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Biology

Calificación de discinesias inducidas por L-DOPA en el modelo de rata lesionada unilateralmente con 6-OHDA de la enfermedad de Parkinson

Published: October 4, 2021 doi: 10.3791/62924
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Psychology, Faculty of Philosophy, Sciences and Letters of Ribeirão Preto, University of São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

Los modelos de roedores de discinesias inducidas por L-DOPA son herramientas invaluables para identificar intervenciones terapéuticas para atenuar el desarrollo o aliviar las manifestaciones que surgen debido a la administración repetida de L-DOPA. Este protocolo demuestra cómo inducir y analizar movimientos discinéticos en el modelo de rata con lesión unilateral de 6-OHDA de la enfermedad de Parkinson.

Abstract

Las discinesias inducidas por L-DOPA (LID) se refieren a complicaciones motoras que surgen de la administración prolongada de L-DOPA a pacientes con enfermedad de Parkinson (EP). El patrón más común observado en la clínica es la discinesia de dosis máxima, que consiste en manifestaciones clínicas de movimientos coreiformes, distónicos y balísticos. El modelo de rata 6-hidroxidopamina (6-OHDA) de PD imita varias características de los LID. Después de la administración repetida de L-DOPA, las ratas con lesión de 6-OHDA exhiben movimientos discinéticos (por ejemplo, movimientos involuntarios anormales, AIMs). Este protocolo demuestra cómo inducir y analizar AIMs en ratas con lesión 6-OHDA con 90% -95% de depleción dopaminérgica en la vía nigroestriatal. La administración repetida (3 semanas) de L-DOPA (5 mg/kg, combinado con 12,5 mg/kg de benserazida) puede inducir el desarrollo de AIMs. El análisis del curso del tiempo revela un aumento significativo de los MIA a los 30-90 min (discinesia de dosis máxima). Los modelos de LID en roedores son una herramienta preclínica importante para identificar intervenciones antidiscinéticas efectivas.

Introduction

El precursor de la dopamina L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA) representa el tratamiento más eficaz para los síntomas motores de la enfermedad de Parkinson (EP)1. La terapia con L-DOPA puede mejorar los síntomas motores asociados con la EP, pero pierde efectividad con el tiempo. Las fluctuaciones motoras como la "fluctuación de desgaste" o el "deterioro al final de la dosis" se manifiestan clínicamente como una duración más corta del efecto de dosis únicas de L-DOPA2. En otros casos, las manifestaciones clínicas consisten en movimientos de torsión lentos y posturas anormales (distonía)3 y ocurren cuando los niveles de dopamina son bajos (distonía fuera del período)4. Por otro lado, las discinesias inducidas por L-DOPA (LID) aparecen cuando los niveles de dopamina en el plasma y el cerebro son altos5.

Los LID producen efectos secundarios debilitantes que incluyen complicaciones motoras como movimientos coreiformes, distónicos y balísticos6. Una vez establecido, LIDs ocurren después de cada administración de L-DOPA. Las complicaciones motoras ocurren en el 40%-50% de los pacientes con EP sometidos a terapia con L-DOPA durante 5 años, y la incidencia aumenta a lo largo de los años7. Aunque los mecanismos fisiopatológicos implicados en el desarrollo de LID en pacientes con EP aún no están completamente dilucidados, el grado de denervación dopaminérgica, la administración pulsátil de L-DOPA, los cambios posteriores en las proteínas y genes estriatales y las anomalías en los sistemas transmisores no dopaminérgicos son factores que contribuyen al desarrollo de estos efectos secundarios no deseados 6,8,9,10.

La neurotoxina 6-hidroxidopamina (6-OHDA) es una herramienta bien caracterizada para estudiar la EP en roedores11,12,13,14. Dado que el 6-OHDA no cruza la barrera hematoencefálica, debe inyectarse directamente en la vía nigroestriatal. La depleción dopaminérgica inducida por 6-OHDA depende de la concentración y del sitio15. La administración unilateral de 6-OHDA en el haz prosencéfalo medial (MFB) puede producir daño nigroestriatal severo (>90%) en roedores16,17,18,19. La administración crónica de L-DOPA a roedores graves con lesión unilateral de 6-OHDA causa la aparición de movimientos discinéticos llamados movimientos involuntarios anormales (AIM). Los movimientos similares a los discinéticos en roedores comparten mecanismos moleculares, funcionales y farmacológicos similares relacionados con las LID en pacientes con EP5. Por lo tanto, las ratas con lesión 6-OHDA20 y los ratones21 son modelos preclínicos valiosos para estudiar las LID. Cuando se tratan crónicamente (7-21 días) con dosis terapéuticas de L-DOPA (5-20 mg/kg), las ratas y ratones lesionados unilateralmente con 6-OHDA muestran un desarrollo gradual de AIMs que afectan las extremidades anteriores, el tronco y los músculos orofaciales contralaterales a la lesión 17,18,19,20,22,23,24 . Esos movimientos se presentan en un curso de tiempo similar a las discinesias de dosis pico inducidas por L-DOPA en pacientes con EP25 y se caracterizan por movimientos hipercinéticos y distonía5. Los AIM generalmente se puntúan en función de su gravedad (por ejemplo, cuando un AIM específico está presente) y amplitud (por ejemplo, caracterizada por la amplitud de cada movimiento)5,23,25.

Los modelos de LID de roedores lesionados con 6-OHDA presentan validez facial (es decir, el modelo tiene varias características que se parecen a la condición humana)5,11,26,27,28. Los AIM de roedores, similares a lo que ocurre en pacientes con EP, se consideran movimientos hipercinéticos (extremidad anterior y orolinguales) y distónicos (axiales)29 e imitan la discinesia de dosis máximas. A nivel molecular y funcional, los modelos de roedores comparten muchas características patológicas con los pacientes con EP5, como la regulación positiva de FosB/ΔFosB 19,26,30,31,32,33 y transportador de serotonina (SERT)34,35 . En cuanto a la validez predictiva, los fármacos que reducen las LID en pacientes con EP (p. ej., el antagonista del receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) amantadina) presentan eficacia antidiscinética en el modelo de roedores 22,36,37,38,39.

La escala de calificación de AIMs para roedores se creó en base a cuatro subtipos de AIMs que incluyen AIMs que afectan la cabeza, el cuello y el tronco (AIMs axiales), movimientos hipercinéticos de las extremidades anteriores (AIMs de extremidades) y movimientos orolinguales tipo discinéticos (AIMs orolinguales). Aunque la rotación contralateral (AIM locomotora) también está presente en roedores lesionados unilateralmente 20,22,23,25,40, no ha sido calificada como un movimiento de tipo discinético ya que puede no representar una medida específica de LIDs 22,37,41.

Aquí, describiremos cómo inducir y analizar movimientos similares a los discinéticos (AIM axiales, de extremidades y orolinguales) en el modelo de EP de rata severa (>90%) con lesión unilateral de 6-OHDA. Organizamos nuestro protocolo basándonos en la literatura previa y nuestra experiencia en laboratorio.

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Protocol

Todos los experimentos fueron realizados de acuerdo con el Comité de Ética de la Facultad de Filosofía, Ciencias y Letras de Ribeirão Preto (CEUA/FFCLRP 18.5.35.59.5).

1. Lesión 6-OHDA

  1. Utilice ratas macho Sprague-Dawley que pesen 200-250 g al comienzo de los experimentos (6 semanas). Alojar a los animales (2-3 por jaula) en condiciones estándar de laboratorio (12:12 h ciclo de luz/oscuridad, luces encendidas a las 06:00 h, instalaciones con temperatura controlada (22-24 °C), con comida y agua disponibles ad libitum.
    NOTA: Una descripción completa de cómo generar ratas graves con lesión de 6-OHDA se describe en otra parte42.
  2. Aclimatar adecuadamente a los animales antes del comienzo de cualquier procedimiento experimental.
  3. Administrar (intraperitonealmente, i.p.) el inhibidor del transportador de norepinefrina imipramina (20 mg/kg, disuelto en solución salina al 0,9%) 30 min antes de la cirugía.
    NOTA: La administración de imipramina aumentará la selectividad de 6-OHDA para las neuronas dopaminérgicas.
  4. Administrar ketamina/xilazina (70/10 mg/kg) por vía intraperitoneal.
  5. Asegúrese de que el animal esté profundamente anestesiado por la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie y colocado en posición prona en el aparato estereotáxico en la parte superior de una almohadilla térmica.
  6. Retire el pelaje de la cabeza y desinfecte el área quirúrgica 3 veces, alternando entre un exfoliante a base de yodo y alcohol.
  7. Use un bisturí para hacer una incisión (aproximadamente 1 cm) en la región donde se producirá la microinyección.
  8. Limpie la región del cráneo con hisopos de algodón y asegúrese de que el Bregma y la Lambda estén expuestos.
  9. Asegúrese de que las coordenadas estereotáxicas MFB se toman de bregma43,44,45: -4,3 mm anterior, 1,6 mm lateral (lado derecho) y 8,3 mm ventral (de la duramadre).
  10. Administrar el 6-OHDA a una velocidad de 0,4 μL/min (10 μg en 4 μL de solución salina que contiene 0,1% de ácido ascórbico) unilateralmente en el haz prosencéfalo medial derecho (MFB) utilizando una jeringa de vidrio Hamilton de 50 μL.
  11. Al final de la cirugía, suturar la incisión del cuero cabelludo y rehidratar al animal con solución salina estéril al 0,9% tibia (~37 °C) (~10 mL/kg, s.c.).
  12. Retire al animal del marco estereotáxico y colóquelo en una jaula de recuperación calentada. Monitorear hasta que se recupere la conciencia.
  13. Evaluar la efectividad de la lesión dopaminérgica 4 semanas después de la lesión mediante una prueba de paso46,47.
    NOTA: En esta prueba, la acinesia de la extremidad anterior contralateral a la lesión se evalúa a través del número de pasos de ajuste con la pata delantera contralateral a la lesión. Las ratas que presentan tres o menos pasos de ajuste con el miembro anterior contralateral se incluyen en el estudio como ratas putativas con lesión severa de 6-OHDA48.

2. Tratamiento crónico L-DOPA

  1. Comience el tratamiento crónico el lunes, 4 semanas después de la lesión 6-OHDA.
    NOTA: Dado que los AIM se grabarán en video durante 3 días consecutivos por semana (miércoles, jueves y viernes) durante 3 semanas, se recomienda comenzar el tratamiento el lunes.
  2. Tratar a las ratas con L-DOPA recién preparada (vía subcutánea (s.c.), 1 mL/kg) más clorhidrato de benserazida (5 mg/kg y 12,5 mg/kg, respectivamente) durante 3 semanas, una vez al día de lunes a viernes45.
    NOTA: Una vez establecidos, los AIM se manifestarán con cada administración de L-DOPA. Por lo tanto, la administración de L-DOPA 2-4 veces a la semana después del período de inducción de 3 semanas es suficiente para mantener una expresión estable de AIMs48.

3. Grabación y puntuación de AIMs

  1. Realizar experimentos entre las 09:00 h y las 17:00 h. Asegúrese de que el investigador desconoce por completo la identidad de las ratas y el tratamiento farmacológico.
  2. Coloque cuidadosamente a la rata dentro de un cilindro transparente (20 cm de diámetro x 40 cm de alto) y deje que se aclimate durante al menos 15 minutos. Asegúrese de que el piso esté cubierto con el material de la cama. Los espejos deben colocarse detrás del cilindro para que el experimentador pueda observar al animal desde todos los ángulos posibles.
    NOTA: Si hay más de una rata por experimento, use un cilindro para cada rata. La manipulación de los animales entre sesiones puede interferir con el análisis de comportamiento.
  3. Coloque una cámara de video de alta resolución de una manera que favorezca la visualización de AIM axiales, de extremidades y orolinguales. Dado que el comportamiento rotacional está presente en estas condiciones experimentales, los espejos detrás del cilindro permitirán rastrear AIMs en un ángulo de 360°. Utilice un trípode o fije la cámara directamente al banco.
    NOTA: Los AIM orolingües pueden ser difíciles de puntuar, especialmente si hay una alta incidencia de comportamiento rotacional. Capturar videos con la cámara colocada ligeramente debajo del plano donde los animales están en un ángulo de 15 ° ayudará a observar este subtipo de movimiento.
  4. Retirar suavemente el animal del cilindro y administrar L-DOPA (5 mg/kg combinado con 12,5 mg/kg de benserazida, s.c.).
  5. Vuelva a colocar al animal en el cilindro y encienda un temporizador para rastrear AIMs después de la inyección de L-DOPA. Utilice una cámara de vídeo para grabar AIMs durante 180 minutos después de la inyección de L-DOPA. Aunque el análisis se puede llevar a cabo mediante la observación directa del animal, se prefiere la puntuación fuera de línea.
    NOTA: Asegúrese de que el temporizador también esté grabado en video para que los AIM se puedan calificar en momentos precisos después de la administración de L-DOPA.
  6. Puntuar AIMs a intervalos de 30 min hasta 180 min después de la inyección de L-DOPA (ver Tabla 1 para las definiciones) como se describió inicialmente20,23. Las puntuaciones deben darse en épocas de 1-2 minutos y clasificarse como axiales, de extremidades u orolinguales (Figura 1).
  7. Observe cuidadosamente cada AIM y las puntuaciones de atributos para la gravedad y la amplitud. Utilice la Tabla 1 para obtener instrucciones. No incluya comportamientos normales, como criar, oler, acicalarse y roer en la calificación. Habrá un total de seis períodos de observación (30, 60, 90, 120, 150 y 180 min).
SUBTIPOS
Axial: torsión de cabeza, cuello y tronco
Extremidad: movimientos involuntarios de la extremidad anterior distal y proximal
Orolingual: movimientos involuntarios de los músculos orofaciales
SEVERIDAD
0: Ausente
1: Ocasional (con interrupciones, presente en menos de la mitad del tiempo de observación)
2: Frecuente (con interrupciones pero presente en más de la mitad del tiempo de observación)
3: Continuo pero interrumpido por estímulos sensoriales externos
4: Continuo y no interrumpido por estímulos sensoriales externos
AMPLITUD
Axial
1: Torsión de cabeza y cuello en un ángulo de aproximadamente 30°
2: Torsión de la cabeza y el cuello en un ángulo de aproximadamente 30° < ≤ 60°
3: Torsión de la cabeza, el cuello y la parte superior del tronco en un ángulo de aproximadamente 60° < ≤ 90°
4: Torsión de la cabeza, el cuello y el tronco en > ángulo de 90°, lo que a menudo hace que la rata pierda el equilibrio
Miembro
1: Pequeños movimientos involuntarios de la extremidad anterior distal
2: Movimientos de baja amplitud que causan translocación de las extremidades anteriores distales y proximales
3: Movimientos involuntarios de toda la extremidad, incluidos los músculos del hombro
4: Movimientos fuertes de las extremidades y los hombros, a menudo similares al balismo
Orolingüe
1: Pequeños movimientos involuntarios de los músculos orofaciales
2: Movimientos orofaciales de gran amplitud con protuberancia de la lengua

Cuadro 1: Definición y criterios de calificación del AIMS.

Figure 1
Figura 1: Secuencia de fotos que muestran cada subtipo AIM. (A a A'") AIM axial que muestra movimientos distónicos en diferentes ángulos (A: ángulo de 30°, A': ángulo de < de 30° ≤ 60°, A": ángulo de < de 60° ≤ 90° y A'": ángulo de > 90°). (B a B") Miembro AIM (flechas negras) que muestra movimientos involuntarios de la extremidad distal (B y B') y de toda la extremidad anterior (incluido el hombro, B"). (C) AIM orolingual (flecha roja) de gran amplitud con protuberancia de la lengua. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

4. Análisis de datos

  1. Calcular los subtipos de AIM axiales, de extremidades u orolinguales multiplicando las puntuaciones de gravedad y amplitud para cada período de observación después de la administración de L-DOPA (es decir, seis períodos de observación) como se describió anteriormente20. La puntuación máxima teórica que un animal podría acumular en una sesión de prueba es de 240 (la puntuación máxima por período de observación es de 40, véase la Tabla 1 para más detalles).
  2. Trazar las puntuaciones de AIMs para los seis períodos de observación registrados el miércoles, jueves y viernes durante las 3 semanas de administración crónica de L-DOPA (Figura 2). Los AIM se pueden resumir para indicar la puntuación máxima de cada animal en cada día de puntuación (Figura 3) o cada semana (Figura 4) durante las 3 semanas de administración crónica de L-DOPA.
  3. Verifique si los datos tienen una distribución cercana a la normal antes de seleccionar el enfoque de análisis estadístico.
    NOTA: Las escalas de calificación de AIM consisten en datos ordinales y se pueden analizar con estadísticas no paramétricas. Las pruebas paramétricas son ampliamente utilizadas cuando se comparan las puntuaciones de AIMs entre grupos experimentales después de sesiones de prueba repetidas40.

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Representative Results

Aunque los patrones AIMs observados en ratas son más simples y limitados en comparación con los observados en humanos y primates no humanos, este modelo reproduce movimientos hipercinéticos y distónicos inducidos por la administración crónica de L-DOPA. Aquí presentamos los datos recogidos de un grupo (n = 10) de ratas lesionadas unilateralmente con 6-OHDA tratadas crónicamente con L-DOPA (5 mg/kg combinado con 12,5 mg/kg de benserazida) durante 3 semanas (de lunes a viernes). Tenga en cuenta que los datos presentados en la Figura 2, Figura 3 y Figura 4 son de los mismos animales.

La Figura 2 muestra el análisis del curso temporal para las puntuaciones aplicadas a los AIM axiales, de extremidades y orolinguales durante 3 semanas de administración crónica de L-DOPA. Cada subtipo de puntuación AIM en un período de observación específico se informa como la multiplicación de las puntuaciones de gravedad y amplitud en este análisis. Este tipo de análisis puede ser conveniente para explorar el efecto de los fármacos que interfieren con el perfil temporal de los AIMs.Tenga en cuenta que las discinesias de dosis pico inducidas por L-DOPA ocurren entre 30-90 min con una disminución gradual después de 120 min después de la inyección (Figura 2).

Figure 2
Figura 2: Análisis de curso de tiempo que muestra AIM axiales, de extremidades y orolinguales durante 3 semanas de administración crónica de L-DOPA (5 mg / kg combinado con 12.5 mg / kg de benserazida) a ratas lesionadas con 6-OHDA. (A) Los AIM axiales, (B) de extremidades y (C) orolinguales se calificaron el miércoles, jueves y viernes durante 3 semanas de administración crónica de L-DOPA. Cada subtipo de AIM se informa como la multiplicación de la gravedad por la amplitud en cada uno de los seis períodos de observación. Cada subtipo de AIM puede analizarse individualmente o resumirse como se indica en (D). Tenga en cuenta que la gravedad máxima de los AIM aumentará gradualmente durante la primera semana de administración crónica de L-DOPA. Los datos se expresan como media ± SEM (n = 10). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La Figura 3 muestra la suma de los puntajes de AIMs presentados para los seis períodos de observación representados en la Figura 2 (los conjuntos de datos están codificados por colores para facilitar las comparaciones). Este análisis indica la puntuación máxima de cada animal en cada día de puntuación (miércoles, jueves y viernes) durante las 3 semanas de administración crónica de L-DOPA. Este tipo de análisis puede ser ventajoso para explorar el efecto de compuestos con posibles perfiles antidiscinéticos, especialmente porque las puntuaciones de AIMs son estables durante las semanas 2 y 3 de la administración crónica de L-DOPA. Además, las puntuaciones semanales de AIMs (Figura 4) se pueden generar a partir de la suma de las puntuaciones atribuidas a ratas lesionadas con 6-OHDA el miércoles, jueves y viernes.

Figure 3
Figura 3: Suma de AIM axiales, de extremidades y orolinguales en días de puntuación individuales durante 3 semanas de administración crónica de L-DOPA (5 mg/kg combinado con 12,5 mg/kg de benserazida) a ratas con lesión de 6-OHDA. En esta figura, se sumaron las puntuaciones de los AIM presentadas en cada uno de los seis períodos de observación (ver detalles en la leyenda de la Figura 2). Los conjuntos de datos individuales se codificaron por colores para compararlos con los datos que se muestran en la Figura 2. Este análisis indica la puntuación máxima de cada animal en cada día de puntuación (miércoles - W, jueves - T y viernes - F) después de 3 semanas de administración crónica de L-DOPA. (A) Axial, (B) Miembro y (C) AIM orolingües. (D) Suma de AIM axiales, de extremidades y orolinguales. Las medidas repetidas unidireccionales ANOVA y la prueba post-hoc de Holm-Sidak revelaron que los MIA aumentan gradualmente sobre la administración crónica de L-DOPA. Tenga en cuenta que las puntuaciones de AIMs son estables durante las semanas 2 y 3 de la administración crónica de L-DOPA (*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 vs. miércoles (W) en la semana 1). Los datos se expresan como media ± SEM (n = 10). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Suma de AIM axiales, de extremidades y orolinguales semanales durante la administración crónica de L-DOPA (5 mg/kg combinados con 12,5 mg/kg de benserazida) a ratas lesionadas con 6-OHDA. En esta figura, se sumaron los AIM puntuados cada semana (miércoles, jueves y viernes, ver Figura 3). Este análisis indica la puntuación máxima de cada animal en cada semana de administración crónica de L-DOPA. (A) Axial, (B) Miembro y (C) AIM orolingües. (D) Suma de AIM axiales, de extremidades y orolinguales. Las medidas repetidas unidireccionales ANOVA y la prueba post-hoc de Holm-Sidak revelaron que los MIA aumentan sobre la administración crónica de L-DOPA (*p < 0.05 vs. Semana 1). Los datos se expresan como media ± SEM (n = 10). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este protocolo demuestra cómo inducir y analizar AIMs en el modelo de rata de PD inducida por microinyección unilateral de 6-OHDA en el MFB. La administración crónica diaria de dosis bajas de L-DOPA (5 mg/kg, combinada con 12,5 mg/kg de benserazida) produjo el desarrollo de AIMs durante las 3 semanas de tratamiento. El análisis temporal reveló un aumento significativo de AIMs, y la discinesia de dosis máxima se observa entre 30 y 90 min después de la administración de L-DOPA. Los AIM son movimientos repetitivos y sin propósito que afectan a los músculos axiales, de las extremidades y orolinguales. El protocolo y los datos aquí presentados concuerdan con la literatura previa 22,23,49,50,51.

La escala de calificación AIMs axial, de extremidades y orolingual es muy sensible porque califica la cantidad de tiempo (es decir, la gravedad) que los roedores muestran movimientos discinéticos e indica la amplitud de estos movimientos20. Las puntuaciones de los AIM pueden expresarse en diferentes resoluciones temporales (ver Figura 2, Figura 3, Figura 4)17,18,19,52. Varios estudios han abordado el papel de la dosis de L-DOPA en el desarrollo de AIMs. La administración crónica de dosis más bajas de L-DOPA (5-20 mg/kg) favorece un desarrollo gradual de AIMs durante el tratamiento, mientras que altas dosis de L-DOPA (25 mg/kg o más) resultan en el desarrollo rápido y robusto de AIMs 23,25,27,53. Curiosamente, una proporción de animales graves lesionados con 6-OHDA puede no desarrollar AIMs (o tener puntuaciones AIMs muy bajas) después de la administración crónica de dosis bajas de L-DOPA40,49,53. También es esencial considerar la vía de administración de la L-DOPA. Aunque los MIA comparten un inicio similar, un perfil de tiempo y un grado de gravedad40, se ha demostrado que los episodios de fracaso de la dosis ocurrieron con frecuencia en ratas tratadas por vía intraperitoneal27. Además, la administración i.p. de L-DOPA produjo variaciones interindividuales en los niveles plasmáticos, efecto que no fue observado después de las inyecciones de s.c.27.

En este estudio, los AIM fueron evidentes en animales con daño nigroestriatal severo (más del 90% de la depleción dopaminérgica). La pérdida masiva de la inervación dopaminérgica estriatal se caracteriza por una reducción en el número de pasos de ajuste realizados con el miembro anterior contralateral a la lesión48. Por lo tanto, recomendamos la prueba de paso para seleccionar animales con lesiones graves putativas de 6-OHDA en la vía nigroestriatal. La prueba de rotación inducida por anfetaminas se usa comúnmente para seleccionar ratas putativas con lesión de 6-OHDA. La anfetamina aumenta la liberación de dopamina en el cuerpo estriado intacto y, por lo tanto, aumenta el desequilibrio existente entre el cuerpo estriado inervado y denervado. Sin embargo, un interesante estudio realizado en 312 ratas con lesión de 6-OHDA11 no reveló correlación entre la rotación inducida por anfetaminas y las células tirosina hidroxilasa positivas en la sustancia ipsilateral nigra pars compacta. Este mismo estudio mostró una correlación pobre entre la rotación inducida por anfetaminas y la gravedad de los AIM.

Existe una clara relación entre la fenomenología de los MIA y el patrón de depleción dopaminérgica nigroestriatal20. El modelo de EP de rata 6-OHDA que utilizamos en este protocolo desarrolla una depleción unilateral severa de los terminales de dopamina nigroestriatal después de la infusión de 6-OHDA en el MFB. Las ratas con lesiones de 6-OHDA completamente depletos de dopamina tienen una mayor incidencia de AIMs en comparación con los animales parcialmente agotados en dopamina. Un análisis detallado de la expresión estriada de los neuropéptidos dinorfina y encefalina después de la lesión de 6-OHDA y la administración crónica de L-DOPA se describe en otra parte45 y es consistente con la literatura previa23,25. A nivel molecular, los roedores discinéticos comparten marcadores moleculares asociados con la discinesia evidente en modelos de primates no humanos de pacientes con EP y EP, como la regulación positiva estriatal del factor de transcripción ΔFosB 26,32,33,54. Además, el modelo de EP en roedores muestra un aumento de la densidad de microvasos en el cuerpo estriado en respuesta al tratamiento con L-DOPA55 de manera similar observada en el putamen de pacientes con EP56. Los modelos de roedores de LID responden a los enfoques farmacológicos antidiscinéticos utilizados en la clínica, como el antagonista del receptor NMDA amantadina 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35,36,37, 38,39. En conjunto, estas pruebas confirman la validez facial y la validez predictiva del modelo de rata 6-OHDA para caracterizar la fisiopatología de los LID y para el cribado de compuestos con propiedades antidiscinéticas. El modelo de ratones de LIDs también es una herramienta valiosa para estudiar varios aspectos de LIDs en ratones transgénicos. Los protocolos para el modelo de LIDs en ratones se pueden encontrar en artículos de diferentes grupos de investigación 30,57,58.

Es importante tener en cuenta que el modelo de LID con lesión de 6-OHDA tiene limitaciones. La depleción dopaminérgica inducida por 6-OHDA es aguda en comparación con la naturaleza progresiva de la depleción nigroestriatal en el paciente con EP5. Además, puede ser difícil encontrar una excelente ventana terapéutica para el uso de un fármaco antidiscinético en pacientes porque el aumento de la dosis de un fármaco puede interferir con el efecto beneficioso producido por L-DOPA o inducir efectos secundarios que pueden no haber sido observados en el modelo animal59,60. Otra limitación del modelo de LIDs en ratas es la falta de similitud física entre los AIM en los roedores y la manifestación de los movimientos coreiformes observados en pacientes y primates no humanos 10,61,62. Otra limitación potencial del protocolo presentado aquí es que los AIM se puntúan cada 30 minutos después de la administración de L-DOPA, pero este problema se puede manejar si el experimentador graba en video a todos los animales durante 180 minutos después de la administración de L-DOPA. El experimentador puede ajustar el protocolo de puntuación para una puntuación más frecuente (por ejemplo, cada 10 o 20 minutos). Este enfoque es ventajoso en experimentos que requieren una imagen más dinámica del curso temporal de AIMs (por ejemplo, la combinación de puntuación AIMs y registros electrofisiológicos o neuroquímicos in vivo).

En conclusión, el modelo de LID en rata 6-OHDA reproduce la fisiopatología de la enfermedad y desarrolla AIMs que pueden ser modulados por fármacos clínicamente utilizados. Aunque tiene limitaciones, el modelo de LID en rata 6-OHDA todavía representa una herramienta preclínica invaluable para identificar intervenciones antidiscinéticas efectivas con potencial traslacional.

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Disclosures

Los autores no tienen conflictos de intereses.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por la Fundación de Investigación de São Paulo (FAPESP, beca 2017/00003-0). Agradecemos la Coordinación para el Perfeccionamiento del Personal de Educación Superior (CAPES). Agradecemos al Dr. Anthony R. West, al Dr. Heinz Steiner y al Dr. Kuei Y. Tseng por su apoyo y tutoría.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-hydroxydopamine hydrobromide Sigma-Aldrich, USA H6507 Neurotoxin that produces degeneration of catecholaminergic terminals
Benzerazide hydrochloride Sigma B7283 Peripheral dopa-decarboxylase inhibitor
Camera Bullet IR Turbo HD (HD-TVI)  2.8mm B HIKVISION DS-2CE16C0T-IRP Camera used to record all behavior
Imipramine hidrochloride Alfa Aesar J63723 Norepinephrine transporter inhibitor (NET) used to protect noradrenergic neurons from 6-OHDA
Ketamine hydrochloride Ceva Animal Health Anesthesia for surgical intervention
L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) methyl ester (hydrochloride) Cayman Chemical Company 16149 Dopamine precursor
Mirrors Used to observe the behavior of animals during experiments in all directions
Needles 0.30 x 13 mm PrecisionGlide Needles used to inject drugs
Sodium chloride (NaCl) Samtec Salt
Syringes 1 ml Sterile BD Plastipak Syringes used to inject drugs
Transparent cylinders Used to record animal behavior during experiments
Xylazine hydrochloride Ceva Animal Health Sedative, analgesic and muscle relaxant for surgical intervention

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biología Número 176 Enfermedad de Parkinson ganglios basales 6-hidroxidopamina discinesias inducidas por L-DOPA movimientos involuntarios anormales
Calificación de discinesias inducidas por L-DOPA en el modelo de rata lesionada unilateralmente con 6-OHDA de la enfermedad de Parkinson
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