Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تحسين فحص حماية الإنزيم لدراسة استوعب المكورات العنقودية والفعالية داخل الخلايا للمركبات المضادة للميكروبات

Published: September 8, 2021 doi: 10.3791/62903
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1,3, 4,5, 4,5, 1, 1,2
1CIRI, Centre International de Recherche en Infectiologie, GIMAP team, University of Lyon, INSERM U1111, CNRS, UMR5308, ENS Lyon, UCBL1, University of St-Etienne, France, 2Department of Infectious Agents and Hygiene, University Hospital of St-Etienne, St-Etienne, France, 3Department of Infectious Diseases, University Hospital of St-Etienne, St-Etienne, France, 4CIRI, Centre International de Recherche en Infectiologie, Staphylococcal Pathogenesis team, University of Lyon, INSERM U1111, CNRS UMR5308, ENS Lyon, UCBL1, University of Lyon, Lyon, France, 5Department of Bacteriology, Institute for Infectious Agents, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

يهدف هذا البروتوكول إلى وصف كيفية دراسة مدى استيعاب المكورات العنقودية والحجرة وقدرتها على البقاء داخل الخلية المضيفة للإنسان ، وكذلك الفعالية داخل الخلايا للمركبات المضادة للميكروبات.

Abstract

المكورات العنقودية أوريوس يعبر عن عوامل الفوعة لتحريك استيعابها في خلايا eukaryote والبقاء على قيد الحياة داخل مقصورات فرعية مختلفة. تصف هذه الورقة فحص حماية الإنزيم لدراسة مدى استيعاب S. aureus وبقائه داخل الخلايا في الخلايا البلعومية غير الاحترافية (NPPCs) بالإضافة إلى الفعالية داخل الخلايا للمركبات المضادة للميكروبات. تزرع NPPCs في لوحة متعددة الآبار حتى تصل إلى التقاء 100٪. S. تزرع الثقافات أوريوس بين عشية وضحاها في خلية الثقافة المتوسطة. يتم تخفيف التعليق البكتيري وفقا لعدد الخلايا لكل بئر لتطعيم الخلايا في تعدد الإصابة الخاضع للرقابة. يتم احتضان الخلايا الملقحة لمدة 2 ساعة للسماح للبكتيريا أن تكون داخلية من قبل NPPCs، وبعد ذلك يتم إضافة الليسوستافين إلى وسط الثقافة لقتل البكتيريا خارج الخلية بشكل انتقائي. ليسوستافين موجود في الوسط الثقافي لبقية التجربة.

عند هذه النقطة، يمكن احتضان الخلايا المصابة بمركبات مضادة للميكروبات لتقييم أنشطتها داخل الخلايا ضد S. aureus. بعد ذلك ، يتم غسل الخلايا ثلاث مرات لإزالة الأدوية ، ثم يتم قياس حمولة S. aureus داخل الخلايا عن طريق الاستزراع على لوحات أجار. بدلا من ذلك، لدراسة عوامل الفوعة المكورات العنقودية المشاركة في البقاء على قيد الحياة داخل الخلايا وسمية الخلية، يمكن تعطيل الليسوستافين مع البروتين K للقضاء على الحاجة إلى خطوات الغسيل. يحسن هذا الطرف موثوقية التحديد الكمي للأحمال البكتيرية داخل الخلايا ، خاصة إذا كانت الخلايا تميل إلى الانفصال عن لوحة الثقافة عندما تصاب بشدة بسبب تكاثر S. aureus داخل الخلية. يمكن استخدام هذه البروتوكولات مع جميع أنواع NPPCs المنضمة تقريبا ومع نماذج ثقافة الخلايا ثلاثية الأبعاد مثل organoids.

Introduction

المكورات العنقودية أوريوس هو على حد سواء ممرض يهدد الحياة وبكتيريا كومينسال من الجلد والغشاء المخاطي الذي يستعمر ملياري فرد في جميع أنحاء العالم1. في البشر، الناقلين الأنف من S. أوريوس لديها خطر متزايد من العدوى مع سلالة خاصة بهم من النقل. ومع ذلك، فإن المحددات متعددة العوامل للنقل المخاطي S. aureus لا تزال غير واضحة1،2. بالإضافة إلى الالتهابات الحادة ، يمكن للمرضى أيضا تطوير التهابات S. aureus المزمنة التي غالبا ما تكون صعبة للعلاج3. إن الفهم الأفضل للتفاعلات بين المضيف ومسببات الأمراض أثناء الاستعمار والعدوى أمر بالغ الأهمية لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة وتحسين إدارة المرضى.

في المختبر، S. أوريوس يمكن أن تؤدي إلى استيعابها في الخلايا المضيفة التي تعبر عن integrin4 α5α1. التفاعل الثلاثي بين البروتينات الملزمة للمكورات العنقودية الليفية الراسية على جدار الخلية S. aureus ، فيبروكتين ، و β1 integrin المعبر عنها على سطح الخلية المضيفة معروف جيدا باسم المسار الرئيسي لاستيعاب S. aureus في NPPCs مثل الخلايا الكيراتينية ، والعظام العظمية ، والخلايا الليفية ، والخلايا الظهارية والظهارية4. تظهر الدراسات الحديثة أن S. aureus يمكن العثور عليها داخل الخلايا البشرية خلال استعمار الأنف5،6 والعدوى7. ومع ذلك ، فإن دور الخزان داخل الخلايا في الإمراض من عدوى S. aureus لا يزال غير واضح. ويمكن للخلايا المضيفة أن تكون بمثابة مأوى ل S. aureus، وهو محمي من كل من الجهاز المناعي8 ومعظم مركبات مضادات الميكروبات6,9.

يمكن اختبار حماية الليسوستافين ، الذي وصفه Proctor10 في وقت سابق من الثمانينيات ، من دراسة العوامل البكتيرية والمضيفة المشاركة في استيعاب عزلات S. aureus. ليسوستوفين هو بكتيريا تنتجها المكورات العنقودية simulans، الذي يظهر نشاطا قويا ضد تقريبا جميع عزلات S. أوريوس، بما في ذلك سلالات مقاومة للمضادات الحيوية11. وقد استخدمت ليسوستافين لتدمير فقط خارج الخلية S. أوريوس لتمكين العد من البكتيريا داخل الخلايا فقط قابلة للحياة12. وقد استخدمت هذه التقنية على نطاق واسع وساهمت في اكتشاف العديد من عوامل الفوعة من S. أوريوس. كما يستخدم جنتامايسين، وحده وجنبا إلى جنب مع الليسوستافين، على نطاق واسع لدراسة البكتيريا داخل الخلايا.

ومع ذلك، أظهرت دراسة حديثة أن جنتامايسين يدخل الخلايا النواة ويصل إلى البكتيريا الداخلية بطريقة تعتمد على الوقت والتركيز13. كما أظهرت هذه الدراسة أن الليسوستافين لا يدخل الخلايا eukaryotic، مما يؤكد أن اختبار حماية الإنزيم القائم على الليسوستافين (EPA) هو الفحص الأكثر دقة لقياس الحمل داخل الخلية S. aureus حسب الثقافة13. بغض النظر عن المركب الذي يستخدم لتدمير البكتيريا خارج الخلية (على سبيل المثال، الليسوستاوستافين أو جنتامايسين)، ينبغي إزالته عن طريق غسل الخلايا قبل طلاء داخل الخلية S. أوريوس على لوحات أجار. قد يؤدي الغسل المتتالي إلى انفصال الخلايا ، وخاصة الخلايا الملتصقة بشكل سيئ (على سبيل المثال ، الخلايا المصابة بشدة) ، مما يؤدي إلى التقليل من شأن حمولة S. aureus داخل الخلايا. تصف هذه الورقة بالتفصيل كيف يمكن استخدام وكالة حماية البيئة لتحديد حمولة S. aureus داخل الخلايا وقياس الفعالية داخل الخلايا لمركبات مضادات الميكروبات باستخدام نموذج المختبر. وتجدر الإشارة إلى أنه تم اقتراح طريقة بسيطة لتحسين موثوقية التحديد الكمي للأحمال داخل الخلايا عن طريق تجنب الغسل المكثف.

Protocol

1. ثقافة الخلايا الظهارية البشرية

  1. إعداد المتوسطة ثقافة كاملة مع دولبيكو تعديل النسر المتوسط (DMEM) ارتفاع الجلوكوز مع فينول الأحمر, تستكمل مع 10٪ مصل البقر الجنين (FBS) دون المضادات الحيوية.
  2. تنمو الخلايا الظهارية A549 في وسط ثقافة كاملة في 36 ± 1 درجة مئوية في 5٪ CO2. ضمان استخدام وعاء ثقافة مناسب الحجم ليكون لديه خلايا كافية للخطوات اللاحقة (انظر الخطوة 1.10).
    ملاحظة: قارورة واحدة بحجم 75 سم2 (T-75) كافية لزرع صفيحتين من 24 بئرا وزراعة الخلايا الفرعية.
  3. قبل يومين من العدوى، قم بإعداد طبق واحد من 24 بئرا.
  4. إزالة وتجاهل المتوسطة الثقافة المستهلكة من قارورة T-75 وغسل الخلايا مرة واحدة مع 10 مل من المالحة الفوسفات المخزنة بالفوسفات (DPBS).
  5. إضافة 5 مل من تريبسين-EDTA واحتضان الخلايا لمدة 5 دقائق في 36 ± 1 درجة مئوية في 5٪ CO2.
  6. إضافة 5 مل من الثقافة كاملة المتوسطة ونقل الخلايا إلى أنبوب.
  7. الطرد المركزي الخلايا لمدة 5 دقائق في 300 × غرام.
  8. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق الخلايا في 10 مل من المتوسطة ثقافة كاملة جديدة.
  9. عد الخلايا باستخدام عداد خلايا تلقائي (أو غرفة عد).
  10. تمييع الخلايا في وسط الثقافة الكاملة لإعداد 30 مل من تعليق الخلية بتركيز 2.0 × 105 خلايا / مل.
  11. أضف 1 مل من تعليق الخلية إلى كل بئر من لوحة 24 بئرا ، والتي تتوافق مع كثافة الخلية التي تبلغ حوالي 1.0 × 105 خلية / سم² لمساحة بئر تبلغ 2 سم².
  12. احتضان الخلايا لمدة 48 ساعة في 36 ± 1 درجة مئوية في 5٪ CO2 حتى تصل إلى التقاء 100٪.
    ملاحظة: بالإضافة إلى الشروط التي سيتم اختبارها، ينبغي حجز ثلاثة آبار للخلايا التي تعتمد على يوم العدوى (انظر الخطوة 3-1-4). وفقا لعدد الشروط التي سيتم اختبارها ، يمكن إعداد ما يصل إلى لوحتين من 24 بئرا في وقت واحد. وينبغي زيادة الكميات المشار إليها في البروتوكول وفقا لذلك.

2. ثقافة سلالات S. أوريوس

  1. قبل يومين من العدوى، وإعداد المتوسطة العدوى كاملة مع DMEM الجلوكوز عالية دون فينول الأحمر، وتكمل مع 10٪ FBS دون المضادات الحيوية.
  2. تذوب س. سلالات أوريوس ليتم اختبارها على لوحات أجار.
  3. احتضان لوحات أجار لمدة 18-24 ساعة في 36 ± 1 درجة مئوية.
  4. في اليوم السابق للتلقيح، تلقيح مستعمرة واحدة من سلالة S. aureus ليتم اختبارها في 10 مل من متوسط العدوى الكاملة.
  5. احتضان البكتيريا لمدة 18-24 ساعة في 36 ± 1 درجة مئوية مع اهتزاز في 160 دورة في الدقيقة. استخدام أنابيب 50 مل عقد في 45° لتجنب استقرار البكتيريا.
    ملاحظة: قبل البدء بسلالة جديدة، يوصى بالتحقق من قابلية اليسوستافين في نفس ظروف الثقافة التي سيتم استخدامها لإجراء المزيد من التجارب (الوسائط، الأحمال البكتيرية، وتركيز الليسوستافين ووقت الحضانة). من المهم أيضا تحديد الحمل البكتيري المقابل ل OD600nm من 0.5 لأنه يمكن أن يختلف قليلا من سلالة إلى أخرى. ويمكن تكييف الظروف الثقافية للسلالات البكتيرية وفقا للهدف التجريبي.

3. العدوى المقايسة مع S. أوريوس

  1. تحديد كثافة الخلية وقابليتها للاستدامة
    1. إزالة وتجاهل المتوسطة الثقافة المستهلكة من الآبار الثلاثة المخصصة لعد خلايا A549.
    2. إضافة 1 مل من المتوسطة العدوى كاملة تحتوي على 5 ميكروغرام / مل من Hoechst 33342 و 1 ميكروغرام / مل من يوديد البروبيديوم.
      ملاحظة: Hoechst 33342 هو mutagen معروفة وينبغي التعامل معها بعناية. يجب التعامل مع يوديد البروبيديوم ، وهو مغفل محتمل ، بعناية والتخلص منه بأمان وفقا للوائح المعمول بها.
    3. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في 36 ± 1 درجة مئوية في 5٪ CO2.
    4. عد رقم الخلية وحساب صلاحية الخلية باستخدام مجهر مضان حقل الفيتو.
      ملاحظة: إذا لم يتوفر مجهر مضان، يمكن حساب كثافة الخلية وقابليتها للحياة باستخدام تلطيخ أزرق مثقب باستخدام غرفة عد الخلايا.
  2. إعداد التعليق البكتيري
    1. الاستغناء عن 25 مل من المتوسط العدوى كاملة في أنبوب وقبل الحارة في 36 ± 1 درجة مئوية.
    2. ضبط تعليق S. أوريوس إلى anOD600nm من 0.5 في المتوسط العدوى كاملة باستخدام متر كثافة الخلية.
    3. إعداد 20 مل من التعليق البكتيري لتطعيم الخلايا عن طريق تخفيف 0.5 OD600nm في المتوسط العدوى الكاملة لتحقيق تعدد العدوى (MOI) من 1 وفقا لعدد الخلايا لكل بئر.
      ملاحظة: يتوافق MOI مع عدد البكتيريا المضافة لكل خلية في كل بئر. على سبيل المثال، لتحقيق MOI من 1 مع 1.0 × 106 خلايا لكل بئر، وإعداد تعليق البكتيرية في 2.0 × 106 CFU/mL بحيث يمكن إضافة 106 CFU في حجم 500 ميكرولتر (انظر الخطوة 3.3.3). يمكن تعديل وزارة الداخلية وفقا لأنواع الخلايا والسلالات البكتيرية التي سيتم اختبارها.
    4. استخدام لوحة حلزونية أوتوماتيكية لتحديد حمولة S. أوريوس من تعليق البكتيرية المخفف لاستخدامها في خطوة تلقيح الخلية.
    5. احتضان لوحات أجار لمدة 18-24 ساعة في 36 ± 1 درجة مئوية.
    6. في اليوم التالي، عد عدد المستعمرات مع عداد مستعمرة لحساب وزارة الداخلية دقيقة لكل سلالة اختبارها.
      ملاحظة: إذا لم يتوفر لوحة حلزونية أوتوماتيكية، يمكن تحديد الحمل البكتيري عن طريق التخفيف التسلسلي على لوحة أجار. انظر الدليل التحليلي البكتريولوجي للحصول على تفاصيل14.
  3. تلقيح الخلايا
    1. مراقبة كل بئر من لوحة 24 جيدا عن طريق المجهر التكبير منخفضة لضمان أن الخلايا صحية وتنمو كما هو متوقع.
    2. إزالة وتجاهل المتوسطة ثقافة الخلية المستهلكة من لوحة 24 جيدا.
    3. إضافة 500 ميكرولتر من التعليق البكتيري للتلقيح إلى كل بئر مع خلايا التقاء 100٪.
    4. احتضان الخلايا لمدة 2 ساعة في 36 ± 1 درجة مئوية و 5٪ CO2.
      ملاحظة: يوصى باستخدام ثلاثة آبار من اللوحة لكل حالة يتم اختبارها (ثلاثية المستويات) وإجراء ثلاث تجارب مستقلة على الأقل. ويمكن تكييف تأخير الحضانة وفقا للهدف التجريبي.
  4. تحديد كمي للبكتيريا داخل الخلايا مع تحسين فحص حماية الإنزيم (iEPA)
    1. إعداد 7 مل من العازلة تحلل 4x مع 3.5 مل من 2٪ تريتون X-100 في الماء العقيم و 3.5 مل من تريبسين-EDTA.
    2. إعداد محلول مخزون اليسوستافين في 10 ملغم / مل في عازلة خلات وaliquot 25 ميكرولتر في cryovials. يخزن عند -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
    3. إعداد 250 ميكرولتر من محلول عمل اليسوستافين الطازجة في 1 ملغ / مل عن طريق خلط 25 ميكرولتر من محلول مخزون اليسوستافين (10 ملغم / مل) و 225 ميكرولتر من 0.1 M تريس-HCl. يخزن عند درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 48 ساعة.
    4. إعداد 6.25 مل من المتوسط عدوى كاملة تستكمل مع اليسوستافين بإضافة 6 مل من المتوسطة العدوى الكاملة إلى 250 ميكرولتر من محلول عمل اليسوستافين.
    5. إضافة 250 ميكرولتر من المتوسط العدوى كاملة تكملها مع اليسوستافين في كل بئر وتهيج بلطف لوحة عن طريق الدوران لوحة باليد.
    6. احتضان الخلايا لمدة 1 ساعة في 36 ± 1 درجة مئوية في 5٪ CO2 للسماح للليسوستافين قتل البكتيريا خارج الخلية.
    7. في نهاية وقت الحضانة، أضف 10 ميكرولتر من البروتين K بمعدل 20 ملغم/مل في كل بئر لتثبيط الليسوستافين.
    8. احتضان الخلايا لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    9. إضافة 250 ميكرولتر من العازلة تحلل 4x لتحلل الخلايا عن طريق صدمة التناضح.
    10. احتضان الخلايا لمدة 10 دقائق في 36 ± 1 درجة مئوية.
    11. مزيج جيدا عن طريق pipetting صعودا وهبوطا عشر مرات في جميع أنحاء الجزء السفلي من البئر لضمان أن يتم lysed الخلايا تماما ومتجانسة.
    12. استخدام لوحة حلزونية التلقائي لتحديد حمولة S. أوريوس من كل بئر.
    13. احتضان لوحات أجار لمدة 18-24 ساعة في 36 ± 1 درجة مئوية.
    14. في اليوم التالي، عد عدد المستعمرات مع عداد مستعمرة لحساب حمولة S. aureus داخل الخلية من كل بئر.
  5. قياس الفعالية داخل الخلايا للمركبات المضادة للميكروبات مع اختبار حماية الإنزيم (EPA)
    1. إعداد 25 مل من العازلة تحلل 1x مع 3.125 مل من 2٪ تريتون X-100 في الماء العقيم، 6.25 مل من تريبسين-EDTA، و 15.625 مل من الماء العقيم.
    2. إعداد 250 ميكرولتر من محلول عمل اليسوستافين الطازجة في 1 ملغ / مل عن طريق خلط 25 ميكرولتر من محلول مخزون اليسوستافين (10 ملغم / مل) و 225 ميكرولتر من 0.1 M تريس-HCl.
    3. إعداد 25 مل من المتوسطة العدوى كاملة تستكمل مع اليسوستافين بإضافة 24.75 مل من المتوسطة العدوى الكاملة إلى 250 ميكرولتر من محلول عمل اليسوستافين.
    4. لكل مركب مضاد للميكروبات ليتم اختباره، قم بإعداد 3.1 مل من متوسط العدوى الكامل المكمل بالليسوستافين ومركب مضادات الميكروبات عند التركيز الذي سيتم دراسته.
    5. إزالة وتجاهل المتوسطة ثقافة الخلية المستهلكة من لوحة 24 جيدا.
    6. إضافة 1 مل من المتوسطة العدوى كاملة تكملها مع اليسوستافين.
    7. احتضان الخلايا لمدة 1 ساعة في 36 ± 1 درجة مئوية في 5٪ CO2 للسماح للليسوستافين قتل البكتيريا خارج الخلية.
    8. إزالة والتخلص من المتوسطة تكملها مع اليسوستافين من لوحة 24 جيدا.
    9. ملء ثلاثة آبار مع 1 مل من المتوسطة تكملها الليسوستافين بالإضافة إلى مركب مضاد للميكروبات ليتم اختبارها.
    10. كرر الخطوة 3.5.9 لكل مركب مضاد للميكروبات ليتم اختباره.
    11. لحالة التحكم، املأ ثلاثة آبار ب 1 مل من المتوسطة المكملة بالليسوستافين دون أي مركب مضاد للميكروبات.
    12. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة في 36 ± 1 درجة مئوية في 5٪ CO2.
    13. في نهاية فترة الحضانة، قم بإزالة وتجاهل الوسط المستهلك واغسل كل بئر بلطف ثلاث مرات مع DPBS معقمة مع CaCl2 و MgCl2.
    14. إضافة 1 مل من العازلة تحلل 1x إلى كل بئر لفصل وlyse الخلايا عن طريق صدمة التناضح.
    15. احتضان الخلايا لمدة 10 دقائق في 36 ± 1 درجة مئوية.
    16. تخلط جيدا عن طريق pipetting صعودا وهبوطا عشر مرات في جميع أنحاء البئر لضمان أن يتم lysed الخلايا تماما ومتجانسة.
    17. استخدام لوحة حلزونية التلقائي لتحديد حمولة S. أوريوس من كل بئر.
    18. احتضان لوحات أجار لمدة 18-24 ساعة في 36 ± 1 درجة مئوية.
    19. في اليوم التالي، عد عدد المستعمرات مع عداد مستعمرة لحساب حمولة S. aureus داخل الخلية من كل بئر.
      ملاحظة: يجب حساب النشاط داخل الخلايا لكل مركب مضاد للميكروبات وفقا للعبء البكتيري لحالة التحكم. من المهم أيضا التحقق من السمية الخلوية لجميع مركبات مضادات الميكروبات لإثبات أن الاختلافات الملاحظة بين التحكم والمركبات ليست بسبب موت الخلية.

Representative Results

يتم تصوير نتائج استيعاب S. aureus بواسطة الخلايا الظهارية A549 في الشكل 1A. تم تلقيح خلايا A549 مع S. aureus SF8300 WT و SF8300 ΔfnbA /B ، والتي تفتقر إلى البروتينات الملزمة للفيبرونيتين A و B ، في وزارة الداخلية من 1 لمدة 2 ساعة. لتدمير خارج الخلية S. أوريوس, تمت إضافة الليسوستافين إلى وسط الثقافة, وتم احتضان الخلايا ل 1 ح. بعد ذلك ، تمت إزالة اليسوستاوستافين إما عن طريق الغسيل لوكالة حماية البيئة أو تعطيلها مع البروتين K ل iEPA. ثم تعطلت الخلايا في عازل التحلل ، وتم قياس الحمل البكتيري كميا حسب الثقافة. باستخدام وكالة حماية البيئة، كان متوسط الأحمال داخل الخلايا 4.46 و 0.49 سجل CFU/mL لSF8300 WT و SF8300 ΔfnbA/B، على التوالي (الشكل 1A، القضبان الخضراء). باستخدام iEPA، كان متوسط الأحمال داخل الخلايا 4.53 و 0.56 سجل CFU/mL لSF8300 WT و SF8300 ΔfnbA/B، على التوالي (الشكل 1A، القضبان الحمراء). ومن المثير للاهتمام أن نلاحظ أن كل من وكالة حماية البيئة و iEPA أظهرت نتائج مماثلة، والتي يمكن تفسيرها من خلال سهولة أداء يغسل عندما تكون الخلايا في حالة جيدة ولأن السمية الخلوية الناجمة عن S. أوريوس منخفضة جدا في هذه الإعدادات التجريبية (البيانات غير مبين).

يتم تصوير نتائج النشاط داخل الخلايا من فانكومايسين, ريفامبيسين, وليفوفلوكساسين ضد S. أوريوس في الشكل 1B. لقياس النشاط داخل الخلايا لهذه المضادات الحيوية، تم تلقيح خلايا HaCaT مع S. aureus ATCC 29213 في وزارة الداخلية من 1 لمدة 2 ساعة. تم احتضان الخلايا بالليسوستافين ، مع أو بدون مركبات مضادات الميكروبات التي سيتم اختبارها ، لمدة 24 ساعة. بعد ذلك ، تمت إزالة اليسوستافين والمركبات المضادة للميكروبات عن طريق الغسيل. تعطلت الخلايا في عازل التحلل ، وتم قياس الحمل البكتيري كميا حسب الثقافة. وكان متوسط الأحمال داخل الخلايا 4.57، 4.51، 3.03، و 2.91 سجل CFU/mL للسيطرة، فانكومايسين (50 ميكروغرام / مل)، ريفامبيسين (7 ميكروغرام / مل)، ويفوفلوكساسين (10 ميكروغرام / مل)، على التوالي (الشكل 1B).

Figure 1
الشكل 1: الحمل المكورات العنقودية الأبهرية داخل الخلايا في الخلايا الظهارية. (أ) فحص حماية الإنزيم (القضبان الخضراء) وتحسين فحص حماية الإنزيم (القضبان الحمراء) في الخلايا A549 المصابة ب S. aureus SF8300 WT و ΔfnbA/B. (B) النشاط داخل الخلايا للمركبات المضادة للميكروبات في خلايا HaCaT المصابة ب S. ATCC 29213. تمثل الأشرطة القيم المتوسطة لثلاث تجارب مستقلة يتم إجراؤها بثلاث نسخ. تمثل أشرطة الخطأ الانحرافات المعيارية. ص < 0.0001. الاختصارات: Ctrl = عنصر التحكم; cfu = وحدات تشكيل المستعمرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

إن المقايسات الموصوفة هنا قيمة لدراسة مدى الاستيعاب والبقاء داخل الخلايا ل S. aureus في NPPCs ، وكذلك الفعالية داخل الخلايا للمركبات المضادة للميكروبات6،15،16. يمكن أن تكون بعض الخطوات في كلا البروتوكولين الفحص حرجة. يجب التحكم في الحالة الصحية وكثافة الخلايا بشكل مثالي ومتسقة بين التجارب المستقلة. يجب أن تكون inoculum البكتيرية موحدة بعناية للحصول على MOI الحقيقي على مقربة من وزارة الداخلية النظرية المستهدفة. بشكل عام، يجب الحرص على عدم فصل أي من الخلايا أثناء الأنابيب. يغسل لإزالة اليسوستافين والمضادات الحيوية هي خطوات حاسمة في وكالة حماية البيئة. تم العثور على استخدام البروتين K لتحسين هذه الخطوة عندما لا يتم استخدام المضادات الحيوية (انظر أدناه). أخيرا وليس آخرا، يجب فصل الخلايا تماما في كل بئر ومتجانسة تماما بعد الحضانة مع العازلة تحلل لتحديد موثوق الحمل S. أوريوس داخل الخلايا.

في بعض الحالات، قد تواجه مشكلات، ويجب التحقق من عدة نقاط أولا. في حالة عدم الإعادة إنتاجها ، يجب أن يوضع في الاعتبار أن S. aureus يمكن أن تشكل كتلا ، مما يجعل القياس الكمي عن طريق الامتصاص غير دقيق. يمكن زيادة تكتل البكتيريا عن طريق الطرد المركزي وخطوات الغسيل إذا كان سيتم استبدال وسيط الثقافة (على سبيل المثال ، للقضاء على البروتين المفرز). يجب استخدام التعليق البكتيري بسرعة لأن البكتيريا تستمر في النمو في درجة حرارة الغرفة. يمكن أن تنخفض فعالية اليسوستافين بسبب ظروف التخزين غير الصحيحة ، وhh دون المستوى الأمثل لنشاط الإنزيم في وسائل الإعلام الثقافية ، والتباين في النشاط الأنزيمي بين الدفعات ومقدمي الخدمات ، وعدم وجود حساسية اليسوستاوستافين لبعض السلالات في ظروف نمو محددة. فينول الأحمر يمكن أن يكون لها تأثير البكتيريا طفيف، وخصوصا عندما يكون متوسط الثقافة فقيرة نسبيا في المواد الغذائية بالمقارنة مع مرق نموذجي المستخدمة لزراعة البكتيريا. وهكذا، فإنه من المستحسن استخدام خلية ثقافة المتوسطة دون فينول الأحمر، الذي يحسن أيضا الملاحظات المجهرية الفلورية عن طريق الحد من الضوضاء الخلفية.

على الرغم من أن هذه الطريقة هي أداة قيمة لدراسة المصير داخل الخلايا من سلالات مختلفة، وينبغي النظر في بعض حدود الأسلوب. ويمكن أن يؤدي استخدام وزارة الداخلية العالية جدا إلى إثقال قدرة الأجهزة النووية على الاستيعاب وتسوية الاختلافات بين السلالات المختلفة التي تم اختبارها. يمكن التقليل من مدى استيعاب السلالات الأكثر السامة للخلايا لأن الليسوستافين (أو المضادات الحيوية) يدمر بسرعة S. aureus التي يتم إطلاقها بواسطة الخلايا التالفة. وهكذا، فإن التجارب ذات المدد الممتدة (أي لدراسة البقاء على قيد الحياة داخل الخلايا أو النشاط داخل الخلايا للمضادات الحيوية) أسهل في الإعداد مع سلالات ذات سمية خلوية منخفضة. لذلك ، يجب تعديل وقت الحضانة و MOI بدقة وفقا لضراوة السلالة ونوع الخلية والهدف التجريبي.

الطريقة الموصوفة هنا مع استخدام الليسوستافين أكثر موثوقية من تلك التي تستند إلى جنتاميسين لأنه ، على عكس الليسوستافين ، يميل جنتاميسين إلى أن يتم استيعابه من قبل الخلايا المضيفة13. الميزة الأخرى هي إمكانية تعطيل ال ليسوستافين. وأبلغ كيم وآخرون 13 عن تثبيط نشاط اليسوستافين باستخدام EDTA لتغلي أيونات الزنك أو 110 فينانثيرولين؛ ومع ذلك ، لا تزال هناك حاجة إلى يغسل مكثفة لإزالة الانزيم قبل طلاء البكتيريا. هنا، بروتيناز K تمكن من تعطيل سريع من اليسوستافين. لاحظنا أن الخلايا تميل إلى الانفصال عن لوحة الثقافة عندما تصاب بشدة بسبب تكاثر S. aureus داخل الخلايا. من خلال تخطي خطوة الغسيل النهائية ، فإن طريقة iEPA تبسيط المعالجة التقنية بشكل كبير وتمكين استرداد البكتيريا الداخلية في الخلايا الملتصقة بشكل فضفاض أو المنفصلة بالفعل.

كما ساعدت الكواشف والمخازن المؤقتة الأكثر تركيزا المستخدمة في iEPA في تقليل جهد الأنابيب وتقليل فقدان الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام iEPA مع الخلايا في التعليق، وكذلك مع organoids التي يصعب غسلها. في الختام، تمكن مقايسات حماية الإنزيم من دراسة مدى الاستيعاب والمصير داخل الخلايا ل S. aureus، وكذلك النشاط داخل الخلايا للأدوية المضادة للميكروبات ذات النماذج المختبرية المختلفة. وينبغي إدخال تحسينات على تحسين توصيف العلاقة بين الاستيعاب والسمية الخلوية لتقدير أفضل لأهمية تطوير الأدوية القادرة على الوصول إلى S. أوريوس داخل الخلية.

Disclosures

ولا يوجد لدى صاحبي البلاغ تضارب في المصالح يعلنانه.

Acknowledgments

S. سلالات أوريوس SF8300 WT وSF8300 ΔfnbA/B كانت موهوبة بسخاء من قبل البروفيسور بينه ديب (جامعة كاليفورنيا، سان فرانسيسكو، الولايات المتحدة الأمريكية). وقد دعم هذا العمل منحة من جمعية فينوفي (#AO13 FINOVI) تحت رعاية مؤسسة جامعة ليون.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well plate CORNING-FALCON 353047
A549 cell line ATCC CCL-185
Acetate buffer solution pH 4.6 Fluka 31048 Used to prepare lysostpahine stock solution at 10 mg/mL in 20 mM sodium acetate.
AMBICIN (Recombinant lysostaphin) AMBI LSPN-50 Lyophilized recominant lysostaphin. Freeze at -80 °C for long-term storage.
COS - Colombia agar + 5% sheep blood Biomerieux 43049 Any agar plate suitable for growing staphylococci can be used instead.
Densitometer WPA CO8000 Biochrom Ltd. 80-3000-45 Cell density meter
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose with phenol red Sigma-Aldrich D6429
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose without phenol red Sigma-Aldrich D1145
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline with MgCl2 and CaCl2, sterile-filtered Sigma-Aldrich D8662
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline, sterile-filtered Sigma-Aldrich D8537
Easyspiral dilute Interscience 414000 Automatic diluter and spiral plater
Fetal bovine serum Gibco 10270-106
HaCaT cell line Cell lines service (CLS) 300493
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water Fisher scientific 11534886
Propidium iodide, 1.0 mg/mL solution in water Invitrogen P3566
Proteinase K, recombinant 20 mg/mL Eurobio GEXPRK01-B5 > 30 U/mg, lot 901727
Scan 4000 Interscience 438000 Automatic colony counter
Sterile water OTEC 600500
T-75 culture flask CORNING-FALCON 353136
TC20 Automated cell counter Biorad 1450102 Automatic cell counter
Tris 1 M pH 8.0 Invitrogen AM9855G Used to prepare lysostaphine working solution at 1 mg/mL in 0.1 M Tris-HCl.
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Trypsin - EDTA solution Sigma-Aldrich T3924 0.05% porcine trypsin and 0.02% EDTA in Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red
Wide-field fluorescence microscope Nikon Ti2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Verhoeven, P. O., et al. Detection and clinical relevance of Staphylococcus aureus nasal carriage: an update. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 12 (1), 75-89 (2014).
  2. Gagnaire, J., et al. Epidemiology and clinical relevance of Staphylococcus aureus intestinal carriage: a systematic review and meta-analysis. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 15 (8), 767-785 (2017).
  3. Tong, S. Y. C., Davis, J. S., Eichenberger, E., Holland, T. L., Fowler, V. G. Staphylococcus aureus infections: epidemiology, pathophysiology, clinical manifestations, and management. Clinical Microbiology Reviews. 28 (3), 603-661 (2015).
  4. Josse, J., Laurent, F., Diot, A. Staphylococcal adhesion and host cell invasion: fibronectin-binding and other mechanisms. Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).
  5. Hanssen, A. -M., et al. Localization of Staphylococcus aureus in tissue from the nasal vestibule in healthy carriers. BMC Microbiology. 17 (1), 89 (2017).
  6. Rigaill, J., et al. Evaluation of the intracellular efficacy of antimicrobial agents used for Staphylococcus aureus decolonization in a cell model mimicking nasal colonization. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 73 (11), 3044-3048 (2018).
  7. Yang, D., et al. Novel insights into Staphylococcus aureus deep bone infections: the Involvement of osteocytes. mBio. 9 (2), 00415-00418 (2018).
  8. Tuchscherr, L., et al. Staphylococcus aureus phenotype switching: an effective bacterial strategy to escape host immune response and establish a chronic infection. EMBO Molecular Medicine. 3 (3), 129-141 (2011).
  9. Valour, F., et al. Antimicrobial activity against intraosteoblastic Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (4), 2029-2036 (2015).
  10. Proctor, R. A., Prendergast, E., Mosher, D. F. Fibronectin mediates attachment of Staphylococcus aureus to human neutrophils. Blood. 59 (4), 681-687 (1982).
  11. Climo, M. W., Ehlert, K., Archer, G. L. Mechanism and suppression of lysostaphin resistance in oxacillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (5), 1431-1437 (2001).
  12. Bur, S., Preissner, K. T., Herrmann, M., Bischoff, M. The Staphylococcus aureus extracellular adherence protein promotes bacterial internalisation by keratinocytes independent of fibronectin-binding proteins. Journal of Investigative Dermatology. 133 (8), 2004-2012 (2013).
  13. Kim, J. -H., Chaurasia, A. K., Batool, N., Ko, K. S., Kim, K. K. Alternative enzyme protection assay to overcome the drawbacks of the gentamicin protection assay for measuring entry and intracellular survival of Staphylococci. Infection and Immunity. 87 (5), 00119 (2019).
  14. Maturin, L., Peeler, J. T. Aerobic plate count. Bacteriological Analytical Manual., Edition 8, Revision A. 3, Available from: https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-3-aerobic-plate-count 3 (2021).
  15. Kolenda, C., et al. Evaluation of the activity of a combination of three bacteriophages alone or in association with antibiotics on Staphylococcus aureus embedded in biofilm or internalized in Osteoblasts. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (3), 02231 (2020).
  16. Abad, L., et al. Antibiofilm and intraosteoblastic activities of rifamycins against Staphylococcus aureus: promising in vitro profile of rifabutin. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 75 (6), 1466-1473 (2020).

Tags

علم الأحياء، العدد 175،

Erratum

Formal Correction: Erratum: Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds
Posted by JoVE Editors on 01/19/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds. One of the affiliations was updated.

The fifth affiliation was updated from:

Département de Bactériologie, Institut des Agents Infectieux, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France

to:

Department of Bacteriology, Institute for Infectious Agents, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France 

تحسين فحص حماية الإنزيم لدراسة استوعب المكورات <em>العنقودية</em> والفعالية داخل الخلايا للمركبات المضادة للميكروبات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rigaill, J., Audoux, E., Rodriguez,… More

Rigaill, J., Audoux, E., Rodriguez, K., Peyron, A., Berthelot, P., Josse, J., Laurent, F., Caire, R., Verhoeven, P. O. Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds. J. Vis. Exp. (175), e62903, doi:10.3791/62903 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter