Summary
Dieses Protokoll ist der Mikrotubuli-Plus-End-Visualisierung durch EB3-Proteintransfektion gewidmet, um ihre dynamischen Eigenschaften in der primären Zellkultur zu untersuchen. Das Protokoll wurde an menschlichen primären Hautfibroblasten implementiert, die von Huntington-Patienten gewonnen wurden.
Abstract
Die Transfektion mit einem fluoreszenzmarkierten Markerprotein von Interesse in Kombination mit der Zeitraffer-Videomikroskopie ist eine klassische Methode zur Untersuchung der dynamischen Eigenschaften des Zytoskeletts. Dieses Protokoll bietet eine Technik für die primäre Fibroblastentransfektion des Menschen, die aufgrund der Besonderheiten der primären Zellkultivierungsbedingungen schwierig sein kann. Darüber hinaus erfordert die Aufrechterhaltung der dynamischen Eigenschaften des Zytoskeletts ein geringes Maß an Transfektion, um ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis zu erhalten, ohne eine Mikrotubuli-Stabilisierung zu verursachen. Es ist wichtig, Maßnahmen zu ergreifen, um die Zellen vor lichtinduziertem Stress und dem Ausbleichen von Fluoreszenzfarbstoffen zu schützen. Im Laufe unserer Arbeit testeten wir verschiedene Transfektionsmethoden und -protokolle sowie verschiedene Vektoren, um die beste Kombination von Bedingungen auszuwählen, die für humane primäre Fibroblastenstudien geeignet sind. Wir analysierten die resultierenden Zeitraffervideos und berechneten die Mikrotubuli-Dynamik mit ImageJ. Die Dynamik der Pluspunkte der Mikrotubuli in den verschiedenen Zellteilen ist nicht ähnlich, daher haben wir die Analyse in Untergruppen unterteilt - die Zentrosomenregion, die Lamelle und den Schwanz der Fibroblasten. Insbesondere kann dieses Protokoll für die In-vitro-Analyse der Zytoskelettdynamik in Patientenproben verwendet werden, was den nächsten Schritt zum Verständnis der Dynamik der verschiedenen Krankheitsentwicklungen ermöglicht.
Introduction
Die Huntington-Krankheit (HD) ist eine unheilbare neurodegenerative Pathologie, die durch eine Mutation im Gen verursacht wird, das für dasHuntingtin-Protein (HTT) kodiert. HTT ist in erster Linie mit Vesikeln und Mikrotubuli assoziiert und wahrscheinlich an mikrotubuliabhängigen Transportprozessen beteiligt1,2. Um den Einfluss von mutiertem HTT auf die Dynamik der Mikrotubuli zu untersuchen, verwendeten wir in vitro die Visualisierung des EB3-Proteins, das die dynamischen Eigenschaften von Mikrotubuli durch Bindung und Stabilisierung der wachsenden Plus-Enden reguliert. Um fluoreszierend markiertes EB3 in menschliche Hautfibroblasten zu laden, wurde eine Plasmidtransfektion angewendet. Wir verwendeten die primäre Fibroblastenkultur, die aus der Hautbiopsie der Huntington-Patienten für diese Studie gewonnen wurde.
Die Mutation im HTT-Protein-Gen führt zu einer Verlängerung des Polyglutamintraktes3. HTT spielt eine Rolle bei zellulären Prozessen wie Endozytose4,Zelltransport1,2,Proteinabbau5usw. Ein wesentlicher Teil dieser Prozesse betrifft verschiedene Elemente des Zellzytoskeletts, einschließlich der Mikrotubuli.
Menschliche Primärzellen sind das beste Modell, um Ereignisse, die in Patientenzellen auftreten, so genau wie möglich zu reproduzieren. Um solche Modelle zu erstellen, muss man Zellen aus menschlichem Biopsiematerial (z.B. aus chirurgischen Proben) isolieren. Die resultierende primäre Zelllinie eignet sich zur Untersuchung der Pathogenese mit verschiedenen genetischen, biochemischen, molekularen und zellbiologischen Methoden. Auch menschliche Primärzellkulturen dienen als Vorläufer für die Schaffung verschiedener transdifferenzierter und transgener Kulturen6.
Im Gegensatz zu immortalisierten Zellkulturen ist der wesentliche Nachteil von Primärzellen jedoch ihre begrenzte Passagefähigkeit. Daher empfehlen wir die Verwendung von Zellen im frühen Passagenstadium (bis zu 15). Ältere Kulturen degenerieren sehr schnell und verlieren ihre einzigartigen Eigenschaften. Daher sollten die neu gewonnenen Primärzellen für die Langzeitlagerung eingefroren gehalten werden.
Primäre Zellkulturen sind anfällig für Kultivierungsbedingungen. Daher erfordern sie oft einzigartige Ansätze und die Optimierung der Wachstumsbedingungen. Insbesondere die primären Fibroblasten der menschlichen Haut, die in unseren Experimenten verwendet werden, stellen hohe Anforderungen an das Substrat. Daher haben wir je nach Versuchstyp verschiedene zusätzliche Beschichtungen (z.B. Gelatine oder Fibronektin) verwendet.
Das Zellzytoskelett bestimmt die Zellform, Beweglichkeit und Fortbewegung. Die Dynamik des Zytoskeletts ist entscheidend für viele intrazelluläre Prozesse sowohl in der Interphase als auch in der Mitose. Insbesondere das aus Tubulin polymerisierte Zytoskelett sind hochdynamische und polare Strukturen, die einen motorproteinvermittelten gerichteten intrazellulären Transport ermöglichen. Die Enden der Mikrotubuli befinden sich in ständiger Neuanordnung, ihre Montagephasen wechseln sich mit den Demontagephasen ab, und dieses Verhalten wird als "dynamische Instabilität"bezeichnet 7,8,9. Verschiedene assoziierte Proteine verschieben das Gleichgewicht der Polymerisationsreaktion, was entweder zur Polymerbildung oder zur Proteinmonomerbildung führt. Die Zugabe von Tubulin-Untereinheiten erfolgt hauptsächlich am Plus-Ende der Mikrotubuli10. Die Familie der endbindenden (EB) Proteine besteht aus drei Mitgliedern: EB1, EB2 und EB3. Sie dienen als Plus-End-Tracking-Proteine (+TIPs) und regulieren die dynamischen Eigenschaften von Mikrotubuli, indem sie ihre wachsenden Plus-Enden binden und stabilisieren11.
Viele Studien verwenden fluoreszierende Molekül-markierte Tubulin-Mikroinjektion oder Transfektion mit Zeitraffer-Bildgebung und Videoanalyse, um Mikrotubuli in vitrozu visualisieren. Diese Methoden können invasiv und schädlich für Zellen sein, insbesondere für primäre menschliche Zellen. Der schwierigste Schritt besteht darin, Bedingungen für die Zelltransfektion zu finden. Wir haben versucht, das höchstmögliche Maß an Transfektion zu erreichen, ohne die Lebensfähigkeit und die native Zellmorphologie zu beeinträchtigen. Diese Studie wendet die klassische Methode an, um die Unterschiede in der Mikrotubulidynamik in Hautfibroblasten von gesunden Spendern und Patienten mit der Huntington-Krankheit zu untersuchen.
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Protocol
Dieses Protokoll folgt den Richtlinien des Bundesforschungs- und Klinischen Zentrums für Physikalisch-Chemische Medizin des Medizinischen Bundesamtes vom 08. September 2015.
HINWEIS: Abbildung 1 gibt einen Überblick über das Protokoll.
1. Gewinnung einer Primärkultur menschlicher Hautfibroblasten (Abbildung 2)
- Bringen Sie die Biopsie innerhalb weniger Stunden in Dulbeccos Modified Eagle Media (DMEM) Medium in ein Labor, ergänzt mit 50 μg/ml Penicillin und 50 U/ml Streptomycin.
HINWEIS: Eine Hautbiopsie muss unter sterilen Bedingungen von einem Arzt durchgeführt werden, nachdem ein Patient eine Einverständniserklärung unterzeichnet hat. - Legen Sie das Biopsiegewebe zusammen mit einer kleinen Menge des Mediums in eine 6 cm große Petrischale.
- Schneiden Sie die Biopsieprobe mit einem sterilen Skalpell in Stücke von etwa 0,5-1 mm Größe. Legen Sie 1-2 erhaltene Fragmente in eine 3,5 cm Petrischale und legen Sie einen sterilen Deckglas über die Biopsiestücke. Fügen Sie langsam 1,5 ml eines Wachstumsmediums zu der folgenden Zusammensetzung hinzu: DMEM, 50 U / ml Penicillin-Streptomycin und 10% fetales Rinderserum (FBS).
- Kulturfibroblasten im Wachstumsmedium ineinem CO 2-Inkubator, der bei 5%CO2,37 °C, 80% Luftfeuchtigkeit gehalten wird.
HINWEIS: Nach 4-7 Tagen beginnen zuerst Keratinozyten, dann Fibroblasten, vom Gewebe zum Boden der Schale zu wandern.
2. Lagerung, Einfrieren und Auftauen der Primärkultur
- Zellen aus der Kulturschale entnehmen (siehe Nummern 3.2-3.4).
- Die Zellsuspension wird für 5 min bei 200 x g in ein konisches 15-ml-Rohr und eine Zentrifuge gegeben. Dann verwerfen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet in 900 μL gekühltem FBS.
- Tropfenweise in ein Kryokonservierungsrohr geben und 100 μL Dimethylsulfoxid (DMSO) zugeben.
- Legen Sie die Kryosonde in einen Niedertemperatur-Gefrierschrank bei -80 °C. Vierundzwanzig Stunden später wird das Kryovial zur Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff (−196 °C) überführt.
- Um die kryokonservierten Zellen aufzutauen, entfernen Sie das Kryovial aus dem Stickstoffspeicher und geben innerhalb von 1 min 1 ml des Inhalts in ein 15 mL konisches Röhrchen mit 9 mL des auf 37 °C vorgewärmten Transportmediums.
- Vorsichtig resuspendieren und dann das Röhrchen für 5 min bei 200 x gzentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand, resuspenieren Sie das Zellpellet im erforderlichen Volumen des Wachstumsmediums und legen Sie es auf eine Petrischale mit dem erforderlichen Durchmesser.
3. Zellkultivierung
- Den Schalenboden mit autoklavierter 0,1%iger Gelatinelösung bedecken, die in destilliertem Wasser zubereitet wird. 15 Min. inkubieren.
HINWEIS: Zur Transfektionsvisualisierung sollte Glasbodenplattengeschirr (konfokales Geschirr mit Glasdicke 170 μm) verwendet werden. - Bereiten Sie ein Kulturmedium mit folgender Zusammensetzung vor: DMEM ergänzt mit 10% FBS, 2 mM L-Alanyl-L-Glutamin, 50 U/ml Penicillin-Streptomycin. Gründlich mischen und bei 4 °C lagern. Erwärmen Sie das Medium auf 37 °C, bevor Sie es den Zellen hinzufügen.
- Beurteilen Sie die Kultur unter dem Mikroskop. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Fibroblasten mit Dulbeccos Phosphat-Salz-Lösung (DPBS).
- Geben Sie 1 ml vorgewärmte 0,25% ige Trypsinlösung zu den Zellen hinzu. Überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, ob sie sich vollständig vom Substrat lösen. Trypsin mit 1 ml des Kulturmediums deaktivieren.
- Übertragen Sie die Zellsuspension in ein konisches 15-ml-Rohr. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 200 x g für 5 min, entfernen Sie den Überstand und resuspenieren Sie das Zellpellet in 1 mL des Kulturmediums.
- Zählen Sie die Anzahl der Zellen. Berechnen Sie die erforderliche Anzahl von Zellen, um sie mit einer Dichte von 8-15 x 103/cm2 zu säen und in 2 ml des Kulturmediums zu resuspendieren.
- Entfernen Sie die Gelatinelösung aus der Kulturschale und fügen Sie sofort 2 ml der Zellsuspension hinzu. Fibroblasten bei 37 °C in einem CO2 -Inkubator kultivieren.
- Aktualisieren Sie das Medium alle 2-4 Tage.
HINWEIS: Verwenden Sie für Experimente die Zellen von 4-11 Passagen.
4. Transfektion
- Ersetzen Sie das Kulturmedium 24 h vor der Transfektion durch ein Frischekulturmedium.
HINWEIS: Der Zellzusammenfluss sollte 70-80% betragen. - Bereiten Sie einen DNA-Lipid-Komplex basierend auf der Fläche und Dichte der Zellaussaat vor. Verwenden Sie Liposomen-basiertes Transfektionsmittel.
HINWEIS: Verwenden Sie die Zellsaatdichte als 1 x 104 Zellen/cm2. - Fügen Sie 3 μL handelsübliches Transfektionsreagenz zu 125 μL optimalem minimal essentiellem Medium (Opti-MEM) hinzu, das keine Antibiotika enthält, ohne die Wände des Röhrchens zu berühren. Vorsichtig resuspendieren.
- Verdünnung der Plasmid-DNA (GFP-EB3) durch Zugabe von 1 μg der Plasmid-DNA zu 125 μL Opti-MEM. Vorsichtig resuspendieren.
HINWEIS: Ausdrucksvektorkodierung GFP-EB311 wurde als freundliches Geschenk von Dr. I. Kaverina (Vanderbilt University, Nashville) mit Genehmigung von Dr. A. Akhmanova (Erasmus Universität, Rotterdam)11erhalten. - Zu jedem Röhrchen verdünnter Transfektionsreagenz (1:1) verdünnte Plasmid-DNA geben. 30 Min. inkubieren.
- Den DNA-Lipid-Komplex in die 6 cm große Petrischale geben, die Zellen enthält, und 30 s lang mit einer kreuzförmigen Schaukel vermischen. Inkubieren Sie Zellen mit einem Transfektionsmittel für 24 h und wechseln Sie dann zu frischem Medium. Analysieren Sie die Effizienz der Transfektion nach 24 h und 48 h.
HINWEIS: 24 h nach der Transfektion betrug der Wirkungsgrad 10-15% und nach 48 h bis zu 40%.
5. Vorbereiten der Bildgebung
- Wechseln Sie vor der Live-Bildgebung von Zellen das Kulturmedium in ein Medium ohne pH-Indikatorfarbstoff, um die Autofluoreszenz zu reduzieren.
- Tragen Sie Mineralöl vorsichtig auf die Mediumsoberfläche auf, um das Medium vollständig zu bedecken, und isolieren Sie es von der äußeren Umgebung, um das Eindringen von O2 und die Verdampfung des Mediums zu reduzieren.
- Verwenden Sie eine Quecksilberlampe und ein 60-faches oder 100-faches Objektiv mit hoher Ziffernöffnung, um die Bilder aufzunehmen.
HINWEIS: Für In-vivo-Beobachtungen muss das Mikroskop mit einem Inkubator ausgestattet sein, um die notwendigen Bedingungen für die Zellen aufrechtzuerhalten, einschließlich der Erwärmung des Objekttisches und der Linse auf +37 °C, einer geschlossenen Kammer mit CO2 -Versorgung und feuchtigkeitsabhängiger Unterstützung. Verwenden Sie doppelt destilliertes Wasser, um Feuchtigkeit zu erzeugen. Überprüfen Sie den Gehalt an doppelt destilliertem Wasser vor dem Filmen. - Legen Sie die konfokale Schale mit den Zellen vor der Bildgebung in den Mikroskophalter. Stellen Sie sicher, dass die Schüssel und die Kamera sicher an der Halterung befestigt sind, um ein Driften während der Aufnahme von Bildern zu vermeiden.
6. Einstellen der Bildgebungsparameter
- Wählen Sie die niedrigen Expositionswerte, da Licht zellschädigende reaktive Sauerstoffspezies (ROS) induziert.
HINWEIS: Um die Dynamik von Mikrotubuli in menschlichen Hautfibroblasten zu untersuchen, wurde eine Exposition von 300 ms gewählt. - Konzentrieren Sie sich auf das Objekt von Interesse.
HINWEIS: Verwenden Sie für Langzeit-Zeitrafferaufnahmen das automatische Fokusstabilisierungssystem, um eine mögliche Verschiebung entlang der z-Achse auszugleichen. - Wählen Sie die optimalen Bildgebungsbedingungen in Abhängigkeit von der Lichtempfindlichkeit der Zellen und der Rate des Fluorochrom-Fadings.
HINWEIS: Da Mikrotubuli hochdynamische Strukturen sind, kann ein relativ kurzes Zeitintervall gewählt werden, und die Bildrate muss ausreichend hoch sein. Um die Mikrotubuli-Dynamik in Hautfibroblasten zu untersuchen, verwendeten wir eine Frequenz von 1 Frame/s für 3-5 min. - Wenn Sie das nächste Objekt auswählen, um das Bild abzurufen, entfernen Sie sich von dem bereits abgebildeten Bereich. Da dieser Bereich unter Lichteinfluss stand, kommt es zu einer spürbaren Fotobleiche.
HINWEIS: Da eine relativ hohe Abbildungsfrequenz verwendet wurde, schloss sich der Verschluss zwischen den Bildern nicht und die Lampe wurde während der gesamten Bildgebungsdauer beleuchtet, weshalb das Verblassen zunahm. - Wählen Sie das optimale Video für die visuelle Untersuchung der Dynamik der Mikrotubuli unter Berücksichtigung der Qualität der Transfektion, der Qualität der Bilder der Mikrotubuli (optimales Signal-Rausch-Verhältnis) und der Abwesenheit von Drift im Falle der analysierten Zelle (Abbildung 3).
- Verwenden Sie die ausgewählten Videos, um die Plus-Ends-Dynamik der Mikrotubuli zu untersuchen, indem Sie sie im Programm ImageJ oder Fiji nachzeichnen (Abbildung 4).
ANMERKUNG: Für Anweisungen zur quantitativen Analyse siehe Ergänzende Abbildung 2 und Ergänzende Akte 1.
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Representative Results
Die resultierenden GFP-EB3-Filme, die mit dem Protokoll hergestellt wurden (Abbildung 1), veranschaulichen die dynamischen Eigenschaften der Mikrotubuli. Mikrotubuli sind an verschiedenen Zellprozessen beteiligt, und ihre dynamischen Eigenschaften beeinflussen verschiedene Lebenseigenschaften der primären menschlichen Zellkultur aus dem Biopsiematerial des Patienten (Abbildung 2).
Die folgenden Parameter bestimmen die dynamische Instabilität von Mikrotubuli: die Wachstumsraten (Polymerisation) und Schrumpfungsraten (Depolymerisation); die Häufigkeit von Katastrophen (Übergang von der Polymerisation zur Depolymerisation); die Häufigkeit der Rettungen (Übergang von der Depolymerisation zur Polymerisation); sowie Pausen - gibt an, wenn der Mikrotubuli nicht polymerisiert und nicht depolymerisiert 12. Alle Parameter sind streng reguliert, und die Polymerisations- und Depolymerisationsraten einzelner Mikrotubuli können sowohl in den gleichen als auch in verschiedenen Zelltypen13,14 ,15,16,17signifikant variieren.
Für die Analyse ist zu berücksichtigen, dass Mikrotubuli je nach ihrer Position in der Zelle unterschiedliche Dynamiken aufweisen können. Mikrotubuli, die sich im Bereich des Kerns und des Zentrosoms befinden, verhalten sich anders als die an der Zellperipherie19. Um ein zuverlässiges Ergebnis zu erhalten, haben wir daher die dynamischen Messungen der Mikrotubuli in drei verschiedenen Bereichen der Zelle durchgeführt: dem zentralen Teil, der Vorderkante und dem Schwanzteil (Abbildung 3). Um die korrekte Verteilung des GFP-EB3-Markers in verschiedenen Zellteilen zu kontrollieren, verwendeten wir humane Lungenarterien-Endothelzellen (HPAEC) (siehe ergänzende Abbildung 1).
Spezialisierte Programme wie ImageJ oder Fiji (ImageJ 2 v1. 53i) ermöglichen die Analyse der Videos anhand der folgenden Parameter: (1) die Wachstumsrate der Mikrotubuli; (2) die Häufigkeit von Katastrophen; (3) die Häufigkeit der Rettungen; (4) die Häufigkeit der Pausen; und (5) Dauer der Pausen. Darüber hinaus ermöglichen einzigartige Programmoptionen und Plugins die automatische Ablaufverfolgung18 oder manuell19 (Abbildung 4). Die manuelle Tracing-Methode funktionierte in unseren Experimenten besser, da automatische Messungen anfällig für größere Fehler sind und mehr Wiederholungen für ein genaueres Ergebnis erfordern. Detaillierte Anweisungen zur Analyse der Mikrotubulidynamik finden Sie in ergänzender Abbildung 2 und ergänzender Datei 1.
Die Bildgebungsparameter erfordern möglicherweise Anpassungen während des Bildgebungsvorgangs. Beispielsweise können die Dauer der Einzelzellbildgebung und die Belichtungswerte geändert werden. Solche Einstellungen sind hilfreich, wenn es zu einem schnellen Signal-Burnout kommt oder die Zelle schrumpft (Abbildung 5).
Abbildung 1: Das allgemeine Schema des GFP-EB3-Transfektionsprotokolls für die Kultur der primären Fibroblasten der menschlichen Haut. Das Protokoll umfasst die folgenden Schritte: Ablösung von Zellen durch die Trypsinlösung; Trypsin-Inaktivierung durch die mittlere Zugabe; Zentrifugation der resultierenden Verbindung; Berechnung der Zellkonzentration; Zellsaat zur Glasbodenschale (konfokale Schale), die mit Gelatine beschichtet ist; Zellkulturtransfektion durch Plasmid-DNA (mit GFP-EB3) mit dem liposomalen Transfektionsreagenz; Inkubation 24-48 h; und Analyse unter dem Mikroskop. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Primäres Kulturvorbereitungsschema für fibroblasten der menschlichen Haut. Eine Hautbiopsie muss unter sterilen Bedingungen von einem Arzt durchgeführt werden, nachdem ein Patient eine Einverständniserklärung unterzeichnet hat. Dann wird ein Stück Gewebe in einer kleinen Menge des Mediums ohne FBS in einer Petrischale ins Labor transportiert. Ein großes Gewebefragment wird in Stücke von 0,5-1 mm Größe geschnitten, und sie werden mit einem Deckglas bedeckt, wobei das Medium mit FBS hinzugefügt wird. Dann wird die Petrischale in einen CO2-Inkubator gegeben, wo nach 4-7 Tagen Fibroblasten vom Gewebefragment zum Glasboden wandern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: GFP-EB3-Marker (grün) in verschiedenen Bereichen transfizierter menschlicher Fibroblasten, gewonnen aus der Hautbiopsie von Huntington-Patienten: Vorderkante (oberes Panel); Schwanz (mittlere Platte); zentraler Teil des Fibroblasten (Zone um das Zentrosom) (untere Platte). Maßstabsleiste = 10 μm. Die Abbildungsfrequenz beträgt 1 Bild/s. Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4:GFP-EB3 manuelles Tracking durch ImageJ Plugin MTrackJ. Spuren, die das Wachstum von Mikrotubuli widerspiegeln, wurden als Ergebnis der manuellen Markierung der GFP-EB3-Etikettenspitzen an den Plus-Enden während 20 s Bildgebung erhalten. Transfizierte kultivierte Fibroblasten, die aus der Hautbiopsie von Huntington-Patienten gewonnen wurden. Die Abbildungsfrequenz beträgt 1 Bild/s. Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie. Maßstabsbalken = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5:Fehlerbehebung während der Bildgebung der Plus-Enden von GFP-EB3-markierten Mikrotubuli. (A) Fluoreszenzmarkierte Mikrotubuli sind aufgrund des Fehlens eines Fokussiersystems unscharf. (B) Mikrotubuli werden stabilisiert und verlieren ihre dynamischen Eigenschaften aufgrund der Überexpression von GFP-EB3 in der Zelle aufgrund der langen Inkubation mit dem transfektiösen Gemisch. (C) Schrumpfung der Zelllamelle infolge von Phototoxizität aufgrund der Freisetzung von ROS. (D) Die Signalintensität nimmt während der Bildgebung ab - schnelles Photobleichen. Transfizierte kultivierte Fibroblasten, die aus der Hautbiopsie von Huntington-Patienten gewonnen wurden. Die Abbildungsfrequenz beträgt 1 Bild pro Sekunde. Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie. Maßstabsbalken = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Ergänzende Abbildung 1: Selektive Visualisierung wachsender Mikrotubuli-Plus-Ends. GFP-EB3-Marker (grün) in verschiedenen Bereichen transfizierter menschlicher Endothelzellen (Kultur von HPAEC: Human Pulmonary Artery Endothelial Cells) in Vorderkante, Schwanz und zentralem Bereich (Zone um das Zentrosom). Maßstabsleisten 10 μm. Die Abbildungsfrequenz beträgt 1 Bild/s Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Abbildung 2: Mikrotubuli-Dynamikanalyse nach GFP-EB3-Label nach manueller Verfolgung mit dem ImageJ-Plugin MTrackJ. (A,B) EB3-Spuren, die durch EB3-GFP-Pflaster erhalten wurden, verdrängen auf einer Zeitrafferserie transfizierter kultivierter Fibroblasten, die aus der Hautbiopsie von Huntington-Patienten gewonnen wurden (sind einzeln gefärbt). (A) EB3-Spur (lila, No46), erhalten durch EB3-GFP-Patches Verschiebung während 18 Sekunden. (B) EB3-Spur (rot, No37) erhalten durch EB3-GFP Patches Verschiebung während 9 Sekunden. (C) Quantifizierung der Plus-Ends-Verschiebung von Mikrotubuli des Hautfibroblasten von Huntington-Patienten, die in (A) gezeigt werden. ( D) Quantifizierung der Verdrängung von Plus-Enden-Verdrängung von Mikrotubuli gemäß (B). Die Grafik zeigt, dass zwischen 6-8 Sekunden eine Pause im Wachstum des Mikrotubuli auftritt (es gibt keine Bewegung des Plus-Endes). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Datei 1: Quantitative Analyse der Dynamik der Plus-Enden von EB3-GFP-markierten Mikrotubuli. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Qualitativ bessere Ergebnisse für die Dynamikanalyse von Mikrotubuli können aus hochwertigen mikroskopischen Bildern gewonnen werden. Es ist wichtig, alle notwendigen Bedingungen für die Zeitraffer-Bildgebung lebender Zellen zu beachten und die Bildgebungsparameter korrekt einzustellen. Die Verwendung spezieller Zellkulturschalen mit Glasboden (konfokale Schalen) ist wichtig, da Glas einen anderen Lichtbrechungsindex aufweist als Kunststoff. Die Dicke des Glases und seine Gleichmäßigkeit über seine gesamte Fläche ist ebenfalls äußerst wichtig, da diese Parameter für die normale Probenfokussierung entscheidend sind. Die Verletzung dieser Parameter führt unweigerlich zu einem Versagen des perfekten Fokussystems, was zu einer schlechten Fokussierung führt, wodurch es unmöglich wird, ein solches unscharfes Video für die Analyse zu verwenden (Abbildung 5A). Eine weitere wichtige Voraussetzung für die Bildgebung von lebenden Zellen ist ihr Schutz vor ROS. Für solche Zwecke können verschiedene Reagenzien verwendet werden20. Bei unserer Arbeit verwenden wir Mineralöl, das das Kulturmedium vollständig von der Atmosphäre isoliert und den Gasaustausch verhindert. Auf die gleiche Weise kann die ROS-reduzierende Oxyrase verwendet werden, aber dieses Enzym ist nicht für alle Zelltypen geeignet und ist häufiger mit zunehmender Zeit auf die Bildgebung anwendbar.
Bei der Auswahl der optimalen Inkubationszeit der Zellen nach der Transfektion (24 oder 48 h) sollte auf die Anzahl der transfizierten Zellen geachtet werden. Eine Anzahl kleiner als die maximale Anzahl von Zellen, die das markierte Protein exprimieren, ist bereits für die Analyse ausreichend. Eine Überexpression sollte nicht erlaubt sein, da Mikrotubuli in solchen Fällen stabilisiert sind und ihre dynamischen Eigenschaften nicht analysiert werden können (Abbildung 5B).
In einigen Fällen kann es notwendig sein, die Bildgebungsparameter entsprechend der Reaktion der Zellen nach Beginn der Videoaufzeichnung anzupassen. So ist es beispielsweise möglich, die Schrumpfung der Zelllamellen aufgrund einer hohen Lichtempfindlichkeit (Phototoxizität) zu beobachten (Abbildung 5C). Wenn sie angeregt werden, reagieren die fluoreszierenden Moleküle typischerweise mit molekularem Sauerstoff zu freien Radikalen, die Zellbestandteile schädigen können21. Bei der Versuchsplanung sollten Fluorophore mit der maximal möglichen Anregungswellenlänge ausgewählt werden, um Zellschäden unter kurzwelliger Beleuchtung zu minimieren. Darüber hinaus gibt es Berichte, dass bestimmte Bestandteile von Standardkulturmedien, einschließlich des Riboflavin-Vitamins und der Tryptophan-Aminosäure, ebenfalls zu den nachteiligen Auswirkungen von Licht auf kultivierte Zellen beitragen können22. Dies kann unter anderem durch eine übermäßige Menge an fluoreszierenden Markierungen in einer Zelle verursacht werden. In diesen Fällen wird es notwendig, die Dauer der Aufnahme und die Intensität der Beleuchtung zu reduzieren. Ein weiteres mögliches Problem kann auch das schnelle Photobleichen sein - Abnehmen der Signalintensität während der Aufnahme (Abbildung 5D). Dieser Effekt sollte bei der Auswahl des nächsten Objekts auf der gleichen Versuchsschale berücksichtigt werden, da die benachbarten Zellen um den abgebildeten Bereich herum ebenfalls ausgebrannt sind.
Es sollte erwähnt werden, dass es andere Methoden zur Mikrotubuli-Visualisierung in lebenden Zellen gibt, wie die Mikroinjektion von fluoreszierendem Tubulin in die Zelle oder die Zelltransduktion unter Verwendung von Viren. Wie bei jeder anderen Methode gibt es auch bei der Transfektionsmethode Vor- und Nachteile. Aus unserer Sicht ist die Transfektion im Vergleich zur Injektionsmethode jedoch effektiver und ermöglicht es, eine Masseneinbindung von Expressionsvektoren in die Zellen zu erreichen, was zu einer großen Anzahl von fluoreszierenden Zellen für die Analyse führt. Außerdem erfordert die Transfektionsmethode keine spezielle Ausrüstung und Fähigkeiten des Forschers. Die Methode der viralen Transduktion zeigt gute Ergebnisse und kann angewendet werden. Dennoch ist es nicht für alle Zellkulturen geeignet (insbesondere ist es weniger geeignet für menschliche Fibroblasten, die aus der Hautbiopsie von Huntington-Patienten gewonnen werden).
Der kritischste Schritt in diesem Protokoll ist die Transfektion, die durchgeführt wird, um eine ausreichende Proteinexpression zu gewährleisten. Ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis, kein Photobleichen von Mikrotubuli und das Fehlen von Zelldrift während der Zeitraffer-Videoaufnahme sind absolut entscheidend für eine effektive Mikrotubuli-Bildgebung. Inunserem Experiment liefern die Visualisierung von Mikrotubuli und die dynamische Analyse wichtige Informationen über die Eigenschaften und das Verhalten von Mikrotubuli in den Zellen mit mutierter HTT. Unser Protokoll ist für Studien anderer Krankheiten anwendbar, bei denen die Pathologie dynamische Eigenschaften von Mikrotubuli impliziert.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preiszugeben.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde vom Ministerium für Wissenschaft und Hochschulbildung der Russischen Föderation, Zuschuss Nr. 075-15-2019-1669 (Transfektion von Fibroblasten), von der Russischen Wissenschaftsstiftung, Zuschuss Nr. 19-15-00425 (alle anderen Arbeiten zur Kultivierung von Fibroblasten in vitro)finanziert. Es wurde teilweise vom Lomonosov Moscow State University Development Program PNR5.13 (Bildgebung und Analyse) unterstützt. Die Autoren danken für die Unterstützung des Nikon Center of Excellence am A. N. Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology. Wir möchten uns besonders bei Ekaterina Taran für ihre Hilfe bei der Sprachausgabe bedanken. Die Autoren danken auch Pavel Belikov für seine Hilfe bei der Videobearbeitung. Figuren in der Handschrift wurden mit BioRender.com geschaffen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrumentation | |||
| Camera iXon DU897 EMCCD | Andor Technology | ||
| Eppendorf Centrifuge 5804 R | Eppendorf Corporate | ||
| Fluorescence filter set HYQ FITC | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| LUNA-II Automated Cell Counte | Logos Biosystems | L40002 | |
| Microscope incubator for lifetime filming | Okolab | Temperature controller H301-T-UNIT-BL-PLUS | |
| Gas controller CO2-O2-UNIT-BL | |||
| Objective lens CFI Plan Apo Lambda 60x Oil 1.4 (WD 0.13) | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Widefield fluorescence light microscope Eclipse Ti-E | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Software | |||
| Fiji (Image J version 2.1.0/1.53c) | Open source image processing software | ||
| NIS Elements | Nikon | Alternative: Leica, Olympus, Zeiss | |
| Additional reagents | |||
| Mineral oil (Light white oil) | MP | 151694 | |
| Cell culture dish | |||
| Cell Culture Dish | SPL Lifesciences | 20035 | |
| Confocal Dish (glass thickness 170 µm) | SPL Lifesciences | 211350 | Alternative: MatTek |
| Conical Centrifuge tube | SPL Lifesciences | 50015 | |
| Cryogenic Vials | Corning-Costar | 430659 | |
| Microcentrifuge Tube | Nest | 615001 | |
| Cultivation | |||
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | |
| Dimethyl sulfoxide | PanEko |  135 |
|
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Media) | PanEko | C420 |
|
| DPBS (Dulbecco's phosphate-salt solution) | PanEko | P060 |
|
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | K053/SH30071.03 | |
| Gelatin (bovine skin) | PanEko | 070 |
|
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Opti-MEM (1x) + Glutamax | Gibco | 519850026 | |
| Penicillin-streptomycin | PanEko | A063 |
|
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | |
| Transfection | |||
| Plasmid DNA with EB3-GFP | Kind gift of Dr. I. Kaverina [Vanderbilt University, Nashville] with permission from Dr. A. Akhmanova [Erasmus University, Rotterdam] |
Stepanova et al., 2003 DOI: 10.1523/JNEUROSCI.23-07-02655.2003 |
References
- Engelender, S., et al. Huntingtin-associated Protein 1 (HAP1) Interacts with the p150 Glued Bubunit of Dynactin. Human Molecular Genetics. 6 (13), 2205-2212 (1997).
- Caviston, J. P., Ross, J. L., Antony, S. M., Tokito, M., Holzbaur, E. L.
- MacMillan, J. C., et al. Molecular analysis and clinical correlations of the Huntington's disease mutation. The Lancet. 342 (8877), 954-958 (1993).
- Proskura, A. L., Vechkapova, S. O., Zapara, T. A., Ratushniak, A. S.
- Steffan, J. S., et al. The Huntington's disease protein interacts with p53 and CREB-binding protein and represses transcription. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97 (12), 6763-6768 (2000).
- Nekrasov, E. D., et al. Manifestation of Huntington's disease pathology in human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Molecular Neurodegeneration. 11 (1), 1-15 (2016).
- Mitchison, T., Kirschner, M.
- Walker, R. A., et al. Dynamic instability of individual microtubules analyzed by video light microscopy: rate constants and transition frequencies. The Journal of Cell Biology. 107 (4), 1437-1448 (1988).
- Desai, A., Mitchison, T. J.
- Allen, C., Borisy, G. G. Structural polarity and directional growth of microtubules of Chlamydomonas flagella. Journal of Molecular Biology. 90 (2), 381-402 (1974).
- Stepanova, T., et al. Visualization of microtubule growth in cultured neurons via the use of EB3-GFP (end-binding protein 3-green fluorescent protein). Journal of Neuroscience. 23 (7), 2655-2664 (2003).
- Shelden, E., Wadsworth, P. Observation and quantification of individual microtubule behavior in vivo: microtubule dynamics are cell-type specific. Journal of Cell Biology. 120 (4), 935-945 (1993).
- O'Brien, E. T., Salmon, E. D., Walker, R. A., Erickson, H. P. Effects of magnesium on the dynamic instability of individual microtubules. Biochemistry. 29 (28), 6648-6656 (1990).
- Drechsel, D. N., Hyman, A. A., Cobb, M. H., Kirschner, M. W. Modulation of the dynamic instability of tubulin assembly by the microtubule-associated protein tau. Molecular Biology of the Cell. 3 (10), 1141-1154 (1992).
- Gildersleeve, R. F., Cross, A. R., Cullen, K. E., Fagen, A. P., Williams, R. C. Microtubules grow and shorten at intrinsically variable rates. Journal of Biological Chemistry. 267 (12), 7995-8006 (1992).
- Penazzi, L., Bakota, L., Brandt, R. Microtubule dynamics in neuronal development, plasticity, and neurodegeneration. International Review of Cell and Molecular Biology. 321, 89-169 (2016).
- van de Willige, D., Hoogenraad, C. C., Akhmanova, A. Microtubule plus-end tracking proteins in neuronal development. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (10), 2053-2077 (2016).
- Applegate, K. T., et al. plusTipTracker: Quantitative image analysis software for the measurement of microtubule dynamics. Journal of Structural Biology. 176 (2), 168-184 (2011).
- Komarova, Y. A., Vorobjev, I. A., Borisy, G. G. Life cycle of MTs: persistent growth in the cell interior, asymmetric transition frequencies and effects of the cell boundary. Journal of Cell Science. 115 (17), 3527-3539 (2002).
- Nahidiazar, L., Agronskaia, A. V., Broertjes, J., vanden Broek, B., Jalink, K. Optimizing imaging conditions for demanding multi-color super resolution localization microscopy. PLoS One. 11 (7), 0158884 (2016).
- Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal. 36 (2), 280-290 (2003).
- Grzelak, A., Rychlik, B., Bartosz, G. Light-dependent generation of reactive oxygen species in cell culture media. Free Radical Biology and Medicine. 30 (12), 1418-1425 (2001).
