Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Vurdering L-DOPA-induserte dyskinesier i ensidig 6-OHDA-lesjonert rottemodell av Parkinsons sykdom

Published: October 4, 2021 doi: 10.3791/62924
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Psychology, Faculty of Philosophy, Sciences and Letters of Ribeirão Preto, University of São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

Gnagermodeller av L-DOPA-induserte dyskinesier er uvurderlige verktøy for å identifisere terapeutiske inngrep for å dempe utviklingen eller lindre manifestasjonene som oppstår på grunn av gjentatt administrering av L-DOPA. Denne protokollen demonstrerer hvordan man induserer og analyserer dyskinetisk-lignende bevegelser i den ensidige 6-OHDA-lesjonerte rottemodellen av Parkinsons sykdom.

Abstract

L-DOPA-induserte dyskinesier (LIDs) refererer til motoriske komplikasjoner som oppstår ved langvarig L-DOPA-administrering til pasienter med Parkinsons sykdom (PD). Det vanligste mønsteret observert i klinikken er toppdose dyskinesi som består av kliniske manifestasjoner av choreiforme, dystoniske og ballistiske bevegelser. 6-hydroksydopamin (6-OHDA) rottemodell av PD etterligner flere egenskaper ved LIDs. Etter gjentatt L-DOPA-administrering viser rotter med 6 OHDA-lesjoner dyskinetiske bevegelser (f.eks. unormale ufrivillige bevegelser, AIM). Denne protokollen demonstrerer hvordan man induserer og analyserer AIMs hos 6-OHDA-lesjonerte rotter med 90% -95% dopaminerg uttømming i nigrostriatalveien. Gjentatt administrering (3 uker) av L-DOPA (5 mg/kg, kombinert med 12,5 mg/kg benserazid) kan indusere utviklingen av AIM. Tidsanalysen viser en signifikant økning i AIMs på 30-90 min (toppdose dyskinesi). Gnagere modeller av LIDs er et viktig preklinisk verktøy for å identifisere effektive antidyskinetiske inngrep.

Introduction

Dopaminforløperen L-3,4-dihydroksyfenylalanin (L-DOPA) representerer den mest effektive behandlingen for motoriske symptomer på Parkinsons sykdom (PD)1. L-DOPA-terapi kan forbedre motoriske symptomer assosiert med PD, men mister effektivitet med tiden. Motoriske svingninger som "slitasje svingninger" eller "end-of-dose forverring" manifesterer seg klinisk som en forkortet varighet av effekten av enkelt L-DOPA doser2. I andre tilfeller består kliniske manifestasjoner av langsomme vridningsbevegelser og unormale stillinger (dystoni)3 og oppstår når dopaminnivåene er lave (off-periode dystoni)4. På den annen side vises L-DOPA-induserte dyskinesier (LIDs) når dopaminnivåene i plasma og hjernen er høye5.

LIDs produserer svekkende bivirkninger som inkluderer motoriske komplikasjoner som choreiform, dystoniske og ballistiske6 bevegelser. Når de er etablert, oppstår lokk etter hver L-DOPA-administrering. Motoriske komplikasjoner forekommer hos 40% -50% av PD-pasientene som gjennomgår L-DOPA-behandling i 5 år, og forekomsten øker i løpet av årene7. Selv om de patofysiologiske mekanismene som er involvert i utviklingen av LIDs hos PD-pasienter ennå ikke er fullstendig klarlagt, er omfanget av dopaminerg denervering, pulsatil L-DOPA-administrasjon, nedstrøms endringer i striatale proteiner og gener, og abnormiteter i ikke-dopaminsendersystemer faktorer som bidrar til utviklingen av disse uønskede bivirkningene 6,8,9,10.

Nevrotoksinet 6-hydroksydopamin (6-OHDA) er et godt karakterisert verktøy for å studere PD hos gnagere11,12,13,14. Siden 6-OHDA ikke krysser blod-hjernebarrieren, må den injiseres direkte inn i nigrostriatalveien. 6-OHDA-indusert dopaminerg deplesjon er konsentrasjons- og stedsavhengig15. Ensidig administrering av 6-OHDA i medial forhjernebunt (MFB) kan gi alvorlig (>90 %) nigrostriatal skade hos gnagere 16,17,18,19. Kronisk administrering av L-DOPA til alvorlige ensidig 6-OHDA-lesjonerte gnagere forårsaker utseende av dyskinetisk-lignende bevegelser kalt unormale ufrivillige bevegelser (AIM). Dyskinetisk-lignende bevegelser hos gnagere deler lignende molekylære, funksjonelle og farmakologiske mekanismer relatert til LIDs hos PD-pasienter5. Derfor er 6-OHDA-lesjonerte rotter20 og mus21 verdifulle prekliniske modeller for å studere LIDs. Ved kronisk behandling (7-21 dager) med terapeutiske doser av L-DOPA (5-20 mg/kg), viser ensidig 6-OHDA-lesjonerte rotter og mus en gradvis utvikling av AIM som påvirker forbenet, bagasjerommet og orofaciale muskler kontralateralt med lesjonen 17,18,19,20,22,23,24 . Disse bevegelsene presenteres i et tidsforløp som ligner på L-DOPA-induserte toppdose dyskinesier hos PD-pasienter25 og er preget av hyperkinetiske bevegelser og dystoni5. AIM skåres vanligvis basert på alvorlighetsgraden (f.eks. når et bestemt AIM er til stede) og amplitude (f.eks. karakterisert ved amplituden til hver bevegelse)5,23,25.

6-OHDA-lesjonerte gnagermodeller av LIDs nåværende ansiktsgyldighet (dvs. modellen har flere egenskaper som ser ut som den menneskelige tilstanden)5,11,26,27,28. Gnagere AIMs, lik det som forekommer hos PD-pasienter, ses som hyperkinetiske (forben og orolingual) og dystoniske (aksiale) bevegelser29 og etterligner toppdose dyskinesi. På molekylært og funksjonelt nivå deler gnagermodeller mange patologiske egenskaper med PD-pasienter5, for eksempel oppregulering av FosB / ΔFosB 19,26,30,31,32,33 og serotonintransportør (SERT)34,35 . Når det gjelder prediktiv validitet, presenterer legemidler som reduserer LIDs hos PD-pasienter (f.eks. N-metyl-D-aspartat (NMDA) reseptorantagonisten amantadin) antidyskinetisk effekt i gnagermodellen 22,36,37,38,39.

Gnagerens AIMs vurderingsskala ble opprettet basert på fire AIMs-undertyper som inkluderer AIMs som påvirker hode, nakke og koffert (aksiale AIM), hyperkinetiske forbenbevegelser (lem AIMs) og dyskinetisk-lignende orolinguale bevegelser (orolinguale AIMs). Selv om kontralateral rotasjon (lokomotiv AIMs) også er tilstede i ensidig lesjonerte gnagere 20,22,23,25,40, har den ikke blitt scoret som en dyskinetisk-lignende bevegelse siden den kanskje ikke representerer et spesifikt mål på LIDs 22,37,41.

Her vil vi beskrive hvordan man induserer og analyserer dyskinetisk lignende bevegelser (aksiale, lemmer og orolinguale AIM) i den alvorlige (>90%) ensidige 6-OHDA-lesjonerte rottemodellen til PD. Vi organiserte protokollen vår basert på tidligere litteratur og vår laboratoriekompetanse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøkene ble utført i samsvar med Det etiske fakultet ved Fakultet for filosofi, vitenskap og brev fra Ribeirão Preto (CEUA/FFCLRP 18.5.35.59.5).

1. 6-OHDA-lesjon

  1. Bruk Sprague-Dawley hannrotter som veier 200-250 g i begynnelsen av forsøkene (6 uker). Hus dyrene (2-3 per bur) under standard laboratorieforhold (12:12 t lys / mørk syklus, lys på kl. 06:00, temperaturkontrollerte anlegg (22-24 ° C), med mat og vann tilgjengelig ad libitum.
    MERK: En fullstendig beskrivelse av hvordan man genererer alvorlige 6-OHDA-lesjonerte rotter er beskrevet andre steder42.
  2. Passende akklimatisere dyr før begynnelsen av en eksperimentell prosedyre.
  3. Administrer (intraperitonealt, i.p.) noradrenalintransportørhemmeren imipramin (20 mg/kg, oppløst i 0,9 % saltoppløsning) 30 minutter før kirurgi.
    MERK: Imipraminadministrasjon vil øke 6-OHDA-selektiviteten for dopaminerge nevroner.
  4. Administrer ketamin/xylazin (70/10 mg/kg) intraperitonealt.
  5. Pass på at dyret er dypt bedøvet av manglende respons på tåklemme og plassert i utsatt stilling i stereotaksisk apparat på toppen av en varmepute.
  6. Fjern pelsen på hodet og desinfiser operasjonsområdet 3 ganger, vekslende mellom en jodbasert skrubbe og alkohol.
  7. Bruk en skalpell til å lage et snitt (ca. 1 cm) i området der mikroinjeksjonen vil oppstå.
  8. Rengjør skalleområdet med bomullspinner og sørg for at Bregma og Lambda er utsatt.
  9. Sørg for at MFB stereotaksiske koordinater er hentet fra bregma43,44,45: -4,3 mm fremre, 1,6 mm lateral (høyre side) og 8,3 mm ventral (fra dura mater).
  10. Administrer 6-OHDA med en hastighet på 0,4 μL/min (10 μg i 4 μL saltoppløsning inneholdende 0,1 % askorbinsyre) ensidig i høyre mediale forhjernebunt (MFB) ved bruk av en 50 μL Hamilton glasssprøyte.
  11. På slutten av operasjonen, sutur hodebunnen snittet og rehydrere dyret med varm (~ 37 ° C) steril 0,9% saltoppløsning (~ 10 ml / kg, s.c.).
  12. Fjern dyret fra stereotaksisk ramme og legg det i et oppvarmet gjenopprettingsbur. Overvåk til bevisstheten er gjenvunnet.
  13. Vurder effektiviteten av den dopaminerge lesjonen 4 uker etter lesjonen ved hjelp av en trinntest46,47.
    MERK: I denne testen vurderes akinesi av forbenet kontralateralt til lesjonen gjennom antall justeringstrinn med forepaw kontralateral til lesjonen. Rotter med tre eller færre justeringstrinn med kontralateral forben er inkludert i studien som antatt alvorlig 6-OHDA-lesjonerte rotter48.

2. L-DOPA kronisk behandling

  1. Start den kroniske behandlingen på mandag, 4 uker etter 6-OHDA-lesjonen.
    MERK: Siden AIM vil bli filmet i 3 påfølgende dager i uken (onsdag, torsdag og fredag) i 3 uker, anbefales det å starte behandlingen på mandag.
  2. Behandle rottene med nylaget L-DOPA (via subkutan (s.c.), 1 ml/kg) pluss benserazidhydroklorid (henholdsvis 5 mg/kg og 12,5 mg/kg) i 3 uker, én gang daglig fra mandag til fredag45.
    MERK: Når de er etablert, vil AIM-er manifestere seg ved hver administrering av L-DOPA. L-DOPA-administrering 2-4 ganger i uken etter 3-ukers induksjonsperioden er derfor tilstrekkelig til å opprettholde et stabilt uttrykk for AIMs48.

3. AIM-opptak og scoring

  1. Utfør eksperimenter mellom kl. 09.00 og 17.00. Sørg for at utprøver er helt uvitende om rottenes identitet og farmakologiske behandling.
  2. Legg rotta forsiktig inne i en gjennomsiktig sylinder (20 cm diameter x 40 cm høy) og la den akklimatisere seg i minst 15 minutter. Sørg for at gulvet er dekket med sengetøymaterialet. Speil må plasseres bak sylinderen slik at forsøkspersonen kan observere dyret fra alle mulige vinkler.
    MERK: Hvis det er mer enn én rotte per forsøk, bruk en sylinder for hver rotte. Manipulering av dyrene mellom økter kan forstyrre atferdsanalysen.
  3. Plasser et videokamera med høy oppløsning på en måte som favoriserer visning av aksiale, lemme og orolinguale AIM-er. Siden rotasjonsadferd er tilstede under disse eksperimentelle forholdene, vil speilene bak sylinderen tillate sporing av AIM i en 360 ° vinkel. Bruk et stativ eller fest kameraet direkte til benken.
    MERK: Orolspråklige AIM-er kan være utfordrende å score, spesielt hvis det er høy forekomst av rotasjonsadferd. Å ta opp videoer med kameraet plassert litt under planet der dyrene er i en 15 ° vinkel, vil bidra til å observere denne bevegelsesundertypen.
  4. Fjern dyret forsiktig fra sylinderen og administrer L-DOPA (5 mg/kg kombinert med 12,5 mg/kg benserazid, s.c.).
  5. Sett dyret tilbake i sylinderen og start en timer for å spore AIMs etter L-DOPA-injeksjon. Bruk et videokamera til å ta opp AIM-er i 180 minutter etter injeksjonen av L-DOPA. Selv om analysen kan utføres ved direkte observasjon av dyret, foretrekkes offline scoring.
    MERK: Forsikre deg om at tidtakeren også er videofilmet slik at AIM-er kan scores på nøyaktige tidspunkter etter administrering av L-DOPA.
  6. Score AIM med 30 minutters mellomrom opp til 180 min injeksjon etter L-DOPA (se tabell 1 for definisjoner) som opprinnelig beskrevet20,23. Skår må gis over 1-2 min epoker og klassifiseres som aksial, lem eller orolingual (figur 1).
  7. Følg nøye med hver AIM og attributt score for alvorlighetsgrad og amplitude. Bruk tabell 1 for instruksjoner. Ikke inkluder normal atferd, for eksempel oppdrett, sniffing, grooming og gnaging i vurderingen. Det vil være totalt seks observasjonsperioder (30, 60, 90, 120, 150 og 180 min).
UNDERTYPER
Aksial: vridning av hode, nakke og koffert
Limb: ufrivillige bevegelser av både distale og proksimale forben
Orolingual: ufrivillige bevegelser av orofaciale muskler
ALVORLIGHETSGRADEN
0: Fraværende
1: Sporadisk (med avbrudd, tilstede i mindre enn halvparten av observasjonstiden)
2: Hyppig (med avbrudd, men tilstede i mer enn halvparten av observasjonstiden)
3: Kontinuerlig, men avbrutt av ytre sensoriske stimuli
4: Kontinuerlig og ikke avbrutt av ytre sensoriske stimuli
AMPLITUDE
Aksial
1: Torsjon av hode og nakke i ca. 30° vinkel
2: Torsjon av hode og nakke i ca. 30° < vinkel ≤ 60°
3: Torsjon av hode, nakke og overkropp i ca. 60° < vinkel ≤ 90°
4: Torsjon av hode, nakke og koffert i > 90° vinkel, noe som ofte fører til at rotta mister balansen
Lem
1: Små ufrivillige bevegelser av distale forben
2: Bevegelser med lav amplitude som forårsaker translokasjon av både distale og proksimale forben
3: Ufrivillige bevegelser av hele lemmen, inkludert skuldermuskler
4: Sterke lemmer og skulderbevegelser, ofte lik ballisme
Orolingual
1: Små ufrivillige bevegelser av orofaciale muskler
2: Orofaciale bevegelser av høy amplitude med tungefremspring

Tabell 1: AIMS definisjon og vurderingskriterier.

Figure 1
Figur 1: Sekvens av bilder som viser hver AIM-undertype. (A til A'") Aksialt AIM som viser dystonlignende bevegelser i forskjellige vinkler (A: 30° vinkel, A': 30° < vinkel ≤ 60°, A": 60° < vinkel ≤ 90°, og A'": > 90° vinkel). (B til B") Limb AIM (svarte piler) som viser ufrivillige bevegelser av distale (B og B') og hele forbenet (inkludert skulder, B"). (C) Orolingual AIM (rød pil) med høy amplitude med tungefremspring. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

4. Analyse av data

  1. Beregn aksiale, limb- eller orolinguale AIM-subtyper ved å multiplisere alvorlighetsgraden og amplitudieskårene for hver observasjonsperiode etter administrering av L-DOPA (dvs. seks observasjonsperioder) som tidligere beskrevet20. Den teoretiske maksimale poengsummen som ett dyr kan akkumulere i en testøkt er 240 (maksimal poengsum per observasjonsperiode er 40, se tabell 1 for detaljer).
  2. Plot AIMs score for alle de seks observasjonsperiodene registrert onsdag, torsdag og fredag i løpet av de 3 ukene med kronisk L-DOPA-administrasjon (figur 2). AIM kan oppsummeres for å indikere hvert dyrs maksimale score på hver skåringsdag (figur 3) eller hver uke (figur 4) i løpet av de 3 ukene med kronisk L-DOPA-administrasjon.
  3. Kontroller om dataene har en nær normalfordeling før du velger statistisk analysemetode.
    MERK: AIMs vurderingsskalaer består av ordinære data og kan analyseres med ikke-parametrisk statistikk. Parametriske tester er mye brukt når man sammenligner AIMs score på tvers av eksperimentelle grupper etter gjentatte testøkter40.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Selv om AIM-mønstrene observert hos rotter er enklere og begrensede sammenlignet med de som er observert hos mennesker og ikke-menneskelige primater, reproduserer denne modellen både hyperkinetiske og dystonlignende bevegelser indusert av kronisk L-DOPA-administrasjon. Her presenterer vi data samlet inn fra en gruppe (n = 10) av ensidig 6-OHDA-lesjonerte rotter kronisk behandlet med L-DOPA (5 mg/kg kombinert med 12,5 mg/kg benserazid) i 3 uker (mandag til fredag). Merk at dataene som presenteres i figur 2, figur 3 og figur 4 er fra de samme dyrene.

Figur 2 viser tidsforløpsanalysen for score brukt på aksiale, lemmer og orolinguale AIM-er over 3 uker med kronisk L-DOPA-administrasjon. Hver AIM-skår-subtype ved en bestemt observasjonsperiode rapporteres som multiplikasjon av alvorlighetsgrad og amplitudeskår i denne analysen. Denne typen analyse kan være praktisk for å undersøke effekten av legemidler som forstyrrer den tidsmessige profilen til AIM.Merk at L-DOPA-induserte toppdose dyskinesier forekommer mellom 30-90 minutter med gradvis reduksjon etter 120 minutter etter injeksjon (figur 2).

Figure 2
Figur 2: Tidsforløpsanalyse som viser aksiale, lemme og orolinguale AIM-er over 3 uker med kronisk L-DOPA-administrering (5 mg/kg kombinert med 12,5 mg/kg benserazid) til rotter med 6 OHDA-lesjoner . (A) Aksial, (B) lem og (C) orolingual AIMs ble scoret onsdag, torsdag og fredag over 3 uker med kronisk L-DOPA administrasjon. Hver AIM-subtype rapporteres som multiplikasjon av alvorlighetsgrad ganger amplitude på hver av de seks observasjonsperiodene. Hver AIM-subtype kan analyseres individuelt eller oppsummeres som angitt i (D). Merk at toppalvorlighetsgraden av AIMs gradvis vil øke i løpet av den første uken med kronisk L-DOPA-administrasjon. Data uttrykkes som gjennomsnitt ± SEM (n = 10). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3 viser summen av AIM-skår presentert for alle de seks observasjonsperiodene som er avbildet i figur 2 (datasettene er fargekodet for enkle sammenligninger). Denne analysen indikerer hvert dyrs maksimale poengsum på hver scoringsdag (onsdag, torsdag og fredag) i løpet av de 3 ukene med kronisk L-DOPA-administrasjon. Denne typen analyse kan være fordelaktig for å undersøke effekten av forbindelser med potensielle antidyskinetiske profiler, spesielt fordi AIM-score er stabile over uke 2 og 3 av kronisk L-DOPA-administrasjon. Videre kan ukentlige AIM-poeng (figur 4) genereres fra summen av score som tilskrives 6-OHDA-lesjonerte rotter onsdag, torsdag og fredag.

Figure 3
Figur 3: Summen av aksiale, lemme og orolinguale AIM-er på individuelle skåringsdager over 3 uker med kronisk L-DOPA-administrasjon (5 mg/kg kombinert med 12,5 mg/kg benserazid) til rotter med 6 OHDA-lesjoner. I denne figuren ble AIM-skår presentert i hver av de seks observasjonsperiodene (se detaljer i figur 2-forklaringen) summert. Individuelle datasett ble fargekodet for å sammenligne med dataene som vises i figur 2. Denne analysen indikerer hvert dyrs maksimale poengsum på hver scoringsdag (onsdag - W, torsdag - T og fredag - F) etter 3 uker med kronisk L-DOPA-administrasjon. (a) Aksiale, (B) lemmer og (C) orolinguale AIM-er. (D) Summen av aksiale, lemme og orolinguale AIM-er. Enveis gjentatte tiltak ANOVA og Holm-Sidak post-hoc test viste at AIMs øker gradvis over kronisk administrering av L-DOPA. Merk at AIM-score er stabil over uke 2 og 3 ved kronisk L-DOPA-administrasjon (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 vs. onsdag (W) i uke 1). Data uttrykkes som gjennomsnitt ± SEM (n = 10). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Summen av ukentlige aksiale, limbe og orolinguale AIM-er ved kronisk L-DOPA-administrering (5 mg/kg kombinert med 12,5 mg/kg benserazid) til rotter med 6 OHDA-lesjoner. I dette tallet ble AIMs scoret hver uke (onsdag, torsdag og fredag - se figur 3) summert. Denne analysen indikerer hvert dyrs maksimale score på hver uke med kronisk L-DOPA-administrasjon. (a) Aksiale, (B) lemmer og (C) orolinguale AIM-er. (D) Summen av aksiale, lemme og orolinguale AIM-er. Enveis gjentatte målinger ANOVA og Holm-Sidak post-hoc test viste at AIMs øker i forhold til kronisk administrering av L-DOPA (*p < 0,05 vs. uke 1). Data uttrykkes som gjennomsnitt ± SEM (n = 10). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen demonstrerer hvordan man induserer og analyserer AIM i rottemodellen av PD indusert av ensidig mikroinjeksjon av 6-OHDA i MFB. Kronisk daglig administrering av lave doser L-DOPA (5 mg/kg, kombinert med 12,5 mg/kg benserazid) ga utvikling av AIM i løpet av de 3 ukene av behandlingen. Tidsmessig analyse viste en signifikant økning av AIM, og toppdose dyskinesi observeres mellom 30 og 90 minutter etter administrering av L-DOPA. AIMs er repeterende og formålsløse bevegelser som påvirker aksiale, lemmer og orolinguale muskler. Protokollen og dataene som presenteres her stemmer overens med den tidligere litteraturen 22,23,49,50,51.

Den aksiale, lemme og orolinguale AIMs vurderingsskalaen er svært følsom fordi den vurderer hvor lang tid (dvs. alvorlighetsgrad) at gnagere viser dyskinetisk-lignende bevegelser og indikerer amplituden til disse bevegelsene20. AIMs score kan uttrykkes i ulike tidsmessige oppløsninger (se figur 2, figur 3, figur 4)17,18,19,52. Flere studier har adressert rollen som L-DOPA dosering på utviklingen av AIM. Kronisk administrering av lavere doser L-DOPA (5-20 mg / kg) favoriserer en gradvis utvikling av AIM over behandlingen, mens høye doser L-DOPA (25 mg / kg eller mer) resulterer i rask og robust utvikling av AIMs 23,25,27,53. Interessant nok kan en andel alvorlige 6-OHDA-lesjonerte dyr ikke utvikle AIMs (eller har svært lave AIM-score) etter kronisk administrering av lave doser L-DOPA40,49,53. Det er også viktig å vurdere L-DOPAs administrasjonsvei. Selv om AIM deler lignende debut, tidsprofil og alvorlighetsgradgrad 40, er det vist at episoder med dosesvikt ofte forekom hos rotter behandlet intraperitonealt27. I.p. administrering av L-DOPA ga også interindividuelle variasjoner i plasmanivåer, en effekt som ikke ble observert etter s.c. injeksjoner27.

I denne studien ble AIM sett hos dyr med alvorlig nigrostriatal skade (over 90% av dopaminerg deplesjon). Massivt tap av striatal dopaminerg innervering er preget av en reduksjon i antall justeringstrinn utført med forbenet kontralateralt til lesjonen48. Derfor anbefaler vi trinntesten for å velge dyr med antatt alvorlige 6-OHDA-lesjoner ved nigrostriatalbanen. Den amfetamininduserte rotasjonstesten brukes ofte til å velge antatte 6-OHDA-lesjonerte rotter. Amfetamin øker dopaminfrigivelsen i intakt striatum, og dermed øker den eksisterende ubalansen mellom det innerverte og denervererte striatumet. En interessant studie utført på 312 6-OHDA-lesjonerte rotter11 viste imidlertid ingen sammenheng mellom amfetaminindusert rotasjon og tyrosinhydroksylasepositive celler i ipsilateral substantia nigra pars compacta. Den samme studien viste en dårlig korrelasjon mellom amfetaminindusert rotasjon og alvorlighetsgraden av AIM.

Det er en klar sammenheng mellom fenomenologien til AIM og mønsteret av nigrostriatal dopaminerg uttømming20. 6-OHDA-rottemodellen av PD vi brukte i denne protokollen utvikler alvorlig ensidig uttømming av nigrostriatale dopaminterminaler etter 6-OHDA-infusjon i MFB. Fullt dopaminutarmede 6-OHDA-lesjonerte rotter har en høyere forekomst av AIM sammenlignet med delvis dopaminutarmede dyr. En detaljert analyse av striatal ekspresjon av nevropeptidene dynorfin og enkefalin etter 6-OHDA-lesjon og kronisk L-DOPA-administrasjon er beskrevet andre steder45 og er i samsvar med tidligere litteratur23,25. På molekylært nivå deler dykinetiske gnagere molekylære markører assosiert med dyskinesi som er tydelig i ikke-menneskelige primatmodeller av PD- og PD-pasienter, for eksempel striatal oppregulering av ΔFosB-transkripsjonsfaktor 26,32,33,54. Også gnagermodellen av PD viser økt mikrokarstetthet i striatum som respons på L-DOPA-behandling55 på lignende måte observert i putamen hos PD-pasienter56. Gnagere modeller av LIDs reagerer på antidyskinetiske farmakologiske tilnærminger som brukes i klinikken, for eksempel NMDA-reseptorantagonisten amantadin 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35,36,37, 38,39. Til sammen bekrefter disse bevisene ansiktsgyldigheten og prediktiv gyldighet av 6-OHDA-rottemodellen for å karakterisere patofysiologien til LIDs og for screening av forbindelser med antidyskinetiske egenskaper. Musmodellen av LIDs er også et verdifullt verktøy for å studere flere aspekter av LIDs i transgene mus. Protokoller for musemodellen av LIDs finnes i artikler fra ulike forskningsgrupper 30,57,58.

Det er viktig å merke seg at 6-OHDA-lesjonsmodellen av LIDs har begrensninger. 6-OHDA-indusert dopaminerg deplesjon er akutt sammenlignet med den progressive karakteren av nigrostriatal deplesjon hos PD-pasient5. Det kan også være utfordrende å finne et utmerket terapeutisk vindu for bruk av et antidyskinetisk legemiddel hos pasienter fordi økning av doseringen av et legemiddel kan forstyrre den gunstige effekten produsert av L-DOPA eller indusere bivirkninger som kanskje ikke er observert i dyremodellen59,60. En annen begrensning av rottemodellen til LIDs er mangelen på fysisk likhet mellom AIMs i gnagere og manifestasjonen av choreiformbevegelsene observert hos pasienter og ikke-menneskelige primater 10,61,62. En annen potensiell begrensning av protokollen som presenteres her er at AIM-er blir scoret hvert 30. minutt etter L-DOPA-administrasjon, men dette problemet kan håndteres hvis eksperimentøren videobånder alle dyrene i 180 minutter etter L-DOPA-administrering. Eksperimentøren kan deretter justere poengberegningsprotokollen for hyppigere poengberegning (f.eks. hvert 10. eller 20. min). Denne tilnærmingen er fordelaktig i eksperimenter som krever et mer dynamisk bilde av AIMs tidsforløp (f.eks. Kombinasjonen av AIMs scoring og in vivo elektrofysiologiske eller nevrokjemiske opptak).

Avslutningsvis reproduserer 6-OHDA-rottemodellen til LID patofysiologien til sykdom og utvikler AIM-er som kan moduleres av legemidler som brukes klinisk. Selv om den har begrensninger, representerer 6-OHDA-rottemodellen av LID fortsatt et uvurderlig preklinisk verktøy for å identifisere effektive antidyskinetiske inngrep med translasjonspotensial.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av São Paulo Research Foundation (FAPESP, stipend 2017/00003-0). Vi er takknemlige for koordineringen for forbedring av høyere utdanningspersonell (CAPES). Vi takker Dr. Anthony R. West, Dr. Heinz Steiner og Dr. Kuei Y. Tseng for støtte og veiledning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-hydroxydopamine hydrobromide Sigma-Aldrich, USA H6507 Neurotoxin that produces degeneration of catecholaminergic terminals
Benzerazide hydrochloride Sigma B7283 Peripheral dopa-decarboxylase inhibitor
Camera Bullet IR Turbo HD (HD-TVI)  2.8mm B HIKVISION DS-2CE16C0T-IRP Camera used to record all behavior
Imipramine hidrochloride Alfa Aesar J63723 Norepinephrine transporter inhibitor (NET) used to protect noradrenergic neurons from 6-OHDA
Ketamine hydrochloride Ceva Animal Health Anesthesia for surgical intervention
L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) methyl ester (hydrochloride) Cayman Chemical Company 16149 Dopamine precursor
Mirrors Used to observe the behavior of animals during experiments in all directions
Needles 0.30 x 13 mm PrecisionGlide Needles used to inject drugs
Sodium chloride (NaCl) Samtec Salt
Syringes 1 ml Sterile BD Plastipak Syringes used to inject drugs
Transparent cylinders Used to record animal behavior during experiments
Xylazine hydrochloride Ceva Animal Health Sedative, analgesic and muscle relaxant for surgical intervention

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jenner, P. Molecular mechanisms of L-DOPA-induced dyskinesia. Nature Reviews. Neuroscience. 9 (9), 665-677 (2008).
  2. Nutt, J. G. Levodopa-induced dyskinesia: review, observations, and speculations. Neurology. 40 (2), 340-345 (1990).
  3. Luquin, M. R., Scipioni, O., Vaamonde, J., Gershanik, O., Obeso, J. A. Levodopa-induced dyskinesias in Parkinson's disease: clinical and pharmacological classification. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Society. 7 (2), 117-124 (1992).
  4. Fabbrini, G., Brotchie, J. M., Grandas, F., Nomoto, M., Goetz, C. G. Levodopa-induced dyskinesias. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Society. 22 (10), 1379 (2007).
  5. Cenci, M. A., Crossman, A. R. Animal models of l-dopa-induced dyskinesia in Parkinson's disease. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Society. 33 (6), 889-899 (2018).
  6. Bastide, M. F., et al. Pathophysiology of L-dopa-induced motor and non-motor complications in Parkinson's disease. Progress in Neurobiology. 132, 96-168 (2015).
  7. Manson, A., Stirpe, P., Schrag, A. Levodopa-induced-dyskinesias clinical features, incidence, risk factors, management and impact on quality of life. Journal of Parkinson's Disease. 2 (3), 189-198 (2012).
  8. Grandas, F., Galiano, M. L., Tabernero, C. Risk factors for levodopa-induced dyskinesias in Parkinson's disease. Journal of Neurology. 246 (12), 1127-1133 (1999).
  9. Schrag, A., Quinn, N. Dyskinesias and motor fluctuations in Parkinson's disease. A community-based study. Brain: A Journal of Neurology. 123, Pt 11 2297-2305 (2000).
  10. Bezard, E., Brotchie, J. M., Gross, C. E. Pathophysiology of levodopa-induced dyskinesia: potential for new therapies. Nature Reviews. Neuroscience. 2 (8), 577-588 (2001).
  11. Tronci, E., Shin, E., Björklund, A., Carta, M. Amphetamine-induced rotation and L-DOPA-induced dyskinesia in the rat 6-OHDA model: a correlation study. Neuroscience Research. 73 (2), 168-172 (2012).
  12. Duty, S., Jenner, P. Animal models of Parkinson's disease: a source of novel treatments and clues to the cause of the disease. British Journal of Pharmacology. 164 (4), 1357-1391 (2011).
  13. Ungerstedt, U. 6-Hydroxy-dopamine induced degeneration of central monoamine neurons. European Journal of Pharmacology. 5 (1), 107-110 (1968).
  14. Ungerstedt, U. Postsynaptic supersensitivity after 6-hydroxy-dopamine induced degeneration of the nigro-striatal dopamine system. Acta Physiologica Scandinavica. Supplementum. 367, 69-93 (1971).
  15. Kirik, D., Rosenblad, C., Bjorklund, A. Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat. Experimental Neurology. 152, 259-277 (1998).
  16. Zahm, D. S. Compartments in rat dorsal and ventral striatum revealed following injection of 6-hydroxydopamine into the ventral mesencephalon. Brain Research. 552 (1), 164-169 (1991).
  17. Padovan-Neto, F. E., Echeverry, M. B., Tumas, V., Del-Bel, E. A. Nitric oxide synthase inhibition attenuates L-DOPA-induced dyskinesias in a rodent model of Parkinson's disease. Neuroscience. 159 (3), 927-935 (2009).
  18. Padovan-Neto, F. E., et al. Antidyskinetic effect of the neuronal nitric oxide synthase inhibitor is linked to decrease of FosB/deltaFosB expression. Neuroscience Letters. 541, 126-131 (2013).
  19. Padovan-Neto, F. E., Cavalcanti-Kiwiatkoviski, R., Carolino, R. O., Anselmo-Franci, J., Del Bel, E. Effects of prolonged neuronal nitric oxide synthase inhibition on the development and expression of L-DOPA-induced dyskinesia in 6-OHDA-lesioned rats. Neuropharmacology. 89, 87-99 (2015).
  20. Winkler, C., Kirik, D., Björklund, A., Cenci, M. A. L-DOPA-induced dyskinesia in the intrastriatal 6-hydroxydopamine model of parkinson's disease: relation to motor and cellular parameters of nigrostriatal function. Neurobiology of Disease. 10 (2), 165-186 (2002).
  21. Francardo, V., et al. Impact of the lesion procedure on the profiles of motor impairment and molecular responsiveness to l-DOPA in the 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 42, 327-340 (2011).
  22. Lundblad, M., et al. Pharmacological validation of behavioural measures of akinesia and dyskinesia in a rat model of Parkinson's disease. The European Journal of Neuroscience. 15 (1), 120-132 (2002).
  23. Cenci, M. A., Lee, C. S., Björklund, A. L-DOPA-induced dyskinesia in the rat is associated with striatal overexpression of prodynorphin- and glutamic acid decarboxylase mRNA. The European Journal of Neuroscience. 10 (8), 2694-2706 (1998).
  24. Henry, B., Crossman, A. R., Brotchie, J. M. Characterization of enhanced behavioral responses to L-DOPA following repeated administration in the 6-hydroxydopamine-lesioned rat model of Parkinson's disease. Experimental Neurology. 151 (2), 334-342 (1998).
  25. Lee, C. S., Cenci, M. A., Schulzer, M., Björklund, A. Embryonic ventral mesencephalic grafts improve levodopa-induced dyskinesia in a rat model of Parkinson's disease. Brain: A Journal of Neurology. 123, Pt 7 1365-1379 (2000).
  26. Andersson, M., Hilbertson, A., Cenci, M. A. Striatal fosB expression is causally linked with l-DOPA-induced abnormal involuntary movements and the associated upregulation of striatal prodynorphin mRNA in a rat model of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 6 (6), 461-474 (1999).
  27. Lindgren, H. S., Rylander, D., Ohlin, K. E., Lundblad, M., Cenci, M. A. The "motor complication syndrome" in rats with 6-OHDA lesions treated chronically with L-DOPA: relation to dose and route of administration. Behavioural Brain Research. 177 (1), 150-159 (2007).
  28. Animal Models of Movement Disorders: volume I, Neuromethods. Lane, E. L., Dunnett, S. 61, Springer Science+Business Media. (2011).
  29. Carlsson, T., Carta, M., Winkler, C., Björklund, A., Kirik, D. Serotonin neuron transplants exacerbate l-DOPA-induced dyskinesias in a rat model of Parkinson's disease. Journal of Neuroscience. 27 (30), 8011-8022 (2007).
  30. Lundblad, M., Picconi, B., Lindgren, H., Cenci, M. A. A model of L-DOPA-induced dyskinesia in 6-hydroxydopamine lesioned mice: relation to motor and cellular parameters of nigrostriatal function. Neurobiology of Disease. 16 (1), 110-123 (2004).
  31. Fasano, S., et al. Inhibition of Ras-guanine nucleotide-releasing factor 1 (Ras-GRF1) signaling in the striatum reverts motor symptoms associated with L-dopa-induced dyskinesia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (50), 21824-21829 (2010).
  32. Berton, O., et al. Striatal overexpression of DeltaJunD resets L-DOPA-induced dyskinesia in a primate model of Parkinson disease. Biological Psychiatry. 66 (6), 554-561 (2009).
  33. Lindgren, H. S., et al. Putaminal upregulation of FosB/ΔFosB-like immunoreactivity in Parkinson's disease patients with dyskinesia. Journal of Parkinson's Disease. 1 (4), 347-357 (2011).
  34. Rylander, D., et al. Maladaptive plasticity of serotonin axon terminals in levodopa-induced dyskinesia. Annals of Neurology. 68 (5), 619-628 (2010).
  35. Smith, R., et al. The role of pallidal serotonergic function in Parkinson's disease dyskinesias: a positron emission tomography study. Neurobiology of Aging. 36 (4), 1736-1742 (2015).
  36. Lundblad, M., et al. Pharmacological validation of a mouse model of l-DOPA-induced dyskinesia. Experimental Neurology. 194 (1), 66-75 (2005).
  37. Dekundy, A., Lundblad, M., Danysz, W., Cenci, M. A. Modulation of L-DOPA-induced abnormal involuntary movements by clinically tested compounds: further validation of the rat dyskinesia model. Behavioural Brain Research. 179 (1), 76-89 (2007).
  38. Blanchet, P. J., Konitsiotis, S., Chase, T. N. Amantadine reduces levodopa-induced dyskinesias in parkinsonian monkeys. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Society. 13 (5), 798-802 (1998).
  39. Verhagen Metman, I., et al. Amantadine as treatment for dyskinesias and motor fluctuations in Parkinson's disease. Neurology. 50 (5), 1323-1326 (1998).
  40. Cenci, M. A., Lundblad, M. Ratings of L-DOPA-induced dyskinesia in the unilateral 6-OHDA lesion model of Parkinson's disease in rats and mice. Current Protocols in Neuroscience. , Chapter 9, Unit 9 25 (2007).
  41. Dupre, K. B., et al. Effects of coincident 5- HT1A receptor stimulation and NMDA receptor antagonism on L-DOPA-induced dyskinesia and rotational behaviors in the hemi-parkinsonian rat. Psychopharmacology (Berl). 199 (1), 99-108 (2008).
  42. Guimarães, P. R., Bariotto-dos-Santos, K., Ribeiro, D. L., Padovan-Neto, F. E. The 6-hydroxydopamine (6-OHDA) rat model of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , (2021).
  43. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. New York. (1998).
  44. Tseng, K. Y., et al. Inhibition of striatal soluble guanylyl cyclase-cGMP signaling reverses basal ganglia dysfunction and akinesia in experimental parkinsonism. PloS One. 6 (11), 27187 (2011).
  45. Padovan-Neto, F. E., et al. Selective regulation of 5-HT1B serotonin receptor expression in the striatum by dopamine depletion and repeated L-DOPA treatment: Relationship to L-DOPA-induced dyskinesias. Molecular Neurobiology. 57 (2), 736-751 (2020).
  46. Olsson, M., Nikkhah, G., Bentlage, C., Bjorklund, A. Forelimb akinesia in the rat Parkinson model: Differential effects of dopamine agonists and nigral transplants as assessed by a new stepping test. Journal of Neuroscience. 15, 3863-3875 (1995).
  47. Chang, J. W., Wachtel, S. R., Young, D., Kang, U. J. Biochemical and anatomical characterization of forepaw adjusting steps in rat models of Parkinson's disease lesions. Neuroscience. 88, 617-628 (1995).
  48. Jayasinghe, V. R., Flores-Barrera, E., West, A. R., Tseng, K. Y. Frequency-dependent corticostriatal disinhibition resulting from chronic dopamine depletion: Role of local striatal cGMP and GABAAR signaling. Cerebral Cortex. 27, 625-634 (2017).
  49. Picconi, B., et al. Loss of bidirectional striatal synaptic plasticity in L-DOPA-induced dyskinesia. Nature Neuroscience. 6 (5), 501-506 (2003).
  50. Carta, M., et al. Role of striatal L-DOPA in the production of dyskinesia in 6-hydroxydopamine lesioned rats. Journal of Neurochemistry. 96 (6), 1718-1727 (2006).
  51. Westin, J. E., Andersson, M., Lundblad, M., Cenci, M. A. Persistent changes in striatal gene expression induced by long-term L-DOPA treatment in a rat model of Parkinson's disease. The European Journal of Neuroscience. 14 (7), 1171-1176 (2001).
  52. Bariotto-Dos-Santos, K., et al. Repurposing an established drug: an emerging role for methylene blue in L-DOPA-induced dyskinesia. The European Journal of Neuroscience. 49 (6), 869-882 (2018).
  53. Lindgren, H. S., Lane, E. L. Rodent Models of l-DOPA-Induced Dyskinesia. Animal Models of Movement Disorders. Neuromethods. Lane, E., Dunnett, S. 61, Humana Press. (2011).
  54. Doucet, J., et al. Drug-drug interactions related to hospital admissions in older adults: A prospective study of 1000 patients. Journal of the American Geriatrics Society. 44, 944-948 (1996).
  55. Ohlin, K. E., et al. Vascular endothelial growth factor is upregulated by L-dopa in the parkinsonian brain: implications for the development of dyskinesia. Brain: A Journal of Neurology. 134, Pt 8 2339-2357 (2011).
  56. Jourdain, V. A., et al. Increased putamen hypercapnic vasoreactivity in levodopa-induced dyskinesia. JCI insight. 2 (20), 96411 (2017).
  57. Thiele, S. L., et al. Generation of a model of l-DOPA-induced dyskinesia in two different mouse strains. Journal of Neuroscience Methods. 197 (2), 193-208 (2011).
  58. Dos-Santos-Pereira, M., et al. Contributive role of TNF-α to L-DOPA-induced dyskinesia in a unilateral 6-OHDA lesion model of Parkinson's disease. Frontiers in Pharmacology. 11, 617085 (2021).
  59. Cenci, M. A., Ohlin, K. E., Odin, P. Current options and future possibilities for the treatment of dyskinesia and motor fluctuations in Parkinson's disease. CNS & Neurological Disorders Drug Targets. 10 (6), 670-684 (2011).
  60. Cenci, M. A. Presynaptic mechanisms of l-DOPA-induced dyskinesia: The findings, the debate, and the therapeutic implications. Frontiers in Neurology. 5, 242 (2014).
  61. Langston, J. W., Quik, M., Petzinger, G., Jakowec, M., Di Monte, D. A. Investigating levodopa-induced dyskinesias in the parkinsonian primate. Annals of Neurology. 47 (4), Suppl 1 79-89 (2000).
  62. Chase, T. N. Levodopa therapy: consequences of the nonphysiologic replacement of dopamine. Neurology. 50 (5), Suppl 5 17-25 (1998).

Tags

Biologi utgave 176 Parkinsons sykdom basalganglier 6-hydroksydopamin L-DOPA-induserte dyskinesier unormale ufrivillige bevegelser
Vurdering L-DOPA-induserte dyskinesier i ensidig 6-OHDA-lesjonert rottemodell av Parkinsons sykdom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bariotto-dos-Santos, K., Ribeiro, D. … More

Bariotto-dos-Santos, K., Ribeiro, D. L., Guimarães, R. P., Padovan-Neto, F. E. Rating L-DOPA-Induced Dyskinesias in the Unilaterally 6-OHDA-Lesioned Rat Model of Parkinson's Disease. J. Vis. Exp. (176), e62924, doi:10.3791/62924 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter