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बेहतर एंजाइम संरक्षण परख अध्ययन Staphylococcus aureus Internalization और रोगाणुरोधी यौगिकों की इंट्रासेल्युलर प्रभावकारिता

Published: September 8, 2021 doi: 10.3791/62903
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1,3, 4,5, 4,5, 1, 1,2
1CIRI, Centre International de Recherche en Infectiologie, GIMAP team, University of Lyon, INSERM U1111, CNRS, UMR5308, ENS Lyon, UCBL1, University of St-Etienne, France, 2Department of Infectious Agents and Hygiene, University Hospital of St-Etienne, St-Etienne, France, 3Department of Infectious Diseases, University Hospital of St-Etienne, St-Etienne, France, 4CIRI, Centre International de Recherche en Infectiologie, Staphylococcal Pathogenesis team, University of Lyon, INSERM U1111, CNRS UMR5308, ENS Lyon, UCBL1, University of Lyon, Lyon, France, 5Department of Bacteriology, Institute for Infectious Agents, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य यह वर्णन करना है कि स्टैफिलोकोकस ऑरियस आंतरिककरण की सीमा और मानव मेजबान सेल के अंदर जीवित रहने की इसकी क्षमता, साथ ही साथ रोगाणुरोधी यौगिकों की इंट्रासेल्युलर प्रभावकारिता का अध्ययन कैसे किया जाए।

Abstract

Staphylococcus aureus यूकेरियोट कोशिकाओं में अपने आंतरिककरण को ट्रिगर करने और विभिन्न उपकोशिकीय डिब्बों के अंदर जीवित रहने के लिए वायरस कारकों को व्यक्त करता है। यह पेपर एक एंजाइम संरक्षण परख का वर्णन करता है एस ऑरियस आंतरिककरण की सीमा और अनुयायी गैर-पेशेवर फागोसाइटिक कोशिकाओं (एनपीपीसी) के साथ-साथ रोगाणुरोधी यौगिकों की इंट्रासेल्युलर प्रभावकारिता में इसके इंट्रासेल्युलर अस्तित्व का अध्ययन करने के लिए। एनपीपीसी को एक बहु-अच्छी तरह से प्लेट में उगाया जाता है जब तक कि वे 100% संगम तक नहीं पहुंच जाते। एस ऑरियस संस्कृतियों को सेल संस्कृति माध्यम में रातोंरात उगाया जाता है। संक्रमण की नियंत्रित बहुलता पर कोशिकाओं को टीका लगाने के लिए प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं की संख्या के अनुसार बैक्टीरियल निलंबन को पतला किया जाता है। संक्रमित कोशिकाओं को एनपीपीसी द्वारा बैक्टीरिया को आंतरिक बनाने की अनुमति देने के लिए 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया जाता है, जिसके बाद लाइसोस्टॉफिन को चुनिंदा रूप से बाह्य कोशिकीय बैक्टीरिया को मारने के लिए संस्कृति माध्यम में जोड़ा जाता है। Lysostaphin प्रयोग के बाकी हिस्सों के लिए संस्कृति माध्यम में मौजूद है।

इस बिंदु पर, संक्रमित कोशिकाओं को एस ऑरियस के खिलाफ उनकी इंट्रासेल्युलर गतिविधियों का आकलन करने के लिए रोगाणुरोधी यौगिकों के साथ ऊष्मायन किया जा सकता है। इसके बाद, दवाओं को हटाने के लिए कोशिकाओं को तीन बार धोया जाता है, और इंट्रासेल्युलर एस ऑरियस लोड को तब अगर प्लेटों पर खेती करके परिमाणित किया जाता है। वैकल्पिक रूप से, इंट्रासेल्युलर अस्तित्व और सेल विषाक्तता में शामिल स्टैफिलोकोकल वायरस कारकों का अध्ययन करने के लिए, लाइसोस्टैफिन को धोने के चरणों की आवश्यकता को खत्म करने के लिए प्रोटीनेज के के साथ निष्क्रिय किया जा सकता है। यह टिप इंट्रासेल्युलर बैक्टीरियल लोड परिमाणीकरण की विश्वसनीयता में सुधार करती है, खासकर यदि कोशिकाएं संस्कृति प्लेट से अलग हो जाती हैं जब वे इंट्रासेल्युलर एस ऑरियस के गुणन के कारण भारी रूप से संक्रमित हो जाते हैं। इन प्रोटोकॉल का उपयोग लगभग सभी प्रकार के अनुयायी एनपीपीसी के साथ और ऑर्गेनोइड्स जैसे 3 डी सेल कल्चर मॉडल के साथ किया जा सकता है।

Introduction

Staphylococcus aureus एक जीवन-धमकी रोगज़नक़ और त्वचा और म्यूकोसा का एक कॉमेन्सल बैक्टीरिया दोनों है जो दुनिया भर में दो अरब व्यक्तियों का उपनिवेश करता है। मनुष्यों में, एस ऑरियस के नाक वाहक में गाड़ी के अपने स्वयं के तनाव के साथ संक्रमण का खतरा बढ़ जाता है; हालांकि, एस ऑरियस म्यूकोसल गाड़ी के मल्टीफैक्टोरियल निर्धारक अभी भी अस्पष्ट हैं1,2। तीव्र संक्रमण के अलावा, रोगी क्रोनिक एस ऑरियस संक्रमण भी विकसित कर सकते हैं जो अक्सर इलाज के लिए चुनौतीपूर्ण होते हैं3। उपनिवेशीकरण और संक्रमण के दौरान मेजबान-रोगज़नक़ इंटरैक्शन की बेहतर समझ उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों को विकसित करने और रोगी प्रबंधन में सुधार के लिए महत्वपूर्ण है।

इन विट्रो में, एस ऑरियस मेजबान कोशिकाओं में अपने आंतरिककरण को ट्रिगर कर सकता है जो α5π1 integrin4 को व्यक्त करता है। एस ऑरियस, फाइब्रोनेक्टिन की कोशिका दीवार पर लंगर डाले गए स्टैफिलोकोकल फाइब्रोनेक्टिन-बाइंडिंग प्रोटीन के बीच त्रिपक्षीय बातचीत, और मेजबान सेल की सतह पर व्यक्त π1 इंटेग्रिन को एनपीपीसी में एस ऑरियस आंतरिककरण के मुख्य मार्ग के रूप में अच्छी तरह से जाना जाता है जैसे कि केराटिनोसाइट्स, ओस्टियोब्लास्ट्स, फाइब्रोब्लास्ट्स, और उपकला और एंडोथेलियल कोशिकाएं 4। हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि एस ऑरियस नाक उपनिवेशीकरण 5,6 और संक्रमण के दौरान मानव कोशिकाओं के अंदर पाया जा सकता है7। हालांकि, एस ऑरियस संक्रमण के रोगजनन में इंट्रासेल्युलर जलाशय की भूमिका अस्पष्ट बनी हुई है। मेजबान कोशिकाएं एस ऑरियस के लिए एक आश्रय के रूप में कार्य कर सकती हैं, जो प्रतिरक्षा प्रणाली 8 और अधिकांश रोगाणुरोधी यौगिकों 6,9 दोनों से सुरक्षित है।

lysostaphin संरक्षण परख, 1980 के दशक में पहले Proctor10 द्वारा वर्णित, एस aureus आइसोलेट्स के internalization में शामिल जीवाणु और मेजबान कारकों के अध्ययन में सक्षम बनाता है. लाइसोस्टाफिन एक बैक्टीरियोसिन है जो स्टैफिलोकोकस सिमुलन द्वारा उत्पादित है, जो एंटीबायोटिक-प्रतिरोधी उपभेदों सहित लगभग सभी एस ऑरियस आइसोलेट्स के खिलाफ शक्तिशाली गतिविधि प्रदर्शित करता है। Lysostaphin का उपयोग केवल व्यवहार्य इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया की गिनती को सक्षम करने के लिए केवल एक्स्ट्रासेल्युलर एस ऑरियस को नष्ट करने के लिए किया गया है12। इस तकनीक का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है और एस ऑरियस के कई विषाणु कारकों की खोज में योगदान दिया है। Gentamycin, अकेले और lysostaphin के साथ संयुक्त, भी व्यापक रूप से इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है।

हालांकि, हाल के एक अध्ययन से पता चला है कि जेंटामाइसिन यूकेरियोटिक कोशिकाओं में प्रवेश करता है और एक समय और एकाग्रता-निर्भर तरीके से आंतरिक बैक्टीरिया तक पहुंचता है। इस अध्ययन ने यह भी प्रदर्शित किया कि लाइसोस्टाफिन यूकेरियोटिक कोशिकाओं में प्रवेश नहीं करता है, यह पुष्टि करता है कि एक लाइसोस्टाफिन-आधारित एंजाइम सुरक्षा परख (ईपीए) संस्कृति 13 द्वारा इंट्रासेल्युलर एस ऑरियस लोड को मापने के लिए सबसे सटीक परख है। भले ही किस यौगिक का उपयोग बाह्य कोशिकीय बैक्टीरिया (जैसे, लाइसोस्टाफिन या जेंटामाइसिन) को नष्ट करने के लिए किया जाता है, इसे आगर प्लेटों पर इंट्रासेल्युलर एस ऑरियस चढ़ाने से पहले कोशिकाओं को धोकर हटा दिया जाना चाहिए। क्रमिक धोने के परिणामस्वरूप कोशिकाओं की टुकड़ी हो सकती है, विशेष रूप से खराब अनुयायी कोशिकाएं (उदाहरण के लिए, भारी संक्रमित कोशिकाएं), जिससे इंट्रासेल्युलर एस ऑरियस लोड को कम करके आंका जाएगा। यह पेपर विस्तार से वर्णन करता है कि ईपीए का उपयोग इंट्रासेल्युलर एस ऑरियस लोड को मापने और इन विट्रो मॉडल का उपयोग करके रोगाणुरोधी यौगिकों की इंट्रासेल्युलर प्रभावकारिता को मापने के लिए कैसे किया जा सकता है। ध्यान दें, गहन धोने से बचने के द्वारा इंट्रासेल्युलर लोड परिमाणीकरण की विश्वसनीयता में सुधार करने के लिए एक सरल विधि प्रस्तावित की गई है।

Protocol

1. मानव उपकला कोशिकाओं की संस्कृति

  1. Dulbecco के संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) फिनोल लाल के साथ उच्च ग्लूकोज के साथ पूर्ण संस्कृति माध्यम तैयार करें, एंटीबायोटिक दवाओं के बिना 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक।
  2. 5% CO2 में 36 ± 1 °C पर पूर्ण संस्कृति माध्यम में A549 उपकला कोशिकाओं को विकसित करें। बाद के चरणों के लिए पर्याप्त कोशिकाओं के लिए उचित आकार के संस्कृति पोत का उपयोग सुनिश्चित करें (चरण 1.10 देखें)।
    नोट: एक 75 सेमी 2 (टी -75) फ्लास्क दो 24-अच्छी तरह से प्लेटों और कोशिकाओं को उपसंस्कृति बीज करने के लिए पर्याप्त है।
  3. संक्रमण से दो दिन पहले, एक एकल 24-अच्छी तरह से प्लेट तैयार करें।
  4. निकालें और T-75 फ्लास्क से खर्च संस्कृति माध्यम को त्याग दें और Dulbecco's फॉस्फेट-बफ़र्ड खारा (DPBS) के 10 mL के साथ एक बार कोशिकाओं को धोलें।
  5. ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 5 मिलीलीटर जोड़ें और 5% CO2 में 36 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  6. पूर्ण संस्कृति माध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें और कोशिकाओं को एक ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  7. 300 × जी पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं को सेंट्रीफ्यूज करें।
  8. supernatant त्यागें और ताजा पूर्ण संस्कृति माध्यम के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend.
  9. स्वचालित कक्ष काउंटर (या एक गिनती कक्ष) के साथ कक्षों की गणना करें.
  10. 2.0 × 105 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता पर सेल निलंबन के 30 मिलीलीटर तैयार करने के लिए पूर्ण संस्कृति माध्यम में कोशिकाओं को पतला करें।
  11. एक 24-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में सेल निलंबन का 1 मिलीलीटर जोड़ें, जो 2 सेमी² के एक अच्छी तरह से क्षेत्र के लिए लगभग 1.0 × 105 सेल / सेमी² के सेल घनत्व से मेल खाता है।
  12. कोशिकाओं को 5% CO2 में 36 ± 1 °C पर 48 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें जब तक कि वे 100% संगम तक नहीं पहुंच जाते।
    नोट: परीक्षण की जाने वाली शर्तों के अलावा, संक्रमण के दिन सेल गिनती के लिए तीन कुओं को आरक्षित किया जाना चाहिए (चरण 3.1.4 देखें)। परीक्षण की जाने वाली शर्तों की संख्या के अनुसार, दो 24-वेल प्लेटों को एक साथ तैयार किया जा सकता है। प्रोटोकॉल में दर्शाए गए वॉल्यूम को तदनुसार बढ़ाया जाना चाहिए।

2. एस ऑरियस उपभेदों की संस्कृति

  1. संक्रमण से दो दिन पहले, फिनोल लाल के बिना डीएमईएम उच्च ग्लूकोज के साथ पूर्ण संक्रमण माध्यम तैयार करें, एंटीबायोटिक दवाओं के बिना 10% एफबीएस के साथ पूरक।
  2. Thaw एस aureus उपभेदों आगर प्लेटों पर परीक्षण किया जा करने के लिए.
  3. आगर प्लेटों को 36 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर 18-24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. टीकाकरण से एक दिन पहले, एस ऑरियस स्ट्रेन की एक कॉलोनी को पूर्ण संक्रमण माध्यम के 10 मिलीलीटर में परीक्षण करने के लिए टीका लगाएं।
  5. 160 आरपीएम पर मिलाते हुए 36 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर 18-24 घंटे के लिए बैक्टीरिया को इनक्यूबेट करें। बैक्टीरिया बसने से बचने के लिए 45 डिग्री पर आयोजित 50 एमएल ट्यूबों का उपयोग करें।
    नोट: एक नए तनाव के साथ शुरू करने से पहले, संस्कृति की उसी स्थिति में इसकी लाइसोस्टाफिन संवेदनशीलता को सत्यापित करने की सिफारिश की जाती है जिसका उपयोग आगे के प्रयोगों (मीडिया, बैक्टीरियल लोड, और लाइसोस्टाफिन एकाग्रता और इनक्यूबेशन समय) के लिए किया जाएगा। 0.5 के OD600nm के अनुरूप जीवाणु भार को निर्धारित करना भी महत्वपूर्ण है क्योंकि यह एक तनाव से दूसरे में थोड़ा भिन्न हो सकता है। जीवाणु उपभेदों की संस्कृति की स्थिति को प्रयोगात्मक उद्देश्य के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है।

3. एस aureus के साथ संक्रमण परख

  1. सेल घनत्व और व्यवहार्यता का निर्धारण
    1. A549 कोशिकाओं की गिनती के लिए समर्पित तीन कुओं से खर्च किए गए संस्कृति माध्यम को निकालें और छोड़ दें।
    2. होचस्ट 33342 के 5 μg/ mL और प्रोपिडियम आयोडाइड के 1 μg/mL युक्त पूर्ण संक्रमण माध्यम का 1 mL जोड़ें।
      नोट: Hoechst 33342 एक ज्ञात mutagen है और देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए। Propidium आयोडाइड, एक संभावित म्यूटाजेन, को देखभाल के साथ संभाला जाना चाहिए और लागू नियमों के अनुसार सुरक्षित रूप से निपटाया जाना चाहिए।
    3. 5% CO2 में 36 ± 1 °C पर 30 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    4. सेल संख्या की गणना करें और एक संचालित क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर सेल व्यवहार्यता की गणना करें।
      नोट:: यदि एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप उपलब्ध नहीं है, तो सेल घनत्व और व्यवहार्यता एक सेल गिनती कक्ष का उपयोग करके trypan नीले धुंधला के साथ गणना की जा सकती है।
  2. बैक्टीरियल निलंबन की तैयारी
    1. एक ट्यूब में पूर्ण संक्रमण माध्यम के 25 मिलीलीटर वितरित करें और 36 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व-गर्म करें।
    2. एक सेल घनत्व मीटर का उपयोग कर पूर्ण संक्रमण माध्यम में 0.5 के anOD600nm के लिए S. aureus निलंबन समायोजित करें।
    3. प्रति अच्छी तरह से कोशिकाओं की संख्या के अनुसार 1 के संक्रमण (एमओआई) की बहुलता प्राप्त करने के लिए पूर्ण संक्रमण माध्यम में 0.5 OD600nm को पतला करके सेल इनोक्यूलेशन के लिए 20 मिलीलीटर बैक्टीरियल निलंबन तैयार करें।
      नोट: MOI प्रत्येक अच्छी तरह से प्रति सेल जोड़े गए बैक्टीरिया की संख्या से मेल खाती है। उदाहरण के लिए, 1.0 × 106 कोशिकाओं के साथ 1 का एक MOI प्राप्त करने के लिए, 2.0 × 106 CFU / mL पर एक जीवाणु निलंबन तैयार करें ताकि 106 CFU को 500 μL की मात्रा में जोड़ा जा सके (चरण 3.3.3 देखें)। MOI को परीक्षण किए जाने वाले सेल प्रकारों और जीवाणु उपभेदों के अनुसार समायोजित किया जा सकता है।
    4. सेल इनोक्यूलेशन चरण के लिए उपयोग किए जाने वाले पतले बैक्टीरियल निलंबन के एस ऑरियस लोड को निर्धारित करने के लिए एक स्वचालित सर्पिल प्लेटर का उपयोग करें।
    5. आगर प्लेटों को 36 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर 18-24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    6. अगले दिन, परीक्षण किए गए प्रत्येक तनाव के लिए सटीक एमओआई की गणना करने के लिए कॉलोनी काउंटर के साथ कॉलोनियों की संख्या की गणना करें।
      नोट: यदि कोई स्वचालित सर्पिल प्लेटर उपलब्ध नहीं है, तो बैक्टीरियल लोड को आगर प्लेट पर सीरियल कमजोर पड़ने से निर्धारित किया जा सकता है। विवरण 14 के लिए बैक्टीरियोलॉजिकल विश्लेषणात्मक मैनुअल देखें।
  3. सेल इनोक्यूलेशन
    1. कम आवर्धन माइक्रोस्कोपी द्वारा 24-अच्छी तरह से प्लेट के हर कुएं का निरीक्षण करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि कोशिकाएं स्वस्थ हैं और उम्मीद के अनुसार बढ़ रही हैं।
    2. निकालें और 24-अच्छी तरह से प्लेट से खर्च सेल संस्कृति माध्यम को छोड़ दें।
    3. 100% confluent कोशिकाओं के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से टीका लगाने के लिए जीवाणु निलंबन के 500 μL जोड़ें।
    4. 36 ± 1 डिग्री सेल्सियस और 5% CO2 पर 2 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
      नोट: प्रत्येक स्थिति का परीक्षण करने के लिए प्लेट के तीन कुओं का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है (तीन प्रतियों) और कम से कम तीन स्वतंत्र प्रयोग करने के लिए। इनक्यूबेशन की देरी को प्रयोगात्मक उद्देश्य के अनुसार अनुकूलित किया जा सकता है।
  4. बेहतर एंजाइम संरक्षण परख (iEPA) के साथ इंट्रासेल्युलर बैक्टीरिया का परिमाणीकरण
    1. बाँझ पानी में 2% ट्राइटन एक्स -100 के 3.5 मिलीलीटर और ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 3.5 मिलीलीटर के साथ 4x लाइसिस बफर के 7 एमएल तैयार करें।
    2. एसीटेट बफर में 10 मिलीग्राम / एमएल पर एक लाइसोस्टेफिन स्टॉक समाधान तैयार करें और क्रायोवियल्स में 25 μL को एलीकोट करें। अप करने के लिए 6 महीने के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. लाइसोस्टाफिन स्टॉक समाधान (10 मिलीग्राम / एमएल) के 25 μL और 0.1 M Tris-HCl के 225 μL को मिलाकर 1 mg/mL पर एक ताजा लाइसोस्टाफिन काम करने वाले समाधान का 250 μL तैयार करें। 48 घंटे तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    4. लाइसोस्टैफिन काम करने वाले समाधान के 250 μL में पूर्ण संक्रमण माध्यम के 6 मिलीलीटर को जोड़कर लाइसोस्टैफिन के साथ पूरक पूर्ण संक्रमण माध्यम के 6.25 मिलीलीटर तैयार करें।
    5. प्रत्येक अच्छी तरह से lysostaphin के साथ पूरक पूर्ण संक्रमण माध्यम के 250 μL जोड़ें और धीरे से हाथ से प्लेट swiveling द्वारा प्लेट को उत्तेजित.
    6. 5% CO2 में 36 ± 1 °C पर 1 h के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें ताकि लाइसोस्टाफिन को बाह्य कोशिकीय बैक्टीरिया को मारने दिया जा सके।
    7. इनक्यूबेशन समय के अंत में, लाइसोस्टाफिन को निष्क्रिय करने के लिए प्रत्येक कुएं में 20 मिलीग्राम / एमएल पर प्रोटीनेज के 10 μL जोड़ें।
    8. कमरे के तापमान पर 2 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    9. आसमाटिक सदमे से कोशिकाओं को लाइस करने के लिए 4x लाइसिस बफर के 250 μL जोड़ें।
    10. 36 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    11. यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाएं पूरी तरह से झूठ और homogenized हैं, अच्छी तरह से नीचे दस बार ऊपर और नीचे पिपेट करके अच्छी तरह से मिलाएं।
    12. प्रत्येक अच्छी तरह से एस ऑरियस लोड को निर्धारित करने के लिए एक स्वचालित सर्पिल प्लेटर का उपयोग करें।
    13. आगर प्लेटों को 36 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर 18-24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    14. अगले दिन, प्रत्येक कुएं के इंट्रासेल्युलर एस ऑरियस लोड की गणना करने के लिए कॉलोनी काउंटर के साथ उपनिवेशों की संख्या की गणना करें।
  5. एंजाइम संरक्षण परख (ईपीए) के साथ रोगाणुरोधी यौगिकों की इंट्रासेल्युलर प्रभावकारिता का मापन
    1. बाँझ पानी में 2% ट्राइटन एक्स -100 के 3.125 मिलीलीटर, ट्रिप्सिन-ईडीटीए के 6.25 मिलीलीटर, और बाँझ पानी के 15.625 मिलीलीटर के साथ 1x लाइसिस बफर के 25 एमएल तैयार करें।
    2. एक लाइसोस्टाफिन स्टॉक समाधान (10 मिलीग्राम / एमएल) के 25 μL और 0.1 M Tris-HCl के 225 μL को मिलाकर 1 mg/mL पर एक ताजा लाइसोस्टाफिन काम करने वाले समाधान का 250 μL तैयार करें।
    3. लाइसोस्टाफिन काम करने वाले समाधान के 250 μL करने के लिए पूर्ण संक्रमण माध्यम के 24.75 mL पूर्ण संक्रमण माध्यम को जोड़कर lysostaphin के साथ पूरक पूर्ण संक्रमण माध्यम के 25 mL तैयार करें।
    4. परीक्षण किए जाने वाले प्रत्येक रोगाणुरोधी यौगिक के लिए, अध्ययन किए जाने वाले एकाग्रता पर लाइसोस्टैफिन और रोगाणुरोधी यौगिक के साथ पूरक पूर्ण संक्रमण माध्यम के 3.1 मिलीलीटर तैयार करें।
    5. निकालें और 24-अच्छी तरह से प्लेट से खर्च सेल संस्कृति माध्यम को छोड़ दें।
    6. lysostaphin के साथ पूरक पूर्ण संक्रमण माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें।
    7. 5% CO2 में 36 ± 1 °C पर 1 h के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें ताकि लाइसोस्टाफिन को बाह्य कोशिकीय बैक्टीरिया को मारने दिया जा सके।
    8. निकालें और 24 अच्छी तरह से प्लेट से lysostaphin के साथ पूरक माध्यम को त्याग दें।
    9. लाइसोस्टॉफिन के साथ पूरक माध्यम के 1 मिलीलीटर के साथ तीन कुओं को भरें और परीक्षण किए जाने वाले रोगाणुरोधी यौगिक।
    10. प्रत्येक रोगाणुरोधी यौगिक का परीक्षण करने के लिए चरण 3.5.9 को दोहराएं।
    11. नियंत्रण की स्थिति के लिए, किसी भी रोगाणुरोधी यौगिक के बिना लाइसोस्टाफिन के साथ पूरक मध्यम के 1 एमएल के साथ तीन कुओं को भरें।
    12. 5% CO2 में 36 ± 1 °C पर 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    13. इनक्यूबेशन अवधि के अंत में, खर्च किए गए माध्यम को हटा दें और छोड़ दें और धीरे-धीरे CaCl2 और MgCl2 के साथ बाँझ DPBS के साथ प्रत्येक को तीन बार अच्छी तरह से धोएं।
    14. आसमाटिक सदमे से कोशिकाओं को अलग करने और लाइस करने के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से 1x लाइसिस बफर के 1 एमएल जोड़ें।
    15. 36 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    16. यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाएं पूरी तरह से झूठ और homogenized हैं, सभी पर दस बार ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण।
    17. प्रत्येक अच्छी तरह से एस ऑरियस लोड को निर्धारित करने के लिए एक स्वचालित सर्पिल प्लेटर का उपयोग करें।
    18. आगर प्लेटों को 36 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर 18-24 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    19. अगले दिन, प्रत्येक कुएं के इंट्रासेल्युलर एस ऑरियस लोड की गणना करने के लिए कॉलोनी काउंटर के साथ उपनिवेशों की संख्या की गणना करें।
      नोट: प्रत्येक रोगाणुरोधी यौगिक की इंट्रासेल्युलर गतिविधि की गणना नियंत्रण स्थिति के जीवाणु भार के अनुसार की जानी चाहिए। यह साबित करने के लिए सभी रोगाणुरोधी यौगिकों की साइटोटॉक्सिसिटी की जांच करना भी महत्वपूर्ण है कि नियंत्रण और यौगिकों के बीच देखे गए अंतर कोशिका मृत्यु के कारण नहीं हैं।

Representative Results

A549 उपकला कोशिकाओं द्वारा S. aureus internalization के परिणामों को चित्र 1A में दर्शाया गया है। A549 कोशिकाओं को S. aureus SF8300 WT और SF8300 ΠfnbA/B के साथ संक्रमित किया गया था, जिसमें फाइब्रोनेक्टिन-बाइंडिंग प्रोटीन A और B की कमी होती है, 2 घंटे के लिए 1 के MOI पर। बाह्य कोशिकीय एस ऑरियस को नष्ट करने के लिए, लाइसोस्टाफिन को संस्कृति माध्यम में जोड़ा गया था, और कोशिकाओं को 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट किया गया था। अगला, लाइसोस्टाफिन को या तो ईपीए के लिए धोकर हटा दिया गया था या आईईपीए के लिए प्रोटीनेज के साथ निष्क्रिय कर दिया गया था। फिर, कोशिकाओं को लाइसिस बफर में बाधित किया गया था, और बैक्टीरियल लोड को संस्कृति द्वारा परिमाणित किया गया था। EPA का उपयोग करके, औसत इंट्रासेल्युलर भार SF8300 WT और SF8300 के लिए क्रमशः 4.46 और 0.49 लॉग CFU / mL थे ( चित्रा 1A, हरी सलाखों)। iEPA का उपयोग करते हुए, औसत इंट्रासेल्युलर लोड SF8300 WT और SF8300 के लिए क्रमशः 4.53 और 0.56 लॉग CFU / mL थे ( चित्रा 1A, लाल सलाखों)। यह ध्यान रखना दिलचस्प है कि ईपीए और आईईपीए दोनों ने समान परिणाम दिखाए, जिन्हें कोशिकाओं के अच्छी स्थिति में होने पर धोने की आसानी से समझाया जा सकता है और क्योंकि एस ऑरियस-प्रेरित साइटोटॉक्सिसिटी इन प्रयोगात्मक सेटिंग्स में बहुत कम है (डेटा नहीं दिखाया गया है)।

एस ऑरियस के खिलाफ वैनकोमाइसिन, रिफैम्पिसिन और लेवोफ्लोक्सासिन की इंट्रासेल्युलर गतिविधि के परिणामों को चित्र 1 बी में दर्शाया गया है। इन एंटीबायोटिक दवाओं की इंट्रासेल्युलर गतिविधि को मापने के लिए, HaCaT कोशिकाओं को 2 घंटे के लिए 1 के एमओआई पर एस ऑरियस एटीसीसी 29213 के साथ संक्रमित किया गया था। कोशिकाओं को लाइसोस्टैफिन के साथ इनक्यूबेट किया गया था, रोगाणुरोधी यौगिकों के साथ या बिना परीक्षण किया जाना था, 24 घंटे के लिए। इसके बाद, लाइसोस्टॉफिन और रोगाणुरोधी यौगिकों को धोने से हटा दिया गया था। कोशिकाओं को लाइसिस बफर में बाधित किया गया था, और बैक्टीरियल लोड को संस्कृति द्वारा परिमाणित किया गया था। औसत इंट्रासेल्युलर भार क्रमशः 4.57, 4.51, 3.03, और 2.91 लॉग CFU / mL नियंत्रण के लिए, वैनकोमाइसिन (50 μg / mL), रिफैम्पिसिन (7 μg / mL), और लेवोफ्लोक्सासिन (10 μg / mL), क्रमशः (चित्रा 1 B) थे।

Figure 1
चित्रा 1: उपकला कोशिकाओं में इंट्रासेल्युलर स्टेफिलोकोकस ऑरियस लोड। (A) एंजाइम सुरक्षा परख (हरी सलाखों) और उन्नत एंजाइम संरक्षण परख (लाल सलाखों) A549 कोशिकाओं में S. aureus SF8300 WT और ΠfnbA / B से संक्रमित (B) S. aureus से संक्रमित HaCaT कोशिकाओं में रोगाणुरोधी यौगिकों की इंट्रासेल्युलर गतिविधि ATCC 29213. सलाखों तीन स्वतंत्र प्रयोगों के माध्य मूल्यों का प्रतिनिधित्व करते हैं जो तीन प्रतियों में किए जाते हैं। त्रुटि पट्टियाँ मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं. पी < 0.0001. संक्षेप: Ctrl = नियंत्रण; cfu = कॉलोनी बनाने वाली इकाइयाँ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यहां वर्णित assays आंतरिककरण की सीमा और NPPCs में एस ऑरियस के इंट्रासेल्युलर अस्तित्व का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान हैं, साथ ही साथ रोगाणुरोधी यौगिकों की इंट्रासेल्युलर प्रभावकारिता 6,15,16। दोनों परख प्रोटोकॉल में कुछ कदम महत्वपूर्ण हो सकता है. स्वास्थ्य की स्थिति और कोशिकाओं के घनत्व को स्वतंत्र प्रयोगों के बीच पूरी तरह से नियंत्रित और सुसंगत होना चाहिए। लक्षित सैद्धांतिक एमओआई के करीब एक वास्तविक एमओआई प्राप्त करने के लिए बैक्टीरियल इनोकुलम को सावधानीपूर्वक मानकीकृत किया जाना चाहिए। सामान्य तौर पर, इस बात का ध्यान रखा जाना चाहिए कि पिपेटिंग करते समय किसी भी कोशिका को अलग न किया जाए। लाइसोस्टॉफिन और एंटीबायोटिक दवाओं को हटाने के लिए धोने ईपीए में महत्वपूर्ण कदम हैं। प्रोटीनेज के का उपयोग इस चरण में सुधार करने के लिए पाया गया है जब कोई एंटीबायोटिक का उपयोग नहीं किया जाता है (नीचे देखें)। अंतिम लेकिन कम से कम नहीं, कोशिकाओं को प्रत्येक अच्छी तरह से पूरी तरह से अलग किया जाना चाहिए और एस ऑरियस इंट्रासेल्युलर लोड को मज़बूती से मापने के लिए लाइसिस बफर के साथ इनक्यूबेशन के बाद पूरी तरह से homogenized किया जाना चाहिए।

कुछ उदाहरणों में, समस्याओं का सामना करना पड़ सकता है, और कई बिंदुओं को पहले चेक किया जाना चाहिए। पुनरुत्पादन की कमी के मामले में, यह ध्यान में रखा जाना चाहिए कि एस ऑरियस clumps बना सकते हैं, absorbance गलत द्वारा परिमाणीकरण बना सकते हैं। बैक्टीरिया के clumping centrifugation और धोने के चरणों द्वारा बढ़ाया जा सकता है यदि संस्कृति माध्यम को प्रतिस्थापित किया जाना है (उदाहरण के लिए, एक स्रावित प्रोटीन को खत्म करने के लिए)। बैक्टीरियल सस्पेंशन का तेजी से उपयोग किया जाना चाहिए क्योंकि बैक्टीरिया कमरे के तापमान पर बढ़ते रहते हैं। गलत भंडारण की स्थिति, संस्कृति मीडिया में एंजाइम गतिविधि के लिए सबऑप्टिमल पीएच, बैचों और प्रदाताओं के बीच एंजाइमेटिक गतिविधि में परिवर्तनशीलता, और विशिष्ट विकास की स्थिति में कुछ उपभेदों की लाइसोस्टॉफिन संवेदनशीलता की कमी के कारण लाइसोस्टेफिन प्रभावकारिता कम हो सकती है। फिनोल लाल रंग में थोड़ा बैक्टीरियोस्टेटिक प्रभाव हो सकता है, खासकर जब संस्कृति माध्यम बढ़ते बैक्टीरिया के लिए उपयोग किए जाने वाले विशिष्ट शोरबा की तुलना में पोषक तत्वों में अपेक्षाकृत खराब होता है। इस प्रकार, फिनोल लाल के बिना एक सेल संस्कृति माध्यम का उपयोग करने की सलाह दी जाती है, जो पृष्ठभूमि शोर को कम करके प्रतिदीप्ति सूक्ष्म टिप्पणियों में भी सुधार करता है।

यद्यपि यह विधि विभिन्न उपभेदों के इंट्रासेल्युलर भाग्य का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान उपकरण है, विधि की कुछ सीमाओं पर विचार किया जाना चाहिए। एक बहुत ही उच्च MOI का उपयोग NPPCs द्वारा internalization की क्षमता अधिभार और परीक्षण किए गए विभिन्न उपभेदों के बीच अंतर को स्तर कर सकते हैं। सबसे साइटोटोक्सिक उपभेदों के आंतरिककरण की सीमा को कम करके आंका जा सकता है क्योंकि लाइसोस्टाफिन (या एंटीबायोटिक्स) तेजी से क्षतिग्रस्त कोशिकाओं द्वारा जारी किए जाने वाले एस ऑरियस को नष्ट कर देता है। इस प्रकार, विस्तारित अवधि के साथ प्रयोग (यानी, एंटीबायोटिक दवाओं के इंट्रासेल्युलर अस्तित्व या इंट्रासेल्युलर गतिविधि का अध्ययन करने के लिए) कम साइटोटॉक्सिसिटी के साथ उपभेदों के साथ स्थापित करना आसान है। इसलिए, इनक्यूबेशन समय और MOI को तनाव, सेल प्रकार और प्रयोगात्मक उद्देश्य के अनुसार सटीक रूप से समायोजित किया जाना चाहिए।

लाइसोस्टाफिन के उपयोग के साथ यहां वर्णित विधि जेंटामाइसिन पर आधारित लोगों की तुलना में अधिक विश्वसनीय है क्योंकि, लाइसोस्टाफिन के विपरीत, जेंटामाइसिन मेजबान कोशिकाओं द्वारा आंतरिक हो जाता है13। अन्य लाभ lysostaphin निष्क्रिय करने की संभावना है। Lysostaphin गतिविधि के निषेध किम एट al.13 द्वारा EDTA के उपयोग के साथ जस्ता आयनों या 1,10-phenanthroline chelate करने के लिए सूचित किया गया था; हालांकि, बैक्टीरिया के चढ़ाना से पहले एंजाइम को हटाने के लिए अभी भी गहन वॉश की आवश्यकता होती है। यहां, प्रोटीनेज के लाइसोस्टैफिन की तेजी से निष्क्रियता को सक्षम बनाता है। हमने देखा कि कोशिकाएं संस्कृति प्लेट से अलग हो जाती हैं जब वे इंट्रासेल्युलर एस ऑरियस के गुणन के कारण भारी रूप से संक्रमित हो जाते हैं। अंतिम धोने के चरण को छोड़कर, आईईपीए विधि ने तकनीकी हैंडलिंग को बहुत सरल बना दिया और ढीले अनुयायी या पहले से ही अलग कोशिकाओं में आंतरिक बैक्टीरिया की वसूली को सक्षम किया।

आईईपीए में उपयोग किए जाने वाले अधिक केंद्रित अभिकर्मकों और बफर ने भी पिपेटिंग प्रयास को कम करने और कोशिकाओं के नुकसान को कम करने में मदद की। इसके अलावा, आईईपीए का उपयोग निलंबन में कोशिकाओं के साथ-साथ ऑर्गेनोइड्स के साथ किया जा सकता है जिन्हें धोना मुश्किल है। अंत में, एंजाइम संरक्षण assays internalization की सीमा और एस aureus के इंट्रासेल्युलर भाग्य के अध्ययन को सक्षम करते हैं, साथ ही साथ विभिन्न इन विट्रो मॉडल के साथ रोगाणुरोधी दवाओं की इंट्रासेल्युलर गतिविधि। आंतरिककरण और साइटोटॉक्सिसिटी के बीच संबंधों को बेहतर ढंग से चिह्नित करने के लिए सुधार किए जाने चाहिए ताकि सेल के अंदर एस ऑरियस तक पहुंचने में सक्षम दवाओं के विकास के महत्व की बेहतर सराहना की जा सके।

Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

एस ऑरियस उपभेदों SF8300 WT और SF8300 ΠfnbA / B उदारता से प्रोफेसर Binh Diep (कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय, सैन फ्रांसिस्को, संयुक्त राज्य अमेरिका) द्वारा उपहार में दिए गए थे। इस काम को ल्यों विश्वविद्यालय के लिए फाउंडेशन के तत्वावधान में फिनोवी एसोसिएशन (#AO13 फिनोवीआई) के अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
24-well plate CORNING-FALCON 353047
A549 cell line ATCC CCL-185
Acetate buffer solution pH 4.6 Fluka 31048 Used to prepare lysostpahine stock solution at 10 mg/mL in 20 mM sodium acetate.
AMBICIN (Recombinant lysostaphin) AMBI LSPN-50 Lyophilized recominant lysostaphin. Freeze at -80 °C for long-term storage.
COS - Colombia agar + 5% sheep blood Biomerieux 43049 Any agar plate suitable for growing staphylococci can be used instead.
Densitometer WPA CO8000 Biochrom Ltd. 80-3000-45 Cell density meter
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose with phenol red Sigma-Aldrich D6429
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, high glucose without phenol red Sigma-Aldrich D1145
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline with MgCl2 and CaCl2, sterile-filtered Sigma-Aldrich D8662
Dulbecco′s Phosphate-buffered Saline, sterile-filtered Sigma-Aldrich D8537
Easyspiral dilute Interscience 414000 Automatic diluter and spiral plater
Fetal bovine serum Gibco 10270-106
HaCaT cell line Cell lines service (CLS) 300493
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate, 10 mg/mL Solution in Water Fisher scientific 11534886
Propidium iodide, 1.0 mg/mL solution in water Invitrogen P3566
Proteinase K, recombinant 20 mg/mL Eurobio GEXPRK01-B5 > 30 U/mg, lot 901727
Scan 4000 Interscience 438000 Automatic colony counter
Sterile water OTEC 600500
T-75 culture flask CORNING-FALCON 353136
TC20 Automated cell counter Biorad 1450102 Automatic cell counter
Tris 1 M pH 8.0 Invitrogen AM9855G Used to prepare lysostaphine working solution at 1 mg/mL in 0.1 M Tris-HCl.
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787
Trypsin - EDTA solution Sigma-Aldrich T3924 0.05% porcine trypsin and 0.02% EDTA in Hanks′ Balanced Salt Solution with phenol red
Wide-field fluorescence microscope Nikon Ti2

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References

  1. Verhoeven, P. O., et al. Detection and clinical relevance of Staphylococcus aureus nasal carriage: an update. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 12 (1), 75-89 (2014).
  2. Gagnaire, J., et al. Epidemiology and clinical relevance of Staphylococcus aureus intestinal carriage: a systematic review and meta-analysis. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 15 (8), 767-785 (2017).
  3. Tong, S. Y. C., Davis, J. S., Eichenberger, E., Holland, T. L., Fowler, V. G. Staphylococcus aureus infections: epidemiology, pathophysiology, clinical manifestations, and management. Clinical Microbiology Reviews. 28 (3), 603-661 (2015).
  4. Josse, J., Laurent, F., Diot, A. Staphylococcal adhesion and host cell invasion: fibronectin-binding and other mechanisms. Frontiers in Microbiology. 8, 2433 (2017).
  5. Hanssen, A. -M., et al. Localization of Staphylococcus aureus in tissue from the nasal vestibule in healthy carriers. BMC Microbiology. 17 (1), 89 (2017).
  6. Rigaill, J., et al. Evaluation of the intracellular efficacy of antimicrobial agents used for Staphylococcus aureus decolonization in a cell model mimicking nasal colonization. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 73 (11), 3044-3048 (2018).
  7. Yang, D., et al. Novel insights into Staphylococcus aureus deep bone infections: the Involvement of osteocytes. mBio. 9 (2), 00415-00418 (2018).
  8. Tuchscherr, L., et al. Staphylococcus aureus phenotype switching: an effective bacterial strategy to escape host immune response and establish a chronic infection. EMBO Molecular Medicine. 3 (3), 129-141 (2011).
  9. Valour, F., et al. Antimicrobial activity against intraosteoblastic Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (4), 2029-2036 (2015).
  10. Proctor, R. A., Prendergast, E., Mosher, D. F. Fibronectin mediates attachment of Staphylococcus aureus to human neutrophils. Blood. 59 (4), 681-687 (1982).
  11. Climo, M. W., Ehlert, K., Archer, G. L. Mechanism and suppression of lysostaphin resistance in oxacillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (5), 1431-1437 (2001).
  12. Bur, S., Preissner, K. T., Herrmann, M., Bischoff, M. The Staphylococcus aureus extracellular adherence protein promotes bacterial internalisation by keratinocytes independent of fibronectin-binding proteins. Journal of Investigative Dermatology. 133 (8), 2004-2012 (2013).
  13. Kim, J. -H., Chaurasia, A. K., Batool, N., Ko, K. S., Kim, K. K. Alternative enzyme protection assay to overcome the drawbacks of the gentamicin protection assay for measuring entry and intracellular survival of Staphylococci. Infection and Immunity. 87 (5), 00119 (2019).
  14. Maturin, L., Peeler, J. T. Aerobic plate count. Bacteriological Analytical Manual., Edition 8, Revision A. 3, Available from: https://www.fda.gov/food/laboratory-methods-food/bam-chapter-3-aerobic-plate-count 3 (2021).
  15. Kolenda, C., et al. Evaluation of the activity of a combination of three bacteriophages alone or in association with antibiotics on Staphylococcus aureus embedded in biofilm or internalized in Osteoblasts. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 64 (3), 02231 (2020).
  16. Abad, L., et al. Antibiofilm and intraosteoblastic activities of rifamycins against Staphylococcus aureus: promising in vitro profile of rifabutin. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 75 (6), 1466-1473 (2020).

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जीव विज्ञान अंक 175

Erratum

Formal Correction: Erratum: Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds
Posted by JoVE Editors on 01/19/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds. One of the affiliations was updated.

The fifth affiliation was updated from:

Département de Bactériologie, Institut des Agents Infectieux, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France

to:

Department of Bacteriology, Institute for Infectious Agents, Hospices Civils de Lyon, Lyon, France 

बेहतर एंजाइम संरक्षण परख <em>अध्ययन Staphylococcus aureus</em> Internalization और रोगाणुरोधी यौगिकों की इंट्रासेल्युलर प्रभावकारिता
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Rigaill, J., Audoux, E., Rodriguez,… More

Rigaill, J., Audoux, E., Rodriguez, K., Peyron, A., Berthelot, P., Josse, J., Laurent, F., Caire, R., Verhoeven, P. O. Improved Enzyme Protection Assay to Study Staphylococcus aureus Internalization and Intracellular Efficacy of Antimicrobial Compounds. J. Vis. Exp. (175), e62903, doi:10.3791/62903 (2021).

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