Summary
Denne protokol præsenterer et nyt reporter-gensystem og den eksperimentelle opsætning til at opdage transskription ved DNA-dobbeltstrengsbrud med enkeltmolekylefølsomhed.
Abstract
DNA-dobbeltstrengspauser (DSB) er den alvorligste type DNA-skader. På trods af de katastrofale konsekvenser for genomets integritet er det indtil videre undvigende, hvordan DSBs påvirker transskription. En af grundene hertil var manglen på egnede værktøjer til samtidig at overvåge transskription og induktion af en gen DSB med tilstrækkelig tidsmæssig og rumlig opløsning. Værket beskriver en række nye journalister, der direkte visualiserer transskription i levende celler umiddelbart efter induktionen af en DSB i DNA-skabelonen. Bacteriophage RNA stilk-loops anvendes til at overvåge transskription med enkelt-molekyle følsomhed. For at målrette DSB mod en bestemt genregion er reportergenerene konstrueret til at indeholde en enkelt anerkendelsessekvens af den homing endonuclease I-SceI, ellers fraværende fra det menneskelige genom. En enkelt kopi af hvert reporter gen blev integreret i genomet af menneskelige cellelinjer. Dette eksperimentelle system gør det muligt at påektionere enkelte RNA-molekyler genereret af den kanoniske gentransskription eller ved DNA-brud-induceret transskription indledning. Disse journalister giver en hidtil uset mulighed for at fortolke de gensidige interaktioner mellem transskription og DNA-skader og for at afsløre hidtil ikke værdsatte aspekter af DNA-brud-induceret transskription.
Introduction
DNA dobbeltstrengede brud (DSBs) er giftige DNA-læsioner, der forstyrrer cellefunktionen og bidrager til opblussen af flere sygdomme og aldring1. Mutationer som følge af den unøjagtige reparation af DSBs påvirker genekspressionen og danner grundlag for cellens funktionelle tilbagegang. Den emergente opfattelse, at DSBs drive de novo break-induceret transskription på læsion site2,3,4,5,6,7 tyder på, at DSBs kan også påvirke cellulære funktion gennem break-induceret RNA'er. Flere nylige undersøgelser tyder på, at DSBs er tilstrækkelige til at indlede programmerede (f.eks. ved stimulus-indukible gener) og uplanlagt (f.eks. hos ikke-kanoniske initiativtagere) transskription4,5,7. På trods af flere undersøgelser, der undersøgte sammenhængen mellem DNA-skader og transskription, haltede feltet dog stadig i sin evne til at levere en præcis (dvs. enkeltmolekyle) karakterisering af transskriptionernes hændelser på DNA-pausesteder. En vigtig årsag til dette var manglen på passende eksperimentelle værktøjer. Cellebestråling (γ stråler, røntgenstråler, tunge ioner) og lægemiddelbehandlinger (f.eks. topoisomerasehæmmere eller interkaleringsmidler) mangler rumlig præcision og fremkalder andre DNA-læsioner end DSBs, herunder enkeltstrengede pauser og DNA-adducts8. Endonucleaser, såsom I-PpoI og AsiSI, genererer locus-specifikke DSBs, men er ikke blevet kombineret med et system, der tillader samtidig live-celle visualisering af transskription på et enkelt græshoppe med høj tidsmæssig præcision8. For at omgå denne begrænsning stod vores laboratorium i spidsen for at udvikle et sæt banebrydende journalister, der direkte visualiserer transskription med enkeltmolekyleopløsning ved kontrolleret induktion af en unik DSB4. Her beskriver vi disse journalister, giver en detaljeret protokol for live-celle billeddannelse af transskription på DSBs og viser data, der afslører transskription indledning på en enkelt DSB.
De reporter gensystemer, der anvendes i denne protokol er baseret på velkarakteriseret mus IgM reporter gen og indeholder exons M1 og M2 af membranen-bundet form (μm) af IgM μ tunge kæde9,10,11. En hybrid intron adskiller de to exons med den stærke adenovirus større sen udskrift (AdML) PY tract12. Udtrykket af reporter gener styres af den menneskelige cytomegalovirus promotor (CMV), hvori to tandem kopier af Tet operatør (TetO) sekvens er blevet indsat. Reporter gener er hver indsat i en plasmid vektor, der indeholder en Flp Recombination Target (FRT) site og indsat i en bestemt FRT mål site i genomet af en HEK293 værtscelle linje. Denne celle linje også konstituerende udtrykker Tet repressor protein til at regulere ekspressionen af reporter genet via tilstedeværelsen eller fraværet af tetracyklin / doxycyclin. For at tillade visualisering af reporter gen transskription, 24 tandem gentagelser af MS2 stilk loop sekvens og 24 tandem gentagelser af PP7 stilk loop sekvens blev indsat på forskellige positioner med hensyn til transskription startsted og exon / intron struktur reporter genet. MS2/PP7 RNA-stilkens sløjfer dannes ved transskription og er specifikt bundet af ektopisk udtrykte MS2/PP7-frakkeproteiner mærket med grønne og røde fluorescerende proteiner, en strategi, der i vid udstrækning blev brugt før til billedtransskription13,14,15. Derudover blev en enkelt kopi af 18 bp anerkendelse sekvens indsat for homing endonuclease I-SceI, der er direkte flankeret af RNA stem-loop sekvens arrays i reporter gener. Standard kloning teknikker blev brugt til at generere alle plasmider, fragmentet indeholder I-SceI-24xMS2 stilk-loop af PROP reporter genet blev syntetiseret af en kommerciel gensyntetisering tjeneste.
Det proksimale DSB-reportergen (PROP) blev konstrueret ved at indsætte I-SceI-skærestedet 45 basispar (bp) nedstrøms putativt transskriptionstartsted i exon I, efterfulgt af 149 bp indtil starten af 24x MS2 stem-loop-kassetten, som var de novo designet med to skiftevis ikke-identiske stilk-loop sekvenser16 og yderligere fem ikke-gentagne 20 bp spacer sekvenser for at reducere redundans. MS2 stem-loop array efterfølges af 72 bp indtil begyndelsen af 1844 bp intron og 1085 bp exon II indtil kavalergang og polyadenylation site. Exon II koder et cyan fluorescerende protein (CFP), der er smeltet sammen til en C-terminal peroxisomal targeting sequence (PTS) fra den humane peroxisomale acyl CoA-oxidase for at muliggøre en uafhængig screening af reportergentrykket (Figur 1A).
Exon II DSB reporter genet (EX2) består af en 167 bp exon jeg efterfulgt af intron og exon II kodning af den fælles fiskeripolitik-PTS. Længere nede ad floden i en afstand af 169 bp blev der indsat en kassette med 24x MS2-stængselsløjfer efterfulgt af en 84 bp linkersekvens med et I-SceI-sted i midten efterfulgt af 24x PP7-stængselsløjfer og 221 bp indtil kavalergangen og polyadenylationsstedet17 (figur 1B).
Endelig er exon II DSB reporter genet med antisense transskription mærkning (EX2AS) er baseret på den menneskelige ubiquitin B (UBB) genudskrift UBB-201 og indeholder to exons og en intron. Exon jeg har en samlet længde på 1534 bp med en omvendt indsættelse af 24x MS2 stilk-loop sekvens. Derfor vil den korrekte MS2 stem-loop RNA sekvens blive transskriberet i en antisense retning med hensyn til den forstand transskription af reporter genet fra CMV promotor. Intronen har en længde på 490 bp, efterfulgt af exon II med I-SceI-webstedet , og der blev indsat et kodningsområde for to in-frame ubiquitin-underenheder. Nedstrøms af UBB genet er en sekvens, der danner en 24x PP7 stem-loop ved transskription af reporter genet i en vis retning (Figur 1C).
Den forbigående gennemgående transfektion af en induktiv konstruktion af den homing endonuclease I-SceI giver mulighed for kontrolleret oprettelse af en DSB på det indsatte anerkendelsessted inden for hvert reporter-gen18. I-SceI endonuclease er smeltet sammen i ramme med ligand-bindende domæne glucocorticoid receptor og en langt rød fluorescerende protein iRFP713. Denne konstruktion er cytoplasmisk i mangel af triamcinolone acetonid (TA), men migrerer hurtigt ind i kernen ved tilsætning af TA til cellernes vækstmedium (Figur 1D). I-SceI-systemets induktion af DSBs er robust, som det blev påvist før 18.19,20. Reporter gen transskription kan overvåges parallelt ved at visualisere fluorescerende mærket RNA stilk-loop systemer MS2 og PP7.
Protocol
1. Forberedelse og transfektion af celler til levende cellemikroskopi
- Forbered en 25 cm2 cellekultur kolbe af reporter celle linje (EX2, EX2-AS, eller PROM) med 5 mL af DMEM at opnå 80-90% sammenløb på dagen før live-celle mikroskopi eksperiment.
- Aspirer mediet med en pipette fra 25 cm2 cellekulturkolben og vask cellerne med 2,5 mL 1x PBS.
- Der tilsættes 1 mL trypsin-EDTA (0,05%) og inkuberes ved 37 °C i 2-3 min.
- Efter celleudnyttelse tilsættes 4 mL DMEM uden phenolrød indeholdende HEPES buffer, suppleret med 10% (v/v) kulstypiseret fosterkvægsserum, og cellerne genbruges forsigtigt.
- 1 mL af celleopløsningen i en rund skål på 35 mm med 10 mm glasbundsbjære (diameter nr. 1,5) og homogeniseres. Opbevar den 35 mm runde skål inde i en 100 mm standardcellekulturskål, og inkuber den ved 37 °C i en befugtet atmosfære med 5 % CO2.
- ~ 6 timer efter såning, transfect cellerne i glasbunden skålen. For hver transfectionblanding skal du forberede to opløsninger på følgende måde:
- I et 1,5 mL mikrocentrifugerør fremstilles opløsning A, der indeholder 150 μL af reduceret serum minimalt essentielt medium (MEM), plasmid-DNA (som beskrevet i tabel 1) og 2,5 μg/μL DNA fra transfection helper reagens (se Materialetabel).
- Parallelt hermed fremstilles opløsning B, der indeholder 150 μL af mem med reduceret serum og 1,5 μg/μL DNA fra et lipidbaseret transfectionreagens (se Materialetabel).
- Inkuber begge opløsninger ved stuetemperatur (RT) i 5 min. Derefter tilsættes opløsning A til opløsning B og inkuberes 20 min ved RT.
- Hvis du vil transfect cellerne, tilsættes 300 μL opløsning A +B dropwise til hver skål og fordeler forsigtigt. Opbevar glasbundsfadet inde i en 100 mm standardcellekulturskål, og inkuber den ved 37 °C i en befugtet atmosfære med 5 % CO2.
- Der fremstilles et 1,5 mL mikrocentrifugerør med 200 μL DMEM med HEPES, uden phenolrød suppleret med 10% (v/v) kulstribet fosterkvægsserum og tilsættes TA til en koncentration på 7,5 x 10-7 M.
2. Eksperimentel opsætning
- Indstil temperaturen på det store plexiglasmikroskopinkubationkammer og inkubationskammeret på øverste trin til 37 °C ved den fælles kontrolenhed. Indstil miljøforholdene inde i faseinkubationkammeret til 5% CO2 og 100% fugtighed.
BEMÆRK: Mikroskopburet og faseinkubatortemperaturen skal være indstillet mindst 1 time, før forsøget påbegyndes, så det hele systemet kan opvarmes for at minimere temperaturudsving. Start alle andre mikroskopstyrings- og driftsenheder på samme tid. - Inducer transskriptionen af reportergener ved at tilføje doxycyclin (0,5 μg/mL) til vækstmediet og bland forsigtigt ved at pipetter op og ned med en 200 μL mikropipette ~ 1 time før mikroskopiobservationen startes.
BEMÆRK: Hold glasbundsfadet med de transfected celler inde i en 100 mm standard cellekulturskål for nem håndtering og transport fra cellekulturen til mikroskoprummet i en styrofoambeholder for at opretholde temperaturen så stabil som muligt. - Transport cellerne til mikroskopet mindst 30 min før observationen påbegyndes, og ved ankomsten placeres 100 mm skålen med cellerne umiddelbart inde i det forvarmede store mikroskopinkubationskammer.
- Mikrocentrifugerøret placeres sammen med den fortyndede TA fra trin 1.7. inde i det store mikroskop miljøkammer til opvarmning af op til 37 °C.
- Udskift låget på glasbundsfadet svarende til det, der blev forberedt før, med et hul med en diameter på 3 mm boret i låget (figur 2A).
BEMÆRK: TA'en tilsættes senere til cellerne gennem det lille hul i låget uden at manipulere fadet monteret på mikroskopstadiet. - Vælg 100x (apokromatisk mål, 1,4 numerisk blænde) olie nedsænkning mål i mikroskop kontrolpanelet. Påfør en dråbe nedsænkning olie til målet.
- Sæt glasbundsskålen med cellerne inde i mikroskopstadiets inkubationskammer og lås det på plads. Luk låget på sceneinkubatoren og alle døre i mikroskophuset.
- Start mikroskopets drifts- og kontrolsoftware, åbn vinduet Fokuskontrol (Figur 2B), klik på ruden Område, og klik på 100% eyeboksen i ruden Emissionsvalg for at indstille okulær strålestien til direkte prøveobservation med øjet.
- Skift til Eye-filtersæt i menuen Filtersæt, og klik på Brightfield, og tryk på knappen Åbn Brightfield .
- Flyt mikroskopmålet mod glasbundsskålen, indtil olien rører glasset. Kig derefter gennem okulæret og fokuser manuelt på cellernes plan. Sluk for knappen Åbn Brightfield .
- Lad cellerne stå i 30 min, før de eksperimentelle observationer påbegyndes for at tilpasse sig miljøforholdene og forhindre brændpunktsdrift under billeddannelse efter temperaturgradienter.
- Placer en 200 μL mikropipette og 200 μL filterspidser klar til brug ved stuetemperatur.
3. Billedopsamling
- I mikroskopstyringssoftwarens fokusstyringsvindue skal laserintensiteten indstilles til 5 % og angive en værdi på 50 ms for eksponeringstiden (figur 2B).
- Åbn capture-vinduet for at justere indstillingerne for at udføre et automatisk billedopsamling af tredimensionelle (3D) time-lapses (Figur 2C).
- Vælg 3D-opsamlingstypen , og indstil 12 til 16 optiske udsnit adskilt af 0,4 μm, sæt kryds i afkrydsningsfelterne for Rækkevidde omkring strøm og Vend tilbage til den aktuelle position efter optagelse.
- Angiv en værdi på 120 for antal tid og 30 s for intervallet i ruden Timelapse Capture.
- Vælg det konfokale filtersæt i henhold til de transfected fluorescerende proteinetiketter med λ = 488 nm for GFP, λ = 561 nm for TagRFPt og λ = 640 nm for iRFP713 , og angiv eksponeringstiden for hver kanal til 50 ms.
- Brug indstillingen Strøm for lasereffekten til at bruge værdien 5 %, der er valgt i fokusvinduet (Figur 2C).
- Gå til ruden Kamera i vinduet Fokuskontrol, vælg kontrolelementet Skaler billedvisning, og vælg knappen Manuel for at konfigurere et fast interval af billedintensiteter, der skal vises. Angiv værdier for Lav: 500 og Høj: 5000 (se figur 2B).
BEMÆRK: Denne indstilling begrænser det dynamiske område af kameraoptagelsen, der vises i livevisningen, for at markere celler inden for samme område af fluorescensintensiteter (figur 2D). - Vælg cellerne til 3D-time-lapse-billeddannelse af transskriptionssteder ved induktion af en DSB. Screen cellerne, og vælg tre synsfelter i overensstemmelse med de betingelser, der er beskrevet i diskussionen.
- Fokuser hver markeret celle, der tidligere var placeret i midten af synsfeltet, med transskriptionsstedet i det midterste plan i Z-stakken.
BEMÆRK: Centrering af cellen og transskriptionsstedet i XYZ rummer for en vis bevægelse af cellen. - Markér hver XYZ-placering i XY-ruden i vinduet Fokuskontrol ved at klikke på Angiv punkt.
BEMÆRK: Genbesøg de valgte positioner 2-3 gange i løbet af de følgende 5 min for at bekræfte kontinuerlig transskription af reportergener og relativ positionsstabilitet af cellernes positioner i XYZ-dimensioner. - Der tilsættes 200 μL af den for fortyndede TA fra trin 1.7. cellerne som vist i figur 2F.
BEMÆRK: Vær yderst forsigtig med ikke at røre ved glasbundsfadet eller låget, mens du tilføjer TA'en for at forhindre skift fra de markerede XY-positioner. Efter DSB induktion, bekræfte, at cellerne er centreret inden for synsfeltet, og transskription site er i midten Z-flyet. Refokuserings- og positionsopdateringen bør ikke tage mere end 1-2 min. - Start 3D-tidsseriebillederne ved at klikke på Start i capturevinduet .
- Gem billeddataene i mikroskopstyringssoftwaredataformatet på mikroskopets styrecomputerhardmdrev.
4. Dataanalyse
- Åbn billeddata i mikroskopstyringssoftwaren, og eksporter som 16-bit TIFF-formatfiler.
- Åbn de eksporterede filer med StaQtool21-softwaren . Vælg 3D-tilstanden Med enkelt spot, og indlæs billedfilerne ved at trykke på Go.
BEMÆRK: Den valgte tidsserie åbnes i Max Projection Timelapse Viewer, der viser en maksimal intensitetsfremskrivning af z-stakken for første gang (Figur 3A). - Juster billedintensitetsvisningen med den lodrette MAX-skyder i venstre side.
- Vælg det tidspunktpunkt, der skal analyseres med skyderen vandret tid.
- Hold markøren fast på placeringen af det mærkede transskriptionssted til manuel markering, eller brug funktionen Autoregistrering , og tryk på det respektive transskriptionssted, hvis der blev registreret flere objekter.
- Brug funktionen Auto track til at bestemme XYZ-positionerne på transskriptionsstedet over tid.
BEMÆRK: Hvis en given position ikke blev sporet korrekt, skal du vælge transskriptionswebstedet manuelt i henhold til StaQtool-softwaremanualen. - Tryk på knappen Auto for at udføre Gauss-monteringen for hvert timepoint, og mål den samlede fluorescensintensitet (TFI).
BEMÆRK: Hvis den transskriptionelle aktivitet ophører, forbliver sporingsværktøjet på den sidste position, hvor der blev registreret et diffraktionsbeskæmret objekt (et mærket transskriptionssted). Hvis cellen bevæger sig i XY-retning, efter at transskriptionswebstedsetiketten er forsvundet, kræves der en manuel flytning af søgepladsen . - Når TFI-værdien er færdig med at tilpasse sig hvert timepoint, skal du trykke på knappen Sluttidspunktsfald for at lukke den aktuelle tidsseriebilledfil og fortsætte til den næste fil.
BEMÆRK: TFI-værdierne eksporteres og gemmes automatisk i en Excel-fil.
5. Mikroskopi kalibrering målinger og analyse
- Frøceller i 35 mm glasbundsfade og transfect med de fluorescerende mærkede MS2- og PP7-bekkeproteiner som beskrevet i afsnit 1.
BEMÆRK: Ved kalibreringsmålingerne skal du bruge de samme reportergencellelinjer, der er beskrevet i introduktionen. - Der tilsættes 0,5 μg/mL doxycylin til cellernes vækstmedium 1 time, før mikroskopibilledopsamlingen påbegyndes.
- Monter glasbunden inde i inkubationskammeret i mikroskopstadiet, og beret billedopsamlingen som før (se afsnit 2).
BEMÆRK: Det originale låg på glasbundsskålen udskiftes ikke til kalibreringsforsøgene. - Brug de samme laserintensitets- og eksponeringsindstillinger som beskrevet i punkt 3.1.
- Angiv hentningsindstillingerne for 2D-tidsserie (fjern markeringen af 3D-indstillingen i ruden Hent type ), og angiv 120 tidsintervaller med intervaller på 500 ms i panelet Timelapse Capture (Figur 2C).
BEMÆRK: Denne indstilling for billedopsamling vil resultere i tidsserier inden for et enkelt optisk plan med meget korte intervaller. - Erhverve snesevis af kalibrering tidsserier fra flere positioner til at generere datasæt til at tælle flere hundrede enkelt udskrifter TFI målinger.
- Ved analyse af kalibreringstidsserien konverteres filerne til 16-bit TIFF-formatfiler i overensstemmelse hermed til punkt 4.1.
- Åbn de eksporterede filer med StaQtool21-softwaren (figur 3). Tryk på knappen Vælg LOG-fil , vælg Logfile for den respektive 2D-tidsserie, der er anskaffet som beskrevet i punkt 4.2.
- Markér afkrydsningsfeltet Flere pletter 2D , og tryk på GO-knappen for at indlæse tidsserien i analysesoftwaren.
- I vinduet Timelapse-fremviser (Figur 3A) i PSF FWHM indsætter inputfeltet den værdi, der er beregnet for mikroskopsystemet og målet som beskrevet21.
- Hvis du vil starte analyseprocessen, skal du trykke på knappen Automatisk registrering for at registrere alle diffraktionsbeskrimlede objekter for det aktuelle tidspunkt, der vises. Klik derefter på AutoFit for at udføre den gaussiske tilpasning for at bestemme TFI-værdien for hvert objekt (Figur 3A).
- Du kan også pege markøren over et diffraktionsbesklede objekt og klikke for at markere det (grøn cirkel i en hvid firkant vises) og trykke på gaussisk tilpasningsprocedure for at vælge den manuelle markering og Gauss-monteringsproceduren.
BEMÆRK: Den sidste tilstand anbefales at udelukke objekter, der ikke tælles, såsom lyse transskriptionssteder med flere spirende udskrifter til stede i samme kerne. - Tryk på knappen Sluttidspunktsfald for at afslutte det forrige trin.
BEMÆRK: Resultaterne gemmes automatisk i et Microsoft Excel-filformat i samme mappe som billedfilen. - Start modulet TFI- og W-fordelinger flere steder ved at trykke på den respektive knap (Figur 3B).
- Indlæs Excel-filer via knappen Tilføj fil , og start TFI-analysen ved at trykke på knappen Start.
BEMÆRK: Outputtet er den gennemsnitlige TFI-værdi bestemt ud fra flere målte enkeltudskrifter TFI'er. - Start W-analysen ved at indsætte den PSF FWHM, der tidligere blev brugt i punkt 5.10. og tryk på knappen Start ved hjælp af standardværdien for placeringen.
BEMÆRK: W-parameteren er kvalitetskontrol for de enkelte TFI-målinger for at overholde den korrekte PSF FWHM-værdi for det anvendte mikroskopsystem.
6. Sammenlægning af data og kalibrering
- Angiv TFI-værdierne for tidsserier, der er hentet fra excelarket, og som er gemt i punkt 4.8. i et nyt Excel-ark og dividere hver gangpunktsværdi med den gennemsnitlige TFI for enkelte udskrifter, der er opnået i punkt 5.15.
BEMÆRK: Til standardisering af denne proces blev der anvendt specialfremstillede Excel-skabelonformularer.
Representative Results
De cellelinjer, der huser de reportergener, der er beskrevet i figur 1A-C, gør det muligt at studere transskriptionsdynamikken hos en enkelt DSB i levende celler. Tallene i figur 1A-C under hver grafisk reporter genrepræsentation angiver længden i kilobasepar (kbp). CMV angiver cytomegalovirus promotor, TetO er Tet-operatør sekvenser, pA fremhæver 3 'kavalergang og poly-adenylation site i genet ende. CFP-PTS er det kodede cyan fluorescerende protein smeltet til et peroxisomalt målretningssignal, og 2UBB er den kodede menneskelige allestedsnærværende B tandemenhed. Ved at følge de ovenfor beskrevne protokol- og analyseprocedurer er det muligt at opnå grafer, der viser antallet af fluorescerende mærkede reportergenudskrifter over tid med en tidsmæssig opløsning på sekunder over perioder på op til timer (figur 4A-D). Grafen i figur 4A viser tidsforløbet for TFI-værdier af et PROM-reportergentransskriptionssted mærket af akkumuleringen af MS2-GFP-molekyler på spirende udskrifter. Denne særlige graf repræsenterer et kontroleksperiment uden TA-tilføjelse. derfor er der ingen DSB, der er induceret. Transskription fortsætter med burst-lignende toppe og 2-8 udskrifter ad gangen over hele observationsperioden på 60 min. Lignende resultater blev opnået for EX2- og EX2-AS-reportergener (data, der ikke er vist her)4. Induktionen af en enkelt DSB'er i reportergener (ved hjælp af I-SceI-GR-iRFP) gør det muligt at studere DSB's indvirkning på den igangværende reportergentransskription og overvågning af transskriptionshændelser, der kommer fra DSB's websted, nemlig break-induceret transskription (figur 4B-D).
Dynamikken i DNA-brud-induceret transskription afhænger af placeringen af DSB inden for genet
Induktionen af en enkelt DSB af I-SceI-GR-iRFP i reporter genet med en promotor-proksimale I-SceI anerkendelse site fører til transskriptionion silencing af reporter genet efter ca 11 min efter TA tilføjelse, og transskriptionen er ikke genoprettet inden for 60 min observation periode (Figur 4B). Ved observation af EX2 reporter gen transskription, fuldstændig undertrykkelse af den kanoniske promotor-drevet transskription blev opdaget ved en samtidig fuldstændig tab af både MS2-GFP og PP7-RFP signaler omkring 30 minutter efter TA tilføjelse. Men inden for 10 min, transskription genstarter, som afsløret ved at genudsende toppe af PP7-RFP fluorescens. Den fuldstændige inddrivelse af PP7-RFP-signalet (og ikke MS2-GFP fluorescensen) viser break-induceret transskription indledning (Figur 4C). Den brud-inducerede transskription er ikke stabil over lange perioder; det ser ud til at være bristet og lav topintensitet, hvilket indikerer, at der kun blev igangsat nogle få brudinducerede udskrifter fra DSB-grunden.
EX2AS reporter gen, som indeholder en 24x PP7 stem-loop array i exon II nedstrøms I-SceI site til at opdage sans transskription, viser den kanoniske promotor-drevet transskription slutter inden ex2AS reporter gen inden for ca 25 minutter efter TA tilføjelse. Det erstattes derefter af antisense break-induceret transskription, som afsløret af ophobning af MS2-GFP protein bindende for RNA genereret fra antisense MS2 stem-loop sekvenser (Figur 4D). Antisense-transskriptionen var fraværende før afbrydelsen af sansetransskriptionen på grund af induktionen af DSB og viser i dette eksempel, at der blev igangsat flere udskrifter fra pausestedet inden for ca. 15 min. De repræsentative data, der er opnået her, viser, at DSBs har forskellige virkninger på transskription afhængigt af deres placering i genet, som det for nylig blev rapporteret4. Dataene afslører også en celle til cellevariation i timingen af DSB induktion af I-SceI-GR-iRFP, som spænder fra 12 til 30 min efter TA tilføjelse. Desuden gør påvisning af individuelle udskrifter det muligt at finde celle til celle og bryde stedforskelle mod intensiteten af den break-inducerede transskriptionsaktivitet. Den break-inducerede transskription opdages kun ved DSBs i genet. Den er fraværende på promotor-proksimale DSBs, hvor den kanoniske transskription ophører hos en DSB i den resterende observationsperiode.
Figur 1: Reporter gener og systemet til at fremkalde DNA dobbelt-streng pauser. Den skematiske repræsentation i (A) til (C) viser strukturen af de tre reporter gener, der anvendes til at studere transskription ved induktion af en DNA dobbelt-streng pause. Reporter genet med promotor-proksimale I-SceI site i den første exon (PROM) flankeret nedstrøms af en 24x MS2 stem-loop (MS2-SL) sekvens array er afbildet i (A). Reporter genet med I-SceI site i den anden exon (EX2) flankeret opstrøms med en 24x MS2 stem-loop sekvens og nedstrøms af en 24x PP7 stem-loop (PP7-SL) array er vist i (B). Reporter genet med I-SceI site placeret i exon II med en anti-parallel indsættelse af 24x MS2 stem-loop sekvens opstrøms af I-SceI site til at opdage antisense transskription (EX2-AS) er vist i (C). Funktionen af I-SceI-GR-iRFP fusion protein konstruktion er afbildet i (D) af en grafisk skærm og tilsvarende billeder af levende celler nedenfor. Ved forbigående udtryk for konstruktionen (rød farve) i reporter gencellelinjerne er proteinet udelukkende cytoplasmisk, hvilket forhindrer en for tidlig kavalergang af målstedet ved I-SceI endonuclease. Ved tilsætning af TA begynder fusionsproteinet at migrere ind i cellekernen (angivet med en stiplet linje) og begynder at akkumulere mellem 5-15 min. Scalebar = 10 μm Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Valg af celler til 3D-time-lapse billeddannelse af transskriptionssteder. Billedet i (A) viser en 35 mm glasbundet skål, der bruges til den levende cellebilleddannelse, med et brugerdefineret modificeret låg, hvor et hul på 3 mm diameter blev boret for at tilføje TA fortyndet i vækstmedium direkte. Hulplaceringen er markeret med en rød cirkel. Panelet i (B) viser et skærmbillede af "Focus" vinduet i mikroskop kontrol software til at oprette live view eksponering tid, filter indstilling, laser intensitet, og skalere billedet display til skærmen for celler til efterfølgende time-lapse imaging i (C), skærmbilledet af den tilsvarende "Capture" vindue til at justere alle indstillinger for levende celler '3D tid bortfalder erhvervelse. De specifikke indstillinger for ruderne Filter, Hentningstype, Time-Lapse og 3D-hentning er beskrevet i afsnit 3. I den opfattelse, der vises her, er indstillingerne justeret for at erhverve en 3D-time-lapse af PROM reporter gen linje transfected med MS2-GFP og I-SceI-GR-iRFP konstruktioner til billeddannelse transskription ved induktion af en DNA dobbelt-streng pause i promotor-proksimale region reporter genet. Billedet i (D) er fusioneret for GFP og iRFP kanaler og viser et synsfelt set gennem mikroskop system, med flere celler i 293-PROM reporter gen celle linje. Cellerne blev co-transfected med tandem dimer MS2 pels protein konstruktion smeltet til en nuklear lokalisering sekvens, to grønne fluorescerende proteiner (GFP-MS2CP), og I-SceI-GR-iRFP konstruktion. Flere celler viser udtryk for GFP-MS2CP konstruktionen og fremhæver dermed kernerne og I-SceI-GR-iRFP-konstruktionen, der fremhæver cytoplasmaet. Den stiplede firkant angiver det forstørrede område, der vises i (E). For 3D time-lapse imaging, celler er valgt i henhold til de krav, der er fastsat i diskussionen, såsom cellen med den større kerne i det forstørrede område i (D). Denne celle er transfected med både fluorescerende konstruktioner og viser en stærkt mærket transskription site (pilespids) ved at akkumulere GFP-MS2CP på de novo transskriberet reporter gen pre-mRNAs (venstre billede). Cellernes vækstmedium indeholder ikke TA; derfor er I-SceI-GR-iRFP konstruktionen udelukkende cytoplasmisk (højre billede). I (F) monteres glasbundsskålen i inkubationskammeret for 3D-time-lapse imaging og er udstyret med det brugerdefinerede låg, der indeholder TA-belastningshullet. 200 μL mikropipetspidsen indsættes forsigtigt i hullet for at påføre den fortyndede TA på cellernes vækstmedium. Scalebar = 10 μm Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Billedopsamlings- og analysesoftware. Panelet i (A) viser et skærmbillede af STaQTool: Spot tracking og kvantificering værktøj. Billedet viser et eksempel tidsserie af PROM reporter gen celle linje med mærket transskription site markeret med en grøn cirkel / hvid firkant i den maksimale intensitet projektion display i midten. Vinduerne i højre side viser en forstørret visning af den valgte transskription site stedet, den tilsvarende 3D skygget intensitet overflade plot med 2D Gaussian fit gitter for det aktuelle tidspunkt samt parceller af transskription site stedet Z position inden for z-stack, gaussiske fit bredde (W) og TFI måling over tid. Det mikroskopiske billede i (B) viser et zoomet enkelt optisk plan af en kerne af en PROM reporter gencellelinje transfected med MS2-GFP. Billedet repræsenterer et engangspunkt i en 2D-kalibreringstidsserie med 120 tidszoner. Kernen viser flere fluorescerende mærket udskrifter vises som diffraktion-begrænsede objekter i nucleoplasma (markeret med hvide firkanter). Højre sidepanel viser et skærmbillede af værktøjet TFI og W Distributions i STaQTool for at analysere flere steder i 2D-time-lapse-erhvervelser. I dette eksempel analyse, værktøjet opdaget 408 diffraktion-begrænsede pletter, der repræsenterer reporter gen udskrifter mærket med MS2-GFP, der diffus i nukleoplasma. Graferne til højre viser TFI og Gaussian passer bredde distribuere histogrammer af objekter og gaussiske fit kurver. De TFI- og W-middelværdier, der er afledt af placeringen af den gaussiske pasformkurves midtertop, og de beregnede konfidensintervaller vises i den respektive rude. Scalebar = 10 μm Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Repræsentative resultater af transskription på steder med DNA-pauser med dobbelt streng. Graferne i (A) til (D) repræsenterer den kalibrerede TFI-kurve på et transskriptionssted over tid. TFI-værdierne konverteres til udskrifter ved hjælp af den gennemsnitlige TFI af enkeltudskrifter målt i kalibreringsforsøgene for den respektive reportergenkonstruktion og fluorescerende mærkede RNA-stilk-loop bindende protein MS2 eller PP7, der anvendes i det respektive eksperiment. I (A) vises en graf fra et kontroleksperiment ved hjælp af PROM-reportergen uden TA-tilføjelse. Udskrifter mærket med MS2-GFP indikerer kontinuerlig transskriptionel aktivitet i hele observationsperioden. Grafen i (B) repræsenterer PROM reporter genet ved TA tilføjelse og induktion af en DSB, som fører til en undertrykkelse af transskription for den resterende observation tid. EX2 reporter gen graf i (C) viser en transskription undertrykkelse af kanoniske promotor-drevet transskription på TA tilføjelse. Senere i samme tid bortfalder, kun PP7-RFP mærket transskription aktivitet opstår. I grafen i (D), ex2-AS reporter gen transskription fra den kanoniske promotor i forstand retning er ligeledes undertrykt på TA tilføjelse til EX2 reporter genet i (C). Men udseendet af MS2-RFP mærket udskrifter stammer fra den inverse indsat MS2 stem-loop sekvens indikerer antisense transskription fraværende under sans transskription aktivitet før TA tilføjelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Reporter cellelinje | EX2 og EX2-AS | PROM |
| Plasmider til transfect | 1,5 μg pI-SceI-GR-iRFP | 1,5 μg pI-SceI-GR-iRFP |
| 0,65 μg pUBC-mCherry-nls-tdPP7-mCherry | 0,5 μg pUBC-GFP-nls-tdMS2-GFP | |
| 0,35 μg pUBC-GFP-nls-tdMS2-GFP |
Tabel 1: Transfection af reporter gen celle linjer. Tabellen beskriver transfection ordninger og mængder af de forskellige plasmider, der anvendes til at transfect de forskellige reporter gen cellelinjer forbigående.
Discussion
Konflikter mellem væsentlige biologiske processer såsom replikation, transskription, DNA-skader og DNA-reparation er blevet identificeret som en kritisk kilde til genom ustabilitet22. Disse undersøgelser har også ført til opdagelsen af transskription på steder af DNA-skader og tilskrives en funktionel rolle til break-induceret udskrifter i reguleringen af DNA-skader reparation processer23. De nye værktøjer og den protokol, der er beskrevet her, giver mulighed for yderligere undersøgelse af RNA Pol II transskription dynamik på DSBs. Et kritisk punkt i denne protokol er dannelsen af cellelinjer, der indeholder en enkelt kopi af reporter genet integreret i genomet. Denne nøglefunktion eliminerer støj skabt af transskription af flere reporter gener integreret med flere kopier inden for en enkelt genomisk græshoppe og tillader indsamling af kinetiske parametre transskription dynamik og individuelle RNA udskrifter. Et afgørende teknisk krav for at observere transskription af enkelt reporter genintegrationer er tilgængeligheden af et mikroskop system, der gør det muligt at opdage enkelt RNA udskrifter mærket med MS2 eller PP7 system i levende celler4,12. Her udføres levende cellemikroskopi på et Confocal Spinning Disk-system monteret på et omvendt mikroskop, udstyret med 100 mW solid-state lasere koblet til et akustisk optisk tunbart filter som beskrevet andetsteds24. For at studere transskription hos en enkelt DSB ved hjælp af journalisterne skal de enkelte celler desuden overvåges nøje for at opnå den højeste tidsopløsning, hvilket kræver billedceller i flere timer, hvilket gør dette til en lav gennemløbsanalyse. Alligevel observerer vi flere celler parallelt med positionering kontrolleret af et piezodrevet mikroskopstadium. For at sikre optimale miljøforhold for levende celleobservation over timer placeres mikroskopkroppen, herunder prøvestadiet, inde i et plexiglasmiljøkammer. Derudover er et lukket fase inkubation kammer monteret på mikroskop fase og forbundet til CO2 og fugtighed levering controllere.
Det første kritiske trin i protokollen er udvælgelsen af områder af interesse med celler til billeddannelse. Hver XY-position, der er markeret til billeddannelse, skal indeholde en eller flere celler, der viser transfektion med de fluorescerende RNA-stamløkkebindende proteiner i henhold til det reportergen- og transfektionsprogram, der er beskrevet i afsnit 1, tabel 1, samt i figur 2D, E. Desuden skal cellerne udvise lyse mærkede transskriptionssteder skal være co-transfected med I-SceI-GR-iRFP713 konstruktion, og proteinet skal lokaliseres i første omgang i cytoplasma (figur 2D og E).
Cellerne skal udvise et fluorescensintensitetsniveau af ubundet fluorescerende mærket MS2 og/eller PP7-frakkeprotein, der er lavt nok til at detektere enkeltmærkede udskrifter over baggrundslyscensniveauet. Samtidig er et robust fluorescensintensitetsniveau for de fluorescerende mærkede MS2- og/eller PP7-frakkeproteiner nødvendigt for at tillade billeddannelse over mindst 60 min uden at miste for meget fluorescens på grund af nogle blegning, der opstår. "Skaler billedvisning" med et fast område som beskrevet i afsnit 3.7 bruges til at muliggøre et standardiseret udvalg af celler i henhold til deres fluorescensintensitetsniveau.
Et andet kritisk protokoltrin er at tilføje TA til cellerne på forudbestemte XY-positioner gennem det lille hul i låget på glasbundsskålen. Enhver manipulation af glasbundsskålen ville medføre et skift fra cellernes markerede XY-position og skal undgås. Derfor er omhyggelig håndtering af mikropipetten, samtidig med at den fortyndede TA fortyndes i det cellulære vækstmedium, afgørende for forhåndsvalgte cellers vellykkede observation, som det fremgår af figur 2F. Tilpasningen af forskellige systemer til at tilføje lægemidler til celler monteret på et mikroskop fase, såsom en perfusion system, ville kræve et separat fase inkubation kammer med rør indgang og udgang åbninger og en pumpe eller injektion system til at administrere narkotika. Andre metoder såsom kanal dias med coverslip-lignende bundoverflader resultere i en langsom diffusion af administrerede lægemidler i kanalen og forårsage en ekstra forsinkelse mellem lægemiddeltilsætning og effekt. Endelig kan glødende pipetter i en kanal slide åbning flytte prøven position så godt. Derfor er det nuværende system med et brugerdefineret boret hul i låget på en glasbundet skål ligetil at tilpasse, lave omkostninger og egnet til administration af forskellige vækstmedier, stoffer og komponenter. Hullets lille diameter og den befugtede atmosfære i faseinkubationkammeret forhindrer også udtørring af cellemediet.
Et tredje kritisk skridt i denne protokol er dataanalysen, som kræver en manuel inspektion af de tidspunkter, hvor transskriptionen ophører på grund af induktionen af en DSB. Tidspunktet for afslutning af transskription er angivet ved at frigive de sidste udskrifter fra det tidligere lyse mærkede sted for reportergentransskriptionen. På samme måde skal hændelserne med udbrudsinduceret transskription indledning inspiceres med omhu for at opdage individuelle transskription hændelser med relativt lavt signal-til-støj-forhold for enkelt fluorescerende mærket mRNAs.
Dynamikken i reparationen af den inducerede DSB tilføjer et ekstra lag af kompleksitet til analyserne af data, der genereres ved hjælp af disse reportere, hvilket begrænser dem til de første minutter umiddelbart efter induktion af DSB. Den transgene karakter af reporter gener og den gentagne-rige karakter af MS2 og PP7 stem-loop arrays kan samle en unik kromatin landskab, forstyrrer oprettelse putative stabil break-induceret transskription programmer. Ikke desto mindre er I-SceI-mæcensningen af en DSB i reportergener et langt mere robust system til at undersøge transskription ved individuelle DSB'er sammenlignet med imitisering eller UV-bestråling.
Forskellige endonuclease systemer såsom I-CreI, I-PpoI, eller AsiSI , der har eller ikke har yderligere anerkendelse steder inden for det menneskelige genom kan kombineres med den nuværende reporter gensystemer for en mulig højere effektivitet for at generere DSBs. Men de kræver først at indføre endonuclease anerkendelse site i reporter gener. For det andet kan de have en lignende variation i timingen og effektiviteten induktion af en DSB i de enkelte celler. På den anden side kan indsættelse af tandemkopier af endonucleasegenkendelsessteder øge effektiviteten af DSB's induktion. Desuden vil test af de præsenterede reporter-gensystemer i forskellige cellelinjer gøre det muligt at sammenligne transskriptionsdynamikken på DSB's lokaliteter mellem forskellige cellebaggrunde og tilgængeligheden af forskellige DNA-skadesreparationsveje som i kræftceller, primære celler og differentierede ikke-cykelceller. Men opførelsen af de reportergener, der skal være kompatible med FLP/FRT-systemet, begrænser i øjeblikket integrationen i tilgængelige FLP/FRT-værtscellelinjer.
Ud over mikroskopibaserede anvendelser kan de nuværende reportergener også kombineres med biokemiske analyser, såsom kromatinimmunptur, for at studere rekrutteringen af DNA-reparations- eller transskriptionsfaktorer til en enkelt DSB eller for at vurdere nukleosombelægning, histonemodifikationer og kromatintilstand omkring DSB-webstedet. Desuden vil en kombination med forskellige reportersystemer gøre det muligt at studere funktionelle forbindelser mellem DNA-skader og processer som genomorganisation eller DNA-replikation.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker RH Singer, J.A. Chao, T. Misteli, M. Carmo-Fonseca for gaver af plasmider og reagenser. Vi står også i gæld til iMM Bioimaging Facility personale, A. Temudo, A. Nascimento, og J. Rino, for kritisk læsning af manuskriptet. Dette arbejde blev finansieret af PTDC/MED-OUT/32271/2017, PTDC/BIA-MOL/30438/2017 og PTDC/MED-OUT/4301/2020 from Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal og af LISBOA-01-0145-FEDER-007391, projekt cofunded af FEDER gennem POR Lisboa, Portugal 2020-Programa Operacional Regional de Lisboa og FCT. Der blev også modtaget støtte fra EU's Horisont 2020-forsknings- og innovationsprogram (RiboMed 857119). M.A. er modtager af FCT Ph.D. stipendiet 2020.05899.BD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mW solid-state Lasers | Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA | ||
| 3i Marianas SDC Confocal Spinning Disk system | Intelligent Imaging Innovations Inc. | ||
| Air-cooled EMCCD Camera Evolve 512 | Photometrics, Tucson, AZ USA | ||
| Axio Observer Z1 inverted microscope | Carl Zeiss MicroImaging, Germany | ||
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| charcoal-stripped fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F6765-500 ML | |
| CO2 module S | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
| CSU-X1 confocal spinning disk unit | Yokogawa Electric, Tokyo, Japan | ||
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| DMEM with Hepes no PhenolRed | Gibco | 21063-029 | |
| Doxicyclin | Sigma-Aldrich | D9891 | for induction of reporter gene expression; stock solution of 0.5 mg/ml was used at 1:1000 dillution in cell growth medium |
| FBS | Gibco | 10270106 | |
| Flp-In T-REx 293 cell line | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | R75007 | |
| I-SceI-24x MS2 stem loop sequence | GeneArt, Thermo Fischer Scientific | custom synthesized DNA fragment containing a single I-SceI recognition sequence and 24 tandem MS2 stem loop sequences | |
| Heating Device Humidity 2000 | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
| Hygromycin B | Roche | 10843555001 | |
| Immersion oil Immersol 518 F | Carl Zeiss MicroImaging Inc.) | 444960-0000-000 | |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Lipofectamin 3000 helper reagent P3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | transfection helper reagent |
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | lipid-based transfection reagent |
| MatTek 35 mm dish, Glass bottom No. 1.5 | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | P35G-1.5-10-C | |
| microscope incubation chamber | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
| pcDNA5/FRT/TO | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | V652020 | |
| pOG44 plasmid | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | V600520 | |
| SlideBook 6.0 Software | Intelligent Imaging Innovations Inc. | ||
| stage incubation chamber PeCon P-Set 2000 | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
| StaQtool Software | iMM-JLA Lisbon, Portugal | available at: https://imm.medicina.ulisboa.pt/facility/bioimaging/lib/exe/fetch.php?media=STaQTool_setup.zip | |
| triamcinolone acetonide (TA) | Sigma-Aldrich | T6501 | synthetic glucocorticoid; induces the glucocorticoid receptor to migrate from the cytoplasm to the nucleus |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Thermo Fisher Scientific | R001100 |
References
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Capozzo, I., Iannelli, F., Francia, S., d'Adda di Fagagna, F. Express or repress? The transcriptional dilemma of damaged chromatin. FEBS Journal. 284 (14), 2133-2147 (2017).
- Michelini, F., et al. Damage-induced lncRNAs control the DNA damage response through interaction with DDRNAs at individual double-strand breaks. Nature Cell Biology. 19 (12), 1400-1411 (2017).
- Vítor, A. C., et al. Single-molecule imaging of transcription at damaged chromatin. Science Advances. 5 (1), (2019).
- Michalik, K. M., Böttcher, R., Förstemann, K. A. Small RNA response at DNA ends in Drosophila. Nucleic Acids Research. 40 (19), 9596-9603 (2012).
- Wei, W., et al. A role for small RNAs in DNA double-strand break repair. Cell. 149 (1), 101-112 (2012).
- Francia, S., et al. Site-specific DICER and DROSHA RNA products control the DNA-damage response. Nature. 488 (7410), 231-235 (2012).
- Vítor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: An ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 24 (2020).
- Alt, F. W., et al. Synthesis of secreted and membrane-bound immunoglobulin mu heavy chains is directed by mRNAs that differ at their 3' ends. Cell. 20 (2), 293-301 (1980).
- Watakabe, A., Tanaka, K., Shimura, Y. The role of exon sequences in splice site selection. Genes & Development. 7 (3), 407-418 (1993).
- Guth, S., Martínez, C., Gaur, R. K., Valcárcel, J. Evidence for substrate-specific requirement of the splicing factor U2AF(35) and for its function after polypyrimidine tract recognition by U2AF(65). Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8263-8271 (1999).
- Martin, R. M., Rino, J., Carvalho, C., Kirchhausen, T., Carmo-Fonseca, M. Live-cell visualization of pre-mRNA splicing with single-molecule sensitivity. Cell Reports. 4 (6), 1144-1155 (2013).
- Peabody, D. S. The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein. The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).
- Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
- Chao, J. A., Patskovsky, Y., Almo, S. C., Singer, R. H. Structural basis for the coevolution of a viral RNA-protein complex. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (1), 103-105 (2008).
- Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. M. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
- Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene. Science. 332 (6028), 475-478 (2011).
- Soutoglou, E., et al. Positional stability of single double-strand breaks in mammalian cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 675-682 (2007).
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096 (1994).
- Roukos, V., Voss, T. C., Schmidt, C. K., Lee, S., Wangsa, D., Misteli, T. Spatial Dynamics of Chromosome Translocations in Living Cells. Science. 341 (6146), New York, N.Y. 660 (2013).
- Rino, J., de Jesus, A. C., Carmo-Fonseca, M. STaQTool: Spot tracking and quantification tool for monitoring splicing of single pre-mRNA molecules in living cells. Methods. 98, 143-149 (2016).
- Hamperl, S., Bocek, M. J., Saldivar, J. C., Swigut, T., Cimprich, K. A. Transcription-replication conflict orientation modulates R-Loop levels and activates distinct DNA damage responses. Cell. 170 (4), 774-786 (2017).
- D'Alessandro, G., d'Adda di Fagagna, F. Transcription and DNA Damage: Holding Hands or Crossing Swords. Journal of Molecular Biology. 429 (21), 3215-3229 (2017).
- Boulant, S., Kural, C., Zeeh, J. C., Ubelmann, F., Kirchhausen, T. Actin dynamics counteract membrane tension during clathrin-mediated endocytosis. Nature Cell Biology. 13 (9), 1124-1131 (2011).
