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Biology

Avaliação de discinesias induzidas por L-dopa no modelo unilateralmente de ratos lesionados com 6-OHDA da doença de Parkinson

Published: October 4, 2021 doi: 10.3791/62924
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Psychology, Faculty of Philosophy, Sciences and Letters of Ribeirão Preto, University of São Paulo
* These authors contributed equally

Summary

Modelos de roedores de discinesias induzidas por L-dopa são ferramentas inestimáveis para identificar intervenções terapêuticas para atenuar o desenvolvimento ou aliviar as manifestações que surgem devido à administração repetida de L-DOPA. Este protocolo demonstra como induzir e analisar movimentos discinéticos no modelo unilateral de ratos lesionados com 6-OHDA da doença de Parkinson.

Abstract

As discinesias induzidas por L-dopa (LIDs) referem-se a complicações motoras que surgem da administração prolongada de L-DOPA em pacientes com doença de Parkinson (DP). O padrão mais comum observado na clínica é a discinesia de dose máxima, que consiste em manifestações clínicas de movimentos coreiformes, distônicos e balísticos. O modelo de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) de PD em ratos imita várias características dos LIDs. Após administração repetida de L-DOPA, ratos com lesão de 6-OHDA exibem movimentos discinéticos semelhantes (por exemplo, movimentos involuntários anormais, AIMs). Este protocolo demonstra como induzir e analisar AIMs em ratos com lesão de 6-OHDA com depleção dopaminérgica de 90%-95% na via nigrostriatal. A administração repetida (3 semanas) de L-DOPA (5 mg/kg, combinada com 12,5 mg/kg de benserazida) pode induzir o desenvolvimento de AIMs. A análise do curso do tempo revela um aumento significativo nos AIMs em 30-90 min (discinesia de dose máxima). Modelos de roedores de LIDs são uma importante ferramenta pré-clínica para identificar intervenções antidiscinéticas eficazes.

Introduction

O precursor da dopamina L-3,4-di-hidroxifenilalanina (L-DOPA) representa o tratamento mais eficaz para os sintomas motores da doença de Parkinson (DP)1. A terapia com L-DOPA pode melhorar os sintomas motores associados à DP, mas perde a eficácia com o tempo. Flutuações motoras como "flutuação de desgaste" ou "deterioração do fim da dose" manifestam-se clinicamente como uma duração encurtada do efeito de doses únicas de L-DOPA2. Em outros casos, as manifestações clínicas consistem em movimentos lentos de torção e posturas anormais (distonia)3 e ocorrem quando os níveis de dopamina são baixos (distonia fora do período)4. Por outro lado, as discinesias induzidas por L-DOPA (LIDs) aparecem quando os níveis de dopamina no plasma e no cérebro são altos5.

Os LIDs produzem efeitos colaterais debilitantes que incluem complicações motoras, como movimentos coriformes, distônicos e balísticos6. Uma vez estabelecidos, os LIDs ocorrem após cada administração de L-DOPA. Complicações motoras ocorrem em 40%-50% dos pacientes com DP submetidos à terapia com L-DOPA por 5 anos, e a incidência aumenta ao longo dos anos7. Embora os mecanismos fisiopatológicos envolvidos no desenvolvimento de LIDs em pacientes com DP ainda não estejam totalmente elucidados, a extensão da denervação dopaminérgica, a administração pulsátil de L-DOPA, as alterações a jusante nas proteínas e genes estriatais e as anormalidades nos sistemas transmissores não dopaminérgicos são fatores que contribuem para o desenvolvimento desses efeitos colaterais indesejados 6,8,9,10.

A neurotoxina 6-hidroxidopamina (6-OHDA) é uma ferramenta bem caracterizada para estudar a DP em roedores11,12,13,14. Uma vez que a 6-OHDA não atravessa a barreira hematoencefálica, deve ser injetada diretamente na via nigrostriatal. A depleção dopaminérgica induzida por 6-OHDA é dependente da concentração e do local15. A administração unilateral de 6-OHDA no feixe do prosencéfalo medial (MFB) pode produzir dano nigrostriatal grave (>90%) em roedores16,17,18,19. A administração crônica de L-DOPA a roedores graves lesionados unilateralmente com 6-OHDA causa o aparecimento de movimentos discinéticos denominados movimentos involuntários anormais (AIMs). Movimentos discinéticos em roedores compartilham mecanismos moleculares, funcionais e farmacológicos semelhantes relacionados aos LIDs em pacientes com DP5. Portanto, ratos lesionados com 6-OHDA20 e camundongos21 são modelos pré-clínicos valiosos para estudar LIDs. Quando tratados cronicamente (7-21 dias) com doses terapêuticas de L-DOPA (5-20 mg/kg), ratos e camundongos lesionados com 6-OHDA apresentam um desenvolvimento gradual de MIAs que acometem os músculos do membro anterior, tronco e orofacial contralaterais à lesão 17,18,19,20,22,23,24 . Esses movimentos são apresentados em um curso temporal semelhante às discinesias de dose máxima induzidas por L-dopa em pacientes com DP25 e são caracterizados por movimentos hipercinéticos e distonia5. Os MIAs geralmente são pontuados com base em sua gravidade (por exemplo, quando uma IAM específica está presente) e amplitude (por exemplo, caracterizada pela amplitude de cada movimento)5,23,25.

Os modelos de LIDs de roedores lesados por 6-OHDA apresentam validade de face (ou seja, o modelo possui diversas características que se parecem com a condição humana)5,11,26,27,28. Os MIAs de roedores, semelhantes ao que ocorre em pacientes com DP, são vistos como movimentos hipercinéticos (membros anteriores e orolinguais) e distônicos (axiais)29 e imitam discinesia de dose máxima. No nível molecular e funcional, os modelos de roedores compartilham muitas características patológicas com pacientes com DP5, como a regulação positiva de FosB/ΔFosB 19,26,30,31,32,33 e do transportador de serotonina (SERT)34,35 . Em relação à validade preditiva, os fármacos que reduzem os LIDs em pacientes com DP (por exemplo, o antagonista do receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) amantadina) apresentam eficácia antidiscinética no modelo roedor 22,36,37,38,39.

A escala de classificação de AIMs de roedores foi criada com base em quatro subtipos de AIMs que incluem AIMs que afetam a cabeça, pescoço e tronco (AIMs axiais), movimentos hipercinéticos dos membros anteriores (AIMs de membros) e movimentos orolinguais discinéticos (AIMs orolinguais). Embora a rotação contralateral (AIM locomotores) também esteja presente em roedores lesionados unilateralmente 20,22,23,25,40, ela não foi pontuada como um movimento discinético, uma vez que pode não representar uma medida específica dos LIDs 22,37,41.

Aqui, descreveremos como induzir e analisar movimentos discinéticos (AIMs axial, de membros e orolinguais) no modelo de DP de ratos com lesão unilateral de 6-OHDA grave (>90%). Organizamos nosso protocolo com base na literatura anterior e em nossa expertise laboratorial.

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Protocol

Todos os experimentos foram realizados de acordo com o Comitê de Ética da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto (CEUA/FFCLRP 18.5.35.59.5).

1. Lesão de 6-OHDA

  1. Use ratos machos Sprague-Dawley pesando 200-250 g no início dos experimentos (6 semanas). Abrigar os animais (2-3 por gaiola) em condições normais de laboratório (ciclo claro/escuro das 12:12 h, luzes acesas às 06:00 h, instalações com temperatura controlada (22-24 °C), com comida e água disponíveis ad libitum.
    NOTA: Uma descrição completa de como gerar ratos graves com lesão de 6-OHDA é descrita em outro lugar42.
  2. Aclimatar adequadamente os animais antes do início de qualquer procedimento experimental.
  3. Administrar (intraperitonealmente, i.p.) o inibidor do transportador de noradrenalina imipramina (20 mg/kg, dissolvido em solução salina a 0,9%) 30 min antes da cirurgia.
    NOTA: A administração de imipramina aumentará a seletividade da 6-OHDA para neurônios dopaminérgicos.
  4. Administrar cetamina/xilazina (70/10 mg/kg) por via intraperitoneal.
  5. Certifique-se de que o animal esteja profundamente anestesiado pela falta de resposta à beliscação do dedo do pé e posicionado em posição prona no aparelho estereotáxico no topo de uma almofada de aquecimento.
  6. Remova o pelo na cabeça e desinfete a área cirúrgica 3 vezes, alternando entre um esfoliante à base de iodo e álcool.
  7. Use um bisturi para fazer uma incisão (aproximadamente 1 cm) na região onde a microinjeção ocorrerá.
  8. Limpe a região do crânio com cotonetes e certifique-se de que o Bregma e o Lambda estejam expostos.
  9. Certifique-se de que as coordenadas estereotáxicas da MFB sejam retiradas do bregma43,44,45: -4,3 mm anterior, 1,6 mm lateral (lado direito) e 8,3 mm ventral (da dura-máter).
  10. Administrar a 6-OHDA a uma taxa de 0,4 μL/min (10 μg em 4 μL de solução salina contendo ácido ascórbico a 0,1%) unilateralmente no feixe do prosencéfalo medial direito (MFB) usando uma seringa de vidro Hamilton de 50 μL.
  11. Ao final da cirurgia, suture a incisão do couro cabeludo e reidrate o animal com solução salina a 0,9% estéril, quente (~37 °C) (~10 mL/kg, s.c.).
  12. Remova o animal da estrutura estereotáxica e coloque-o em uma gaiola de recuperação aquecida. Monitore até que a consciência seja recuperada.
  13. Avaliar a efetividade da lesão dopaminérgica 4 semanas após a lesão por meio de um teste de stepping46,47.
    NOTA: Neste teste, a acinesia do membro anterior contralateral à lesão é avaliada através do número de passos de ajuste com a pata anterior contralateral à lesão. Ratos que apresentam três ou menos passos de ajuste com o membro anterior contralateral são incluídos no estudo como supostos ratos gravemente lesionados com 6-OHDA48.

2. Tratamento crônico com L-DOPA

  1. Inicie o tratamento crônico na segunda-feira, 4 semanas após a lesão da 6-OHDA.
    NOTA: Como os AIMs serão filmados por 3 dias consecutivos por semana (quarta, quinta e sexta-feira) durante 3 semanas, recomenda-se iniciar o tratamento na segunda-feira.
  2. Trate os ratos com L-DOPA recém-preparada (via subcutânea (s.c.), 1 mL/kg) associada a cloridrato de benserazida (5 mg/kg e 12,5 mg/kg, respectivamente) por 3 semanas, uma vez ao dia, de segunda a sexta-feira45.
    NOTA: Uma vez estabelecidos, os AIMs se manifestarão com cada administração de L-DOPA. Portanto, a administração de L-DOPA 2-4 vezes por semana após o período de indução de 3 semanas é suficiente para manter uma expressão estável de AIMs48.

3. Registo e pontuação dos AIMs

  1. Realizar experimentos entre 09:00 h e 17:00 h. Certifique-se de que o investigador desconhece totalmente a identidade e o tratamento farmacológico dos ratos.
  2. Coloque cuidadosamente o rato dentro de um cilindro transparente (20 cm de diâmetro x 40 cm de altura) e deixe-o se aclimatar por pelo menos 15 min. Certifique-se de que o chão esteja coberto com o material de cama. Os espelhos devem ser posicionados atrás do cilindro para que o experimentador possa observar o animal de todos os ângulos possíveis.
    NOTA: Se houver mais de um rato por experimento, use um cilindro para cada rato. A manipulação dos animais entre as sessões pode interferir na análise comportamental.
  3. Posicione uma câmera de vídeo de alta resolução de uma forma que favoreça a visualização de AIM axiais, membros e orolinguais. Como o comportamento rotacional está presente nessas condições experimentais, os espelhos atrás do cilindro permitirão rastrear os AIMs em um ângulo de 360°. Use um tripé ou fixe a câmera diretamente no banco.
    NOTA: Os MIAs orolinguais podem ser difíceis de pontuar, especialmente se houver uma alta incidência de comportamento rotacional. Capturar vídeos com a câmera posicionada ligeiramente abaixo do plano onde os animais estão em um ângulo de 15° ajudará a observar esse subtipo de movimento.
  4. Retirar suavemente o animal da garrafa e administrar L-DOPA (5 mg/kg combinados com 12,5 mg/kg de benserazida, s.c.).
  5. Coloque o animal de volta no cilindro e inicie um temporizador para rastrear os AIMs após a injeção de L-DOPA. Use uma câmera de vídeo para gravar AIMs por 180 minutos após a injeção de L-DOPA. Embora a análise possa ser realizada por observação direta do animal, a pontuação off-line é preferida.
    NOTA: Certifique-se de que o temporizador também seja filmado para que os AIMs possam ser pontuados em momentos precisos após a administração de L-DOPA.
  6. Pontuação AIMs em intervalos de 30 minutos até 180 min pós-injeção de L-DOPA (ver Tabela 1 para definições), conforme descrito inicialmente20,23. Os escores devem ser dados ao longo de 1-2 min e classificados em axial, membro ou orolingual (Figura 1).
  7. Observe cuidadosamente cada AIM e atribua escores de gravidade e amplitude. Use a Tabela 1 para obter instruções. Não inclua comportamentos normais, como criar, cheirar, cuidar e roer na classificação. Haverá um total de seis períodos de observação (30, 60, 90, 120, 150 e 180 min).
SUBTIPOS
Axial: torção da cabeça, pescoço e tronco
Membro: movimentos involuntários do membro anterior distal e proximal
Orolingual: movimentos involuntários da musculatura orofacial
SEVERIDADE
0: Ausente
1: Ocasional (com interrupções, presente em menos da metade do tempo de observação)
2: Frequente (com interrupções, mas presente em mais da metade do tempo de observação)
3: Contínuo, mas interrompido por estímulos sensoriais externos
4: Contínuo e não interrompido por estímulos sensoriais externos
AMPLITUDE
Axial
1: Torção da cabeça e pescoço em ângulo de aproximadamente 30°
2: Torção da cabeça e pescoço em aproximadamente 30° < ângulo ≤ 60°
3: Torção da cabeça, pescoço e tronco superior a aproximadamente 60° < ângulo ≤ 90°
4: Torção da cabeça, pescoço e tronco em > ângulo de 90°, muitas vezes fazendo com que o rato perca o equilíbrio
Membro
1: Pequenos movimentos involuntários do membro anterior distal
2: Movimentos de baixa amplitude causando translocação do membro anterior distal e proximal
3: Movimentos involuntários de todo o membro, incluindo os músculos do ombro
4: Movimentos fortes dos membros e ombros, muitas vezes semelhantes ao balismo
Orolingual
1: Pequenos movimentos involuntários dos músculos orofaciais
2: Movimentos orofaciais de alta amplitude com protrusão da língua

Quadro 1: Definição e critérios de classificação do AIMS.

Figure 1
Figura 1: Sequência de fotos mostrando cada subtipo AIM. (A a A'") AIM axial mostrando movimentos distônicos em diferentes ângulos (A: ângulo de 30°, A': ângulo de 30° < ≤ 60°, A": ângulo de 60° < ≤ 90° e A'": ângulo de > de 90°). (B a B") Objetivo do membro (setas pretas) mostrando movimentos involuntários do distal (B e B') e de todo o membro anterior (incluindo ombro, B"). (C) IAM-do-orolingual (seta vermelha) de alta amplitude com protrusão da língua. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. Análise dos dados

  1. Calcule os subtipos de AIMs axiais, de membros ou orolinguais multiplicando os escores de gravidade e amplitude para cada período de observação após a administração de L-DOPA (ou seja, seis períodos de observação), conforme descrito anteriormente20. A pontuação máxima teórica que um animal poderia acumular em uma sessão de teste é de 240 (a pontuação máxima por período de observação é 40, consulte a Tabela 1 para detalhes).
  2. Plote os escores dos AIMs para todos os seis períodos de observação registrados na quarta, quinta-feira e sexta-feira durante as 3 semanas de administração crônica de L-DOPA (Figura 2). Os MIAs podem ser somados para indicar a pontuação máxima de cada animal em cada dia de pontuação (Figura 3) ou a cada semana (Figura 4) durante as 3 semanas de administração crônica de L-DOPA.
  3. Verifique se os dados têm uma distribuição próxima do normal antes de selecionar a abordagem de análise estatística.
    NOTA: As escalas de classificação dos AIMs consistem em dados ordinais e podem ser analisadas com estatísticas não paramétricas. Os testes paramétricos são amplamente utilizados quando se comparam os escores dos AIMs entre grupos experimentais após repetidas sessões de teste40.

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Representative Results

Embora os padrões de MIAs observados em ratos sejam mais simples e limitados em comparação com os observados em humanos e primatas não humanos, este modelo reproduz movimentos hipercinéticos e distônicos induzidos pela administração crônica de L-DOPA. Aqui apresentamos dados coletados de um grupo (n = 10) de ratos lesionados unilateralmente com 6-OHDA tratados cronicamente com L-DOPA (5 mg/kg combinados com 12,5 mg/kg de benserazida) por 3 semanas (segunda a sexta-feira). Observe que os dados apresentados na Figura 2, Figura 3 e Figura 4 são dos mesmos animais.

A Figura 2 mostra a análise do curso temporal para os escores aplicados aos MIMs axiais, de membros e orolinguais ao longo de 3 semanas de administração crônica de L-DOPA. Cada subtipo de escore AIM em um período de observação específico é relatado como a multiplicação dos escores de gravidade e amplitude nesta análise. Este tipo de análise pode ser conveniente para explorar o efeito de drogas que interferem com o perfil temporal dos AIMs.Note que as discinesias de dose máxima induzidas por L-DOPA ocorrem entre 30-90 min com uma diminuição gradual após 120 min pós-injeção (Figura 2).

Figure 2
Figura 2: Análise do curso temporal mostrando AIMs axiais, membros e orolinguais ao longo de 3 semanas de administração crônica de L-DOPA (5 mg/kg combinados com 12,5 mg/kg de benserazida) a ratos lesionados com 6-OHDA. (A) AIMs axial, (B) membro e (C) orolingual foram pontuados na quarta, quinta-feira e sexta-feira ao longo de 3 semanas de administração crônica de L-DOPA. Cada subtipo de AIM é relatado como a multiplicação da amplitude dos tempos de severidade em cada um dos seis períodos de observação. Cada subtipo de AIM pode ser analisado individualmente ou resumido conforme indicado em (D). Observe que o pico de gravidade dos AIMs aumentará gradualmente durante a primeira semana de administração crônica de L-DOPA. Os dados são expressos como média ± MEV (n = 10). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 3 mostra a soma dos escores dos AIMs apresentados para todos os seis períodos de observação descritos na Figura 2 (os conjuntos de dados são codificados por cores para facilitar as comparações). Esta análise indica a pontuação máxima de cada animal em cada dia de pontuação (quarta, quinta-feira, e sexta-feira) ao longo das 3 semanas de administração crônica de L-DOPA. Este tipo de análise pode ser vantajoso para explorar o efeito de compostos com potenciais perfis antidiscinéticos, especialmente porque os escores dos AIMs são estáveis ao longo das semanas 2 e 3 da administração crônica de L-DOPA. Além disso, os escores semanais dos AIMs (Figura 4) podem ser gerados a partir da soma dos escores atribuídos aos ratos lesionados com 6-OHDA na quarta, quinta e sexta-feira.

Figure 3
Figura 3: Soma dos MIAs axiais, membros e orolinguais em dias de pontuação individuais durante 3 semanas de administração crônica de L-DOPA (5 mg/kg combinados com 12,5 mg/kg de benserazida) a ratos com lesão de 6-OHDA. Nesta figura, os escores dos MIAs apresentados em cada um dos seis períodos de observação (ver detalhes na legenda da Figura 2) foram somados. Os conjuntos de dados individuais foram codificados por cores para comparação com os dados apresentados na Figura 2. Esta análise indica a pontuação máxima de cada animal em cada dia de pontuação (quarta-feira - W, quinta-feira - T e sexta-feira - F) após 3 semanas de administração crônica de L-dopa. (A) AIMs axiais, (B) membros e (C) orolinguais. (D) Soma dos AIM axiais, membros e orolinguais. ANOVA de medidas repetidas unidirecionais e teste post-hoc de Holm-Sidak revelaram que os AIMs aumentam gradualmente ao longo da administração crônica de L-DOPA. Observe que os escores dos AIMs são estáveis ao longo das semanas 2 e 3 da administração crônica de L-DOPA (*p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 vs. quarta-feira (W) na Semana 1). Os dados são expressos como média ± MEV (n = 10). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Soma dos MIAs axiais, membros e orolinguais semanais durante a administração crônica de L-DOPA (5 mg/kg combinados com 12,5 mg/kg de benserazida) em ratos com lesão de 6-OHDA. Nesta figura, os AIMs pontuados a cada semana (quarta, quinta-feira e sexta-feira - ver Figura 3) foram somados. Esta análise indica a pontuação máxima de cada animal em cada semana de administração crônica de L-DOPA. (A) AIMs axiais, (B) membros e (C) orolinguais. (D) Soma dos AIM axiais, membros e orolinguais. ANOVA de medidas repetidas unidirecionais e teste post-hoc de Holm-Sidak revelaram que os AIMs aumentam ao longo da administração crônica de L-DOPA (*p < 0,05 vs. Semana 1). Os dados são expressos como média ± MEV (n = 10). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este protocolo demonstra como induzir e analisar AIMs no modelo de DP induzida por microinjeção unilateral de 6-OHDA na MFB. A administração diária crônica de baixas doses de L-DOPA (5 mg/kg, combinada com 12,5 mg/kg de benserazida) produziu o desenvolvimento de MIAs ao longo das 3 semanas de tratamento. A análise temporal revelou um aumento significativo dos AIMs, e a discinesia de dose máxima é observada entre 30 e 90 minutos após a administração de L-DOPA. Os MIAs são movimentos repetitivos e sem propósito que afetam os músculos axiais, membros e orolinguais. O protocolo e os dados aqui apresentados estão de acordo com a literatura anterior 22,23,49,50,51.

A escala de classificação dos AIMs axial, de membros e orolinguais é muito sensível, pois avalia a quantidade de tempo (ou seja, gravidade) que os roedores apresentam movimentos discinéticos e indica a amplitude desses movimentos20. Os escores dos MIAs podem ser expressos em diferentes resoluções temporais (ver Figura 2, Figura 3, Figura 4)17,18,19,52. Vários estudos têm abordado o papel da dosagem de L-DOPA no desenvolvimento de AIMs. A administração crônica de doses mais baixas de L-DOPA (5-20 mg/kg) favorece um desenvolvimento gradual de MIAs ao longo do tratamento, enquanto altas doses de L-DOPA (25 mg/kg ou mais) resultam no desenvolvimento rápido e robusto de MIAs 23,25,27,53. Curiosamente, uma proporção de animais graves lesionados com 6-OHDA pode não desenvolver AIMs (ou ter escores muito baixos de AIMs) após a administração crônica de baixas doses de L-DOPA40,49,53. Também é essencial considerar a via de administração do L-DOPA. Embora os MIAs compartilhem início, perfil de tempo e grau de gravidade40 semelhantes, foi demonstrado que os episódios de falha de dose ocorreram frequentemente em ratos tratados por via intraperitoneal27. Além disso, a administração intravenosa de L-DOPA produziu variações interindividuais nos níveis plasmáticos, efeito que não foi observado após as injeções de SC27.

Neste estudo, os MIAs foram evidentes em animais com dano nigrostriatal grave (mais de 90% da depleção dopaminérgica). A perda maciça da inervação dopaminérgica estriatal é caracterizada por uma redução no número de passos de ajuste realizados com o membro anterior contralateral à lesão48. Portanto, recomendamos o teste de stepping para selecionar animais com lesões graves de 6-OHDA putativas na via nigrostriatal. O teste de rotação induzido por anfetaminas é comumente usado para selecionar ratos supostamente lesionados com 6-OHDA. A anfetamina aumenta a liberação de dopamina no estriado intacto e, portanto, aumenta o desequilíbrio existente entre o estriado inervado e desnervado. No entanto, um interessante estudo realizado em 312 ratos lesionados com 6-OHDA11 não revelou correlação entre a rotação induzida por anfetamina e células positivas para tirosina hidroxilase na substância nigra pars compacta ipsilateral. Este mesmo estudo mostrou uma fraca correlação entre a rotação induzida por anfetaminas e a gravidade dos AIMs.

Existe uma clara relação entre a fenomenologia dos MIA e o padrão de depleção dopaminérgica nigrostriatal20. O modelo de DP de 6-OHDA em ratos que utilizamos neste protocolo desenvolve depleção unilateral grave de terminais dopaminérgicos nigrostriatais após infusão de 6-OHDA na MFB. Ratos totalmente empobrecidos de dopamina 6-OHDA-lesionados têm uma maior incidência de AIMs em comparação com animais parcialmente empobrecidos de dopamina. Uma análise detalhada da expressão estriatal dos neuropeptídeos dinorfina e encefalina após lesão de 6-OHDA e administração crônica de L-DOPA é descrita em outro lugar45 e é consistente com a literatura anterior23,25. No nível molecular, roedores discinéticos compartilham marcadores moleculares associados à discinesia evidente em modelos de primatas não humanos de pacientes com DP e DP, como a regulação positiva estriatal do fator de transcrição ΔFosB 26,32,33,54. Além disso, o modelo de DP em roedores mostra aumento da densidade de microvasos no estriado em resposta ao tratamento com L-DOPA55 de forma semelhante observada no putâmen de pacientes com DP56. Modelos de roedores de LIDs respondem a abordagens farmacológicas antidiscinéticas utilizadas na clínica, como o antagonista do receptor NMDA amantadina 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34, 35,36,37, 38,39. Em conjunto, essas evidências confirmam a validade de face e a validade preditiva do modelo de rato 6-OHDA para caracterizar a fisiopatologia dos LIDs e para o rastreamento de compostos com propriedades antidiscinéticas. O modelo de camundongos de LIDs também é uma ferramenta valiosa para estudar vários aspectos de LIDs em camundongos transgênicos. Protocolos para o modelo de camundongos de LIDs podem ser encontrados em artigos de diferentes grupos de pesquisa 30,57,58.

É importante notar que o modelo de roedores lesados por 6-OHDA de LIDs tem limitações. A depleção dopaminérgica induzida por 6-OHDA é aguda em comparação com a natureza progressiva da depleção nigrostriatal no paciente com DP5. Além disso, pode ser um desafio encontrar uma excelente janela terapêutica para o uso de um medicamento antidiscinético em pacientes, pois o aumento da dosagem de um fármaco pode interferir no efeito benéfico produzido pela L-DOPA ou induzir efeitos colaterais que podem não ter sido observados no modelo animal59,60. Outra limitação do modelo de LIDs em ratos é a falta de similaridade física entre os AIMs nos roedores e a manifestação dos movimentos coriformes observados em pacientes e primatas não humanos 10,61,62. Outra limitação potencial do protocolo apresentado aqui é que os AIMs são pontuados a cada 30 minutos após a administração de L-DOPA, mas essa questão pode ser gerenciada se o experimentador filmar todos os animais por 180 minutos após a administração de L-DOPA. O experimentador pode então ajustar o protocolo de pontuação para uma pontuação mais frequente (por exemplo, a cada 10 ou 20 minutos). Essa abordagem é vantajosa em experimentos que exigem uma imagem mais dinâmica do curso do tempo dos AIMs (por exemplo, a combinação de pontuação de AIMs e registros eletrofisiológicos ou neuroquímicos in vivo).

Em conclusão, o modelo de LID de 6-OHDA em ratos reproduz a fisiopatologia da doença e desenvolve MIAs que podem ser modulados por drogas clinicamente utilizadas. Embora tenha limitações, o modelo de LID em ratos com 6-OHDA ainda representa uma ferramenta pré-clínica inestimável para identificar intervenções antidiscinéticas eficazes com potencial translacional.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse.

Acknowledgments

Este trabalho contou com o apoio da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, bolsa 2017/00003-0). Agradecemos a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). Agradecemos ao Dr. Anthony R. West, ao Dr. Heinz Steiner e ao Dr. Kuei Y. Tseng pelo apoio e orientação.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6-hydroxydopamine hydrobromide Sigma-Aldrich, USA H6507 Neurotoxin that produces degeneration of catecholaminergic terminals
Benzerazide hydrochloride Sigma B7283 Peripheral dopa-decarboxylase inhibitor
Camera Bullet IR Turbo HD (HD-TVI)  2.8mm B HIKVISION DS-2CE16C0T-IRP Camera used to record all behavior
Imipramine hidrochloride Alfa Aesar J63723 Norepinephrine transporter inhibitor (NET) used to protect noradrenergic neurons from 6-OHDA
Ketamine hydrochloride Ceva Animal Health Anesthesia for surgical intervention
L-3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) methyl ester (hydrochloride) Cayman Chemical Company 16149 Dopamine precursor
Mirrors Used to observe the behavior of animals during experiments in all directions
Needles 0.30 x 13 mm PrecisionGlide Needles used to inject drugs
Sodium chloride (NaCl) Samtec Salt
Syringes 1 ml Sterile BD Plastipak Syringes used to inject drugs
Transparent cylinders Used to record animal behavior during experiments
Xylazine hydrochloride Ceva Animal Health Sedative, analgesic and muscle relaxant for surgical intervention

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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