Summary
Dit protocol is gewijd aan de microtubule plus-end visualisatie door EB3-eiwittransfectie om hun dynamische eigenschappen in primaire celkweek te bestuderen. Het protocol werd geïmplementeerd op menselijke primaire huidfibroblasten verkregen van patiënten met de Ziekte van Huntington.
Abstract
Transfectie met een fluorescerend gelabeld markereiwit van belang in combinatie met time-lapse videomicroscopie is een klassieke methode om de dynamische eigenschappen van het cytoskelet te bestuderen. Dit protocol biedt een techniek voor menselijke primaire fibroblasttransfectie, die moeilijk kan zijn vanwege de specifieke kenmerken van primaire celkweekomstandigheden. Bovendien vereist het onderhoud van de dynamische eigenschap van cytoskeletten een laag niveau van transfectie om een goede signaal-ruisverhouding te verkrijgen zonder microtubulestabilisatie te veroorzaken. Het is belangrijk om maatregelen te nemen om de cellen te beschermen tegen door licht veroorzaakte stress en fluorescerende kleurstofvervaging. In de loop van ons werk hebben we verschillende transfectiemethoden en -protocollen getest, evenals verschillende vectoren om de beste combinatie van aandoeningen te selecteren die geschikt is voor menselijke primaire fibroblaststudies. We analyseerden de resulterende time-lapse-video's en berekenden de microtubule-dynamiek met behulp van ImageJ. De dynamiek van de plus-uiteinden van microtubuli in de verschillende celdelen is niet vergelijkbaar, dus verdeelden we de analyse in subgroepen - het centrosoomgebied, de lamellen en de staart van fibroblasten. Dit protocol kan met name worden gebruikt voor in vitro analyse van cytoskeletdynamica in patiëntmonsters, waardoor de volgende stap kan worden gezet naar het begrijpen van de dynamiek van de verschillende ziekteontwikkelingen.
Introduction
De ziekte van Huntington (ZvH) is een ongeneeslijke neurodegeneratieve pathologie veroorzaakt door een mutatie-gen dat codeert voor het kjatingtine-eiwit (HTT). HTT wordt voornamelijk geassocieerd met blaasjes en microtubuli en is waarschijnlijk betrokken bij microtubuli-afhankelijke transportprocessen1,2. Om de invloed van mutant HTT op de microtubuledynamica te bestuderen, gebruikten we in vitro visualisatie van het EB3-eiwit, dat de dynamische eigenschappen van microtubuli reguleert door de groeiende plus-uiteinden te binden en te stabiliseren. Om fluorescerend gelabelde EB3 in menselijke huidfibroblasten te laden, werd plasmidetransfectie toegepast. We gebruikten de primaire fibroblastcultuur verkregen uit de huidbiopsie van de ZvH-patiënten voor deze studie.
De mutatie in het HTT-eiwitgen leidt tot verlenging van het polyglutaminekanaal3. HTT heeft een rol in cellulaire processen zoals endocytose4,celtransport1,2,eiwitafbraak5,enz. Een substantieel deel van deze processen omvat verschillende elementen van het celcytoskelet, waaronder de microtubuli.
Menselijke primaire cellen zijn het beste model om gebeurtenissen die zich in patiëntencellen voordoen zo goed mogelijk te reproduceren. Om dergelijke modellen te maken, moet men cellen isoleren van menselijk biopsiemateriaal (bijvoorbeeld uit chirurgische monsters). De resulterende primaire cellijn is geschikt om pathogenese te bestuderen met behulp van verschillende genetische, biochemische, moleculaire en celbiologische methoden. Ook dienen menselijke primaire celculturen als een voorloper voor het creëren van verschillende transgedifferentieerde en transgene culturen6.
In tegenstelling tot vereeuwigde celculturen is het belangrijke nadeel van primaire cellen echter hun beperkte doorgangscapaciteit. Daarom raden we aan om cellen te gebruiken in de vroege passagefase (tot 15). Oudere culturen degenereren zeer snel en verliezen hun unieke eigenschappen. Daarom moeten de nieuw verkregen primaire cellen bevroren worden gehouden voor langdurige opslag.
Primaire celculturen zijn gevoelig voor kweekomstandigheden. Daarom vereisen ze vaak unieke benaderingen en optimalisatie van groeiomstandigheden. Met name de primaire fibroblasten van de menselijke huid die in onze experimenten worden gebruikt, zijn veeleisend voor het substraat. Daarom gebruikten we verschillende extra coatings (bijv. Gelatine of fibronectine), afhankelijk van het type experiment.
Het celcytoskelet bepaalt de celvorm, mobiliteit en voortbeweging. De dynamiek van het cytoskelet is cruciaal voor veel intracellulaire processen, zowel in de interfase als in mitose. In het bijzonder het cytoskelet gepolymeriseerd uit tubuline, zijn zeer dynamische en polaire structuren, waardoor motoreiwit-gemedieerd gericht intracellulair transport mogelijk is. De uiteinden van de microtubuli zijn in constante herschikking, hun assemblagefasen worden afgewisseld met de demontagefasen en dit gedrag wordt "dynamische instabiliteit" genoemd7,8,9. Verschillende geassocieerde eiwitten verschuiven het evenwicht van de polymerisatiereactie, wat leidt tot de polymeervorming of de eiwitmonomeervorming. De toevoeging van tubuline-subeenheden vindt voornamelijk plaats aan het plus-uiteinde van microtubuli10. De eindbindende (EB) eiwitfamilie bestaat uit drie leden: EB1, EB2 en EB3. Ze dienen als plus-end-tracking eiwitten (+ TIPs) en reguleren de dynamische eigenschappen van microtubuli door hun groeiende plus-ends te binden en te stabiliseren11.
Veel studies gebruiken fluorescerende molecuul-gelabelde tubuline micro-injectie of transfectie met time-lapse beeldvorming en video-analyse om microtubuli in vitrote visualiseren. Deze methoden kunnen invasief zijn en schadelijk voor cellen, vooral primaire menselijke cellen. De meest uitdagende stap is het vinden van voorwaarden voor celtransfectie. We probeerden het hoogst mogelijke niveau van transfectie te bereiken zonder de levensvatbaarheid en de morfologie van inheemse cellen te beïnvloeden. Deze studie past de klassieke methode toe om de verschillen in microtubulidynamiek in huidfibroblasten van gezonde donoren en patiënten met de Ziekte van Huntington te bestuderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dit protocol volgt de richtlijnen van het Federal Research and Clinical Center of Physical-Chemical Medicine van het Federal Medical Biological Agency van 8 september 2015.
OPMERKING: Figuur 1 geeft een overzicht van het protocol.
1. Het verkrijgen van een primaire kweek van menselijke huidfibroblasten (Figuur 2)
- Lever de biopsie binnen enkele uren af bij een laboratorium in Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM) medium aangevuld met 50 μg/ml penicilline en 50 U/ml streptomycine.
OPMERKING: Een huidbiopsie moet onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd door een arts nadat een patiënt een geïnformeerde toestemming heeft ondertekend. - Plaats het biopsieweefsel in een petrischaaltje van 6 cm samen met een kleine hoeveelheid van het medium.
- Snijd met behulp van een steriel scalpel het biopsiemonster in stukken van ongeveer 0,5-1 mm groot. Plaats 1-2 verkregen fragmenten in een petrischaaltje van 3,5 cm en plaats een steriele deklap over de biopsiestukken. Voeg langzaam 1,5 ml van een groeimedium toe aan de volgende samenstelling: DMEM, 50 E / ml penicilline-streptomycine en 10% foetaal runderserum (FBS).
- Kweekfibroblasten in het groeimedium in een CO2-incubator op 5% CO2,37 °C, 80% vochtigheid.
OPMERKING: Na 4-7 dagen beginnen eerst keratinocyten en vervolgens fibroblasten van het weefsel naar de bodem van de schaal te migreren.
2. Opslag, invriezen en ontdooien van primaire cultuur
- Verwijder cellen uit de kweekschaal (zie de punten 3.2-3.4).
- Breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 200 x g. Gooi vervolgens het supernatant weg en resuspend de celkorrel in 900 μL gekoeld FBS.
- Breng druppelsgewijs over in een cryopreservatiebuis en voeg 100 μL dimethylsulfoxide (DMSO) toe.
- Plaats de cryoprobe in een lage temperatuur vriezer bij -80 °C. Breng vierentwintig uur later het cryoviale over op vloeibare stikstof (−196 °C) voor langdurige opslag.
- Om de gecryopreserveerde cellen te ontdooien, verwijdert u het cryoviaal uit de stikstofopslag en brengt u binnen 1 minuut 1 ml van de inhoud over in een conische buis van 15 ml met 9 ml van het tot 37 °C voorverwarmde transportmedium.
- Voorzichtig resuspend en vervolgens centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 200 x g. Gooi het supernatant weg, resuspend de celkorrel in het vereiste volume van het groeimedium en plaats ze op een petrischaal met de vereiste diameter.
3. Celkweek
- Bedek de bodem van de schaal met geautoclaveerde 0,1% gelatineoplossing bereid in gedestilleerd water. Incubeer gedurende 15 min.
OPMERKING: Voor transfectievisualisatie moeten schotels met glazen bodem (confocale schalen met een glasdikte van 170 μm) worden gebruikt. - Bereid een kweekmedium met de volgende samenstelling: DMEM aangevuld met 10% FBS, 2 mM L-alanyl-L-glutamine, 50 U/ml penicilline-streptomycine. Meng goed en bewaar bij 4 °C. Verwarm het medium tot 37 °C voordat u het aan de cellen toevoegt.
- Beoordeel de cultuur onder de microscoop. Verwijder het medium en was de fibroblasten met Dulbecco's fosfaatzoutoplossing (DPBS).
- Voeg 1 ml voorverwarmde 0,25% trypsine-oplossing toe aan de cellen. Controleer de cellen onder de microscoop als ze volledig loskomen van het substraat. Deactiveer trypsine met 1 ml van het kweekmedium.
- Breng de celsuspensie over in een conische buis van 15 ml. Centrifugeer de buis gedurende 5 minuten bij 200 x g, verwijder het supernatant en resuspend de celkorrel in 1 ml van het kweekmedium.
- Tel het aantal cellen. Bereken het benodigde aantal cellen om ze te zaaien met een dichtheid van 8-15 x10 3/ cm2 en resuspend in 2 ml van het kweekmedium.
- Verwijder de gelatine-oplossing uit de kweekschaal en voeg onmiddellijk 2 ml van de celsuspensie toe. Kweek fibroblasten bij 37 °C in een CO2-incubator.
- Ververs het medium om de 2-4 dagen.
OPMERKING: Gebruik voor experimenten de cellen van 4-11 passages.
4. Transfectie
- Vervang het kweekmedium 24 uur voor de transfectie door een vers kweekmedium.
OPMERKING: De celconfluentie moet 70-80% zijn. - Bereid een DNA-lipidencomplex voor op basis van het gebied en de dichtheid van de celzaaiing. Gebruik transfectiemiddel op basis van liposoom.
OPMERKING: Gebruik de celzaaidichtheid als 1 x 104 cellen / cm2. - Voeg 3 μL commercieel transfectiereagens toe aan 125 μL optimaal minimaal essentieel medium (Opti-MEM) dat geen antibiotica bevat, zonder de wanden van de buis aan te raken. Voorzichtig resuspend.
- Verdun plasmide-DNA (GFP-EB3) door 1 μg van het plasmide-DNA toe te voegen aan 125 μL Opti-MEM. Voorzichtig resuspend.
OPMERKING: Expressievectorcodering GFP-EB311 werd ontvangen als een vriendelijk geschenk van Dr. I. Kaverina (Vanderbilt University, Nashville) met toestemming van Dr. A. Akhmanova (Erasmus Universiteit, Rotterdam)11. - Voeg verdund plasmide-DNA toe aan elke buis verdund transfectiereagens (1:1). Incubeer gedurende 30 min.
- Voeg het DNA-lipidencomplex toe aan de 6 cm petrischaal met cellen en meng met een kruisvormige zwaai gedurende 30 s. Incubateer cellen met een transfectiemiddel gedurende 24 uur en verander dan in vers medium. Analyseer de efficiëntie van transfectie na 24 uur en 48 uur.
OPMERKING: 24 uur na transfectie was het rendement 10-15% en na 48 uur tot 40%.
5. Voorbereiding op beeldvorming
- Voordat de cellen live worden ingebeeld, moet u het kweekmedium veranderen in een medium zonder pH-indicatorkleurstof om autofluorescentie te verminderen.
- Breng voorzichtig minerale olie aan op het mediumoppervlak om het medium volledig te bedekken en te isoleren van de externe omgeving om de O2-penetratie en de mediumverdamping te verminderen.
- Gebruik een kwiklamp en olie-onderdompeling 60x of 100x objectieflens met een hoog numeriek diafragma om de foto's te maken.
OPMERKING: Voor in vivo waarnemingen moet de microscoop zijn uitgerust met een incubator om de noodzakelijke omstandigheden voor de cellen te handhaven, inclusief het verwarmen van de objecttafel en de lens tot +37 °C, een gesloten kamer met CO2-toevoer en ondersteuning van het vochtigheidsniveau. Gebruik dubbel gedestilleerd water om vocht te creëren. Controleer het niveau van dubbel gedestilleerd water voordat u gaat filmen. - Plaats de confocale schaal met de cellen in de microscoophouder voordat u de afbeelding maakt. Zorg ervoor dat de schotel en de camera stevig aan de houder zijn bevestigd om driften tijdens het maken van foto's te voorkomen.
6. De beeldparameters instellen
- Kies de lage blootstellingswaarden omdat licht celbeschadigende reactieve zuurstofsoorten (ROS) induceert.
OPMERKING: Om de dynamiek van microtubuli in menselijke huidfibroblasten te bestuderen, werd een blootstelling van 300 ms geselecteerd. - Focus op het object van belang.
OPMERKING: Gebruik voor langdurige time-lapse-beelden het automatische focusstabilisatiesysteem om een mogelijke verschuiving langs de z-as te compenseren. - Kies de optimale beeldvormingsomstandigheden afhankelijk van de lichtgevoeligheid van de cellen en de snelheid waarmee het fluorochroom vervaagt.
OPMERKING: Aangezien microtubuli zeer dynamische structuren zijn, kan een redelijk kort tijdsinterval worden geselecteerd en moet de framesnelheid voldoende hoog zijn. Om de microtubuledynamiek in huidfibroblasten te onderzoeken, gebruikten we met een frequentie van 1 frame /s gedurende 3-5 minuten. - Wanneer u het volgende object selecteert om de afbeelding op te halen, gaat u weg van het gebied dat al is afgebeeld. Omdat dit gebied onder invloed van licht was, zal er merkbaar fotobleken zijn.
OPMERKING: Omdat een relatief hoge beeldfrequentie werd gebruikt, sloot de sluiter niet tussen de beelden en werd de lamp gedurende de hele beeldperiode verlicht, waardoor de vervaging toenam. - Kies de optimale video voor het visueel bestuderen van de dynamiek van de microtubuli, rekening houdend met de kwaliteit van transfectie, de kwaliteit van de beelden van de microtubuli (optimale signaal-ruisverhouding) en de afwezigheid van drifting in het geval van de geanalyseerde cel (figuur 3).
- Gebruik de geselecteerde video's om de plus-ends dynamiek van de microtubuli te bestuderen door ze te traceren in het ImageJ- of Fiji-programma(Figuur 4).
OPMERKING: Voor instructies voor kwantitatieve analyse, zie aanvullende figuur 2 en aanvullend dossier 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De resulterende GFP-EB3-films geproduceerd met behulp van het protocol (Figuur 1) illustreren de dynamische eigenschappen van de microtubuli. Microtubuli zijn betrokken bij verschillende celprocessen en hun dynamische eigenschappen beïnvloeden verschillende levenskenmerken van de primaire menselijke celcultuur uit biopsiemateriaal van patiënten(figuur 2).
De volgende parameters bepalen de dynamische instabiliteit van microtubuli: de groeisnelheden (polymerisatie) en krimp (depolymerisatie); de frequentie van catastrofes (overgang van polymerisatie naar depolymerisatie); de frequentie van reddingen (overgang van depolymerisatie naar polymerisatie); evenals pauzes - stelt wanneer de microtubuli niet polymeriseren en niet depolymeriseren 12. Alle parameters zijn strak gereguleerd en de snelheden van polymerisatie en depolymerisatie van individuele microtubuli kunnen aanzienlijk variëren, zowel in dezelfde als in verschillende celtypen13,14,15,16,17.
Het is noodzakelijk om voor de analyse te overwegen dat microtubuli verschillende dynamieken kunnen hebben, afhankelijk van hun positie in de cel. Microtubuli in het gebied van de kern en het centrosoom gedragen zich anders in vergelijking met die aan de celrand19. Daarom hebben we, om een betrouwbaar resultaat te verkrijgen, de dynamische metingen van de microtubuli uitgevoerd in drie afzonderlijke gebieden van de cel: het centrale deel, de voorrand en het staartgedeelte(figuur 3). Om de juiste verdeling van het GFP-EB3-label in verschillende celdelen te regelen, gebruikten we menselijke pulmonale arterie-endotheelcellen (HPAEC)(zie aanvullende figuur 1).
Gespecialiseerde programma's, zoals ImageJ of Fiji (ImageJ 2 v1. 53i), maken de analyse van de video's mogelijk door de volgende parameters: (1) de snelheid van de groei van de microtubuli; (2) de frequentie van rampen; (3) de frequentie van de reddingen; (4) de frequentie van pauzes; en (5) duur van pauzes. Bovendien maken unieke programma-opties en plug-ins het mogelijk om automatisch18 of handmatig19 te traceren(figuur 4). De handmatige traceermethode werkte beter in onze experimenten, omdat automatische metingen gevoelig zijn voor grotere fouten en meer herhalingen vereisen voor een nauwkeuriger resultaat. Gedetailleerde instructies over de analyse van dynamische gegevens over microtubuli zijn te vinden in aanvullende figuur 2 en aanvullend bestand 1.
De beeldvormingsparameters kunnen aanpassingen vereisen tijdens het beeldvormingsproces. Zo kunnen bijvoorbeeld de duur van één celbeeldvorming en de belichtingswaarden worden gewijzigd. Dergelijke instellingen zijn nuttig als er een snelle signaal burn-out is, of de cel krimpt(Figuur 5).
Figuur 1: Het algemene schema van het GFP-EB3 transfectieprotocol voor de primaire fibroblastencultuur van de menselijke huid. Het protocol omvat de volgende stappen: losmaken van cellen door de trypsine-oplossing; trypsine-inactivatie door de mediumtoevoeging; centrifugering van de resulterende verbinding; berekening van de celconcentratie; cel zaaien naar de glazen bodemschaal (confocale schaal) bedekt met gelatine; celkweektransfectie door plasmide-DNA (met GFP-EB3) met het liposomale transfectiereagentiatergens; incubatie 24-48 uur; en analyse onder een microscoop. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Primaire kweekvoorbereidingsschema voor menselijke huidfibroblasten. Een huidbiopsie moet onder steriele omstandigheden door een arts worden uitgevoerd nadat een patiënt een geïnformeerde toestemming heeft ondertekend. Vervolgens wordt een stukje weefsel in een kleine hoeveelheid van het medium zonder FBS naar het laboratorium in een petrischaaltje getransporteerd. Een groot weefselfragment wordt in stukken van 0, 5-1 mm groot gesneden en ze zijn bedekt met een dekglas met de toevoeging van het medium met FBS. Vervolgens wordt de petrischaal in een CO2-incubator geplaatst, waar na 4-7 dagen fibroblasten van het weefselfragment naar de glazen bodem migreren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: GFP-EB3 marker (groen) in verschillende gebieden van getransfecteerde menselijke fibroblasten, verkregen uit de huidbiopsie van ZvH patiënten: leading edge (bovenpaneel); staart (middenpaneel); centraal deel van fibroblast (zone rond het centrosoom) (onderste paneel). Schaalbalk = 10 μm. De beeldfrequentie is 1 frame/s. Wide-field fluorescerende microscopie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: GFP-EB3 handmatige tracking door ImageJ plugin MTrackJ. Sporen die de groei van microtubuli weerspiegelen, werden verkregen als gevolg van frame-voor-frame handmatige markering van de GFP-EB3-labelstips aan de plus-uiteinden tijdens 20 s van beeldvorming. Getransfecteerde gekweekte fibroblasten, verkregen uit huidbiopsie van ZvH-patiënten. De beeldfrequentie is 1 frame/s. Wide-field fluorescerende microscopie. Schaalbalk = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Probleemoplossing tijdens het afbeelden van de plus-uiteinden van GFP-EB3-gelabelde microtubuli. (A) Fluorescerende microtubuli zijn onscherp vanwege de afwezigheid van een scherpstelsysteem. (B)Microtubuli worden gestabiliseerd en verliezen hun dynamische eigenschappen als gevolg van overexpressie van GFP-EB3 in de cel als gevolg van lange incubatie met het transfecterende mengsel. (C) Krimp van de cellamellen als gevolg van fototoxiciteit als gevolg van het vrijkomen van ROS. (D) Signaalintensiteit daalt tijdens beeldvorming - snelle fotobleaching. Getransfecteerde gekweekte fibroblasten, verkregen uit huidbiopsie van ZvH-patiënten. De beeldfrequentie is 1 frame per seconde. Wide-field fluorescerende microscopie. Schaalbalken = 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Selectieve visualisatie van groeiende microtubuli plus-ends. GFP-EB3 marker (groen) in verschillende gebieden van getransfecteerde menselijke endotheelcel (cultuur van HPAEC: Human Pulmonary Artery Endothelial Cells) in leading edge, tail en central area (zone rond het centrosoom). Schaalstaven 10 μm. De beeldfrequentie is 1 frame/s Wide-field fluorescerende microscopie. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Microtubule dynamics analyse door GFP-EB3 label na handmatige tracking met behulp van ImageJ plugin MTrackJ. (A,B) EB3-sporen verkregen door EB3-GFP-pleisters verplaatsing op time-lapse-serie van getransfecteerde gekweekte fibroblasten, verkregen uit de huidbiopsie van ZvH-patiënten (worden individueel gekleurd). (A) EB3 track (paars, No46) verkregen door EB3-GFP patches verplaatsing gedurende 18 seconden. (B) EB3-spoor (rood, No37) verkregen door EB3-GFP-patches verplaatsing gedurende 9 seconden. (C)Kwantificering van plus-ends verplaatsing van microtubuli van de huidfibroblast van menselijke ZvH patiënten getoond in(A). D) Kwantificering van de verplaatsing van de uiteinden van microtubuli als aangegeven inB). De grafiek laat zien dat er tussen 6-8 seconden een pauze is in de groei van de microtubuli (er is geen beweging van het plus-uiteinde). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend dossier 1: Kwantitatieve analyse van de dynamiek van EB3-GFP gelabelde microtubuli's plus-ends. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Betere kwaliteitsresultaten voor de dynamische analyse van microtubuli kunnen worden verkregen uit microscopische beelden van hoge kwaliteit. Het is belangrijk om alle noodzakelijke voorwaarden voor time-lapse beeldvorming van levende cellen in acht te nemen en de beeldvormingsparameters correct aan te passen. Het gebruik van speciale celkweekschalen met een glazen bodem (confocale schotels) is belangrijk, omdat glas een andere brekingsindex van licht heeft dan plastic. De dikte van het glas en de uniformiteit ervan over het hele gebied is ook uiterst belangrijk, omdat deze parameters cruciaal zijn voor een normale monsterfocus. Overtreding van deze parameters leidt onvermijdelijk tot een falen van het perfecte focussysteem, wat resulteert in een slechte scherpstelling, waardoor het onmogelijk wordt om dergelijke onscherpe video te gebruiken voor analyse (Figuur 5A). Een andere belangrijke voorwaarde voor live-cell imaging is hun bescherming tegen ROS. Voor dergelijke doeleinden kunnen verschillende reagentia worden gebruikt20. In ons werk gebruiken we minerale olie, die het kweekmedium volledig isoleert van de atmosfeer en gasuitwisseling voorkomt. Op dezelfde manier kan de ROS-reducerende oxyraas worden gebruikt, maar dit enzym is niet geschikt voor alle celtypen en is vaker toepasbaar op beeldvorming met verhoogde tijd.
Bij het kiezen van de optimale incubatietijd van cellen na transfectie (24 of 48 uur), moet aandacht worden besteed aan het aantal getransfecteerde cellen. Een aantal kleiner dan het maximale aantal cellen dat het gelabelde eiwit tot expressie brengt, is al voldoende voor de analyse. Overexpressie mag niet worden toegestaan omdat microtubuli in dergelijke gevallen worden gestabiliseerd en hun dynamische eigenschappen niet kunnen worden geanalyseerd(figuur 5B).
In sommige gevallen kan het nodig zijn om de beeldvormingsparameters aan te passen in overeenstemming met de reactie van cellen na het begin van de video-opname. Het is bijvoorbeeld mogelijk om cellamellen te zien krimpen als gevolg van hoge gevoeligheid voor licht (fototoxiciteit) (figuur 5C). Wanneer ze worden geëxciteerd, reageren de fluorescerende moleculen meestal met moleculaire zuurstof om vrije radicalen te vormen die celcomponenten kunnen beschadigen21. Bij het ontwerpen van experimenten moeten fluoroforen met de maximaal mogelijke excitatiegolflengte worden geselecteerd om celschade bij kortegolfverlichting te minimaliseren. Bovendien zijn er rapporten dat bepaalde componenten van standaard kweekmedia, waaronder de riboflavinevitamine en het tryptofaanaminozuur, ook kunnen bijdragen aan de nadelige effecten van licht op gekweekte cellen22. Dit kan onder andere worden veroorzaakt door een overmatige hoeveelheid fluorescerende labels in één cel. In deze gevallen wordt het noodzakelijk om de duur van de opname en de intensiteit van de verlichting te verminderen. Een ander mogelijk probleem kan ook snelle fotobleaching zijn - afname van de signaalintensiteit tijdens de opname(figuur 5D). Met dit effect moet rekening worden gehouden bij het selecteren van het volgende object op dezelfde experimentele schotel, omdat de naburige cellen rond het afgebeelde gebied ook zijn opgebrand.
Er moet worden vermeld dat er andere methoden zijn voor microtubulevisualisatie in levende cellen, zoals micro-injectie van fluorescerend gelabelde tubuline in de cel of celtransductie met behulp van virussen. Zoals bij elke andere methode, zijn er voor- en nadelen aan de transfectiemethode. Vanuit ons oogpunt is transfectie echter effectiever in vergelijking met de injectiemethode en maakt het mogelijk om massale opname van expressievectoren in de cellen te bereiken, wat resulteert in een groot aantal fluorescerende cellen voor analyse. Ook vereist de transfectiemethode geen speciale apparatuur en vaardigheden van de onderzoeker. De methode van virale transductie vertoont goede resultaten en kan worden toegepast. Toch is het niet geschikt voor alle celculturen (in het bijzonder is het minder geschikt voor menselijke fibroblasten, verkregen uit huidbiopsie van ZvH-patiënten).
De meest kritische stap in dit protocol is de transfectie die wordt uitgevoerd om voldoende eiwitexpressie te garanderen. Een goede signaal-ruisverhouding, geen fotobleaching van microtubuli en de afwezigheid van celdrift tijdens time-lapse video-opname zijn absoluut cruciaal voor effectieve beeldvorming van microtubuli. In onsexperiment bieden visualisatie van microtubuli en de dynamische analyse essentiële informatie over microtubulieigenschappen en gedrag in de cellen met mutant HTT. Ons protocol is van toepassing op studies van andere ziekten waarvoor pathologie dynamische eigenschappen van microtubuli impliceert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gefinancierd door het ministerie van Wetenschap en Hoger Onderwijs van de Russische Federatie, subsidie nr. 075-15-2019-1669 (transfectie van fibroblasten), door de Russian Science Foundation, subsidie nr. 19-15-00425 (alle andere werken aan de teelt van fibroblasten in vitro). Het werd gedeeltelijk ondersteund door Lomonosov Moscow State University Development program PNR5.13 (beeldvorming en analyse). De auteurs erkennen de steun van het Nikon Center of Excellence aan het A. N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology. We willen onze speciale dank uitspreken aan Ekaterina Taran voor haar hulp bij stemacteren. De auteurs bedanken ook Pavel Belikov voor zijn hulp bij de videobewerking. Figuren in het manuscript zijn gemaakt met BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrumentation | |||
| Camera iXon DU897 EMCCD | Andor Technology | ||
| Eppendorf Centrifuge 5804 R | Eppendorf Corporate | ||
| Fluorescence filter set HYQ FITC | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| LUNA-II Automated Cell Counte | Logos Biosystems | L40002 | |
| Microscope incubator for lifetime filming | Okolab | Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS | |
| Gas controller CO2-O2-UNIT-BL | |||
| Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13) | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Software | |||
| Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c) | Open source image processing software | ||
| NIS Elements | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Additional reagents | |||
| Mineral oil (Light white oil) | MP | 151694 | |
| Cell culture dish | |||
| Cell Culture Dish | SPL Lifesciences | 20035 | |
| Confocal Dish (glass thickness 170 µm) | SPL Lifesciences | 211350 | Alternative: MatTek |
| Conical Centrifuge tube | SPL Lifesciences | 50015 | |
| Cryogenic Vials | Corning-Costar | 430659 | |
| Microcentrifuge Tube | Nest | 615001 | |
| Cultivation | |||
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| Dimethyl sulfoxide | PanEko |  135 |
|
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | PanEko | C420 |
|
| DPBS (Dulbecco's phosphate-salt solution) | PanEko | P060 |
|
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | K053/SH30071.03 | |
| Gelatin (bovine skin) | PanEko | 070 |
|
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Opti-MEM (1x) + Glutamax | Gibco | 519850026 | |
| Penicillin-streptomycin | PanEko | A063 |
|
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| Transfection | |||
| Plasmid DNA with EB3-GFP | Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova [Erasmus University, Rotterdam] |
Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003 |
References
- Engelender, S., et al. Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin. Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).
- Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L.
- MacMillan, J. C., et al. Molecular analysis and clinical correlations of the Huntington's disease mutation. The Lancet. 342 (8877), 954-958 (1993).
- Proskura, A. L., Vechkapova, S. O., Zapara, T. A., Ratushniak, A. S.
- Steffan, J. S., et al. The Huntington's disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6763-6768 (2000).
- Nekrasov, E. D., et al. Manifestation of Huntington's disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Molecular Neurodegeneration. 11 (1), 1-15 (2016).
- Mitchison, T., Kirschner, M.
- Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).
- Desai, A., Mitchison, T. J.
- Allen, C., Borisy, G. G. Structural polarity and directional growth of microtubules of Chlamydomonas flagella. Journal of Molecular Biology. 90 (2), 381-402 (1974).
- Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
- Shelden, E., Wadsworth, P. Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific. Journal of Cell Biology. 120 (4), 935-945 (1993).
- O'Brien, E. T., Salmon, E. D., Walker, R. A., Erickson, H. P. Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules. Biochemistry. 29 (28), 6648-6656 (1990).
- Drechsel, D. N., Hyman, A. A., Cobb, M. H., Kirschner, M. W. Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1141-1154 (1992).
- Gildersleeve, R. F., Cross, A. R., Cullen, K. E., Fagen, A. P., Williams, R. C. Microtubules grow and shorten at intrinsically variable rates. Journal of Biological Chemistry. 267 (12), 7995-8006 (1992).
- Penazzi, L., Bakota, L., Brandt, R. Microtubule dynamics in neuronal development, plasticity, and neurodegeneration. International Review of Cell and Molecular Biology. 321, 89-169 (2016).
- van de Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).
- Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
- Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary. Journal of Cell Science. 115 (17), 3527-3539 (2002).
- Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., vanden Broek, B., Jalink, K. Optimizing imaging conditions for demanding multi-color super resolution localization microscopy. PLoS One. 11 (7), 0158884 (2016).
- Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal. 36 (2), 280-290 (2003).
- Grzelak, A., Rychlik, B., Bartosz, G. Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media. Free Radical Biology and Medicine. 30 (12), 1418-1425 (2001).
