltin.
  11. 24 kuyu plakasının her kuyusuna 1 mL hücre süspansiyonu ekleyin, bu da 2 cm²'lik bir kuyu alanı için yaklaşık 1,0 × 105 hücre/cm² hücre yoğunluğuna karşılık gelir.
  12. Hücreleri % 100 birliğe ulaşana kadar% 5 CO2'de 36 ± 1 °C'de 48 saat kuluçkaya yatırın.
    NOT: Test edilecek koşullara ek olarak, enfeksiyon gününde hücre sayımı için üç kuyu rezerve edilmelidir (bkz. adım 3.1.4). Test edilecek koşul sayısına göre aynı anda en fazla iki adet 24 kuyu plakası hazırlanabilir. Protokolde belirtilen hacimler buna göre artırılmalıdır.

2. S. aureus suşlarının kültürü

  1. Enfeksiyondan iki gün önce, fenol kırmızısı olmadan DMEM yüksek glikoz ile tam enfeksiyon ortamı hazırlayın, antibiyotiksiz% 10 FBS ile desteklenmiştir.
  2. Agar plakalarında test edilecek thaw S. aureus suşları.
  3. Agar plakalarını 36 ± 1 °C'de 18-24 saat kuluçkaya yaslayın.
  4. Aşılamadan bir gün önce, S. aureus suşunun bir kolonisini aşılayıp 10 mL tam enfeksiyon ortamında test edilir.
  5. Bakterileri 36 ± 1 °C'de 18-24 saat kuluçkaya yatırın ve 160 rpm'de sallanın. Bakterilerin yerleşmesini önlemek için 45° 'de tutulan 50 mL tüp kullanın.
    NOT: Yeni bir suşla başlamadan önce, daha fazla deney için kullanılacak aynı kültür koşullarında (ortam, bakteri yükleri ve lisostafin konsantrasyonu ve kuluçka süresi) lisostafin duyarlılığını doğrulamanız önerilir. 0,5 OD600nm'ye karşılık gelen bakteri yükünü belirlemek de önemlidir, çünkü bir suştan diğerine biraz değişebilir. Bakteriyel suşların kültür koşulları deneysel amala göre uyarlanabilir.

3. S. aureus ile enfeksiyon tahlilleri

  1. Hücre yoğunluğunun ve canlılığının belirlenmesi
    1. Harcanan kültür ortamını A549 hücrelerini saymak için ayrılmış üç kuyudan çıkarın ve atın.
    2. 5 μg/mL Hoechst 33342 ve 1 μg/mL propidium iyodür içeren 1 mL tam enfeksiyon ortamı ekleyin.
      NOT: Hoechst 33342 bilinen bir mutajendir ve özenle ele alınmalıdır. Potansiyel bir mutajen olan propidium iyodür, ilgili düzenlemelere göre özenle ele alınmalı ve güvenli bir şekilde atılmalıdır.
    3. Hücreleri % 5 CO2'de 36 ± 1 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
    4. Hücre numarasını sayın ve bir wield alanı floresan mikroskobu kullanarak hücre canlılığını hesaplayın.
      NOT: Floresan mikroskop mevcut değilse, hücre yoğunluğu ve canlılığı, hücre sayma odası kullanılarak trippan mavisi boyama ile hesaplanabilir.
  2. Bakteriyel süspansiyonun hazırlanması
    1. Bir tüpte 25 mL tam enfeksiyon ortamı dağıtın ve 36 ± 1 °C'de önceden ısıtın.
    2. S. aureus süspansiyonunu, bir hücre yoğunluk ölçer kullanarak tam enfeksiyon ortamında 0,5 anOD600nm'ye ayarlayın.
    3. Kuyu başına hücre sayısına göre 1 enfeksiyon (MOI) çokluğu elde etmek için tam enfeksiyon ortamında 0,5 OD600nm seyrelterek hücre aşılaması için 20 mL bakteriyel süspansiyon hazırlayın.
      NOT: MOI, her kuyuda hücre başına eklenen bakteri sayısına karşılık gelir. Örneğin, kuyu başına 1,0 × 106 hücre ile 1 MOI elde etmek için, 500 μL'lik bir hacme 106 CFU eklenebilmesi için 2,0 × 106 CFU/mL'de bakteriyel bir süspansiyon hazırlayın (bkz. adım 3.3.3). MOI, test edilecek hücre tiplerine ve bakteri suşlarına göre ayarlanabilir.
    4. Hücre aşılama adımı için kullanılacak seyreltilmiş bakteri süspansiyonunun S. aureus yükünü belirlemek için otomatik bir spiral plaka kullanın.
    5. Agar plakalarını 36 ± 1 °C'de 18-24 saat kuluçkaya yaslayın.
    6. Ertesi gün, test edilen her gerinim için doğru MOI'yi hesaplamak için koloni sayacı olan kolonilerin sayısını sayın.
      NOT: Otomatik spiral plaka mevcut değilse, bakteri yükü bir agar plakası üzerinde seri seyreltme ile belirlenebilir. Ayrıntılar için bakteriyolojik analitik kılavuza bakın14.
  3. Hücre aşısı
    1. Hücrelerin sağlıklı ve beklendiği gibi büyüdüğünden emin olmak için 24 kuyu plakasının her kuyusuna düşük büyütme mikroskopisi ile gözlemleyin.
    2. Harcanan hücre kültürü ortamını 24 kuyu plakasından çıkarın ve atın.
    3. %100 birikme hücrelerine sahip her kuyuya aşılama için 500 μL bakteri süspansiyonu ekleyin.
    4. Hücreleri 36 ± 1 °C ve% 5 CO2'de 2 saat kuluçkaya yatırın.
      NOT: Test edilecek her durum için plakanın üç kuyusunun kullanılması (üçe üçe kadar) ve en az üç bağımsız deney yapılması önerilir. Kuluçka gecikmesi deneysel amace göre uyarlanabilir.
  4. Hücre içi bakterilerin gelişmiş enzim koruma testine (iEPA) ile nicelleştirilmesi
    1. Steril suda %2 Triton X-100'ün 3,5 mL'si ve 3,5 mL tripsin-EDTA ile 7 mL 4x lizis tamponu hazırlayın.
    2. Asetat tamponunda 10 mg/mL'de ve aliquot 25 μL'de bir lysostaphin stok çözeltisi hazırlayın. -80 °C'de 6 aya kadar saklayın.
    3. Lysostaphin stok çözeltisinin 25 μL'si (10 mg/mL) ve 225 μL'si 0,1 M Tris-HCl karıştırılarak 1 mg/mL'de 250 μL taze lysostaphin çalışma çözeltisi hazırlayın. 4 °C'de 48 saate kadar saklayın.
    4. Lysostaphin çalışma çözeltisinin 250 μL'sine 6 mL tam enfeksiyon ortamı ekleyerek lysostaphin ile desteklenmiş 6,25 mL tam enfeksiyon ortamı hazırlayın.
    5. Her kuyuya lysostaphin ile desteklenmiş 250 μL tam enfeksiyon ortamı ekleyin ve plakayı elle döndürerek plakayı hafifçe çalkalayın.
    6. Lysostaphin'in hücre dışı bakterileri öldürmesine izin vermek için hücreleri% 5 CO2'de 36 ± 1 °C'de 1 saat kuluçkaya bırakın.
    7. Kuluçka süresinin sonunda, lizostaphin'i inaktive etmek için her kuyuya 20 mg / mL'de 10 μL proteinaz K ekleyin.
    8. Hücreleri oda sıcaklığında 2 dakika kuluçkaya yatırın.
    9. Hücreleri ozmotik şokla lyse etmek için 250 μL 4x lizis tamponu ekleyin.
    10. Hücreleri 36 ± 1 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
    11. Hücrelerin tamamen lisli ve homojenize olduğundan emin olmak için kuyunun alt kısmının her yerine on kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak iyice karıştırın.
    12. Her kuyunun S. aureus yükünü belirlemek için otomatik spiral plaka kullanın.
    13. Agar plakalarını 36 ± 1 °C'de 18-24 saat kuluçkaya yaslayın.
    14. Ertesi gün, her kuyunun hücre içi S. aureus yükünü hesaplamak için koloni sayacı olan kolonilerin sayısını sayın.
  5. Enzim koruma tahlilleri (EPA) ile antimikrobiyal bileşiklerin hücre içi etkinliğinin ölçümü
    1. Steril suda %2 Triton X-100,6,25 mL tripsin-EDTA ve 15,625 mL steril suda 3,125 mL triton X-100 ile 25 mL 1x lizis tamponu hazırlayın.
    2. 25 μL lysostaphin stok çözeltisini (10 mg/mL) ve 225 μL 0,1 M Tris-HCl'yi karıştırarak 1 mg/mL'de 250 μL taze lysostaphin çalışma çözeltisi hazırlayın.
    3. Lysostaphin çalışma çözeltisinin 250 μL'sine 24,75 mL tam enfeksiyon ortamı ekleyerek lysostaphin ile desteklenmiş 25 mL tam enfeksiyon ortamı hazırlayın.
    4. Test edilecek her antimikrobiyal bileşik için, çalışılacak konsantrasyonda lysostaphin ve antimikrobiyal bileşik ile desteklenmiş 3.1 mL tam enfeksiyon ortamı hazırlayın.
    5. Harcanan hücre kültürü ortamını 24 kuyu plakasından çıkarın ve atın.
    6. Lysostaphin ile desteklenmiş 1 mL tam enfeksiyon ortamı ekleyin.
    7. Lysostaphin'in hücre dışı bakterileri öldürmesine izin vermek için hücreleri% 5 CO2'de 36 ± 1 °C'de 1 saat kuluçkaya bırakın.
    8. Lysostaphin ile takviye edilen ortamı 24 kuyu plakasından çıkarın ve atın.
    9. Üç kuyuyu lysostaphin ile desteklenmiş 1 mL orta ve test edilecek antimikrobiyal bileşik ile doldurun.
    10. Test edilecek her antimikrobiyal bileşik için 3.5.9 adımını yineleyin.
    11. Kontrol durumu için, üç kuyuyu herhangi bir antimikrobiyal bileşik olmadan lysostaphin ile desteklenmiş 1 mL orta ile doldurun.
    12. Hücreleri % 5 CO2'de 36 ± 1 °C'de 24 saat kuluçkaya yatırın.
    13. Kuluçka süresinin sonunda, harcanan ortamı çıkarın ve atın ve her kuyuyu CaCl2 ve MgCl2 ile steril DPBS ile üç kez hafifçe yıkayın.
    14. Hücreleri ozmotik şokla ayırmak ve indirgenmek için her kuyuya 1 mL 1x lizis tamponu ekleyin.
    15. Hücreleri 36 ± 1 °C'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
    16. Hücrelerin tamamen lisli ve homojenize olduğundan emin olmak için kuyunun her yerine on kez yukarı ve aşağı pipetleme yaparak iyice karıştırın.
    17. Her kuyunun S. aureus yükünü belirlemek için otomatik spiral plaka kullanın.
    18. Agar plakalarını 36 ± 1 °C'de 18-24 saat kuluçkaya yaslayın.
    19. Ertesi gün, her kuyunun hücre içi S. aureus yükünü hesaplamak için koloni sayacı olan kolonilerin sayısını sayın.
      NOT: Her antimikrobiyal bileşiğin hücre içi aktivitesi kontrol durumunun bakteri yüküne göre hesaplanmalıdır. Kontrol ve bileşikler arasında gözlenen farklılıkların hücre ölümüne bağlı olmadığını kanıtlamak için tüm antimikrobiyal bileşiklerin sitotoksikliğini kontrol etmek de önemlidir.

Representative Results

S. aureus internalization'ın A549 epitel hücreleri tarafından elde edilen sonuçları Şekil 1A'da gösterilmektedir. A549 hücreleri, 2 saat boyunca 1 MOI'de, fibronektin bağlayıcı proteinler A ve B'den yoksun S. aureus SF8300 WT ve SF8300 ΔfnbA/B ile aşılandı. Hücre dışı S. aureus'u yok etmek için kültür ortamına lysostaphin eklendi ve hücreler 1 saat kuluçkaya yatırıldı. Daha sonra, lysostaphin ya EPA için yıkanarak çıkarıldı ya da iEPA için proteinaz K ile inaktive edildi. Daha sonra lizis tamponunda hücreler bozuldu ve bakteri yükü kültür tarafından ölçüldü. EPA kullanılarak, ortalama hücre içi yükler sırasıyla SF8300 WT ve SF8300 ΔfnbA/B için 4.46 ve 0.49 Log CFU/mL'ydi (Şekil 1A, yeşil çubuklar). iEPA kullanılarak, ortalama hücre içi yükler sırasıyla SF8300 WT ve SF8300 ΔfnbA/B için ortalama hücre içi yükler 4,53 ve 0,56 Log CFU/mL'ydi (Şekil 1A, kırmızı çubuklar). Hem EPA hem de iEPA'nın benzer sonuçlar gösterdiğini belirtmek ilginçtir, bu da hücreler iyi durumdayken yıkamaları yapma kolaylığı ile açıklanabilir ve S. aureus kaynaklı sitotoksiklik bu deneysel ortamlarda çok düşüktür (veriler gösterilmez).

Vankösin, rifampicin ve levofloksasin'in S. aureus'a karşı hücre içi aktivitesinin sonuçları Şekil 1B'de tasvir edilmektedir. Bu antibiyotiklerin hücre içi aktivitesini ölçmek için HaCaT hücreleri 2 saat boyunca 1 MOI'de S. aureus ATCC 29213 ile aşılandı. Hücreler, test edilecek antimikrobiyal bileşikler olsun ya da olmasın, 24 saat boyunca lisostafin ile inkübe edildi. Daha sonra, lisostafin ve antimikrobiyal bileşikler yıkanarak çıkarıldı. Hücreler lizis tamponunda bozuldu ve bakteri yükü kültür tarafından ölçüldü. Ortalama hücre içi yükler sırasıyla 4.57, 4.51, 3.03 ve kontrol için 2.91 log CFU/mL, vankoksisin (50 μg/mL), rifampicin (7 μg/mL) ve levofloksasin (10 μg/mL) olarak sırasıyla (Şekil 1B) oldu.

Figure 1
Şekil 1: Epitel hücrelerinde hücre içi Staphylococcus aureus yükü. (A) S. aureus SF8300 WT ve ΔfnbA/B ile enfekte olan A549 hücrelerinde enzim koruma tahlili (yeşil çubuklar) ve geliştirilmiş enzim koruma tahlili (kırmızı çubuklar). ATCC 29213. Çubuklar, üç taraflı olarak gerçekleştirilen üç bağımsız deneyin ortalama değerlerini temsil eder. Hata çubukları standart sapmaları temsil eder. s < 0.0001. Kısaltmalar: Ctrl = denetim; cfu = koloni oluşturan birimler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Burada açıklanan tahliller, NPPC'lerde S. aureus'un içselleştirilmesinin ve hücre içi sağkalımının yanı sıra antimikrobiyal bileşiklerin hücre içi etkinliğini incelemek için değerlidir6,15,16. Her iki test protokolündeki bazı adımlar kritik olabilir. Sağlık durumu ve hücrelerin yoğunluğu, bağımsız deneyler arasında mükemmel bir şekilde kontrol edilmeli ve tutarlı olmalıdır. Hedeflenen teorik MOI'ye yakın gerçek bir MOI elde etmek için bakteriyel inoculum dikkatlice standartlaştırılmalıdır. Genel olarak, pipetleme yaparken hücrelerin hiçbirini ayırmamaya özen edilmelidir. Lisostaphin ve antibiyotikleri çıkarmak için yıkamalar EPA'da kritik adımlardır. Proteinaz K kullanımının antibiyotik kullanılmadığında bu adımı iyileştirdiği bulunmuştur (aşağıya bakınız). Son olarak, hücreler her kuyuda tamamen ayrılmalı ve S. aureus hücre içi yükü güvenilir bir şekilde ölçmek için lizis tamponu ile inkübasyondan sonra iyice homojenize edilmelidir.

Bazı durumlarda, sorunlarla karşılaşılabilir ve önce birkaç noktanın denetlenmesi gerekir. Tekrarlanabilirlik eksikliği durumunda, S. aureus'un kümeler oluşturabileceği ve absorbans yanlışlığı ile nicelik yapabileceği akılda tutulmalıdır. Kültür ortamı değiştirilecekse (örneğin, salgılanan bir proteini ortadan kaldırmak için) bakterilerin topaklanması santrifüjleme ve yıkama adımları ile arttırılabilir. Bakteri süspansiyonu hızla kullanılmalıdır çünkü bakteriler oda sıcaklığında büyümeye devam eder. Yanlış depolama koşulları, kültür medyasında enzim aktivitesi için yetersiz pH, partiler ve sağlayıcılar arasındaki enzimamatik aktivitede değişkenlik ve belirli büyüme koşullarında bazı suşların lisostafin hassasiyetinin olmaması nedeniyle lisostafin etkinliği azalabilir. Fenol kırmızısı, özellikle kültür ortamı, bakteri yetiştirmek için kullanılan tipik et sularına kıyasla besin bakımından nispeten zayıf olduğunda, hafif bir bakteriyostatik etkiye sahip olabilir. Bu nedenle, arka plan gürültüsünü azaltarak floresan mikroskobik gözlemleri de iyileştiren fenol kırmızısı olmayan bir hücre kültürü ortamının kullanılması tavsiye edilir.

Bu yöntem farklı suşların hücre içi kaderini incelemek için değerli bir araç olmasına rağmen, yöntemin bazı sınırları göz önünde bulundurulmalıdır. Çok yüksek bir MOI kullanımı, NPPC'ler tarafından içselleştirme yeteneğini aşırı yükleyebilir ve test edilen farklı suşlar arasındaki farkları seviyelendirebilir. En sitotoksik suşların içselleştirilmesinin kapsamı hafife alınabilir, çünkü lisostafin (veya antibiyotikler) hasarlı hücreler tarafından salınan S. aureus'u hızla yok eder. Bu nedenle, uzun süreli deneyler (yani, hücre içi sağkalım veya hücre içi antibiyotik aktivitesini incelemek için) düşük sitotoksisiteye sahip suşlarla kurmak daha kolaydır. Bu nedenle, inkübasyon süresi ve MOI, gerinim virülansına, hücre tipine ve deneysel amaca göre doğru bir şekilde ayarlanmalıdır.

Burada lysostaphin kullanımı ile açıklanan yöntem gentamisin bazlı olanlardan daha güvenilirdir, çünkü lizostafin aksine, gentamisin konak hücreler tarafından içselleştirilme eğilimindedir13. Diğer avantaj, lisostaphin'i devre dışı bırakma olasılığıdır. Kim ve ark.13 tarafından çinko iyonlarını şelatlamak için EDTA veya 1.10-fenantropin kullanılarak lysostaphin aktivitesinin inhibisyonu bildirilmiştir; bununla birlikte, bakterilerin kaplayılmadan önce enzimi çıkarmak için hala yoğun yıkamalar gereklidir. Burada proteinaz K, lizostafin hızlı inaktivasyonunu sağlar. Hücre içi S. aureus çoğalması nedeniyle hücrelerin ağır enfekte olduklarında kültür plakasından kopma eğiliminde olduklarını gözlemledik. Son yıkama adımını atlayarak, iEPA yöntemi teknik kullanımı büyük ölçüde basitleştirdi ve gevşek yapışan veya zaten ayrılmış hücrelerde içselleştirilmiş bakterilerin geri kazanılmasını sağladı.

iEPA'da kullanılan daha konsantre reaktifler ve tamponlar da pipetleme çabasını azaltmaya ve hücre kaybını en aza indirmeye yardımcı oldu. Ek olarak, iEPA süspansiyondaki hücrelerle ve yıkanması zor organoidlerle kullanılabilir. Sonuç olarak, enzim koruma tahlilleri, S. aureus'un içselleştirmenin kapsamının ve hücre içi kaderinin yanı sıra farklı in vitro modellere sahip antimikrobiyal ilaçların hücre içi aktivitesinin incelenmesini sağlar. Hücre içindeki S. aureus'a ulaşabilen ilaçlar geliştirmenin önemini daha iyi takdir etmek için içselleştirme ve sitotoksiklik arasındaki ilişkiyi daha iyi karakterize etmek için iyileştirmeler yapılmalıdır.

Disclosures

Yazarların beyan edecekleri bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

S. aureus suşları SF8300 WT ve SF8300 ΔfnbA/B, Prof. Binh Diep (Kaliforniya Üniversitesi, San Francisco, ABD) tarafından cömertçe hediye edildi. Bu çalışma, Lyon Üniversitesi Vakfı'nın himayesinde finovi derneğinin (#AO13 FINOVI) hibesi ile desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well plate CORNING-FALCON 353047
A549 cell line ATCC CCL-185
Acetate buffer solution pH 4.6 Fluka 31048 Used to prepare lysostpahine stock solution at 10 mg/mL in 20 mM sodium acetate.
AMBICIN (Recombinant lysostaphin) AMBI LSPN-50 Lyophilized recominant lysostaphin. Freeze at -80 °C for long-term storage.
COS - Colombia agar + 5% sheep blood Biomerieux 43049 Any agar plate suitable for growing staphylococci can be used instead.
Densitometer WPA CO8000 Biochrom Ltd. 80-3000-45 Cell density meter
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose with phenol red Sigma-Aldrich D6429
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose without phenol red Sigma-Aldrich D1145
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline with MgCl2 and CaCl2, sterile-filtered Sigma-Aldrich D8662
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline, sterile-filtered Sigma-Aldrich D8537
Easyspiral dilute Interscience 414000 Automatic diluter and spiral plater
Fetal bovine serum Gibco 10270-106
HaCaT cell line Cell lines service (CLS) 300493
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water Fisher scientific 11534886
Propidium iodide, 1.0 mg/mL solution in water Invitrogen P3566
Proteinase K, recombinant 20 mg/mL Eurobio GEXPRK01-B5 > 30 U/mg, lot 901727
Scan 4000 Interscience 438000 Automatic colony counter
Sterile water OTEC 600500
T-75 culture flask CORNING-FALCON 353136
TC20 Automated cell counter Biorad 1450102 Automatic cell counter
Tris 1 M pH 8.0 Invitrogen AM9855G Used to prepare lysostaphine working solution at 1 mg/mL in 0.1 M Tris-HCl.
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Trypsin - EDTA solution Sigma-Aldrich T3924 0.05% porcine trypsin and 0.02% EDTA in Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red
Wide-field fluorescence microscope Nikon Ti2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verhoeven, P. O., et al. Detection and clinical relevance of Staphylococcus aureus nasal carriage: an update. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 12 (1), 75-89 (2014).
  2. Gagnaire, J., et al. Epidemiology and clinical relevance of Staphylococcus aureus intestinal carriage: a systematic review and meta-analysis. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 15 (8), 767-785 (2017).
  3. Tong, S. Y. C., Davis, J. S., Eichenberger, E., Holland, T. L., Fowler, V. G. Staphylococcus aureus infections: epidemiology, pathophysiology, clinical manifestations, and management. Clinical Microbiology Reviews. 28 (3), 603-661 (2015).
  4. Josse, J., Laurent, F., Diot, A. Staphylococcal adhesion and host cell invasion: fibronectin-binding and other mechanisms. Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).
  5. Hanssen, A. -M., et al. Localization of Staphylococcus aureus in tissue from the nasal vestibule in healthy carriers. BMC Microbiology. 17 (1), 89 (2017).
  6. Rigaill, J., et al. Evaluation of the intracellular efficacy of antimicrobial agents used for Staphylococcus aureus decolonization in a cell model mimicking nasal colonization. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 73 (11), 3044-3048 (2018).
  7. Yang, D., et al. Novel insights into Staphylococcus aureus deep bone infections: the Involvement of osteocytes. mBio. 9 (2), 00415-00418 (2018).
  8. Tuchscherr, L., et al. Staphylococcus aureus phenotype switching: an effective bacterial strategy to escape host immune response and establish a chronic infection. EMBO Molecular Medicine. 3 (3), 129-141 (2011).
  9. Valour, F., et al. Antimicrobial activity against intraosteoblastic Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (4), 2029-2036 (2015).
  10. Proctor, R. A., Prendergast, E., Mosher, D. F. Fibronectin mediates attachment of Staphylococcus aureus to human neutrophils. Blood. 59 (4), 681-687 (1982).
  11. Climo, M. W., Ehlert, K., Archer, G. L. Mechanism and suppression of lysostaphin resistance in oxacillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (5), 1431-1437 (2001).
  12. Bur, S., Preissner, K. T., Herrmann, M., Bischoff, M. The Staphylococcus aureus extracellular adherence protein promotes bacterial internalisation by keratinocytes independent of fibronectin-binding proteins. Journal of Investigative Dermatology. 133 (8), 2004-2012 (2013).
  13. Kim, J. -H., Chaurasia, A. K., Batool, N., Ko, K. S., Kim, K. K. Alternative enzyme protection assay to overcome the drawbacks of the gentamicin protection assay for measuring entry and intracellular survival of Staphylococci. Infection and Immunity. 87 (5), 00119 (2019).
  14. Maturin, L., Peeler, J. T. Aerobic plate count. Bacteriological Analytical Manual., Edition 8, Revision A. 3, Available from: https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-3-aerobic-plate-count 3 (2021).
  15. Kolenda, C., et al. Evaluation of the activity of a combination of three bacteriophages alone or in association with antibiotics on Staphylococcus aureus embedded in biofilm or internalized in Osteoblasts. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (3), 02231 (2020).
  16. Abad, L., et al. Antibiofilm and intraosteoblastic activities of rifamycins against Staphylococcus aureus: promising in vitro profile of rifabutin. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 75 (6), 1466-1473 (2020).

Tags

Biyoloji Sayı 175

Erratum

Formal Correction: Erratum: Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds
Posted by JoVE Editors on 01/19/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds. One of the affiliations was updated.

The fifth affiliation was updated from:

Département de Bactériologie, Institut des Agents Infectieux, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France

to:

Department of Bacteriology, Institute for Infectious Agents, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France 

Antimikrobiyal Bileşiklerin <em>Staphylococcus aureus</em> Internalization ve Hücre İçi Etkinliğini İncelemek için Geliştirilmiş Enzim Koruma Tahlilleri
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rigaill, J., Audoux, E., Rodriguez,… More

Rigaill, J., Audoux, E., Rodriguez, K., Peyron, A., Berthelot, P., Josse, J., Laurent, F., Caire, R., Verhoeven, P. O. Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds. J. Vis. Exp. (175), e62903, doi:10.3791/62903 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter