Summary
פרוטוקול זה מוקדש להדמיה של מיקרוטובול פלוס-קצה על ידי טרנספקטציה של חלבון EB3 כדי לחקור את התכונות הדינמיות שלהם בתרבית התאים העיקרית. הפרוטוקול יושם על פיברובלסטים ראשוניים אנושיים שהתקבלו מחולים במחלת הנטינגטון.
Abstract
טרנספקטיון עם חלבון סמן שכותרתו פלואורסצנטית של עניין בשילוב עם מיקרוסקופיית וידאו לשגות זמן היא שיטה קלאסית של לימוד המאפיינים הדינמיים של ציטוסקלטון. פרוטוקול זה מציע טכניקה עבור טרנספקט פיברובלסט ראשוני אנושי, אשר יכול להיות קשה בגלל הפרטים של תנאי טיפוח התא העיקריים. בנוסף, תחזוקת הנכס הדינמי של ציטוסקלטון דורשת רמה נמוכה של טרנספקטציה כדי להשיג יחס אות לרעש טוב מבלי לגרום לייצוב מיקרוטובול. חשוב לנקוט באמצעים כדי להגן על התאים מפני מתח המושרה באור ודחיכת צבע פלואורסצנטי. במהלך עבודתנו, בדקנו שיטות ופרוטוקולים שונים של טרנספקטיישן, כמו גם וקטורים שונים כדי לבחור את השילוב הטוב ביותר של תנאים המתאימים למחקרי פיברובלסט ראשוניים אנושיים. ניתחנו את הסרטונים שהתקבלו בזמן וחישוב דינמיקת המיקרו-קוטביות באמצעות ImageJ. הדינמיקה של המיקרוטובולים בחלקי התא השונים אינה דומה, ולכן חילקנו את הניתוח לתת-קבוצות - אזור המרכז, הלאמלה וזנב הפיברובלסטים. ראוי לציין, פרוטוקול זה יכול לשמש לניתוח במבחנה של דינמיקת cytoskeleton בדגימות המטופל, המאפשר את הצעד הבא לקראת הבנת הדינמיקה של התפתחות המחלה השונה.
Introduction
מחלת הנטינגטון (HD) היא פתולוגיה נוירודגנרטיבית חשוכת מרפא הנגרמת על ידי חלבון קידוד גן מוטציה (HTT). HTT קשורה בעיקר עם שלל ומיקרוטובולות והוא מעורב כנראה בתהליכי הובלה תלויי מיקרוטובול1,2. כדי לחקור את ההשפעה של מוטציה HTT על דינמיקת microtubule, השתמשנו בהדמיה חוץ גופית של חלבון EB3, המווסת את המאפיינים הדינמיים של microtubules על ידי כריכה וייצוב הפלוס-קצוות הגדלים. כדי לטעון פלואורסצנטית שכותרתו EB3 לתוך פיברובלסטים בעור אנושי, transfection plasmid הוחל. השתמשנו בתרבות הפיברובלסט העיקרית שהתקבלה מהביופסיה של העור של חולי HD למחקר זה.
המוטציה בגן חלבון HTT מובילה להארכה של דרכי פוליגלוטמין3. HTT יש תפקיד בתהליכים תאיים כגון אנדוציטוזיס4, הובלת תאים1,2, השפלת חלבון5,וכו '. חלק ניכר מהתהליכים הללו כרוך באלמנטים שונים של ציטוסקלטון התא, כולל המיקרוטובולות.
תאים ראשוניים אנושיים הם המודל הטוב ביותר לשחזור אירועים המתרחשים בתאי המטופל קרוב ככל האפשר. כדי ליצור מודלים כאלה, יש לבודד תאים מחומר ביופסיה אנושי (למשל, מדגימות כירורגיות). קו התאים העיקרי המתקבל מתאים לחקר פתוגנזה בשיטות ביולוגיות גנטיות, ביוכימיות, מולקולריות ותאיות שונות. כמו כן, תרביות תאים ראשוניות אנושיות משמשות מבשר ליצירת תרבויות שונות transdifferentiated ומהונדס6.
עם זאת, בניגוד תרביות תאים מונצחות, החיסרון המשמעותי של תאים ראשוניים הוא יכולת המעבר המוגבלת שלהם. לכן, אנו ממליצים להשתמש בתאים בשלב המעברים המוקדמים (עד 15). תרבויות ישנות יותר מתנוונות מהר מאוד, מאבדות את תכונותיהן הייחודיות. לכן, התאים העיקריים שהושגו לאחרונה צריכים להישמר קפואים לאחסון לטווח ארוך.
תרביות התאים העיקריות רגישות לתנאי הטיפוח. לכן, לעתים קרובות הם דורשים גישות ייחודיות ואופטימיזציה של תנאי הגידול. בפרט, הפיברובלסטים העיקריים של העור האנושי המשמשים בניסויים שלנו תובעניים על המצע. לפיכך, השתמשנו בציפויים נוספים שונים (למשל, ג'לטין או פיברונקטין) בהתאם לסוג הניסוי.
ציטוסקלטון התא קובע את צורת התא, הניידות והקטר. הדינמיקה של הציטוסקלטון חיונית לתהליכים תאיים רבים הן באינטרפאזה והן במיטוזה. בפרט, הציטוסקלטון פולימר מ טובולין, הם מבנים דינמיים מאוד קוטביים, המאפשרים תחבורה תאית מכוונת בתיווך חלבון מוטורי. קצות המיקרוטובולות נמצאים בסידור מחדש מתמיד, שלבי ההרכבה שלהם מתחלפים עם שלבי הפירוק, והתנהגות זו נקראת "חוסר יציבות דינמית"7,8,9. חלבונים שונים הקשורים לשנות את שיווי המשקל של תגובת פילמור, המוביל או היווצרות פולימר או היווצרות מונומר חלבון. התוספת של subunits טובולין מתרחשת בעיקר בקצה פלוס של microtubules10. משפחת החלבונים המחייבים את הקצה (EB) מורכבת משלושה חברים: EB1, EB2 ו-EB3. הם משמשים חלבונים במעקב אחר קצה פלוס (+TIPs) ומווסתים את המאפיינים הדינמיים של מיקרוטובולות על ידי כריכה וייצוב הגדילה שלהם פלוס-קצוות11.
מחקרים רבים משתמשים במיקרו-אינטרינג'קציה או טרנס-מולקולה של טובולין עם הדמיה בזמן וניתוח וידאו כדי לדמיין מיקרוטובולות במבחנה. שיטות אלה עלולות להיות פולשניות ומזיקות לתאים, במיוחד לתאים אנושיים ראשוניים. הצעד המאתגר ביותר הוא למצוא תנאים להדבקה בתאים. ניסינו להגיע לרמה הגבוהה ביותר האפשרית של טרנס-זיהום מבלי להשפיע על הכדאיות ועל מורפולוגיה של תאים מקומיים. מחקר זה מיישם את השיטה הקלאסית כדי לחקור את ההבדלים בדינמיקה microtubule בפיברובלסטים בעור של תורמים בריאים וחולים עם מחלת הנטינגטון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
פרוטוקול זה עוקב אחר ההנחיות של המרכז הפדרלי למחקר ולרפואה קלינית של רפואה פיזית-כימית של הסוכנות הביולוגית הרפואית הפדרלית מיום 08 בספטמבר 2015.
הערה: איור 1 מספק מבט כולל על הפרוטוקול.
1. השגת תרבות עיקרית של פיברובלסטים בעור האדם (איור 2)
- לספק את הביופסיה למעבדה בתוך כמה שעות במדיום הנשר המשונה של Dulbecco (DMEM) בתוספת 50 מיקרוגרם / מ"ל של פניצילין ו 50 U / mL של סטרפטומיצין.
הערה: ביופסיה לעור חייבת להתבצע בתנאים סטריליים על ידי רופא לאחר שחולה חותם על הסכמה מדעת. - מניחים את רקמת הביופסיה בצלחת פטרי 6 ס"מ יחד עם כמות קטנה של המדיום.
- באמצעות אזמל סטרילי, לחתוך את דגימת הביופסיה לחתיכות של כ 0.5-1 מ"מ בגודל. מניחים 1-2 שברים המתקבלים לתוך צלחת פטרי 3.5 ס"מ ומניחים כיסוי סטרילי מעל חתיכות הביופסיה. לאט לאט להוסיף 1.5 מ"ל של מדיום צמיחה להרכב הבא: DMEM, 50 U / mL פניצילין-סטרפטומיצין, 10% סרום בקר עוברי (FBS).
- פיברובלסטים תרבות במדיום הצמיחה בתוך אינקובטור CO2 נשמר ב 5% CO2, 37 °C (70 °F), 80% לחות.
הערה: לאחר 4-7 ימים, תחילה קרטינוציטים, ואז פיברובלסטים, מתחילים לנדוד מהרקמה לתחתית המנה.
2. אחסון, הקפאה והפרה של התרבות העיקרית
- הסר תאים מצלחת התרבות (ראה נקודות 3.2-3.4).
- העבר את מתלה התא לצינור חרוטי 15 מ"ל וצנטריפוגה למשך 5 דקות ב 200 x g. ואז להשליך את supernatant ו resuspend גלולה התא ב 900 μL של FBS מקורר.
- העבר לצינור הקפאה טיפה טיפה טיפה ולהוסיף 100 μL של דימתיל גופרתי (DMSO).
- מניחים את הקריופרוב במקפיא בטמפרטורה נמוכה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס. עשרים וארבע שעות מאוחר יותר, להעביר את cryovial לחנקן נוזלי (−196 °C) לאחסון לטווח ארוך.
- כדי להפשיר את התאים cryopreserved, להסיר את cryovial מן אחסון חנקן, בתוך 1 דקות, להעביר 1 מ"ל של התוכן לתוך צינור חרוט 15 מ"ל המכיל 9 מ"ל של אמצעי התחבורה מחומם מראש ל 37 °C (55 °F).
- בזהירות resuspend ולאחר מכן צנטריפוגה הצינור במשך 5 דקות ב 200 x g. להשליך את supernatant, resuspend את גלולה התא בנפח הנדרש של מדיום הצמיחה ומניחים אותם על צלחת פטרי בקוטר הנדרש.
3. טיפוח תאים
- מכסים את תחתית המנה בתמיסת ג'לטין 0.1% אוטומטית המוכנה במים מזוקקים. דגירה במשך 15 דקות.
הערה: עבור הדמיית transfection, יש להשתמש במנות צלחת בתחתית זכוכית (מנות קונפוקליות עם עובי זכוכית 170 מיקרומטר) יש להשתמש. - הכן מדיום תרבות בעל הרכב הבא: DMEM בתוספת 10% FBS, 2 מ"מ L-אלניל-L-גלוטמין, 50 U / mL פניצילין-סטרפטומיצין. מערבבים היטב ומאחסנים ב 4 °C (7 °F). מחממים את המדיום עד 37 °C (70 °F) לפני הוספת התאים.
- להעריך את התרבות מתחת למיקרוסקופ. הסר את המדיום ולשטוף את פיברובלסטים עם פתרון פוספט מלח של Dulbecco (DPBS).
- הוסף 1 מ"ל של פתרון טריפסין 0.25% מחומם מראש לתאים. בדוק את התאים מתחת למיקרוסקופ אם הם מתנתקים לחלוטין מהמצע. בטל טריפסין עם 1 מ"ל של מדיום התרבות.
- העבר את השעיית התא לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגות הצינור ב 200 x g במשך 5 דקות, להסיר את supernatant, ו resuspend גלולה התא ב 1 מ"ל של מדיום התרבות.
- תספור את מספר התאים. חשב את המספר הנדרש של תאים כדי לזרוע אותם עם צפיפות של 8-15 x 103/ ס"מ2 ו resuspend ב 2 מ"ל של מדיום התרבות.
- הסר את פתרון הג'לטין מצלחת התרבות ומיד להוסיף 2 מ"ל של השעיית התא. לטפח פיברובלסטים ב 37 °C (5 °F) בחממה CO2.
- רענן את המדיום כל 2-4 ימים.
הערה: לניסויים, השתמש בתאים של 4-11 מעברים.
4. תעתיק
- החלף את המדיום התרבותי במדיום תרבות טרי 24 שעות לפני ההדבקה.
הערה: מפגש התא צריך להיות 70-80%. - הכן קומפלקס DNA-שומנים המבוסס על האזור והצפיפות של זריעת התא. השתמש בסוכן טרנספקטויזום מבוסס ליפוזום.
הערה: השתמש בצפיפות זריעת התא כ- 1 x 104 תאים / ס"מ2. - הוסף 3 μL של ריאגנט transfection מסחרי ל 125 μL של מדיום חיוני מינימלי אופטימלי (Opti-MEM) לא מכיל שום אנטיביוטיקה, מבלי לגעת בקירות הצינור. בעדינות resuspend.
- לדלל את ה- DNA הפלסמי (GFP-EB3) על ידי הוספת 1 מיקרוגרם של ה- DNA הפלסמידים ל- 125 μL של Opti-MEM. בעדינות resuspend.
הערה: קידוד וקטור ביטוי GFP-EB311 התקבל כמתנה חביבה מד"ר א. קוורינה (אוניברסיטת ונדרבילט, נאשוויל) באישור ד"ר א. אחמנובה (אוניברסיטת ארסמוס, רוטרדם)11. - הוסף דנ"א פלסמי מדולל לכל שפופרת של ריאגנט טרנס-זיהום מדולל (1:1). דגירה במשך 30 דקות.
- מוסיפים את קומפלקס ה-DNA-השומנים לצלחת פטרי בגודל 6 ס"מ המכילה תאים ומערבבים עם נדנדת צליבה במשך 30 s. דגירה תאים עם סוכן transfection עבור 24 שעות ולאחר מכן לשנות למדיום טרי. לנתח את היעילות של transfection לאחר 24 שעות ו 48 שעות.
הערה: 24 שעות לאחר transfection, היעילות הייתה 10-15%, ואחרי 48 שעות עד 40%.
5. הכנה להדמיה
- לפני הדמיה חיה של תאים, לשנות את המדיום התרבותי למדיום ללא צבע pH מחוון כדי להפחית את autofluorescence.
- יש למרוח בזהירות שמן מינרלי על המשטח הבינוני כדי לכסות לחלוטין את המדיום, ולבודד אותו מהסביבה החיצונית כדי להפחית את חדירת O2 ואת האידוי הבינוני.
- השתמש מנורת כספית ושמן טבילה 60x או 100x מטרה עדשה עם צמצם ספרות גבוה כדי לצלם את התמונות.
הערה: עבור תצפיות ויוו, המיקרוסקופ חייב להיות מצויד באינקובטור כדי לשמור על התנאים הדרושים לתאים, כולל חימום שולחן האובייקטים והעדשה ל +37 °C (37 °F), תא סגור עם אספקת CO2 ותמיכה ברמת הלחות. יש להשתמש במים מזוקקים כפולים ליצירת לחות. בדוק את רמת המים מזוקקים כפולים לפני הצילומים. - מניחים את צלחת הקונפוקלי עם התאים במחזיק המיקרוסקופ לפני ההדמיה. ודא כי המנה והמצלמה מחוברים באופן מאובטח למחזיק כדי למנוע נסחף בעת צילום תמונות.
6. הגדרת פרמטרי ההדמיה
- בחר את ערכי החשיפה הנמוכים מכיוון שהאור גורם למינים תגובתיים מזיקים לתאים (ROS).
הערה: כדי לחקור את הדינמיקה של microtubules בפיברובלסטים בעור האנושי, נבחרה חשיפה של 300 אלפיות שניים. - תתמקד במושא העניין.
הערה: להדמיה ארוכת טווח, השתמש במערכת ייצוב המיקוד האוטומטית כדי לפצות על שינוי אפשרי לאורך ציר z. - בחר את תנאי ההדמיה האופטימליים בהתאם לחשיות של התאים ולקצב דועך הפלואורוכרום.
הערה: מאחר שמיקרוטובולות הן מבנים דינמיים מאוד, ניתן לבחור מרווח זמן קצר למדי, וקצב הפריימים חייב להיות גבוה מספיק. כדי לחקור את הדינמיקה microtubule בפיברובלסטים העור, השתמשנו בתדר של 1 מסגרת / s במשך 3-5 דקות. - בשעת בחירת האובייקט הבא כדי לקבל את התמונה, התרחקו מהאזור שכבר התמונה. מכיוון שאזור זה היה תחת השפעת אור, תהיה להלבנה פוטו מורגשת.
הערה: מכיוון שנעשה שימוש בתדר הדמיה גבוה יחסית, התריס לא נסגר בין תמונות, והמנורה הודלקה במשך כל תקופת ההדמיה, ולכן הדהייה גדלה. - בחרו את הסרטון האופטימלי לחקר הדינמיקה של המיקרוטובולות באופן חזותי, תוך התחשבות באיכות ההדבקה, באיכות התמונות של המיקרוטובולות (יחס אות לרעש אופטימלי), והיעדר נסחף במקרה של התא המנותח (איור 3).
- השתמש בסרטונים שנבחרו כדי ללמוד את הדינמיקה של המיקרוטובולים על-ידי התחקות אחריהן בתוכנית ImageJ או Fiji (איור 4).
הערה: לקבלת הוראות לניתוח כמותי ראו איור 2 משלים וקובץ משלים 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סרטי GFP-EB3 שנוצרו באמצעות הפרוטוקול (איור 1) ממחישים את המאפיינים הדינמיים של המיקרוטובולות. מיקרוטובולות מעורבות בתהליכים שונים של תאים, ומאפייניהם הדינמיים משפיעים על מאפייני חיים שונים של תרבית התאים האנושיים העיקרית מחומר הביופסיה של המטופלים (איור 2).
הפרמטרים הבאים קובעים את חוסר היציבות הדינמית של microtubules: שיעורי הצמיחה (פילמור) וכיווץ (depolymerization); תדירות האסונות (מעבר מפיפולימריזציה לדפולימריזציה); תדירות ההצלות (מעבר מדפולימריזציה לפיפולימריזציה); כמו גם הפסקות - מצבים כאשר microtubule אינו פולימר ולא depolymerize 12. כל הפרמטרים מוסדרים היטב, ואת שיעורי פילמוריזציה depolymerization של microtubules בודדים יכול להשתנות באופן משמעותי הן בסוגי תאים זהים ושונים13,14,15,16,17.
יש לקחת בחשבון עבור הניתוח כי microtubules יכול להיות דינמיקה שונה בהתאם למיקום שלהם בתא. Microtubules הממוקם באזור הגרעין ואת centrosome מתנהגים אחרת לעומת אלה בפריפריה התא19. לכן, כדי להשיג תוצאה אמינה, ביצענו את המדידות הדינמיות של המיקרוטובולות בשלושה אזורים נפרדים של התא: החלק המרכזי, הקצה המוביל וחלק הזנב(איור 3). כדי לשלוט בהתפלגות הנכונה של תווית GFP-EB3 בחלקי תאים שונים, השתמשנו בתאי אנדותל בעורק הריאות האנושי (HPAEC) (ראה איור 1 משלים).
תוכניות מיוחדות, כגון ImageJ או פיג'י (ImageJ 2 v1. 53i), מאפשרות ניתוח של הסרטונים לפי הפרמטרים הבאים: (1) קצב הצמיחה של המיקרוטובולות; (2) תדירות האסונות; (3) תדירות ההצלות; (4) תדירות ההפסקות; ו-(5) משך ההפסקות. בנוסף, אפשרויות ותוסף ייחודיים של תוכניות מאפשרים מעקב אוטומטי18 אוידנית 19 (איור 4). שיטת המעקב הידנית עבדה טוב יותר בניסויים שלנו מכיוון שהמדידות האוטומטיות נוטות לשגיאות גדולות יותר ודורשות חזרות נוספות לקבלת תוצאה מדויקת יותר. הוראות מפורטות על ניתוח נתונים דינמי microtubules ניתן למצוא איור 2 משלים וקובץ משלים 1.
פרמטרי ההדמיה עשויים לדרוש התאמות במהלך תהליך ההדמיה. לדוגמה, ניתן לשנות את משך הדמיית תא אחד וערכי החשיפה. הגדרות כאלה מועילות אם יש שחיקה מהירה של אותות, או התא מתכווץ(איור 5).
איור 1: התוכנית הכללית של פרוטוקול טרנספקטציה GFP-EB3 לתרבות הפיברובלסטים העיקרית של העור האנושי. הפרוטוקול כולל את השלבים הבאים: ניתוק תאים על ידי פתרון טריפסין; חוסר הפעילות של טריפסין על ידי התוספת הבינונית; צנטריפוגה של המתחם המתקבל; חישוב ריכוז התאים; זריעת תאים לצלחת התחתונה של הכוס (צלחת קונפוקלית) מצופה בג'לטין; טרנספקטציה של תרבית תאים על ידי DNA פלסמיד (עם GFP-EB3) עם ריאגנט transfection liposomal; דגירה 24-48 שעות; וניתוח תחת מיקרוסקופ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: פיברובלסטים של עור האדם מכינים את ערכת ההכנה העיקרית לתרבות. ביופסיה לעור חייבת להתבצע בתנאים סטריליים על ידי רופא לאחר שחולה חותם על הסכמה מדעת. ואז חתיכת רקמה מועברת בכמות קטנה של המדיום ללא FBS למעבדה בצלחת פטרי. שבר גדול של רקמה נחתך לחתיכות של 0.5-1 מ"מ בגודל, והם מכוסים זכוכית כיסוי עם תוספת של המדיום עם FBS. לאחר מכן צלחת פטרי ממוקמת באינקובטור CO2, שם לאחר 4-7 ימים פיברובלסטים נודדים מרסיס הרקמה לתחתית הזכוכית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: סמן GFP-EB3 (ירוק) באזורים שונים של פיברובלסטים אנושיים שהודבקו, המתקבלים מהביופסיה של העור של חולי HD: קצה מוביל (פאנל עליון); זנב (פאנל אמצעי); חלק מרכזי של פיברובלסט (אזור סביב המרכז) (לוח תחתון). סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. תדירות ההדמיה היא 1 מסגרת/שניה. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רחבת שדה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: מעקב ידני GFP-EB3 על ידי תוסף ImageJ MTrackJ. מסלולים המשקפים את הצמיחה של microtubules התקבלו כתוצאה של סימון ידני מסגרת אחר פריים של תוויות GFP-EB3 טיפים בקצוות פלוס במהלך 20 s של הדמיה. פיברובלסטים בתרביתות מודבקות, המתקבלים מהביופסיה של העור של חולי HD. תדירות ההדמיה היא 1 מסגרת/שניה. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רחבת שדה. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: פתרון בעיות במהלך הדמיה של GFP-EB3 שכותרתו מיקרוטובולות של קצוות. (A)מיקרוטובולות עם תווית פלואורסצנטית אינן ממוקדות בשל היעדר מערכת מיקוד. (B)Microtubules מתייצבים ומאבדים את המאפיינים הדינמיים שלהם עקב ביטוי יתר של GFP-EB3 בתא עקב דגירה ארוכה עם תערובת transfecting. (ג)כיווץ התא lamella כתוצאה של פוטוטוקסיות עקב שחרורו של ROS. (D)עוצמת האות יורדת במהלך הדמיה - הדמיה - הדמיה מהירה של תמונות. פיברובלסטים בתרביתות מודבקות, המתקבלים מהביופסיה של העור של חולי HD. תדירות ההדמיה היא 1 פריים לשנייה. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רחבת שדה. סרגלי קנה מידה = 10 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 1 משלים: הדמיה סלקטיבית של גידול מיקרוטובולות פלוס-קצוות. סמן GFP-EB3 (ירוק) באזורים שונים של תא אנדותל אנושי שהודבק (תרבית של HPAEC: תאי אנדותל עורק ריאות אנושי) בקצה המוביל, בזנב ובאזור המרכזי (אזור סביב הצנטרוזום). מוטות קנה מידה 10 מיקרומטר. תדר ההדמיה הוא מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רחבת שדה/1. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
איור 2 משלים: ניתוח דינמיקה Microtubule על ידי תווית GFP-EB3 לאחר מעקב ידני באמצעות תוסף ImageJ MTrackJ. (א,ב) מסלולי EB3 המתקבלים על ידי עקירת טלאי EB3-GFP בסדרה של פיברובלסטים מתורבתים שהודבקו, המתקבלים מהביופסיה של העור של חולי HD (צבועים בנפרד). (A)מסלול EB3 (סגול, No46) שהושג על ידי EB3-GFP טלאי תזוזה במהלך 18 שניות. (B)מסלול EB3 (אדום, No37) שהושג על ידי EB3-GFP טלאי תזוזה במהלך 9 שניות. (C)כימות של עקירה בקצוות פלוס של מיקרוטובולות של פיברובלסט העור של חולי HD אנושיים המוצגים ב -A). (D)כימות של תזוזה בקצוות פלוס של מיקרוטובולות המוצגות ב- (B). הגרף מראה כי בין 6-8 שניות יש הפסקה בצמיחה של microtubule (אין תנועה של הקצה פלוס). נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 1: ניתוח כמותי של הדינמיקה של EB3-GFP שכותרתו מיקרוטובולות ' פלוס-קצוות. נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ניתן להשיג תוצאות באיכות טובה יותר לניתוח הדינמיקה של microtubules מתמונות מיקרוסקופיות באיכות גבוהה. חשוב לבחון את כל התנאים הדרושים להדמיה של תאים חיים בזמן ולהתאים נכונה את פרמטרי ההדמיה. שימוש במנות מיוחדות לתרבות תאים עם תחתית זכוכית (מנות קונפוקליות) חשוב, שכן זכוכית יש אינדקס שבירה שונה של אור מאשר פלסטיק. עובי הזכוכית ואחידותה על פני כל שטחה הוא גם חשוב ביותר, שכן פרמטרים אלה חיוניים עבור התמקדות מדגם נורמלי. הפרה של פרמטרים אלה מובילה בהכרח לכישלון של מערכת המיקוד המושלמת וכתוצאה מכך התמקדות גרועה ובכך הופכת את השימוש בסרטון כזה מחוץ למיקוד לניתוח (איור 5A). תנאי חשוב נוסף להדמיה של תאים חיים הוא ההגנה שלהם מפני ROS. ריאגנטים שונים יכולים לשמש למטרות כאלה20. בעבודתנו אנו משתמשים בשמן מינרלי, אשר מבודד לחלוטין את המדיום התרבותי מהאטמוספירה ומונע חילופי גזים. באותו אופן, אוקסיראז הפחתת ROS ניתן להשתמש, אבל אנזים זה אינו מתאים לכל סוגי התאים והוא חל לעתים קרובות יותר הדמיה עם זמן מוגבר.
בעת בחירת זמן הדגירה האופטימלי של תאים לאחר transfection (24 או 48 שעות), יש לתת תשומת לב למספר התאים שהודבקו. מספר קטן יותר מהמספר המרבי של תאים המבטאים את החלבון המסומן כבר מספיק לניתוח. אין לאפשר ביטוי יתר מכיוון שמיקרוטובולות, במקרים כאלה, מתייצבות ולא ניתן לנתח את המאפיינים הדינמיים שלהן (איור 5B).
במקרים מסוימים, ייתכן שיהיה צורך להתאים את פרמטרי ההדמיה בהתאם לתגובת התאים לאחר תחילת הקלטת הווידאו. לדוגמה, ניתן לצפות בהתכווצות התאים בשל רגישות גבוהה לאור (פוטוטוקסיות)(איור 5C). כאשר נרגשים, מולקולות פלורסנט בדרך כלל מגיבות עם חמצן מולקולרי כדי ליצור רדיקלים חופשיים שיכולים לפגוע ברכיבי התא21. בעת תכנון ניסויים, פלואורופורים עם אורך גל העירור המרבי האפשרי יש לבחור כדי למזער את נזקי התאים תחת תאורת גל קצר. בנוסף, ישנם דיווחים כי מרכיבים מסוימים של מדיה תרבותית סטנדרטית, כולל ויטמין ריבופלבין וחומצת האמינו טריפטופן, עשויים גם לתרום להשפעות השליליות של האור על תאים מתורבתים22. בין היתר, זה עלול להיגרם על ידי כמות מופרזת של תוויות פלואורסצנטיות בתא אחד. במקרים אלה, יש צורך להפחית את משך ההקלטה ואת עוצמת התאורה. בעיה אפשרית נוספת עשויה להיות גם צילומים מהירים - הפחתת עוצמת האות במהלך ההקלטה (איור 5D). אפקט זה צריך להילקח בחשבון בעת בחירת האובייקט הבא על אותה צלחת ניסיונית, שכן התאים השכנים סביב האזור התמונה נשרפים גם.
יש לציין כי ישנן שיטות אחרות להדמיה microtubule בתאים חיים כמו מיקרו-ג'ק של טובולין תווית פלואורסצנטית לתוך התא או התמרה התא באמצעות וירוסים. כמו בכל שיטה אחרת, ישנם יתרונות וחסרונות לשיטת transfection. עם זאת, מנקודת המבט שלנו, בהשוואה לשיטת ההזרקה, transfection יעיל יותר ומאפשר להשיג הכללה המונית של וקטורים ביטוי לתוך התאים, וכתוצאה מכך מספר רב של תאים פלואורסצנטיים לניתוח. כמו כן, שיטת טרנספקטציה אינה דורשת ציוד מיוחד וכישורים מהחוקר. השיטה של טרנסדוקציה ויראלית מראה תוצאות טובות וניתן ליישם. ובכל זאת, זה לא מתאים לכל תרביות התא (בפרט, זה פחות מתאים פיברובלסטים אנושיים, המתקבל ביופסיה העור של חולי HD).
השלב הקריטי ביותר בפרוטוקול זה הוא טרנספקטיון המבוצע כדי להבטיח ביטוי חלבון מספיק. יחס אות לרעש טוב, ללא צילומים של מיקרוטובולות, והיעדר תאים נסחפים במהלך הקלטת וידאו בזמן מעידה הם קריטיים לחלוטין להדמיית מיקרוטובולות יעילה. בניסוי שלנו, הדמיה של microtubules ואת הניתוח הדינמי לספק מידע חיוני על תכונות microtubule והתנהגות בתאים עם מוטציה HTT. הפרוטוקול שלנו חל על מחקרים של מחלות אחרות שעבורן פתולוגיה מסבכת תכונות דינמיות של microtubules.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי משרד המדע וההשכלה הגבוהה של הפדרציה הרוסית, מענק מס '075-15-2019-1669 (טרנספקטים של פיברובלסטים), על ידי הקרן הרוסית למדע, מענק מס '19-15-00425 (כל שאר העבודות על טיפוח פיברובלסטים במבחנה). זה נתמך חלקית על ידי Lomonosov מוסקבה המדינה האוניברסיטה פיתוח תוכנית PNR5.13 (הדמיה וניתוח). המחברים מכירים בתמיכת מרכז ניקון למצוינות במכון א.נ. בלוצרסקי לביולוגיה פיזיקו-כימית. אנחנו רוצים להודות במיוחד ליקטרינה טארן על עזרתה במשחק קול. המחברים מודים גם לפאבל בליצ'קוב על עזרתו בעריכת הווידאו. דמויות בכתב היד נוצרו עם BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrumentation | |||
| Camera iXon DU897 EMCCD | Andor Technology | ||
| Eppendorf Centrifuge 5804 R | Eppendorf Corporate | ||
| Fluorescence filter set HYQ FITC | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| LUNA-II Automated Cell Counte | Logos Biosystems | L40002 | |
| Microscope incubator for lifetime filming | Okolab | Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS | |
| Gas controller CO2-O2-UNIT-BL | |||
| Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13) | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Software | |||
| Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c) | Open source image processing software | ||
| NIS Elements | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Additional reagents | |||
| Mineral oil (Light white oil) | MP | 151694 | |
| Cell culture dish | |||
| Cell Culture Dish | SPL Lifesciences | 20035 | |
| Confocal Dish (glass thickness 170 µm) | SPL Lifesciences | 211350 | Alternative: MatTek |
| Conical Centrifuge tube | SPL Lifesciences | 50015 | |
| Cryogenic Vials | Corning-Costar | 430659 | |
| Microcentrifuge Tube | Nest | 615001 | |
| Cultivation | |||
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| Dimethyl sulfoxide | PanEko |  135 |
|
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | PanEko | C420 |
|
| DPBS (Dulbecco's phosphate-salt solution) | PanEko | P060 |
|
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | K053/SH30071.03 | |
| Gelatin (bovine skin) | PanEko | 070 |
|
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Opti-MEM (1x) + Glutamax | Gibco | 519850026 | |
| Penicillin-streptomycin | PanEko | A063 |
|
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| Transfection | |||
| Plasmid DNA with EB3-GFP | Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova [Erasmus University, Rotterdam] |
Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003 |
References
- Engelender, S., et al. Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin. Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).
- Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L.
- MacMillan, J. C., et al. Molecular analysis and clinical correlations of the Huntington's disease mutation. The Lancet. 342 (8877), 954-958 (1993).
- Proskura, A. L., Vechkapova, S. O., Zapara, T. A., Ratushniak, A. S.
- Steffan, J. S., et al. The Huntington's disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6763-6768 (2000).
- Nekrasov, E. D., et al. Manifestation of Huntington's disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Molecular Neurodegeneration. 11 (1), 1-15 (2016).
- Mitchison, T., Kirschner, M.
- Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).
- Desai, A., Mitchison, T. J.
- Allen, C., Borisy, G. G. Structural polarity and directional growth of microtubules of Chlamydomonas flagella. Journal of Molecular Biology. 90 (2), 381-402 (1974).
- Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
- Shelden, E., Wadsworth, P. Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific. Journal of Cell Biology. 120 (4), 935-945 (1993).
- O'Brien, E. T., Salmon, E. D., Walker, R. A., Erickson, H. P. Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules. Biochemistry. 29 (28), 6648-6656 (1990).
- Drechsel, D. N., Hyman, A. A., Cobb, M. H., Kirschner, M. W. Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1141-1154 (1992).
- Gildersleeve, R. F., Cross, A. R., Cullen, K. E., Fagen, A. P., Williams, R. C. Microtubules grow and shorten at intrinsically variable rates. Journal of Biological Chemistry. 267 (12), 7995-8006 (1992).
- Penazzi, L., Bakota, L., Brandt, R. Microtubule dynamics in neuronal development, plasticity, and neurodegeneration. International Review of Cell and Molecular Biology. 321, 89-169 (2016).
- van de Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).
- Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
- Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary. Journal of Cell Science. 115 (17), 3527-3539 (2002).
- Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., vanden Broek, B., Jalink, K. Optimizing imaging conditions for demanding multi-color super resolution localization microscopy. PLoS One. 11 (7), 0158884 (2016).
- Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal. 36 (2), 280-290 (2003).
- Grzelak, A., Rychlik, B., Bartosz, G. Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media. Free Radical Biology and Medicine. 30 (12), 1418-1425 (2001).
