Summary
هذا البروتوكول مخصص للتصور microtubule زائد نهاية بواسطة EB3 البروتين transfection لدراسة خصائصها الحيوية في ثقافة الخلايا الأولية. تم تنفيذ البروتوكول على الخلايا الليفية الجلدية الأولية البشرية التي تم الحصول عليها من مرضى مرض هنتنغتون.
Abstract
Transfection مع بروتين علامة المسمى fluorescently من الفائدة في تركيبة مع المجهر الفيديو الفاصل الزمني هو وسيلة كلاسيكية لدراسة الخصائص الديناميكية للهيكل الخلوي. يقدم هذا البروتوكول تقنية لإصابة الإنسان بالخلايا الليفية الأولية ، والتي يمكن أن تكون صعبة بسبب تفاصيل ظروف زراعة الخلايا الأولية. بالإضافة إلى ذلك، يتطلب الهيكل الخلوي صيانة الممتلكات الحيوية مستوى منخفض من العدوى للحصول على نسبة جيدة من الإشارة إلى الضوضاء دون التسبب في استقرار microtubule. من المهم اتخاذ تدابير لحماية الخلايا من الإجهاد الناجم عن الضوء وتلاشي الصبغة الفلورية. في سياق عملنا، اختبرنا طرق وبروتوكولات مختلفة للإصابة وكذلك ناقلات مختلفة لاختيار أفضل مزيج من الشروط المناسبة لدراسات الورم الليفي الأولي للإنسان. قمنا بتحليل مقاطع الفيديو الناتجة عن الفاصل الزمني وديناميكيات microtubule المحسوبة باستخدام ImageJ. ديناميات microtubules 'زائد ينتهي في أجزاء الخلية المختلفة ليست متشابهة ، لذلك قسمنا التحليل إلى مجموعات فرعية -- المنطقة المركزية ، ولاميلا ، وذيل الخلايا الليفية. وتجدر الإشارة إلى أن هذا البروتوكول يمكن استخدامه للتحليل المختبري لديناميكيات الهيكل الخلوي في عينات المرضى ، مما يتيح الخطوة التالية نحو فهم ديناميكيات تطور المرض المختلفة.
Introduction
مرض هنتنغتون (HD) هو مرض تنكسي عصبي غير قابل للشفاء ناجم عن بروتين ترميز الجينات الطفرة (HTT). ويرتبط HTT في المقام الأول مع الحويصلات والبيبوليتولات الصغيرة، وربما تشارك في عمليات النقل التي تعتمد على microtubule1،2. لدراسة تأثير HTT متحولة على ديناميات microtubule، استخدمنا في التصور المختبري للبروتين EB3، الذي ينظم الخصائص الديناميكية لل microtubules عن طريق ربط وتحقيق الاستقرار في النمو زائد ينتهي. لتحميل الفلورسنت المسمى EB3 في الخلايا الليفية الجلد البشري، تم تطبيق التراتوفيكيد البلازميد. استخدمنا ثقافة الخلايا الليفية الأولية التي تم الحصول عليها من خزعة جلد المرضى عالية الدقة لهذه الدراسة.
الطفرة في الجين البروتين HTT يؤدي إلى استطالة من البوليglutamine المسالك3. HTT له دور في عمليات خلوية مثل الغدد الصماء4، نقل الخلية1،2، تدهور البروتين5، إلخ. جزء كبير من هذه العمليات ينطوي على عناصر مختلفة من الهيكل الخلوي الخلية، بما في ذلك microtubules.
الخلايا الأولية البشرية هي أفضل نموذج لإعادة إنتاج الأحداث التي تحدث في خلايا المريض عن كثب قدر الإمكان. لإنشاء مثل هذه النماذج ، يحتاج المرء إلى عزل الخلايا عن مواد الخزعة البشرية (على سبيل المثال ، من العينات الجراحية). خط الخلية الأولية الناتجة مناسبة لدراسة الإمراض باستخدام مختلف الأساليب الوراثية والكيميائية الحيوية والجزيئية وبيولوجيا الخلايا. أيضا، ثقافات الخلايا الأولية البشرية بمثابة مقدمة لخلق مختلف الثقافات المتحولة وراثيا ومحورةوراثيا 6.
ومع ذلك ، على النقيض من ثقافات الخلايا الخالدة ، فإن العيب الكبير للخلايا الأولية هو قدرتها المحدودة على المرور. لذلك، نوصي باستخدام الخلايا في مرحلة الممرات المبكرة (حتى 15). الثقافات القديمة تتدهور بسرعة كبيرة، وتفقد خصائصها الفريدة. وبالتالي، ينبغي الاحتفاظ الخلايا الأولية التي تم الحصول عليها حديثا المجمدة للتخزين على المدى الطويل.
ثقافات الخلايا الأولية عرضة لظروف الزراعة. ولذلك، فإنها غالبا ما تتطلب نهجا فريدة من نوعها والاستفادة المثلى من ظروف النمو. على وجه الخصوص ، فإن الخلايا الليفية الأولية للبشرة البشرية المستخدمة في تجاربنا تتطلب على الركيزة. ومن ثم، استخدمنا مختلف الطلاء إضافية (على سبيل المثال، الجيلاتين أو فيبروكتين) اعتمادا على نوع التجربة.
يحدد الهيكل الخلوي الخلوي شكل الخلية وحركتها وحركتها. ديناميات الهيكل الخلوي حاسمة بالنسبة للعديد من العمليات داخل الخلايا على حد سواء في مرحلة ما بين المراحل والميتوسيس. على وجه الخصوص، والهيكل الخلوي بوليمر من توبولين، هي هياكل ديناميكية للغاية والقطبية، وتمكين النقل الحركي بوساطة البروتين الموجهة داخل الخلايا. نهايات microtubules هي في إعادة ترتيب مستمر، مراحل التجميع الخاصة بهم بالتناوب مع مراحل التفكيك، وهذا السلوك يسمى "عدم الاستقرار الديناميكي"7،8،9. تحول البروتينات المختلفة المرتبطة بها توازن تفاعل البلمرة ، مما يؤدي إما إلى تكوين البوليمر أو تكوين مونومر البروتين. إضافة وحدات توبولين الفرعية يحدث أساسا في نهاية زائد من microtubules10. تتكون عائلة البروتينات الملزمة النهائية (EB) من ثلاثة أعضاء: EB1 و EB2 و EB3. أنها بمثابة زائد نهاية تتبع البروتينات (+TIPs) وتنظيم الخصائص الديناميكية لل microtubules عن طريق ربط وتحقيق الاستقرار في النمو زائد ينتهي11.
تستخدم العديد من الدراسات الفلورسنت المسمى جزيء أنبوبولين microinjection أو العدوى مع التصوير الفاصل الزمني وتحليل الفيديو لتصور microtubules في المختبر. قد تكون هذه الطرق الغازية والضارة للخلايا، وخاصة الخلايا البشرية الأولية. الخطوة الأكثر تحديا هي إيجاد ظروف لإصابة الخلايا. حاولنا الوصول إلى أعلى مستوى ممكن من العدوى دون التأثير على الجدوى ومورفولوجيا الخلايا الأصلية. تطبق هذه الدراسة الطريقة الكلاسيكية لدراسة الاختلافات في ديناميات microtubule في الخلايا الليفية الجلدية من المتبرعين الأصحاء والمرضى الذين يعانون من مرض هنتنغتون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يتبع هذا البروتوكول المبادئ التوجيهية للمركز الاتحادي للبحوث والسريرية للطب الفيزيائي والكيميائي للوكالة البيولوجية الطبية الاتحادية بتاريخ 08 سبتمبر 2015.
ملاحظة: الشكل 1 يعطي نظرة عامة على البروتوكول.
1. الحصول على ثقافة أساسية من الخلايا الليفية الجلد البشري (الشكل 2)
- تسليم خزعة إلى المختبر في غضون ساعات قليلة في وسائط النسر المعدلة دولبيكو (DMEM) المتوسطة تكملها مع 50 ميكروغرام / مل من البنسلين و 50 U / مل من العقدية.
ملاحظة: يجب إجراء خزعة الجلد تحت ظروف معقمة من قبل الطبيب بعد أن يوقع المريض على موافقة مستنيرة. - ضع نسيج الخزعة في طبق بيتري 6 سم مع كمية صغيرة من الوسط.
- باستخدام مشرط معقم، قطع عينة الخزعة إلى قطع من حوالي 0.5-1 ملم في الحجم. مكان 1-2 شظايا حصلت في طبق بيتري 3.5 سم ووضع غطاء معقم على قطع خزعة. أضف ببطء 1.5 مل من متوسط النمو إلى التركيب التالي: DMEM ، 50 U / mL البنسلين - العقدية ، و 10 ٪ مصل البقر الجنيني (FBS).
- الخلايا الليفية الثقافية في وسط النمو داخل حاضنة CO2 حافظت على 5٪ CO2، 37 ° C ، 80٪ رطوبة.
ملاحظة: بعد 4-7 أيام، تبدأ الخلايا القرنية الأولى، ثم الخلايا الليفية، في الهجرة من الأنسجة إلى أسفل الطبق.
2. تخزين، تجميد، وإلغاء تجميد الثقافة الأولية
- إزالة الخلايا من طبق الثقافة (انظر النقاط 3.2-3.4).
- نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل والطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 200 x g. ثم تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه الخلية في 900 ميكرولتر من FBS المبردة.
- نقل إلى أنبوب التبريد قطرة قطرة وإضافة 100 ميكرولتر من كبريتيد ثنائي ميثيل (DMSO).
- ضع المبرد في ثلاجة منخفضة الحرارة عند -80 درجة مئوية. وبعد 24 ساعة، قم بنقل النيتروجين المبرد إلى النيتروجين السائل (−196 درجة مئوية) للتخزين على المدى الطويل.
- لإذابة الجليد في الخلايا المبردة، قم بإزالة التبريد من تخزين النيتروجين، وفي غضون دقيقة واحدة، قم بنقل 1 مل من المحتوى إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 9 مل من وسيط النقل المحمى مسبقا إلى 37 درجة مئوية.
- إعادة إنفاق بعناية ثم الطرد المركزي الأنبوب لمدة 5 دقائق في 200 × ز. تجاهل supernatant، resuspend بيليه الخلية في الحجم المطلوب من المتوسط النمو ووضعها على طبق بيتري من القطر المطلوب.
3. زراعة الخلايا
- تغطية أسفل الطبق مع محلول الجيلاتين 0.1٪ المعبأة في الماء المقطر. حضانة لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: بالنسبة لتصور العدوى، يجب استخدام أطباق الأطباق ذات القاع الزجاجي (أطباق الكونفوجال ذات سمك الزجاج 170 ميكرومتر). - إعداد وسيط ثقافة لها التكوين التالي: تكمل DMEM مع 10٪ FBS، 2 MM L-ألانيل-L-الجلوتامين، 50 U/mL البنسلين-streptomycin. تخلط جيدا وتخزينها في 4 °C. قم بتدفئة الوسط إلى 37 درجة مئوية قبل إضافته إلى الخلايا.
- تقييم الثقافة تحت المجهر. إزالة المتوسطة وغسل الخلايا الليفية مع محلول ملح الفوسفات دولبيكو (DPBS).
- إضافة 1 مل من محلول التريبسين 0.25٪ قبل الدفء إلى الخلايا. تحقق من الخلايا تحت المجهر إذا كانت تنفصل عن الركيزة تماما. إلغاء تنشيط التريبسين مع 1 مل من وسيط الثقافة.
- نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل. الطرد المركزي الأنبوب في 200 × ز لمدة 5 دقائق، وإزالة supernatant، وإعادة إنفاق بيليه الخلية في 1 مل من المتوسط الثقافة.
- عد عدد الخلايا. حساب العدد المطلوب من الخلايا لزرع لهم مع كثافة 8-15 × 103/ سم2 وإعادة الإنفاق في 2 مل من المتوسط الثقافة.
- إزالة محلول الجيلاتين من طبق الثقافة وإضافة 2 مل فورا من تعليق الخلية. زراعة الخلايا الليفية عند 37 درجة مئوية فيحاضنة ثاني أكسيد الكربون.
- تحديث المتوسطة كل 2-4 أيام.
ملاحظة: للتجارب، استخدم خلايا المقاطع 4-11.
4. العدوى
- استبدال الوسط الثقافي مع ثقافة جديدة متوسطة 24 ساعة قبل transfection.
ملاحظة: يجب أن يكون التقاء الخلية 70-80٪. - إعداد مجمع الحمض النووي الدهون على أساس مساحة وكثافة بذر الخلية. استخدام عامل العدوى القائم على الدهون.
ملاحظة: استخدام كثافة البذر الخلية كما 1 × 104 خلايا / سم2. - إضافة 3 ميكرولتر من كاشف العدوى التجارية إلى 125 ميكرولتر من الحد الأدنى الأمثل المتوسطة الأساسية (Opti-MEM) لا تحتوي على أي مضادات حيوية، دون لمس جدران الأنبوب. إعادة الإنفاق بلطف.
- تمييع الحمض النووي البلازميد (GFP-EB3) عن طريق إضافة 1 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد إلى 125 ميكرولتر من Opti-MEM. إعادة الإنفاق بلطف.
ملاحظة: تم تلقي التعبير المتجه ترميز GFP-EB311 كهدية نوع من الدكتور I. كافرينا (جامعة فاندربيلت، ناشفيل) بإذن من الدكتور أ. أخمانوفا (جامعة إيراسموس، روتردام)11. - إضافة الحمض النووي البلازميد المخفف إلى كل أنبوب من كاشف العدوى المخفف (1:1). حضانة لمدة 30 دقيقة.
- أضف مجمع الحمض النووي الدهني إلى طبق بيتري الذي يبلغ 6 سم ويحتوي على خلايا واخلطه مع أرجوحة صليبية لمدة 30 s. احتضان الخلايا مع عامل العدوى لمدة 24 ساعة ومن ثم تغيير إلى وسط جديد. تحليل كفاءة العدوى بعد 24 ساعة و 48 ساعة.
ملاحظة: 24 ساعة بعد العدوى، كانت الكفاءة 10-15٪، وبعد 48 ساعة تصل إلى 40٪.
5. التحضير للتصوير
- قبل التصوير الحي للخلايا، قم بتغيير متوسط الثقافة إلى وسط بدون صبغة مؤشر درجة الحموضة لتقليل الفلورة الذاتية.
- تطبيق الزيوت المعدنية بعناية على السطح المتوسط لتغطية تماما المتوسطة، وعزلها عن البيئة الخارجية للحد من اختراق O2 والتبخر المتوسط.
- استخدم مصباح الزئبق والغمر الزيت 60x أو 100x عدسة الهدف مع فتحة أرقام عالية لالتقاط الصور.
ملاحظة: بالنسبة للملاحظات في الجسم الحي، يجب أن يكون المجهر مجهزا وحاضنة للحفاظ على الظروف اللازمة للخلايا، بما في ذلك تسخين طاولة الجسم والعدسة إلى +37 درجة مئوية، وغرفة مغلقة مزودةبإمدادات ثاني أكسيد الكربون، ودعم مستوى الرطوبة. استخدام المياه المقطرة مزدوجة لخلق الرطوبة. تحقق من مستوى الماء المقطر المزدوج قبل التصوير. - ضع طبق الكونفوجكال مع الخلايا في حامل المجهر قبل التصوير. تأكد من أن الطبق والكاميرا متصلان بشكل آمن بحامل الحامل لتجنب الانجراف أثناء التقاط الصور.
6. وضع المعلمات التصوير
- اختر قيم التعرض المنخفضة لأن الضوء يحفز أنواع الأكسجين التفاعلية الضارة بالخلايا (ROS).
ملاحظة: لدراسة ديناميات microtubules في الخلايا الليفية الجلد البشري، تم اختيار التعرض 300 مللي ثانية. - التركيز على الهدف من الاهتمام.
ملاحظة: بالنسبة للتصوير الفاصل الزمني على المدى الطويل، استخدم نظام تثبيت التركيز التلقائي للتعويض عن التحول المحتمل على طول المحور z. - اختر ظروف التصوير الأمثل اعتمادا على الحساسية الضوئية للخلايا ومعدل تلاشي الفلوروشروم.
ملاحظة: بما أن الهياكل الدقيقة هي هياكل ديناميكية للغاية، يمكن اختيار فاصل زمني قصير إلى حد معقول، ويجب أن يكون معدل الإطار مرتفعا بما فيه الكفاية. للتحقيق في ديناميات microtubule في الخلايا الليفية الجلد، استخدمنا على تردد 1 إطار / ثانية لمدة 3-5 دقائق. - عند تحديد الكائن التالي للحصول على الصورة، ابتعد عن المنطقة المصورة بالفعل. وبما أن هذه المنطقة كانت تحت تأثير الضوء، سيكون هناك تبييض ملحوظ للصور.
ملاحظة: نظرا لاستخدام تردد تصوير عالي نسبيا، لم يغلق الغالق بين الصور، وأضاء المصباح طوال فترة التصوير، ولهذا السبب ازداد التلاشي. - اختر الفيديو الأمثل لدراسة ديناميات microtubules بصريا ، مع الأخذ في الاعتبار جودة العدوى ، ونوعية صور microtubules (نسبة الإشارة إلى الضوضاء المثلى) ، وعدم الانجراف في حالة الخلية المحللة(الشكل 3).
- استخدم مقاطع الفيديو المختارة لدراسة ديناميكيات microtubules الإضافية من خلال تتبعها في برنامج ImageJ أو فيجي(الشكل 4).
ملاحظة: للحصول على إرشادات التحليل الكمي انظر الشكل التكميلي 2 والملف التكميلي 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
توضح أفلام GFP-EB3 الناتجة التي تم إنتاجها باستخدام البروتوكول(الشكل 1)الخصائص الديناميكية للبيبات الدقيقة. وتشارك Microtubules في عمليات الخلايا المختلفة، وخصائصها الحيوية تؤثر على مختلف خصائص الحياة من ثقافة الخلية البشرية الأولية من المواد خزعة المرضى(الشكل 2).
تحدد المعلمات التالية عدم الاستقرار الديناميكي للميكروبات: معدلات النمو (البلمرة) والتقلص (إزالة البوليمر)؛ تواتر الكوارث (الانتقال من البلمرة إلى إزالة البلمرة)؛ تواتر عمليات الإنقاذ (الانتقال من إزالة البوليمر إلى البلمرة)؛ وكذلك توقف - الدول عندما microtubule لا البلمرة ولا depolymerize 12. جميع المعلمات منظمة بإحكام ، ومعدلات البلمرة وإزالة البلمرة من microtubules الفردية يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا في كل من أنواع الخلايا نفسهاومختلفة 13،14،15،16،17.
من الضروري النظر في التحليل أن microtubules يمكن أن يكون لها ديناميات مختلفة اعتمادا على وضعها في الخلية. Microtubules تقع في منطقة النواة والقنطور تتصرف بشكل مختلف بالمقارنة مع تلك الموجودة على محيط الخلية19. لذلك ، للحصول على نتيجة موثوق بها ، قمنا بعمل قياسات ديناميكية microtubules في ثلاث مناطق منفصلة من الخلية: الجزء المركزي ، الحافة الرائدة ، والجزء الذيل(الشكل 3). للتحكم في التوزيع الصحيح لعلامة GFP-EB3 في أجزاء مختلفة من الخلايا، استخدمنا الخلايا البطانية الشريانية الرئوية البشرية (HPAEC)(انظر الشكل التكميلي 1).
البرامج المتخصصة، مثل ImageJ أو فيجي (ImageJ 2 v1. 53i)، تسمح بتحليل مقاطع الفيديو من خلال المعلمات التالية: (1) معدل نمو الأجهزة المجهرية؛ (2) معدل نمو الأجهزة المجهرية؛ (2) معدل نمو الأجهزة المجهرية؛ (2) معدل نمو الأجهزة المجهرية؛ (2) معدل نمو الأجهزة المجهرية؛ (2) معدل نمو الأجهزة المجهرية؛ (2) معدل نمو الأجهزة المجهرية؛ (2) معدل نمو الأجهزة المجهرية؛ (2) معدل نمو الأجهزة المجهرية؛ (2) معدل نمو الأجهزة المجهرية؛ (2) معدل نمو الأجهزة المجهرية (2) تواتر الكوارث؛ (3) وتيرة عمليات الإنقاذ؛ (4) تواتر وقفات؛ و (5) مدة الإيقاف المؤقت. بالإضافة إلى ذلك ، تسمح خيارات البرنامج الفريدة والإضافات بالتتبع تلقائيا18 أويدويا 19 (الشكل 4). عملت طريقة التتبع اليدوي بشكل أفضل في تجاربنا لأن القياسات التلقائية عرضة للأخطاء الأكبر وتتطلب المزيد من التكرار للحصول على نتيجة أكثر دقة. ويمكن الاطلاع على تعليمات مفصلة عن microtubules ديناميات تحليل البيانات في الشكل التكميلي 2 والملف التكميلي 1.
قد تتطلب معلمات التصوير تعديلات أثناء عملية التصوير. على سبيل المثال، يمكن تغيير مدة تصوير خلية واحدة وقيم التعرض. هذه الإعدادات مفيدة إذا كان هناك نضوب إشارة سريعة، أو تقلص الخلية(الشكل 5).
الشكل 1:المخطط العام لبروتوكول العدوى عبر الخلايا الليفية GFP-EB3 لثقافة الخلايا الليفية الأولية للبشرة البشرية. يتضمن البروتوكول الخطوات التالية: مفرزة الخلايا بواسطة الحل تريبسين; تعطيل التريبسين عن طريق إضافة المتوسطة; الطرد المركزي للمجمع الناتج؛ حساب تركيز الخلية؛ البذر الخلية إلى طبق أسفل الزجاج (طبق confocal) المغلفة مع الجيلاتين; نقل زراعة الخلايا بواسطة الحمض النووي البلازميد (مع GFP-EB3) مع كاشف العدوى الليبوسومالية؛ حضانة 24-48 ساعة; والتحليل تحت المجهر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: الجلد البشري الليفي الخلايا الليفية الأولية مخطط إعداد الثقافة. يجب إجراء خزعة الجلد في ظل ظروف معقمة من قبل الطبيب بعد أن يوقع المريض على موافقة مستنيرة. ثم يتم نقل قطعة من الأنسجة في كمية صغيرة من المتوسط دون FBS إلى المختبر في طبق بيتري. يتم قطع جزء كبير من الأنسجة إلى قطع من 0.5-1 ملم في الحجم ، وهي مغطاة بكأس غطاء مع إضافة الوسيط مع FBS. ثم يتم وضع طبق بيتري في حاضنة ثاني أكسيد الكربون2 ، حيث بعد 4-7 أيام تهاجر الخلايا الليفية من جزء الأنسجة إلى القاع الزجاجي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: GFP-EB3 علامة (الأخضر) في مناطق مختلفة من الخلايا الليفية البشرية المصابة، التي تم الحصول عليها من خزعة الجلد المرضى HD: حافة الرائدة (لوحة أعلى)؛ الذيل (لوحة الأوسط)؛ الجزء المركزي من الخلايا الليفية (المنطقة المحيطة سنتروسوم) (لوحة أسفل). شريط المقياس = 10 ميكرومتر. تردد التصوير هو إطار واحد / ثانية. المجهر الفلوري واسع المجال. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: GFP - EB3 دليل تتبع بواسطة البرنامج المساعد ImageJ MTrackJ. تم الحصول على المسارات التي تعكس نمو microtubules نتيجة لوضع علامات يدوية من إطار إلى إطار لنصائح تسميات GFP-EB3 عند الأطراف الإضافية خلال 20 ثانية من التصوير. الخلايا الليفية المستزرعة عبر المصابة، التي تم الحصول عليها من خزعة الجلد للمرضى عالية الدقة. تردد التصوير هو إطار واحد / ثانية. المجهر الفلوري واسع المجال. شريط المقياس = 10 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: استكشاف الأخطاء وإصلاحها أثناء تصوير GFP-EB3 المسمى microtubules 'زائد ينتهي. (أ) microtubules الفلورسنت المسمى هي من التركيز بسبب عدم وجود نظام التركيز. (ب) استقرت Microtubules وتفقد خصائصها الحيوية بسبب الإفراط في التعبير عن GFP-EB3 في الخلية بسبب الحضانة الطويلة مع خليط العدوى. (ج) تقلص اللاميلا الخلية نتيجة السمية الضوئية بسبب الافراج عن ROS. (D) قطرات كثافة الإشارة أثناء التصوير - photobleaching السريع. الخلايا الليفية المستزرعة عبر المصابة، التي تم الحصول عليها من خزعة الجلد للمرضى عالية الدقة. تردد التصوير هو إطار واحد في الثانية. المجهر الفلوري واسع المجال. أشرطة المقياس = 10 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 1: التصور الانتقائي لنمو microtubule زائد ينتهي. GFP-EB3 علامة (الأخضر) في مناطق مختلفة من الخلايا البطانية البشرية المصابة (ثقافة HPAEC: الخلايا البطانية الشريان الرئوي البشري) في الحافة الرائدة، الذيل والمنطقة الوسطى (المنطقة المحيطة سنتروسوم). أشرطة المقياس 10 ميكرومتر. تردد التصوير هو إطار واحد / ثانية المجهر الفلوري واسع المجال. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الشكل التكميلي 2: تحليل ديناميات Microtubule بواسطة تسمية GFP-EB3 بعد التتبع اليدوي باستخدام مكون ImageJ المساعد MTrackJ. (أ, ب) المسارات EB3 التي تم الحصول عليها من قبل EB3-GFP بقع النزوح على سلسلة الفاصل الزمني من الخلايا الليفية المستزرعة المصابة، التي تم الحصول عليها من خزعة الجلد المرضى HD (ملونة بشكل فردي). (أ) مسار EB3 (أرجواني، No46) تم الحصول عليه بواسطة إزاحة بقع EB3-GFP خلال 18 ثانية. (ب) مسار EB3 (أحمر، No37) تم الحصول عليه بواسطة إزاحة بقع EB3-GFP خلال 9 ثوان. (ج)تحديد كمي للإزاحة زائد ينتهي من microtubules من الإنسان HD المرضى 'الجلد الليفية هو مبين في (A). (د)تحديد كمي للإزاحة زائد ينتهي من microtubules هو مبين في (ب). الرسم البياني يبين أن ما بين 6-8 ثانية هناك وقفة في نمو microtubule (لا توجد حركة من زائد نهاية). الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
الملف التكميلي 1: التحليل الكمي لديناميكيات EB3-GFP المسمى النهايات الإضافية للبيبوليت. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الملف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يمكن الحصول على نتائج أفضل جودة لتحليل ديناميكيات microtubules من صور مجهرية عالية الجودة. من المهم مراقبة جميع الشروط اللازمة لتصوير الخلايا الحية بفارق زمني وضبط معلمات التصوير بشكل صحيح. استخدام أطباق خاصة ثقافة الخلية مع أسفل الزجاج (أطباق confocal) مهم، لأن الزجاج لديه مؤشر الانكسار مختلفة من الضوء من البلاستيك. سمك الزجاج وتوحيده على كامل مساحتها مهم للغاية أيضا ، لأن هذه المعلمات حاسمة لتركيز العينة العادية. انتهاك هذه المعلمات يؤدي حتما إلى فشل نظام التركيز المثالي مما أدى إلى تركيز سيئة مما يجعل من المستحيل استخدام مثل هذا الفيديو خارج التركيز للتحليل (الشكل 5A). شرط آخر مهم للتصوير بالخلايا الحية هو حمايتهم من ROS. يمكن استخدام الكواشف المختلفة لمثل هذهالأغراض 20. في عملنا، نستخدم النفط المعدني، الذي يعزل تماما وسط الثقافة عن الغلاف الجوي ويمنع تبادل الغاز. وبنفس الطريقة، يمكن استخدام الأوكسيراز الذي يقلل من ROS، ولكن هذا الإنزيم غير مناسب لجميع أنواع الخلايا وغالبا ما ينطبق على التصوير مع زيادة الوقت.
عند اختيار وقت الحضانة الأمثل للخلايا بعد العدوى (24 أو 48 ساعة) ، يجب الانتباه إلى عدد الخلايا المصابة. وهناك عدد أصغر من العدد الأقصى من الخلايا التي تعبر عن البروتين المسمى يكفي بالفعل للتحليل. لا ينبغي السماح بالإفراط في التعبير لأن ال microtubules ، في مثل هذه الحالات ، يتم تثبيتها ولا يمكن تحليل خصائصها الديناميكية(الشكل 5B).
في بعض الحالات، قد يكون من الضروري ضبط معلمات التصوير وفقا لرد فعل الخلايا بعد بدء تسجيل الفيديو. على سبيل المثال، فمن الممكن لمراقبة انكماش الخلايا اللاميلا بسبب حساسية عالية للضوء (السمية الضوئية) (الشكل 5C). عندما متحمس، جزيئات الفلورسنت عادة ما تتفاعل مع الأكسجين الجزيئي لتشكيل الجذور الحرة التي يمكن أن تلحق الضرر مكونات الخلية21. عند تصميم التجارب، ينبغي اختيار الفلوروفوريس مع أقصى طول موجي ممكن للإثارة لتقليل تلف الخلايا تحت إضاءة الموجات القصيرة. وبالإضافة إلى ذلك, هناك تقارير تفيد بأن بعض مكونات وسائل الإعلام ثقافة القياسية, بما في ذلك فيتامين ريبوفلافين والأحماض الأمينية التربتوفان, قد تسهم أيضا في الآثار السلبية للضوء على الخلايا المستزرعة22. من بين أمور أخرى ، قد يكون سبب ذلك هو كمية مفرطة من التسميات الفلورية في خلية واحدة. في هذه الحالات ، يصبح من الضروري تقليل مدة التسجيل وشدة الإضاءة. قد تكون مشكلة أخرى محتملة أيضا photobleaching السريع -- خفض كثافة الإشارة أثناء التسجيل(الشكل 5D). يجب أن يؤخذ هذا التأثير في الاعتبار عند اختيار الكائن التالي على نفس الطبق التجريبي ، حيث يتم حرق الخلايا المجاورة حول المنطقة المصورة أيضا.
وتجدر الإشارة إلى أن هناك أساليب أخرى لتصور microtubule في الخلايا الحية مثل microinjection من التوبولين المسمى الفلورسنت في الخلية أو نقل الخلية باستخدام الفيروسات. كما هو الحال مع أي طريقة أخرى ، هناك مزايا وعيوب لطريقة العدوى. ومع ذلك ، من وجهة نظرنا ، بالمقارنة مع طريقة الحقن ، فإن العدوى العابرة أكثر فعالية وتسمح بتحقيق إدراج جماعي لنواقل التعبير في الخلايا ، مما يؤدي إلى عدد كبير من الخلايا الفلورية للتحليل. أيضا ، لا تتطلب طريقة العدوى معدات ومهارات خاصة من الباحث. طريقة النقل الفيروسي تظهر نتائج جيدة ويمكن تطبيقها. ومع ذلك ، فإنه ليس مناسبا لجميع ثقافات الخلايا (على وجه الخصوص ، فهو أقل ملاءمة للخلايا الليفية البشرية ، التي تم الحصول عليها من خزعة الجلد للمرضى عالية الدقة).
الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هي العدوى التي أجريت لضمان التعبير البروتين كافية. نسبة جيدة من الإشارة إلى الضوضاء ، لا photobleaching من microtubules ، وعدم وجود خلية الانجراف خلال تسجيل الفيديو الفاصل الزمني حاسمة للغاية لتصوير microtubules فعالة. في تجربتنا، والتصور من microtubules والتحليل الديناميكي توفير معلومات حيوية عن خصائص microtubule والسلوك في الخلايا مع HTT متحولة. ينطبق بروتوكولنا على دراسات الأمراض الأخرى التي ينطوي علم الأمراض على خصائص ديناميكية للميكروبات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
تم تمويل هذا البحث من قبل وزارة العلوم والتعليم العالي في الاتحاد الروسي، منحة رقم 075-15-2019-1669 (نقل الخلايا الليفية)، من قبل مؤسسة العلوم الروسية، منحة رقم 19-15-00425 (جميع الأعمال الأخرى على زراعة الخلايا الليفية في المختبر). وقد دعم جزئيا من قبل برنامج تطوير جامعة موسكو الحكومية لومونوسوف PNR5.13 (التصوير والتحليل). يعترف المؤلفون بدعم مركز نيكون للتميز في معهد أ. ن. بيلوزيرسكي للبيولوجيا الفيزيائية والكيميائية. نريد أن نقدم شكرنا الخاص لإيكاترينا تاران لمساعدتها في التمثيل الصوتي. كما يشكر المؤلفون بافل بيلكوف على مساعدته في تحرير الفيديو. تم إنشاء الأرقام في المخطوطة مع BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrumentation | |||
| Camera iXon DU897 EMCCD | Andor Technology | ||
| Eppendorf Centrifuge 5804 R | Eppendorf Corporate | ||
| Fluorescence filter set HYQ FITC | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| LUNA-II Automated Cell Counte | Logos Biosystems | L40002 | |
| Microscope incubator for lifetime filming | Okolab | Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS | |
| Gas controller CO2-O2-UNIT-BL | |||
| Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13) | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Software | |||
| Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c) | Open source image processing software | ||
| NIS Elements | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Additional reagents | |||
| Mineral oil (Light white oil) | MP | 151694 | |
| Cell culture dish | |||
| Cell Culture Dish | SPL Lifesciences | 20035 | |
| Confocal Dish (glass thickness 170 µm) | SPL Lifesciences | 211350 | Alternative: MatTek |
| Conical Centrifuge tube | SPL Lifesciences | 50015 | |
| Cryogenic Vials | Corning-Costar | 430659 | |
| Microcentrifuge Tube | Nest | 615001 | |
| Cultivation | |||
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| Dimethyl sulfoxide | PanEko |  135 |
|
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | PanEko | C420 |
|
| DPBS (Dulbecco's phosphate-salt solution) | PanEko | P060 |
|
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | K053/SH30071.03 | |
| Gelatin (bovine skin) | PanEko | 070 |
|
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Opti-MEM (1x) + Glutamax | Gibco | 519850026 | |
| Penicillin-streptomycin | PanEko | A063 |
|
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| Transfection | |||
| Plasmid DNA with EB3-GFP | Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova [Erasmus University, Rotterdam] |
Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003 |
References
- Engelender, S., et al. Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin. Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).
- Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L.
- MacMillan, J. C., et al. Molecular analysis and clinical correlations of the Huntington's disease mutation. The Lancet. 342 (8877), 954-958 (1993).
- Proskura, A. L., Vechkapova, S. O., Zapara, T. A., Ratushniak, A. S.
- Steffan, J. S., et al. The Huntington's disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6763-6768 (2000).
- Nekrasov, E. D., et al. Manifestation of Huntington's disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Molecular Neurodegeneration. 11 (1), 1-15 (2016).
- Mitchison, T., Kirschner, M.
- Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).
- Desai, A., Mitchison, T. J.
- Allen, C., Borisy, G. G. Structural polarity and directional growth of microtubules of Chlamydomonas flagella. Journal of Molecular Biology. 90 (2), 381-402 (1974).
- Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
- Shelden, E., Wadsworth, P. Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific. Journal of Cell Biology. 120 (4), 935-945 (1993).
- O'Brien, E. T., Salmon, E. D., Walker, R. A., Erickson, H. P. Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules. Biochemistry. 29 (28), 6648-6656 (1990).
- Drechsel, D. N., Hyman, A. A., Cobb, M. H., Kirschner, M. W. Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1141-1154 (1992).
- Gildersleeve, R. F., Cross, A. R., Cullen, K. E., Fagen, A. P., Williams, R. C. Microtubules grow and shorten at intrinsically variable rates. Journal of Biological Chemistry. 267 (12), 7995-8006 (1992).
- Penazzi, L., Bakota, L., Brandt, R. Microtubule dynamics in neuronal development, plasticity, and neurodegeneration. International Review of Cell and Molecular Biology. 321, 89-169 (2016).
- van de Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).
- Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
- Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary. Journal of Cell Science. 115 (17), 3527-3539 (2002).
- Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., vanden Broek, B., Jalink, K. Optimizing imaging conditions for demanding multi-color super resolution localization microscopy. PLoS One. 11 (7), 0158884 (2016).
- Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal. 36 (2), 280-290 (2003).
- Grzelak, A., Rychlik, B., Bartosz, G. Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media. Free Radical Biology and Medicine. 30 (12), 1418-1425 (2001).
