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Ensaio de proteção de enzimas melhorada para estudar a internalização staphylococcus aureus e eficácia intracelular de compostos antimicrobianos

Published: September 8, 2021 doi: 10.3791/62903
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1,3, 4,5, 4,5, 1, 1,2
1CIRI, Centre International de Recherche en Infectiologie, GIMAP team, University of Lyon, INSERM U1111, CNRS, UMR5308, ENS Lyon, UCBL1, University of St-Etienne, France, 2Department of Infectious Agents and Hygiene, University Hospital of St-Etienne, St-Etienne, France, 3Department of Infectious Diseases, University Hospital of St-Etienne, St-Etienne, France, 4CIRI, Centre International de Recherche en Infectiologie, Staphylococcal Pathogenesis team, University of Lyon, INSERM U1111, CNRS UMR5308, ENS Lyon, UCBL1, University of Lyon, Lyon, France, 5Department of Bacteriology, Institute for Infectious Agents, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Este protocolo tem como objetivo descrever como estudar a extensão da internalização do Staphylococcus aureus e sua capacidade de sobreviver dentro da célula hospedeira humana, bem como a eficácia intracelular de compostos antimicrobianos.

Abstract

Staphylococcus aureus expressa fatores de virulência para desencadear sua internalização em células eucariotes e sobreviver dentro de diferentes compartimentos subcelulares. Este artigo descreve um ensaio de proteção enzimática para estudar a extensão da internalização de S. aureus e sua sobrevivência intracelular em células fagocíticas não profissionais aderentes (NPPCs), bem como a eficácia intracelular de compostos antimicrobianos. Os NPPCs são cultivados em uma placa multi-poço até atingirem 100% de confluência. Culturas S. aureus são cultivadas da noite para o dia no meio da cultura celular. A suspensão bacteriana é diluída de acordo com o número de células por poço para vacinar as células em uma multiplicidade controlada de infecção. As células inoculadas são incubadas por 2h para permitir que as bactérias sejam internalizadas pelos NPPCs, seguindo as quais a linsstalfina é adicionada ao meio de cultura para matar seletivamente bactérias extracelulares. A linsstafina está presente no meio cultural para o resto do experimento.

Neste ponto, as células infectadas poderiam ser incubadas com compostos antimicrobianos para avaliar suas atividades intracelulares contra S. aureus. Em seguida, as células são lavadas três vezes para remover as drogas, e a carga intracelular S. aureus é então quantificada por culminar em placas de ágar. Alternativamente, para estudar fatores de virulência estafilocócica envolvidos na sobrevivência intracelular e toxicidade celular, a linstafina poderia ser inativada com proteinase K para eliminar a necessidade de lavar etapas. Esta dica melhora a confiabilidade da quantificação da carga bacteriana intracelular, especialmente se as células tendem a se desprender da placa de cultura quando ficam fortemente infectadas por causa da multiplicação do S. aureus intracelular. Esses protocolos podem ser usados com praticamente todos os tipos de NPPCs aderentes e com modelos de cultura celular 3D, como organoides.

Introduction

Staphylococcus aureus é um patógeno com risco de vida e uma bactéria commensal da pele e a mucosa que coloniza dois bilhões de indivíduos em todo o mundo1. Em humanos, portadores nasais de S. aureus têm um risco aumentado de infecção com sua própria cepa de transporte; no entanto, os determinantes multifatoriais do transporte mucosal S. aureus ainda não estão claros1,2. Além das infecções agudas, os pacientes também podem desenvolver infecções crônicas de S. aureus que muitas vezes são desafiadoras para curar3. Uma melhor compreensão das interações hospedeiro-patógeno durante a colonização e infecção é crucial para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas e melhoria do manejo do paciente.

In vitro, S. aureus pode desencadear sua internalização em células hospedeiras expressando o α5β1 integrin4. A interação tripartite entre as proteínas de ligação de fibronectina staphylococcal ancoradas na parede celular de S. aureus, a fibronectina e a integrin β1 expressa na superfície celular hospedeira é bem conhecida como a principal via da internalização de S. aureus em NPPCs como queratinócitos, osteoblastos, fibroblastos e células epiteliais e endoteliais4. Estudos recentes mostram que S. aureus pode ser encontrado dentro de células humanas durante a colonização nasal5,6 e infecção7. No entanto, o papel do reservatório intracelular na patogênese da infecção por S. aureus permanece incerto. As células hospedeiras poderiam atuar como um abrigo para S. aureus, que é protegido tanto do sistema imunológico8 quanto da maioria dos compostos antimicrobianos6,9.

O ensaio de proteção à linstafina, descrito pelo Proctor10 no início da década de 1980, permite o estudo de fatores bacterianos e hospedeiros envolvidos na internalização dos isolados de S. aureus. Lysostaphin é uma bactericina produzida por simuladores staphylococcus, que exibe atividade potente contra quase todos os isolados de S. aureus, incluindo cepas resistentes a antibióticos11. A linsstalfina tem sido usada para destruir apenas s. aureus extracelular para permitir a contagem de apenas bactérias intracelulares viáveis12. Esta técnica tem sido amplamente utilizada e tem contribuído para a descoberta de vários fatores de virulência de S. aureus. A gentamicina, sozinha e combinada com a linfotaphina, também é amplamente utilizada para estudar bactérias intracelulares.

No entanto, um estudo recente mostrou que a gentamicina entra em células eucarióticas e atinge bactérias internalizadas de forma tempo e dependente de concentração13. Este estudo também demonstrou que a lysostaphina não entra em células eucarióticas, confirmando que um ensaio de proteção enzimática à base de lysostaphin (EPA) é o ensaio mais preciso para quantificar a carga intracelular S. aureus pela cultura13. Independentemente de qual composto é usado para destruir bactérias extracelulares (por exemplo, lysostaphin ou gentamycin), ele deve ser removido lavando as células antes de emplacamento de S. aureus intracelular em placas de ágar. Lavagens sucessivas podem resultar no descolamento das células, especialmente células pouco aderentes (por exemplo, células fortemente infectadas), o que levaria a uma subestimação da carga intracelular S. aureus . Este artigo descreve em detalhes como a EPA pode ser usada para quantificar a carga intracelular S. aureus e medir a eficácia intracelular de compostos antimicrobianos usando um modelo in vitro . Note-se que foi proposto um método simples para melhorar a confiabilidade da quantificação da carga intracelular, evitando lavagens intensivas.

Protocol

1. Cultura das células epiteliais humanas

  1. Prepare o meio de cultura completa com a alta glicose de alta glicose (DMEM) modificada do meio Águia (DMEM) modificada de Dulbecco com vermelho fenol, suplementada com 10% de soro bovino fetal (FBS) sem antibióticos.
  2. Cresça células epiteliais A549 em meio de cultura completa a 36 ± 1 °C em 5% de CO2. Certifique-se do uso de um vaso de cultura de tamanho apropriado para ter células suficientes para etapas subsequentes (ver etapa 1.10).
    NOTA: Um frasco de 75 cm2 (T-75) é suficiente para semear duas placas de 24 poços e subcultura das células.
  3. Dois dias antes da infecção, prepare uma única placa de 24 poços.
  4. Remova e descarte o meio de cultura gasto do frasco T-75 e lave as células uma vez com 10 mL de soro fisco tamponado por fosfato de Dulbecco (DPBS).
  5. Adicione 5 mL de trippsina-EDTA e incuba as células por 5 min a 36 ± 1 °C em 5% de CO2.
  6. Adicione 5 mL de meio de cultura completa e transfira as células para um tubo.
  7. Centrifugar as células por 5 min a 300 × g.
  8. Descarte o supernatante e resuspenque as células em 10 mL de meio de cultura completa fresco.
  9. Conte as células com um contador automático de células (ou uma câmara de contagem).
  10. Diluir as células em meio de cultura completa para preparar 30 mL de suspensão celular a uma concentração de 2,0 × 105 células/mL.
  11. Adicione 1 mL da suspensão celular a cada poço de uma placa de 24 poços, o que corresponde a uma densidade celular de aproximadamente 1,0 × 105 células/cm² para uma área de poço de 2 cm².
  12. Incubar as células por 48 h a 36 ± 1 °C em 5% de CO2 até atingirem 100% de confluência.
    NOTA: Além das condições a serem testadas, três poços devem ser reservados para a contagem celular no dia da infecção (ver passo 3.1.4). De acordo com o número de condições a serem testadas, até duas placas de 24 poços podem ser preparadas simultaneamente. Os volumes indicados no protocolo devem ser aumentados em conformidade.

2. Cultura de Cepas S. aureus

  1. Dois dias antes da infecção, prepare o meio completo de infecção com DMEM de alta glicose sem vermelho fenol, suplementado com 10% de FBS sem antibióticos.
  2. Descongelar as cepas de S. aureus para serem testadas em placas de ágar.
  3. Incubar as placas de ágar por 18-24 h a 36 ± 1 °C.
  4. Um dia antes da inoculação, inocular uma colônia da cepa S. aureus a ser testada em 10 mL de meio completo de infecção.
  5. Incubar a bactéria por 18-24 h a 36 ± 1 °C com agitação a 160 rpm. Use tubos de 50 mL mantidos a 45° para evitar que as bactérias se instalem.
    NOTA: Antes de começar com uma nova cepa, recomenda-se verificar sua suscetibilidade à linstafina nas mesmas condições de cultura que serão utilizadas para outros experimentos (mídia, cargas bacterianas e tempo de concentração e incubação de linsstalaphina). Também é importante determinar a carga bacteriana correspondente a um OD600nm de 0,5 porque pode variar ligeiramente de uma cepa para outra. As condições culturais das cepas bacterianas poderiam ser adaptadas de acordo com o objetivo experimental.

3. Ensaio de infecção com S. aureus

  1. Determinação da densidade celular e viabilidade
    1. Remova e descarte o meio de cultura gasto dos três poços dedicados à contagem de células A549.
    2. Adicione 1 mL de infecção completa contendo 5 μg/mL de Hoechst 33342 e 1 μg/mL de iodeto de propídio.
      NOTA: Hoechst 33342 é um mutagênico conhecido e deve ser tratado com cuidado. O iodeto de propidium, um potencial mutagênico, deve ser tratado com cuidado e descartado com segurança de acordo com as normas aplicáveis.
    3. Incubar as células por 30 min a 36 ± 1 °C em 5% de CO2.
    4. Conte o número da célula e calcule a viabilidade celular usando um microscópio de fluorescência de campo de empunhadura.
      NOTA: Se um microscópio de fluorescência não estiver disponível, a densidade e a viabilidade da célula podem ser calculadas com coloração azul trypan usando uma câmara de contagem de células.
  2. Preparação da suspensão bacteriana
    1. Dispense 25 mL de meio completo de infecção em um tubo e pré-aqueça a 36 ± 1 °C.
    2. Ajuste a suspensão S. aureus para anOD600nm de 0,5 em meio completo de infecção usando um medidor de densidade celular.
    3. Prepare 20 mL de suspensão bacteriana para inoculação celular diluindo o 0,5 OD600nm em meio completo de infecção para alcançar uma multiplicidade de infecção (MOI) de 1 de acordo com o número de células por poço.
      NOTA: O MOI corresponde ao número de bactérias adicionadas por célula em cada poço. Por exemplo, para obter um MOI de 1 com 1,0 × 106 células por poço, prepare uma suspensão bacteriana a 2,0 × 106 UFC/mL para que 106 UFC possam ser adicionados em um volume de 500 μL (ver etapa 3.3.3). O MOI pode ser ajustado de acordo com os tipos de células e cepas bacterianas a serem testadas.
    4. Use um plater espiral automático para determinar a carga S. aureus da suspensão bacteriana diluída a ser usada para a etapa de inoculação celular.
    5. Incubar as placas de ágar por 18-24 h a 36 ± 1 °C.
    6. No dia seguinte, conte o número de colônias com um contador de colônias para calcular o MOI preciso para cada cepa testada.
      NOTA: Se não houver um plater espiral automático disponível, a carga bacteriana pode ser determinada por diluição serial em uma placa de ágar. Consulte o manual analítico bacteriológico para obter detalhes14.
  3. Inoculação celular
    1. Observe cada poço da placa de 24 poços por microscopia de baixa ampliação para garantir que as células estejam saudáveis e crescendo como esperado.
    2. Remova e descarte o meio de cultura celular gasto da placa de 24 poços.
    3. Adicione 500 μL da suspensão bacteriana para inoculação em cada poço com células 100% confluentes.
    4. Incubar as células por 2h a 36 ± 1 °C e 5% de CO2.
      NOTA: recomenda-se usar três poços da placa para que cada condição seja testada (triplicado) e realizar pelo menos três experimentos independentes. O atraso da incubação pode ser adaptado de acordo com o objetivo experimental.
  4. Quantificação de bactérias intracelulares com ensaio de proteção de enzimas melhorado (iEPA)
    1. Prepare 7 mL de tampão de 4x lysis com 3,5 mL de 2% Triton X-100 em água estéril e 3,5 mL de trippsina-EDTA.
    2. Prepare uma solução de estoque de lisostaphin a 10 mg/mL em tampão de acetato e alíquota de 25 μL em criovials. Armazenar a -80 °C por até 6 meses.
    3. Prepare 250 μL de uma solução de trabalho de linfofina fresca a 1 mg/mL misturando 25 μL da solução de estoque de lysostaphin (10 mg/mL) e 225 μL de 0,1 M Tris-HCl. Armazenar a 4 °C por até 48 h.
    4. Prepare 6,25 mL de infecção completa complementada com linfofina, adicionando 6 mL de infecção completa de meio a 250 μL da solução de trabalho de linsstalaphina.
    5. Adicione 250 μL de infecção completa complementada com linsstalfina em cada poço e agitar suavemente a placa girando a placa à mão.
    6. Incubar as células por 1h a 36 ± 1 °C em 5% de CO2 para deixar a linsstalofina matar as bactérias extracelulares.
    7. Ao final do tempo de incubação, adicione 10 μL de proteinase K a 20 mg/mL em cada poço para inativar a linsostamphina.
    8. Incubar as células por 2 minutos em temperatura ambiente.
    9. Adicione 250 μL de tampão de 4x lise para lise as células por choque osmótico.
    10. Incubar as células por 10 min a 36 ± 1 °C.
    11. Misture bem por tubulação para cima e para baixo dez vezes em todo o fundo do poço para garantir que as células estejam totalmente reladas e homogeneizadas.
    12. Use um emplacador espiral automático para determinar a carga S. aureus de cada poço.
    13. Incubar as placas de ágar por 18-24 h a 36 ± 1 °C.
    14. No dia seguinte, conte o número de colônias com um contador de colônias para calcular a carga intracelular de S. aureus de cada poço.
  5. Medição da eficácia intracelular de compostos antimicrobianos com ensaio de proteção de enzimas (EPA)
    1. Prepare 25 mL de tampão de 1x de lise com 3,125 mL de 2% Triton X-100 em água estéril, 6,25 mL de trippsin-EDTA e 15,625 mL de água estéril.
    2. Prepare 250 μL de uma solução de trabalho de linfofina fresca a 1 mg/mL misturando 25 μL de uma solução de estoque de lysostaphin (10 mg/mL) e 225 μL de 0,1 M Tris-HCl.
    3. Prepare 25 mL de infecção completa suplementada com linfofina adicionando 24,75 mL de meio completo de infecção a 250 μL da solução de trabalho de linsaphina.
    4. Para cada composto antimicrobiano a ser testado, prepare 3,1 mL de infecção completa complementada com linsstalfina e o composto antimicrobiano na concentração a ser estudada.
    5. Remova e descarte o meio de cultura celular gasto da placa de 24 poços.
    6. Adicione 1 mL de infecção completa suplementada com linstaphina.
    7. Incubar as células por 1h a 36 ± 1 °C em 5% de CO2 para deixar a linsstalofina matar as bactérias extracelulares.
    8. Retire e descarte o meio suplementado com linfofetamphina da placa de 24 poços.
    9. Encha três poços com 1 mL de médio suplementado com linfofina mais o composto antimicrobiano a ser testado.
    10. Repita o passo 3.5.9 para cada composto antimicrobiano a ser testado.
    11. Para a condição de controle, encha três poços com 1 mL de médio suplementado com linfofina sem qualquer composto antimicrobiano.
    12. Incubar as células por 24 h a 36 ± 1 °C em 5% de CO2.
    13. Ao final do período de incubação, remova e descarte o meio gasto e lave suavemente cada poço três vezes com DPBS estéreis com CaCl2 e MgCl2.
    14. Adicione 1 mL de tampão de 1x de lise a cada poço para desprender e lise as células por choque osmótico.
    15. Incubar as células por 10 min a 36 ± 1 °C.
    16. Misture bem por tubulação para cima e para baixo dez vezes em todo o poço para garantir que as células estejam totalmente reladas e homogeneizadas.
    17. Use um emplacador espiral automático para determinar a carga S. aureus de cada poço.
    18. Incubar as placas de ágar por 18-24 h a 36 ± 1 °C.
    19. No dia seguinte, conte o número de colônias com um contador de colônias para calcular a carga intracelular de S. aureus de cada poço.
      NOTA: A atividade intracelular de cada composto antimicrobiano deve ser calculada de acordo com a carga bacteriana da condição de controle. Também é importante verificar a citotoxicidade de todos os compostos antimicrobianos para provar que as diferenças observadas entre o controle e os compostos não são devidos à morte celular.

Representative Results

Os resultados da internalização de S. aureus por células epiteliais A549 são retratados na Figura 1A. As células A549 foram inoculadas com S. aureus SF8300 WT e SF8300 ΔfnbA/B, que carece de proteínas de ligação de fibronectina A e B, em um MOI de 1 por 2 h. Para destruir o S. aureus extracelular, a linstafofina foi adicionada ao meio da cultura, e as células foram incubadas por 1h. Em seguida, a lisostaphina foi removida pela lavagem para EPA ou inativada com proteinase K para iEPA. Em seguida, as células foram interrompidas em tampão de lise, e a carga bacteriana foi quantificada pela cultura. Utilizando-se EPA, as cargas intracelulares médias foram de 4,46 e 0,49 Log CFU/mL para SF8300 WT e SF8300 ΔfnbA/B, respectivamente (Figura 1A, barras verdes). Utilizando o iEPA, as cargas intracelulares médias foram de 4,53 e 0,56 Log CFU/mL para SF8300 WT e SF8300 ΔfnbA/B, respectivamente (Figura 1A, barras vermelhas). É interessante notar que tanto a EPA quanto a iEPA apresentaram resultados semelhantes, o que pode ser explicado pela facilidade de realização das lavagens quando as células estão em boas condições e porque a citotoxicidade induzida pelo S. aureus é muito baixa nessas configurações experimentais (dados não mostrados).

Os resultados da atividade intracelular de vancomicina, rifampicina e levofloxacina contra S. aureus são retratados na Figura 1B. Para medir a atividade intracelular desses antibióticos, as células HaCaT foram inoculadas com S. aureus ATCC 29213 em um MOI de 1 por 2 h. As células foram incubadas com linfofina, com ou sem os compostos antimicrobianos a serem testados, por 24 h. Em seguida, a linstafina e os compostos antimicrobianos foram removidos por lavagem. As células foram interrompidas em tampão de lise, e a carga bacteriana foi quantificada pela cultura. As cargas intracelulares médias foram de 4,57, 4,51, 3,03 e 2,91 log CFU/mL para controle, vancomicina (50 μg/mL), rifampicina (7 μg/mL) e levofloxacina (10 μg/mL), respectivamente (Figura 1B).

Figure 1
Figura 1: Carga intracelular de Staphylococcus aureus em células epiteliais. (A) Ensaio de proteção de enzimas (barras verdes) e melhor ensaio de proteção de enzimas (barras vermelhas) em células A549 infectadas com S. aureus SF8300 WT e ΔfnbA/B. (B) Atividade intracelular de compostos antimicrobianos em células HaCaT infectadas com S. aureus ATCC 29213. As barras representam os valores médios de três experimentos independentes realizados em triplicado. As barras de erro representam os desvios padrão. p < 0,0001. Abreviaturas: Ctrl = controle; cfu = unidades formadoras de colônias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Os ensaios aqui descritos são valiosos para estudar a extensão da internalização e a sobrevivência intracelular de S. aureus em NPPCs, bem como a eficácia intracelular dos compostos antimicrobianos6,15,16. Alguns passos em ambos os protocolos de ensaio podem ser críticos. A condição de saúde e a densidade das células devem ser perfeitamente controladas e consistentes entre experimentos independentes. O inóculo bacteriano deve ser cuidadosamente padronizado para obter um MOI real próximo ao MOI teórico alvo. Em geral, deve-se tomar cuidado para não desprender nenhuma das células durante a pipetação. As lavagens para remover a linstalfina e os antibióticos são passos críticos na EPA. O uso de proteinase K foi encontrado para melhorar esta etapa quando nenhum antibiótico é usado (veja abaixo). Por último, mas não menos importante, as células devem ser totalmente separadas em cada poço e completamente homogeneizadas após a incubação com o tampão de lise para quantificar de forma confiável a carga intracelular S. aureus.

Em alguns casos, as questões podem ser encontradas, e vários pontos devem ser verificados primeiro. Em caso de falta de reprodutibilidade, deve-se ter em mente que S. aureus pode formar aglomerados, tornando a quantificação por absorvência imprecisa. O agrupamento de bactérias pode ser aumentado por centrifugação e etapas de lavagem se o meio de cultura for substituído (por exemplo, para eliminar uma proteína secreta). A suspensão bacteriana deve ser usada rapidamente porque as bactérias continuam a crescer à temperatura ambiente. A eficácia da lysostaphin pode diminuir devido às condições incorretas de armazenamento, pH subótimal para atividade enzimática na mídia cultural, variabilidade na atividade enzimática entre lotes e provedores e falta de sensibilidade à linfotefina de algumas cepas em condições específicas de crescimento. O vermelho fenol pode ter um leve efeito bacteriostático, especialmente quando o meio de cultura é relativamente pobre em nutrientes em comparação com os caldos típicos usados para o cultivo de bactérias. Assim, é aconselhável usar um meio de cultura celular sem fenol vermelho, o que também melhora as observações microscópicas de fluorescência reduzindo o ruído de fundo.

Embora este método seja uma ferramenta valiosa para estudar o destino intracelular de diferentes cepas, alguns limites do método devem ser considerados. O uso de um MOI muito alto pode sobrecarregar a capacidade de internalização por NPPCs e nivelar as diferenças entre as diferentes cepas testadas. A extensão da internalização das cepas mais citotóxicas pode ser subestimada porque a linstafina (ou antibióticos) destrói rapidamente o S. aureus que é liberado por células danificadas. Assim, experimentos com durações prolongadas (ou seja, para estudar sobrevida intracelular ou atividade intracelular de antibióticos) são mais fáceis de configurar com cepas com baixa citotoxicidade. Portanto, o tempo de incubação e o MOI devem ser ajustados com precisão de acordo com a virulência da cepa, o tipo celular e o objetivo experimental.

O método descrito aqui com o uso de linfotaphina é mais confiável do que aqueles baseados na gentamicina porque, ao contrário da linsaphina, a gentamicina tende a ser internalizada pelas células hospedeiras13. A outra vantagem é a possibilidade de inativar a linsstalaphina. A inibição da atividade de lisefotaphina foi relatada por Kim et al.13 com o uso de EDTA para quelatar íons de zinco ou 1,10-fenoanthrolina; no entanto, lavagens intensivas ainda são necessárias para remover a enzima antes de emplacamento das bactérias. Aqui, proteinase K permite a rápida inativação da linsstalaphina. Observamos que as células tendem a se desprender da placa de cultura quando se tornam fortemente infectadas por causa da multiplicação do S. aureus intracelular. Ao pular a etapa final de lavagem, o método iEPA simplificou muito o manuseio técnico e possibilitou a recuperação das bactérias internalizadas em células frouxamente aderentes ou já separadas.

Os reagentes e tampões mais concentrados utilizados no iEPA também ajudaram a reduzir o esforço de pipetação e minimizar a perda de células. Além disso, o iEPA pode ser usado com células em suspensão, bem como com organoides de difícil lavagem. Em conclusão, ensaios de proteção enzimática permitem o estudo da extensão da internalização e do destino intracelular de S. aureus, bem como a atividade intracelular de antimicrobianos com diferentes modelos in vitro . Melhorias devem ser feitas para caracterizar melhor a relação entre internalização e citotoxicidade para apreciar melhor a importância do desenvolvimento de drogas capazes de atingir S. aureus dentro da célula.

Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.

Acknowledgments

As cepas SF8300 WT e SF8300 ΔfnbA/B foram generosamente dotadas pelo Prof. Binh Diep (Universidade da Califórnia, São Francisco, EUA). Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da associação FINOVI (#AO13 FINOVI) sob a égide da Fundação para a Universidade de Lyon.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well plate CORNING-FALCON 353047
A549 cell line ATCC CCL-185
Acetate buffer solution pH 4.6 Fluka 31048 Used to prepare lysostpahine stock solution at 10 mg/mL in 20 mM sodium acetate.
AMBICIN (Recombinant lysostaphin) AMBI LSPN-50 Lyophilized recominant lysostaphin. Freeze at -80 °C for long-term storage.
COS - Colombia agar + 5% sheep blood Biomerieux 43049 Any agar plate suitable for growing staphylococci can be used instead.
Densitometer WPA CO8000 Biochrom Ltd. 80-3000-45 Cell density meter
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose with phenol red Sigma-Aldrich D6429
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose without phenol red Sigma-Aldrich D1145
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline with MgCl2 and CaCl2, sterile-filtered Sigma-Aldrich D8662
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline, sterile-filtered Sigma-Aldrich D8537
Easyspiral dilute Interscience 414000 Automatic diluter and spiral plater
Fetal bovine serum Gibco 10270-106
HaCaT cell line Cell lines service (CLS) 300493
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water Fisher scientific 11534886
Propidium iodide, 1.0 mg/mL solution in water Invitrogen P3566
Proteinase K, recombinant 20 mg/mL Eurobio GEXPRK01-B5 > 30 U/mg, lot 901727
Scan 4000 Interscience 438000 Automatic colony counter
Sterile water OTEC 600500
T-75 culture flask CORNING-FALCON 353136
TC20 Automated cell counter Biorad 1450102 Automatic cell counter
Tris 1 M pH 8.0 Invitrogen AM9855G Used to prepare lysostaphine working solution at 1 mg/mL in 0.1 M Tris-HCl.
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Trypsin - EDTA solution Sigma-Aldrich T3924 0.05% porcine trypsin and 0.02% EDTA in Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red
Wide-field fluorescence microscope Nikon Ti2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biologia Edição 175

Erratum

Formal Correction: Erratum: Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds
Posted by JoVE Editors on 01/19/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds. One of the affiliations was updated.

The fifth affiliation was updated from:

Département de Bactériologie, Institut des Agents Infectieux, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France

to:

Department of Bacteriology, Institute for Infectious Agents, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France 

Ensaio de proteção de enzimas melhorada para estudar a internalização <em>staphylococcus aureus</em> e eficácia intracelular de compostos antimicrobianos
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Rigaill, J., Audoux, E., Rodriguez,… More

Rigaill, J., Audoux, E., Rodriguez, K., Peyron, A., Berthelot, P., Josse, J., Laurent, F., Caire, R., Verhoeven, P. O. Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds. J. Vis. Exp. (175), e62903, doi:10.3791/62903 (2021).

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