Summary
Dieses Protokoll stellt ein neues Reporter-Gensystem und den Versuchsaufbau zum Nachweis der Transkription bei DNA-Doppelstrangbrüchen mit Einzelmolekülsensitivität vor.
Abstract
DNA-Doppelstrangbrüche (DSB) sind die schwerste Art von DNA-Schäden. Trotz der katastrophalen Folgen für die Integrität des Genoms ist es bisher schwer fassbar, wie DSBs die Transkription beeinflussen. Ein Grund dafür war der Mangel an geeigneten Werkzeugen, um die Transkription und die Induktion eines genischen DSB mit ausreichender zeitlicher und räumlicher Auflösung gleichzeitig zu überwachen. Diese Arbeit beschreibt eine Reihe neuer Reporter, die die Transkription in lebenden Zellen unmittelbar nach der Induktion eines DSB in der DNA-Vorlage direkt visualisieren. Bakteriophagen-RNA-Stammschleifen werden verwendet, um die Transkription mit Einzelmolekülempfindlichkeit zu überwachen. Um das DSB auf eine bestimmte Genregion auszurichten, werden die Reportergene so konstruiert, dass sie eine einzige Erkennungssequenz der Homing-Endonuklease I-SceI enthalten, die sonst im menschlichen Genom fehlt. Eine einzelne Kopie jedes Reportergens wurde in das Genom menschlicher Zelllinien integriert. Dieses experimentelle System ermöglicht den Nachweis einzelner RNA-Moleküle, die durch die kanonische Gentranskription oder durch DNA-Break-induzierte Transkriptionsinitiierung erzeugt werden. Diese Reporter bieten eine beispiellose Gelegenheit, die wechselseitigen Wechselwirkungen zwischen Transkription und DNA-Schäden zu interpretieren und bisher ungeschätzte Aspekte der DNA-Bruch-induzierten Transkription offenzulegen.
Introduction
DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) sind toxische DNA-Läsionen, die die Zellfunktion stören und zum Auftreten mehrerer Krankheiten und zum Altern beitragen1. Mutationen, die aus der ungenauen Reparatur von DSBs resultieren, beeinflussen die Genexpression und bilden die Grundlage für den funktionellen Verfall der Zelle. Die aufkommende Ansicht, dass DSBs die de novo breakinduzierte Transkription an der Läsionsstelle vorantreiben2,3,4,5,6,7 legt nahe, dass DSBs auch die zelluläre Funktion durch bruchinduzierte RNAs beeinflussen können. Mehrere neuere Studien deuten darauf hin, dass DSBs ausreichen, um eine programmierte (z. B. an stimulusinduzierbaren Genen) und ungeplante (z. B. an nicht-kanonischen Promotoren) Transkription zu initiieren4,5,7. Trotz mehrerer Studien, die die Zusammenhänge zwischen DNA-Schäden und Transkription untersuchten, hinkte das Feld jedoch immer noch in seiner Fähigkeit hinterher, eine präzise (d.h. Einzelmolekül-) Charakterisierung der transkriptionellen Ereignisse an DNA-Bruchstellen zu liefern. Ein wichtiger Grund dafür war der Mangel an geeigneten experimentellen Werkzeugen. Zellbestrahlung (γ, Röntgenstrahlen, Schwerionen) und medikamentöse Behandlungen (z. B. Topoisomerase-Inhibitoren oder Interkalationsmittel) sind nicht räumlich präzise und induzieren andere DNA-Läsionen als DSBs, einschließlich Einzelstrangbrüche und DNA-Addukte8. Endonukleasen wie I-PpoI und AsiSI erzeugen lokusspezifische DSBs, wurden jedoch nicht mit einem System kombiniert, das die gleichzeitige Visualisierung der Transkription an einem einzelnen Ort mit hoher zeitlicher Präzision ermöglicht8. Um diese Einschränkung zu umgehen, führte unser Labor die Entwicklung einer Reihe von hochmodernen Reportern an, die die Transkription mit Einzelmolekülauflösung bei der kontrollierten Induktion eines einzigartigen DSB4 direkt visualisieren. Hier beschreiben wir diese Reporter, stellen ein detailliertes Protokoll für die Live-Cell-Bildgebung der Transkription an DSBs zur Verfügung und zeigen Daten, die die Transkriptionsinitiation an einem einzelnen DSB aufdecken.
Die in diesem Protokoll verwendeten Reporter-Gensysteme basieren auf dem gut charakterisierten Maus-IgM-Reporter-Gen und enthalten die Exons M1 und M2 der membrangebundenen Form (μm) der IgM-μ schweren Kette9,10,11. Ein Hybrid-Intron trennt die beiden Exons mit dem starken Adenovirus Major Late Transcript (AdML) PY tract12. Die Expression der Reportergene wird durch den humanen Cytomegalovirus-Promotor (CMV) gesteuert, in den zwei Tandemkopien der Tet-Operator-Sequenz (TetO) eingefügt wurden. Die Reportergene werden jeweils in einen Plasmidvektor eingefügt, der eine FLP-Rekombinationszielstelle (FRT) enthält, und in eine spezifische FRT-Zielstelle im Genom einer HEK293-Wirtszelllinie eingefügt. Diese Zelllinie exprimiert auch konstitutiv das Tet-Repressorprotein, um die Expression des Reportergens durch die Anwesenheit oder Abwesenheit von Tetracyclin / Doxycyclin zu regulieren. Um die Visualisierung der Reporter-Gentranskription zu ermöglichen, wurden 24 Tandemwiederholungen der MS2-Stammschleifensequenz und 24 Tandemwiederholungen der PP7-Stammschleifensequenz an verschiedenen Positionen in Bezug auf die Transkriptionsstartstelle und die Exon/Intron-Struktur des Reportergens eingefügt. Die MS2/PP7-RNA-Stammschleifen bilden sich bei der Transkription und werden spezifisch durch ektopisch exprimierte MS2/PP7-Mantelproteine gebunden, die mit grün und rot fluoreszierenden Proteinen markiert sind, eine Strategie, die vor der Bildtranskription weit verbreitet war13,14,15. Darüber hinaus wurde eine einzelne Kopie der 18 bp-Erkennungssequenz für die Homing-Endonuklease I-SceI eingefügt, die direkt von den RNA-Stamm-Schleifen-Sequenzarrays in den Reportergenen flankiert wird. Standard-Klonierungstechniken wurden verwendet, um alle Plasmide zu erzeugen, das Fragment, das die I-SceI-24xMS2-Stammschleife des PROP-Reportergens enthielt, wurde von einem kommerziellen Gensynthesedienst synthetisiert.
Das Promotor-proximale DSB-Reporter-Gen (PROP) wurde konstruiert, indem die I-SceI-Schnittstelle 45 Basenpaare (bp) stromabwärts der mutmaßlichen Transkriptionsstartstelle in Exon I eingefügt wurde, gefolgt von 149 bp bis zum Start der 24x MS2-Stammschleifenkassette, die de novo mit zwei abwechselnden, nicht identischen Stammschleifensequenzen entworfen wurde16 und zusätzliche fünf sich nicht wiederholende 20-bp-Abstandshaltersequenzen, um Redundanz zu reduzieren. Auf das MS2 Stem-Loop-Array folgen 72 bp bis zum Beginn des 1844 bp Introns und das 1085 bp Exon II bis zur Spaltungs- und Polyadenylierungsstelle. Das Exon II kodiert für ein cyanfarbenes fluoreszierendes Protein (CFP), das mit einer C-terminalen peroxisomalen Targeting-Sequenz (PTS) aus der humanen peroxisomalen Acyl-CoA-Oxidase fusioniert ist, um ein unabhängiges Screening der Reportergenexpression zu ermöglichen (Abbildung 1A).
Das Exon II DSB-Reportergen (EX2) besteht aus einem 167 bp Exon I, gefolgt vom Intron und Exon II, die für das CFP-PTS kodieren. Weiter stromabwärts wurde in einem Abstand von 169 bp eine Kassette mit 24x MS2-Stem-Loops eingefügt, gefolgt von einer 84 bp Linkersequenz mit einer I-SceI-Stelle in der Mitte, gefolgt von 24x PP7-Stammschleifen und 221 bp bis zur Spaltungs- und Polyadenylierungsstelle17 (Abbildung 1B).
Schließlich basiert das Exon II DSB-Reportergen mit Antisense-Transkriptionsmarkierung (EX2AS) auf dem humanen Ubiquitin B (UBB)-Gentranskript UBB-201 und enthält zwei Exons und ein Intron. Das Exon I hat eine Gesamtlänge von 1534 bp mit einer inversen Insertion der 24x MS2 Stem-Loop-Sequenz. Daher wird die korrekte MS2-Stammschleifen-RNA-Sequenz in eine Antisense-Richtung in Bezug auf die Sinnestranskription des Reportergens vom CMV-Promotor transkribiert. Das Intron hat eine Länge von 490 bp, gefolgt von Exon II mit der I-SceI-Stelle , und eine kodierende Region wurde für zwei In-Frame-Ubiquitin-Untereinheiten eingefügt. Stromabwärts des UBB-Gens befindet sich eine Sequenz, die bei der Transkription des Reportergens in eine Sinnesrichtung eine 24x PP7-Stammschleife bildet (Abbildung 1C).
Die transiente Transfektion eines induzierbaren Konstrukts der Homing-Endonuklease I-SceI ermöglicht die kontrollierte Erzeugung eines DSB an der eingefügten Erkennungsstelle innerhalb jedes Reportergens18. Die I-SceI-Endonuklease ist im Rahmen mit der ligandenbindenden Domäne des Glukokortikoidrezeptors und einem weit rot fluoreszierenden Protein iRFP713 verschmolzen. Dieses Konstrukt ist in Abwesenheit von Triamcinolonacetonid (TA) zytoplasmatisch, wandert aber bei Zugabe von TA zum Wachstumsmedium der Zellen schnell in den Zellkern ein (Abbildung 1D). Die Induktion von DSBs durch das I-SceI-System ist robust, wie vor 18,19,20 gezeigt. Die Reporter-Gentranskription kann parallel überwacht werden, indem die fluoreszierend markierten RNA-Stammschleifensysteme MS2 und PP7 visualisiert werden.
Protocol
1. Präparation und Transfektion von Zellen für die Lebendzellmikroskopie
- Bereiten Sie einen 25 cm2 Zellkulturkolben der Reporterzelllinie (EX2, EX2-AS oder PROM) mit 5 ml DMEM vor, um am Tag vor dem Lebendzellmikroskopieexperiment eine Konfluenz von 80-90% zu erreichen.
- Das Medium mit einer Pipette aus dem 25 cm2 Zellkulturkolben absaugen und die Zellen mit 2,5 ml 1x PBS waschen.
- 1 ml Trypsin-EDTA (0,05 %) zugeben und bei 37 °C für 2-3 min zur Zellablösung inkubieren.
- Nach der Zellablösung 4 ml DMEM ohne phenolrothaltigen HEPES-Puffer, ergänzt mit 10% (v/v) holzkohleabisoliertem fötalem Rinderserum, und vorsichtig resuspendieren Sie die Zellen.
- Platte 1 mL der Zelllösung in einer 35 mm runden Schale mit 10 mm Glasbodenmulde (Durchmesser Nr. 1,5) und homogenisieren. Lagern Sie die 35 mm runde Schale in einer 100 mm Standard-Zellkulturschale und inkubieren Sie sie bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO2.
- ~ 6 h nach der Aussaat die Zellen in der Glasbodenschale transfizieren. Bereiten Sie für jedes Transfektionsgemisch zwei Lösungen auf folgende Weise vor:
- In einem 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen Lösung A herstellen, die 150 μL reduziertes Serum minimal essential medium (MEM), Plasmid-DNA (wie in Tabelle 1 beschrieben) und 2,5 μg/μL DNA des Transfektionshilfsmittelreagenzes enthält (siehe Materialtabelle).
- Bereiten Sie parallel Lösung B vor, die 150 μL MEM mit reduziertem Serum und 1,5 μg/μL DNA eines lipidbasierten Transfektionsreagenzes enthält (siehe Materialtabelle).
- Inkubieren Sie beide Lösungen bei Raumtemperatur (RT) für 5 min. Dann vorsichtig Lösung A zu Lösung B geben und 20 min bei RT inkubieren.
- Um die Zellen zu transfizieren, geben Sie 300 μL Lösung A + B tropfenweise zu jeder Schüssel und verteilen Sie sie vorsichtig. Lagern Sie die Glasbodenschale in einer 100 mm Standard-Zellkulturschale und inkubieren Sie sie bei 37 °C in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO2.
- Bereiten Sie ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 200 μL DMEM mit HEPES vor, ohne Phenolrot, ergänzt mit 10% (v/v) Holzkohle-gestreiftem fötalem Rinderserum, und fügen Sie TA zu einer Konzentration von 7,5 x 10-7 M hinzu.
2. Versuchsaufbau
- Stellen Sie die Temperatur der großen Plexiglasmikroskop-Inkubationskammer und der obersten Inkubationskammer am gemeinsamen Steuergerät auf 37 °C ein. Stellen Sie die Umgebungsbedingungen in der Inkubationskammer der Bühne auf 5% CO2 und 100% Luftfeuchtigkeit ein.
HINWEIS: Die Temperatur des Mikroskopkäfigs und des Bühneninkubators muss mindestens 1 h vor Beginn des Experiments eingestellt werden, damit das gesamte System erwärmt werden kann, um Temperaturschwankungen zu minimieren. Starten Sie alle anderen Mikroskopsteuerungs- und Bedieneinheiten gleichzeitig. - Induzieren Sie die Transkription der Reportergene, indem Sie Doxycyclin (0,5 μg / ml) zum Wachstumsmedium hinzufügen und vorsichtig mischen, indem Sie mit einer 200 μL-Mikropipette ~ 1 h auf und ab pipettieren, bevor Sie mit der Mikroskopiebeobachtung beginnen.
HINWEIS: Bewahren Sie die Glasbodenschale mit den transfizierten Zellen in einer 100 mm Standard-Zellkulturschale auf, um die Handhabung und den Transport von der Zellkultur in den Mikroskopraum in einem Styroporbehälter zu erleichtern, um die Temperatur so stabil wie möglich zu halten. - Transportieren Sie die Zellen mindestens 30 Minuten vor Beginn der Beobachtung zum Mikroskop und stellen Sie bei der Ankunft die 100-mm-Schale mit den Zellen sofort in die vorgewärmte große Mikroskop-Inkubationskammer.
- Legen Sie das Mikrozentrifugenröhrchen mit der vorverdünnten TA aus Schritt 1.7. in der großen Mikroskop-Umgebungskammer zur Erwärmung auf bis zu 37 °C.
- Ersetzen Sie den Deckel der Glasbodenschale ähnlich dem zuvor vorbereiteten durch ein in den Deckel gebohrtes Loch mit einem Durchmesser von 3 mm (Abbildung 2A).
HINWEIS: Der TA wird später durch das kleine Loch im Deckel zu den Zellen hinzugefügt, ohne die auf dem Mikroskoptisch montierte Schüssel zu manipulieren. - Wählen Sie das 100-fache (apochromatisches Objektiv, 1,4 numerische Apertur) Ölimmersionsobjektiv im Mikroskopbedienfeld aus. Tragen Sie einen Tropfen Tauchöl auf das Objektiv auf.
- Stellen Sie die Glasbodenschale mit den Zellen in die Inkubationskammer der Mikroskopstufe und verriegeln Sie sie. Schließen Sie den Deckel des Bühneninkubators und alle Türen des Mikroskopgehäuses.
- Starten Sie die Betriebs- und Steuerungssoftware für das Mikroskop, öffnen Sie das Fenster "Fokussteuerung " (Abbildung 2B), klicken Sie auf den Bereich "Umfang " und klicken Sie im Bereich "Emissionsauswahl " auf das Feld "100 % Auge ", um den Augenstrahlpfad für die direkte Probenbeobachtung mit dem Auge festzulegen.
- Wechseln Sie im Menü Filtersatz zu Augenfiltersatz , klicken Sie auf Hellfeld, und drücken Sie die Schaltfläche Hellfeld öffnen .
- Bewegen Sie das Mikroskopobjektiv in Richtung der Glasbodenschale, bis das Öl das Glas berührt. Schauen Sie dann durch die Augen und konzentrieren Sie sich manuell auf die Ebene der Zellen. Schalten Sie die Schaltfläche Brightfield öffnen aus.
- Lassen Sie die Zellen vor Beginn der experimentellen Beobachtungen 30 Minuten stehen, um sich an die Umgebungsbedingungen anzupassen und eine fokale Drift während der Bildgebung durch Temperaturgradienten zu verhindern.
- Legen Sie eine 200 μL Mikropipette und 200 μL Filterspitzen bei Raumtemperatur gebrauchsfertig beiseite.
3. Bildaufnahme
- Stellen Sie im Fenster Fokussteuerung der Mikroskopsteuerungssoftware die Laserintensität auf 5 % ein und geben Sie einen Wert von 50 ms für die Belichtungszeit ein (Abbildung 2B).
- Öffnen Sie das Aufnahmefenster , um die Einstellungen für eine automatisierte Bilderfassung von dreidimensionalen (3D) Zeitraffern anzupassen (Abbildung 2C).
- Wählen Sie den 3D-Erfassungstyp aus und setzen Sie 12 bis 16 optische Scheiben, die durch 0,4 μm getrennt sind, aktivieren Sie die Kontrollkästchen Bereich um Strom und Zurück zur aktuellen Position nach der Aufnahme.
- Geben Sie im Bereich Zeitraffererfassung den Wert 120 für die Anzahl der Zeitpunkte und 30 s für das Intervall ein.
- Wählen Sie den konfokalen Filterset entsprechend den transfizierten fluoreszierenden Proteinmarkierungen mit λ = 488 nm für GFP, λ = 561 nm für TagRFPt und λ = 640 nm für iRFP713 und stellen Sie die Belichtungszeit für jeden Kanal auf 50 ms ein.
- Verwenden Sie die Einstellung Strom für die Laserleistung, um den im Fokusfenster ausgewählten Wert von 5 % zu verwenden (Abbildung 2C).
- Wechseln Sie im Fenster Fokussteuerung zum Bereich Kamera , wählen Sie das Steuerelement Bildanzeige skalieren aus, und klicken Sie auf die Schaltfläche Manuell , um einen festen Bereich der anzuzeigenden Bildintensitäten festzulegen. Geben Sie Werte für Niedrig: 500 und Hoch: 5000 ein (siehe Abbildung 2B).
HINWEIS: Diese Einstellung schränkt den Dynamikbereich der in der Live-Ansicht angezeigten Kameraaufnahme ein, um Zellen innerhalb desselben Fluoreszenzintensitätsbereichs auszuwählen (Abbildung 2D). - Selektieren Sie die Zellen für die 3D-Zeitraffer-Bildgebung von Transkriptionsstellen bei Induktion eines DSB. Überprüfen Sie die Zellen, und wählen Sie drei Ansichtsfelder entsprechend den in der Diskussion beschriebenen Bedingungen aus.
- Fokussieren Sie jede ausgewählte Zelle, die sich zuvor in der Mitte des Sichtfeldes befand, mit der Transkriptionsstelle in der mittleren Ebene des Z-Stapels.
HINWEIS: Die Zentrierung der Zelle und der Transkriptionsstelle in XYZ ermöglicht eine gewisse Bewegung der Zelle. - Markieren Sie jede XYZ-Position im Bereich XY des Fensters Fokussteuerung , indem Sie auf Sollwert (Set Point) klicken.
HINWEIS: Wiederholen Sie die ausgewählten Positionen 2-3 Mal in den folgenden 5 Minuten, um die kontinuierliche Transkription der Reportergene und die relative Positionsstabilität der Positionen der Zellen in XYZ-Dimensionen zu bestätigen. - 200 μL der vorverdünnten TA aus Schritt 1.7 zugeben. zu den Zellen, wie in Abbildung 2F dargestellt.
HINWEIS: Achten Sie beim Hinzufügen des TA darauf, die Glasbodenschale oder den Deckel nicht zu berühren, um eine Verschiebung von den markierten XY-Positionen zu verhindern. Vergewissern Sie sich nach der DSB-Induktion, dass die Zellen im Sichtfeld zentriert sind und sich die Transkriptionsstelle in der mittleren Z-Ebene befindet. Die Neufokussierung und Positionsaktualisierung sollte nicht länger als 1-2 Minuten dauern. - Starten Sie die 3D-Zeitreihenbildgebung, indem Sie im Aufnahmefenster auf Start klicken.
- Speichern Sie die Bilddaten im Datenformat der Mikroskopsteuerungssoftware auf der Festplatte des Mikroskopsteuerungscomputers.
4. Datenanalyse
- Öffnen Sie die Bilddaten in der Mikroskopsteuerungssoftware und exportieren Sie sie als Dateien im 16-Bit-TIFF-Format.
- Öffnen Sie die exportierten Dateien mit der StaQtool21 Software. Wählen Sie den Single Spot 3D-Modus und laden Sie die Bilddateien durch Drücken von Go.
HINWEIS: Die ausgewählte Zeitreihe wird im Max Projection Timelapse Viewer geöffnet und zeigt eine maximale Intensitätsprojektion des Z-Stacks des ersten Zeitpunkts an (Abbildung 3A). - Passen Sie die Anzeige der Bildintensität mit dem vertikalen MAX-Schieberegler auf der linken Seite an.
- Wählen Sie den zu analysierenden Zeitpunkt mit dem horizontalen Zeitpunktschieberegler aus.
- Bewegen Sie den Cursor auf die Position der beschrifteten Transkriptionsstelle zum manuellen Markieren oder verwenden Sie die Auto-Detect-Funktion und drücken Sie auf die jeweilige Transkriptionsstelle, wenn mehrere Objekte erkannt wurden.
- Verwenden Sie die Auto Track-Funktion , um die XYZ-Positionen der Transkriptionsstelle im Laufe der Zeit zu bestimmen.
HINWEIS: Wenn eine bestimmte Position nicht korrekt verfolgt wurde, wählen Sie die Transkriptionsstelle manuell gemäß dem StaQtool-Softwarehandbuch aus. - Drücken Sie die Auto-Taste , um die Gaußanpassung für jeden Zeitpunkt durchzuführen und die Gesamtfluoreszenzintensität (TFI) zu messen.
HINWEIS: Wenn die Transkriptionsaktivität aufhört, verbleibt das Tracking-Tool an der letzten Position, an der ein beugungsbegrenztes Objekt (eine markierte Transkriptionsstelle) erkannt wurde. Wenn sich die Zelle nach dem Verschwinden der Transkriptionsstellenbezeichnung in XY-Richtung bewegt, ist eine manuelle Neupositionierung des Suchquadrats erforderlich. - Nachdem Sie die Anpassung des TFI-Werts für jeden Zeitpunkt abgeschlossen haben, drücken Sie die Schaltfläche Zeitraffer beenden , um die aktuelle Zeitreihenbilddatei zu schließen und mit der nächsten Datei fortzufahren.
HINWEIS: Die TFI-Werte werden automatisch exportiert und in einer Excel-Datei gespeichert.
5. Mikroskopie Kalibrierung Messungen und Analyse
- Samenzellen in 35 mm Glasbodenschalen und transfizieren mit den fluoreszierend markierten MS2- und PP7-Mantelproteinen, wie in Abschnitt 1 beschrieben.
HINWEIS: Verwenden Sie für die Kalibrierungsmessungen die gleichen Reporter-Genzelllinien, die in der Einleitung beschrieben sind. - 0,5 μg/ml Doxycyclin 1 h in das Wachstumsmedium der Zellen geben, bevor mit der mikroskopischen Bildaufnahme begonnen wird.
- Montieren Sie die Glasbodenschale in der Inkubationskammer der Mikroskopstufe und bereiten Sie die Bildaufnahme wie bisher vor (siehe Abschnitt 2).
HINWEIS: Der Originaldeckel der Glasbodenschale wird für die Kalibrierungsexperimente nicht ausgetauscht. - Verwenden Sie die gleichen Laserintensitäts- und Belichtungseinstellungen wie in Nummer 3.1 beschrieben.
- Legen Sie die Aufnahmeeinstellungen für 2D-Zeitreihen fest (deaktivieren Sie die Option 3D im Bereich "Aufnahmetyp ") und legen Sie im Zeitraffererfassungsfenster 120 Zeitpunkte in Abständen von 500 ms fest (Abbildung 2C).
HINWEIS: Diese Bildaufnahmeeinstellung führt zu Zeitreihen innerhalb einer einzelnen optischen Ebene in sehr kurzen Intervallen. - Erfassen Sie Dutzende von Kalibrierungszeitreihen von mehreren Positionen, um Datensätze zu generieren, um mehrere hundert einzelne Transkripte TFI-Messungen zu zählen.
- Für die Analyse der Kalibrierzeitreihen konvertieren Sie die Dateien in Dateien im 16-Bit-TIFF-Format gemäß Punkt 4.1.
- Öffnen Sie die exportierten Dateien mit der StaQtool21 Software (Abbildung 3). Drücken Sie die Schaltfläche LOG-Datei auswählen , wählen Sie die Protokolldatei der jeweiligen 2D-Zeitreihe, die wie in Punkt 4.2 beschrieben erfasst wurde.
- Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Multiple Spots 2D und drücken Sie die GO-Taste , um die Zeitreihe in die Analysesoftware zu laden.
- Im Zeitraffer-Viewer-Fenster (Abbildung 3A) wird im PSF-FWHM im Eingabefeld der für das Mikroskopsystem und das Objektiv berechnete Wert wie beschrieben eingefügt21.
- Um den Analyseprozess zu starten, drücken Sie die Taste Automatische Erkennung , um alle beugungsbegrenzten Objekte für den aktuell angezeigten Zeitpunkt zu erkennen. Klicken Sie dann auf AutoAnpassung , um das Gaußsche Fitting auszuführen und den TFI-Wert für jedes Objekt zu bestimmen (Abbildung 3A).
- Alternativ können Sie den Cursor über ein beugungsbegrenztes Objekt bewegen und klicken, um es auszuwählen (grüner Kreis innerhalb eines weißen Quadrats wird angezeigt), und drücken Sie die Gaußsche Anpassungstaste für die manuelle Auswahl und das Gaußanpassungsverfahren.
HINWEIS: Der letzte Modus wird empfohlen, um Objekte auszuschließen, die nicht gezählt wurden, z. B. helle Transkriptionsstellen mit mehreren entstehenden Transkripten, die im selben Kern vorhanden sind. - Drücken Sie die Taste Zeitraffer beenden , um den vorherigen Schritt abzuschließen.
Hinweis: Die Ergebnisse werden automatisch in einem Microsoft Excel-Dateiformat im selben Ordner wie die Bilddatei gespeichert. - Starten Sie das Modul TFI und W Distributions für mehrere Spots durch Drücken der entsprechenden Taste (Abbildung 3B).
- Laden Sie Excel-Dateien über den Button Datei hinzufügen und starten Sie die TFI-Analyse durch Drücken der Go-Taste.
HINWEIS: Die Ausgabe ist der mittlere TFI-Wert, der aus mehreren gemessenen einzelnen Transkript-TFIs bestimmt wird. - Beginnen Sie die W-Analyse, indem Sie die zuvor in Punkt 5.10 verwendete PSF-FWHM einfügen. und drücken Sie die Schaltfläche Gehe zu mit dem Standardwert für den Papierkorb.
HINWEIS: Der W-Parameter ist die Qualitätskontrolle für die TFI-Messungen mit einem einzigen Transkript, um den korrekten PSF-FWHM-Wert für das verwendete Mikroskopsystem einzuhalten.
6. Zusammenführung von Daten und Kalibrierung
- Geben Sie die TFI-Werte der Zeitreihe ein, die sie aus der in Nummer 4.8 gespeicherten Excel-Tabelle erhalten haben. in ein neues Excel-Blatt und dividieren Sie jeden Zeitpunktwert durch den mittleren TFI für einzelne Transkripte gemäß Nummer 5.15.
HINWEIS: Zur Standardisierung dieses Prozesses wurden benutzerdefinierte Excel-Vorlagenformulare verwendet.
Representative Results
Die Zelllinien, die die in Abbildung 1A-C beschriebenen Reportergene beherbergen, ermöglichen die Untersuchung der Transkriptionsdynamik an einem einzigen DSB in lebenden Zellen. Die Zahlen in Abbildung 1A-C unter jeder grafischen Reportergendarstellung geben die Länge in Kilobase-Paaren (kbp) an. CMV gibt den Cytomegalovirus-Promotor an, TetO sind die Tet-Operator-Sequenzen, pA hebt die 3'-Spaltungs- und Poly-Adenylierungsstelle am Genende hervor. CFP-PTS ist das kodierte Cyan-Fluoreszenzprotein, das zu einem peroxisomalen Zielsignal fusioniert ist, und 2UBB ist die kodierte menschliche Ubiquitin-B-Tandemeinheit. Durch Befolgen der oben beschriebenen Protokoll- und Analyseverfahren ist es möglich, Diagramme zu erhalten, die die Anzahl der fluoreszenzmarkierten Reporter-Gentranskripte im Laufe der Zeit mit einer zeitlichen Auflösung von Sekunden über Zeiträume von bis zu Stunden anzeigen (Abbildung 4A-D). Die Grafik in Abbildung 4A zeigt den zeitlichen Verlauf der TFI-Werte einer PROM-Reporter-Gentranskriptionsstelle, die durch die Akkumulation von MS2-GFP-Molekülen auf entstehenden Transkripten gekennzeichnet ist. Dieser spezielle Graph stellt ein Kontrollexperiment ohne TA-Addition dar; daher wird kein DSB induziert. Die Transkription wird mit burstartigen Peaks und 2-8 Transkripten gleichzeitig über den gesamten Beobachtungszeitraum von 60 min fortgesetzt. Ähnliche Ergebnisse wurden für die EX2- und EX2-AS-Reportergene erzielt (Daten hier nicht gezeigt)4. Die Induktion eines einzelnen DSBs in den Reportergenen (unter Verwendung von I-SceI-GR-iRFP) ermöglicht die Untersuchung des Einflusses des DSB auf die laufende Reporter-Gentranskription und die Überwachung von Transkriptionsereignissen, die von der DSB-Stelle ausgehen, nämlich der breakinduzierten Transkription (Abbildung 4B-D).
Die Dynamik der DNA-Bruch-induzierten Transkription hängt von der Position des DSB innerhalb des Gens ab
Die Induktion eines einzelnen DSB durch I-SceI-GR-iRFP im Reportergen mit einer Promotor-proximalen I-SceI-Erkennungsstelle führt nach etwa 11 min nach TA-Zugabe zu einem transkriptionellen Stummschalten des Reportergens, und die Transkription wird innerhalb des Beobachtungszeitraums von 60 Minuten nicht wiederhergestellt (Abbildung 4B). Bei der Beobachtung der EX2-Reporter-Gentranskription wurde eine vollständige Unterdrückung der kanonischen promotorgetriebenen Transkription durch einen gleichzeitigen vollständigen Verlust von MS2-GFP- und PP7-RFP-Signalen etwa 30 min nach TA-Addition nachgewiesen. Innerhalb von 10 Minuten beginnt die Transkription jedoch neu, wie die wieder auftretenden Peaks der PP7-RFP-Fluoreszenz zeigen. Die vollständige Wiederherstellung des PP7-RFP-Signals (und nicht der MS2-GFP-Fluoreszenz) zeigt eine bruchinduzierte Transkriptionsinitiation (Abbildung 4C). Die bruchinduzierte Transkription ist über lange Zeiträume nicht stabil; es erscheint burstartig und mit niedriger Spitzenintensität, was darauf hindeutet, dass nur wenige bruchinduzierte Transkripte von der DSB-Site initiiert wurden.
Das EX2AS-Reportergen, das ein 24x PP7-Stammschleifen-Array in Exon II stromabwärts der I-SceI-Stelle enthält, um die Sinnestranskription nachzuweisen, zeigt die kanonische promotorgesteuerte Transkription, die innerhalb des EX2AS-Reportergens innerhalb von etwa 25 minuten nach TA-Addition endet. Es wird dann durch eine Antisense-Break-induzierte Transkription ersetzt, wie die Akkumulation von MS2-GFP-Proteinen zeigt, die an RNA binden, die aus Antisense-MS2-Stammschleifensequenzen generiert wurden (Abbildung 4D). Die Antisense-Transkriptionsaktivität fehlte vor der Unterbrechung der Sinnestranskription aufgrund der Induktion des DSB und zeigt in diesem Beispiel, dass mehrere Transkripte innerhalb von etwa 15 min von der Breakstelle initiiert wurden. Die hier gewonnenen repräsentativen Daten zeigen, dass DSBs je nach ihrer Lage innerhalb des Gens unterschiedliche Auswirkungen auf die Transkription haben, wie kürzlich berichtet wurde4. Die Daten zeigen auch eine Zell-zu-Zell-Variabilität im Timing der DSB-Induktion durch I-SceI-GR-iRFP, die zwischen 12 und 30 minuten nach TA-Addition liegt. Darüber hinaus ermöglicht der Nachweis einzelner Transkripte die Entdeckung von Zell-zu-Zell- und Break-Site-Unterschieden in Richtung der Intensität der breakinduzierten Transkriptionsaktivität. Die bruchinduzierte Transkription wird nur an DSBs innerhalb des Gens nachgewiesen. Es fehlt an Promotor-proximalen DSBs, wo die kanonische Transkription bei einem DSB für den verbleibenden Beobachtungszeitraum aufhört.
Abbildung 1: Reportergene und das System zur Induktion von DNA-Doppelstrangbrüchen. Die schematische Darstellung in (A) bis (C) zeigt die Struktur der drei Reportergene, die zur Untersuchung der Transkription bei Induktion eines DNA-Doppelstrangbruchs verwendet werden. Das Reportergen mit der Promotor-proximalen I-SceI-Stelle im ersten Exon (PROM), das stromabwärts von einem 24x MS2 Stem-Loop (MS2-SL) Sequenzarray flankiert wird, ist in (A) dargestellt. Das Reportergen mit der I-SceI-Stelle im zweiten Exon (EX2), flankiert stromaufwärts mit einer 24x MS2-Stem-Loop-Sequenz und stromabwärts durch ein 24x PP7 Stem-Loop (PP7-SL) Array ist in (B) dargestellt. Das Reportergen mit der I-SceI-Stelle in Exon II mit einer antiparallelen Insertion der 24x MS2-Stammschleifensequenz vor der I-SceI-Stelle zum Nachweis der Antisense-Transkription (EX2-AS) ist in (C) dargestellt. Die Funktion des I-SceI-GR-iRFP-Fusionsproteinkonstrukts wird in (D) durch eine grafische Darstellung und entsprechende Bilder lebender Zellen unten dargestellt. Bei vorübergehender Expression des Konstrukts (rote Farbe) in den Reporter-Genzelllinien ist das Protein ausschließlich zytoplasmatisch, was eine vorzeitige Spaltung der Zielstelle durch die I-SceI-Endonuklease verhindert. Nach Zugabe von TA beginnt das Fusionsprotein in den Zellkern zu wandern (angezeigt durch eine gestrichelte Linie) und beginnt sich zwischen 5-15 min anzusammeln. Scalebar = 10 μm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Auswählen von Zellen für die 3D-Zeitrafferdarstellung von Transkriptionsstellen. Das Foto in (A) zeigt eine 35-mm-Glasbodenschale, die für die Lebendzellbildgebung verwendet wird, mit einem speziell modifizierten Deckel, in den ein Loch von 3 mm Durchmesser gebohrt wurde, um das im Wachstumsmedium verdünnte TA direkt hinzuzufügen. Die Lochposition ist mit einem roten Kreis markiert. Das Bedienfeld in (B) zeigt einen Screenshot des "Fokus" -Fensters der Mikroskopsteuerungssoftware, um die Live-View-Belichtungszeit, die Filtereinstellung, die Laserintensität und die Skalierungsbildanzeige einzurichten, um nach Zellen für die nachfolgende Zeitraffer-Bildgebung in (C) zu suchen, den Screenshot des entsprechenden "Capture" -Fensters, um alle Einstellungen für die 3D-Zeitraffererfassung von lebenden Zellen anzupassen. Die spezifischen Einstellungen für die Bereiche Filter, Aufnahmetyp, Zeitraffererfassung und 3D-Erfassung werden in Abschnitt 3 beschrieben. In der hier gezeigten Ansicht werden die Einstellungen angepasst, um einen 3D-Zeitraffer der PROM-Reporter-Genlinie zu erfassen, die mit den MS2-GFP- und I-SceI-GR-iRFP-Konstrukten für die bildgebende Transkription bei Induktion eines DNA-Doppelstrangbruchs in der Promotor-Proximal-Region des Reportergens transfiziert wurde. Das Bild in (D) wird für die GFP- und iRFP-Kanäle zusammengeführt und zeigt ein Sichtfeld, wie es durch das Mikroskopsystem gesehen wird, mit mehreren Zellen der 293-PROM-Reporter-Gen-Zelllinie. Die Zellen wurden mit dem Tandem-Dimer-MS2-Mantelproteinkonstrukt kotransfiziert, das mit einer Kernlokalisierungssequenz, zwei grün fluoreszierenden Proteinen (GFP-MS2CP) und dem I-SceI-GR-iRFP-Konstrukt fusionierte. Mehrere Zellen zeigen die Expression des GFP-MS2CP-Konstrukts, wodurch die Kerne und das I-SceI-GR-iRFP-Konstrukt hervorgehoben werden, das das Zytoplasma hervorhebt. Das gestrichelte Quadrat zeigt den vergrößerten Bereich an, der in (E) angezeigt wird. Für die 3D-Zeitraffer-Bildgebung werden Zellen nach den in der Diskussion genannten Anforderungen ausgewählt, wie z.B. die Zelle mit dem größeren Kern im vergrößerten Bereich in (D). Diese Zelle ist mit beiden fluoreszierenden Konstrukten transfiziert und zeigt eine hell markierte Transkriptionsstelle (Pfeilspitze), indem sie das GFP-MS2CP auf de novo transkribierten Reportergenen vor mRNAs akkumuliert (linkes Bild). Das Wachstumsmedium der Zellen enthält keine TA; daher ist das I-SceI-GR-iRFP-Konstrukt ausschließlich zytoplasmatisch (rechtes Bild). In (F) ist die Glasbodenschale in der Inkubationskammer der Mikroskopstufe für 3D-Zeitraffer-Bildgebungsexperimente montiert und mit dem kundenspezifischen Deckel ausgestattet, der das TA-Ladeloch enthält. Die 200 μL Mikropipettenspitze wird vorsichtig in das Loch eingeführt, um die verdünnte TA auf das Wachstumsmedium der Zellen aufzutragen. Scalebar = 10 μm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Bilderfassungs- und Analysesoftware. Das Bedienfeld in (A) zeigt einen Screenshot des STaQTool: Spot Tracking and Quantification Tool. Das Bild zeigt eine Beispiel-Zeitreihe der PROM-Reporter-Genzelllinie mit einer beschrifteten Transkriptionsstelle, die mit einem grünen Kreis / weißen Quadrat in der Projektionsanzeige mit maximaler Intensität in der Mitte markiert ist. Die Fenster auf der rechten Seite zeigen eine vergrößerte Ansicht des ausgewählten Transkriptionsstellenspots, das entsprechende 3D-schattierte Intensitätsflächendiagramm mit dem 2D-Gauß-Fit-Gitter für den aktuellen Zeitpunkt sowie Diagramme der Transkriptionsstelle Punkt Z-Position innerhalb des Z-Stapels, der Gaußschen Anpassungsbreite (W) und der TFI-Messung im Zeitverlauf. Das mikroskopische Bild in (B) zeigt eine gezoomte einzelne optische Ebene eines Kerns einer PROM-Reporter-Genzelllinie, die mit MS2-GFP transfiziert ist. Das Bild stellt einen einmaligen Zeitpunkt einer 2D-Kalibrierungszeitreihe mit 120 Zeitpunkten dar. Der Kern zeigt mehrere fluoreszenzmarkierte Transkripte, die als beugungsbegrenzte Objekte im Nukleoplasma (markiert durch weiße Quadrate) erscheinen. Das rechte Seitenfeld zeigt einen Screenshot des TFI- und W-Verteilungswerkzeugs im STaQTool, um mehrere Spots in 2D-Zeitrafferaufnahmen zu analysieren. In dieser Beispielanalyse entdeckte das Tool 408 beugungsbegrenzte Flecken, die Reporter-Gentranskripte darstellen, die mit MS2-GFP markiert sind und im Nukleoplasma diffundieren. Die Diagramme auf der rechten Seite zeigen die TFI- und Gaußsche Anpassungsbreitenverteilungshistogramme der Objekte und die Gaußschen Anpassungskurven an. Die TFI- und W-Mittelwerte, die sich aus der Position des Mittelpeaks der Gaußschen Fit-Kurve und den berechneten Konfidenzintervallen ableiten, werden im jeweiligen Bereich angezeigt. Scalebar = 10 μm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Repräsentative Ergebnisse des Transkriptionsnachweises an Stellen von DNA-Doppelstrangbrüchen. Die Graphen in (A) bis (D) stellen die kalibrierte TFI-Kurve einer Transkriptionsstelle im Laufe der Zeit dar. Die TFI-Werte werden unter Verwendung des mittleren TFI einzelner Transkripte, die in den Kalibrierexperimenten für das jeweilige Reportergenkonstrukt gemessen wurden, und des fluoreszenzmarkierten RNA-Stammschleifen-bindenden Proteins MS2 oder PP7, das im jeweiligen Experiment verwendet wird, in Transkripte umgewandelt. In (A) ist eine Grafik aus einem Kontrollexperiment mit dem PROM-Reportergen ohne TA-Addition dargestellt. Transkripte, die mit MS2-GFP markiert sind, zeigen eine kontinuierliche Transkriptionsaktivität über den gesamten Beobachtungszeitraum an. Die Grafik in (B) stellt das PROM-Reportergen bei TA-Addition und Induktion eines DSB dar, was zu einer Unterdrückung der Transkription für die verbleibende Beobachtungszeit führt. Der EX2-Reporter-Gengraph in (C) zeigt eine Transkriptionsunterdrückung der kanonischen Promotor-gesteuerten Transkription bei TA-Addition. Später im selben Zeitraffer taucht nur die PP7-RFP-markierte Transkriptionsaktivität auf. In der Grafik in (D) wird die EX2-AS-Reporter-Gentranskription vom kanonischen Promotor in Sinnesrichtung in ähnlicher Weise bei TA zusätzlich zum EX2-Reportergen in (C) unterdrückt. Das Auftreten von MS2-RFP-markierten Transkripten, die aus der invers eingefügten MS2-Stammschleifensequenz stammen, deutet jedoch darauf hin, dass die Antisense-Transkription während der Sense-Transkriptionsaktivität vor der TA-Addition fehlt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Reporter-Zellleitung | EX2 und EX2-AS | BALL |
| Zu transfizierende Plasmide | 1,5 μg pI-SceI-GR-iRFP | 1,5 μg pI-SceI-GR-iRFP |
| 0,65 μg pUBC-mCherry-nls-tdPP7-mCherry | 0,5 μg pUBC-GFP-nls-tdMS2-GFP | |
| 0,35 μg pUBC-GFP-nls-tdMS2-GFP |
Tabelle 1: Transfektion der Reporter-Genzelllinien. Die Tabelle beschreibt die Transfektionsschemata und -mengen der verschiedenen Plasmide, die verwendet werden, um die verschiedenen Reportergenzelllinien vorübergehend zu transfizieren.
Discussion
Konflikte zwischen essentiellen biologischen Prozessen wie Replikation, Transkription, DNA-Schäden und DNA-Reparatur wurden als kritische Quelle der Genominstabilität identifiziert22. Diese Studien haben auch zur Entdeckung der Transkription an Stellen von DNA-Schäden geführt und den bruchinduzierten Transkripten eine funktionelle Rolle bei der Regulierung von DNA-Schadensreparaturprozessen zugeschrieben23. Die neuen Werkzeuge und das hier beschriebene Protokoll ermöglichen eine weitere Untersuchung der RNA Pol II-Transkriptionsdynamik an DSBs. Ein kritischer Punkt in diesem Protokoll ist die Erzeugung von Zelllinien, die eine einzige Kopie des in das Genom integrierten Reportergens enthalten. Diese Schlüsselfunktion eliminiert das Rauschen, das durch die Transkription mehrerer Reportergene entsteht, die mit mehreren Kopien in einem einzigen genomischen Locus integriert sind, und ermöglicht die Erfassung kinetischer Parameter der Transkriptionsdynamik und einzelner RNA-Transkripte. Eine entscheidende technische Voraussetzung für die Beobachtung der Transkription von Single-Reporter-Genintegrationen ist die Verfügbarkeit eines Mikroskopsystems, das den Nachweis einzelner RNA-Transkripte ermöglicht, die mit dem MS2- oder PP7-System in lebenden Zellen markiert sind4,12. Hier wird die Live-Cell-Mikroskopie an einem konfokalen Spinning Disk-System durchgeführt, das auf einem inversen Mikroskop montiert ist und mit 100 mW Festkörperlasern ausgestattet ist, die an einen akustisch-optisch abstimmbaren Filter gekoppelt sind, wie an anderer Stelle beschrieben24. Um die Transkription an einem einzelnen DSB mit den Reportern zu untersuchen, müssen einzelne Zellen sorgfältig überwacht werden, um die höchste Zeitauflösung zu erreichen, die bildgebende Zellen für mehrere Stunden erfordert, was dies zu einem Test mit niedrigem Durchsatz macht. Dennoch beobachten wir mehrere Zellen parallel mit der Positionierung, die von einem piezogetriebenen Mikroskoptisch gesteuert wird. Um optimale Umgebungsbedingungen für die Beobachtung lebender Zellen über Stunden zu gewährleisten, wird der Mikroskopkörper einschließlich der Probenstufe in eine Plexiglas-Umgebungskammer gelegt. Zusätzlich ist eine geschlossene Inkubationskammer auf dem Mikroskoptisch montiert und an CO2- und Feuchteversorgungsregler angeschlossen.
Der erste kritische Schritt im Protokoll ist die Auswahl von Regionen von Interesse mit Zellen für die Bildgebung. Jede für die Bildgebung markierte XY-Position muss eine oder mehrere Zellen enthalten, die eine Transfektion mit den fluoreszierenden RNA-Stammschleifen-bindenden Proteinen gemäß dem in Abschnitt 1, Tabelle 1, sowie in Abbildung 2D, E beschriebenen Reportergen und Transfektionsschema zeigen. Darüber hinaus müssen die Zellen hell markierte Transkriptionsstellen aufweisen, die mit dem I-SceI-GR-iRFP713-Konstrukt kotransfiziert werden müssen, und das Protein muss zunächst im Zytoplasma lokalisiert sein (Abbildung 2D und E).
Die Zellen sollten eine Fluoreszenzintensität von ungebunden fluoreszierend markiertem MS2- und/oder PP7-Mantelprotein aufweisen, die niedrig genug ist, um einzelne markierte Transkripte über dem Hintergrundfluoreszenzniveau nachzuweisen. Gleichzeitig ist ein robustes Fluoreszenzintensitätsniveau der fluoreszenzmarkierten MS2- und/oder PP7-Beschichtungsproteine erforderlich, um eine Bildgebung über mindestens 60 min zu ermöglichen, ohne zu viel Fluoreszenz aufgrund einer Bleiche zu verlieren. Die "Skalenbildanzeige" mit einem festen Bereich wie in Abschnitt 3.7 beschrieben wird verwendet, um eine standardisierte Auswahl von Zellen nach ihrem Fluoreszenzintensitätsniveau zu ermöglichen.
Ein zweiter kritischer Protokollschritt ist das Hinzufügen des TA zu den Zellen an vorher festgelegten XY-Positionen durch das kleine Loch im Deckel der Glasbodenschale. Jede Manipulation der Glasbodenschale würde eine Verschiebung von der markierten XY-Position der Zellen verursachen und muss vermieden werden. Daher ist der sorgfältige Umgang mit der Mikropipette bei gleichzeitiger Zugabe des im zellulären Wachstumsmedium verdünnten TA für die erfolgreiche Beobachtung vorausgewählter Zellen von entscheidender Bedeutung, wie in Abbildung 2F gezeigt. Die Anpassung verschiedener Systeme zur Zugabe von Medikamenten zu Zellen, die auf einem Mikroskoptisch montiert sind, wie z. B. ein Perfusionssystem, würde eine separate Stufeninkubationskammer mit Rohreingangs- und -austrittsöffnungen und ein Pumpen- oder Injektionssystem zur Verabreichung von Medikamenten erfordern. Andere Methoden wie Kanalobjektträger mit deckglasartigen Bodenflächen führen zu einer langsamen Diffusion der verabreichten Medikamente in den Kanal und verursachen eine zusätzliche Verzögerung zwischen Arzneimittelzugabe und Wirkung. Schließlich kann das unvorsichtige Pipettieren in eine Kanalschieberöffnung auch die Probenposition verschieben. Daher ist das derzeitige System mit einem kundenspezifisch gebohrten Loch im Deckel einer Glasbodenschale einfach anzupassen, kostengünstig und für die Verabreichung verschiedener Wachstumsmedien, Medikamente und Komponenten geeignet. Der geringe Durchmesser des Lochs und die befeuchtete Atmosphäre in der Stufeninkubationskammer verhindern zudem ein Austrocknen des Zellmediums.
Ein dritter kritischer Schritt in diesem Protokoll ist die Datenanalyse, die eine manuelle Überprüfung der Zeitpunkte erfordert, an denen die Transkription aufgrund der Induktion eines DSB eingestellt wird. Der Zeitpunkt der Beendigung der Transkription wird durch die Freigabe der letzten Transkripte von der zuvor hell markierten Stelle der Reporter-Gentranskription angegeben. Ebenso müssen die Ereignisse der bruchinduzierten Transkriptionsinitiation sorgfältig untersucht werden, um einzelne Transkriptionsereignisse mit dem relativ niedrigen Signal-Rausch-Verhältnis einzelner fluoreszend markierter mRNAs zu erkennen.
Die Dynamik der Reparatur des induzierten DSB fügt den Analysen der mit diesen Reportern generierten Daten eine zusätzliche Komplexitätsebene hinzu und beschränkt sie auf die ersten Minuten unmittelbar nach der Induktion des DSB. Die transgene Natur der Reportergene und die wiederholungsreiche Natur der MS2- und PP7-Stammschleifen-Arrays können eine einzigartige Chromatinlandschaft zusammensetzen, die die Etablierung vermeintlich stabiler bruchinduzierter Transkriptionsprogramme stört. Im Vergleich zur Ionisations- oder UV-Bestrahlung ist die I-SceI-vermittelte Induktion eines DSB in Reportergenen jedoch ein viel robusteres System zur Untersuchung der Transkription an einzelnen DSBs.
Verschiedene Endonukleasesysteme wie I-CreI, I-PpoI oder AsiSI , die zusätzliche Erkennungsstellen innerhalb des menschlichen Genoms haben oder nicht, können mit den vorliegenden Reportergensystemen kombiniert werden, um eine mögliche höhere Effizienz der Erzeugung von DSBs zu erzielen. Sie erfordern jedoch zuerst die Einführung der Endonuklease-Erkennungsstelle in die Reportergene. Zweitens können sie eine ähnliche Variabilität bei der Timing- und Effizienzinduktion eines DSB in einzelnen Zellen aufweisen. Auf der anderen Seite kann das Einfügen von Tandemkopien von Endonuklease-Erkennungsstellen die Effizienz der DSB-Induktion erhöhen. Darüber hinaus würde das Testen der vorgestellten Reporter-Gensysteme in verschiedenen Zelllinien den Vergleich der Transkriptionsdynamik an DSB-Stellen zwischen verschiedenen zellulären Hintergründen und die Verfügbarkeit verschiedener DNA-Schadensreparaturwege wie in Krebszellen, Primärzellen und differenzierten nicht-zyklischen Zellen ermöglichen. Die Konstruktion der Reportergene, die mit dem Flp/FRT-System kompatibel sind, schränkt derzeit jedoch die Integration in verfügbare Flp/FRT-Wirtszelllinien ein.
Zusätzlich zu mikroskopiebasierten Anwendungen können die aktuellen Reportergene auch mit biochemischen Assays wie der Chromatin-Immunpräzipitation kombiniert werden, um die Rekrutierung von DNA-Reparatur- oder Transkriptionsfaktoren für ein einzelnes DSB zu untersuchen oder die Nukleosombelegung, Histonmodifikationen und den Chromatinzustand um den DSB-Standort zu bewerten. Darüber hinaus würde eine Kombination mit verschiedenen Reportersystemen die Untersuchung funktioneller Zusammenhänge zwischen DNA-Schäden und Prozessen wie Genomorganisation oder DNA-Replikation ermöglichen.
Disclosures
Die Autoren haben keinen Interessenkonflikt offenzulegen.
Acknowledgments
Wir danken RH Singer, J.A. Chao, T. Misteli, M. Carmo-Fonseca für geschenke von plasmiden und reagenzien. Wir sind auch den Mitarbeitern der iMM Bioimaging Facility, A. Temudo, A. Nascimento und J. Rino, für die kritische Lektüre des Manuskripts zu Dank verpflichtet. Diese Arbeit wurde von PTDC/MED-OUT/32271/2017, PTDC/BIA-MOL/30438/2017 und PTDC/MED-OUT/4301/2020 von Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal, und von LISBOA-01-0145-FEDER-007391, einem von FEDER über POR Lisboa, Portugal 2020-Programa Operacional Regional de Lisboa und FCT kofinanzierten Projekt, finanziert. Gefördert wurde auch das FORSCHUNGS- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der EU (RiboMed 857119). M.A. ist der Empfänger des FCT Ph.D. Fellowship 2020.05899.BD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mW solid-state Lasers | Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA | ||
| 3i Marianas SDC Confocal Spinning Disk system | Intelligent Imaging Innovations Inc. | ||
| Air-cooled EMCCD Camera Evolve 512 | Photometrics, Tucson, AZ USA | ||
| Axio Observer Z1 inverted microscope | Carl Zeiss MicroImaging, Germany | ||
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| charcoal-stripped fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F6765-500 ML | |
| CO2 module S | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
| CSU-X1 confocal spinning disk unit | Yokogawa Electric, Tokyo, Japan | ||
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| DMEM with Hepes no PhenolRed | Gibco | 21063-029 | |
| Doxicyclin | Sigma-Aldrich | D9891 | for induction of reporter gene expression; stock solution of 0.5 mg/ml was used at 1:1000 dillution in cell growth medium |
| FBS | Gibco | 10270106 | |
| Flp-In T-REx 293 cell line | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | R75007 | |
| I-SceI-24x MS2 stem loop sequence | GeneArt, Thermo Fischer Scientific | custom synthesized DNA fragment containing a single I-SceI recognition sequence and 24 tandem MS2 stem loop sequences | |
| Heating Device Humidity 2000 | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
| Hygromycin B | Roche | 10843555001 | |
| Immersion oil Immersol 518 F | Carl Zeiss MicroImaging Inc.) | 444960-0000-000 | |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Lipofectamin 3000 helper reagent P3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | transfection helper reagent |
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | lipid-based transfection reagent |
| MatTek 35 mm dish, Glass bottom No. 1.5 | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | P35G-1.5-10-C | |
| microscope incubation chamber | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
| pcDNA5/FRT/TO | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | V652020 | |
| pOG44 plasmid | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | V600520 | |
| SlideBook 6.0 Software | Intelligent Imaging Innovations Inc. | ||
| stage incubation chamber PeCon P-Set 2000 | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
| StaQtool Software | iMM-JLA Lisbon, Portugal | available at: https://imm.medicina.ulisboa.pt/facility/bioimaging/lib/exe/fetch.php?media=STaQTool_setup.zip | |
| triamcinolone acetonide (TA) | Sigma-Aldrich | T6501 | synthetic glucocorticoid; induces the glucocorticoid receptor to migrate from the cytoplasm to the nucleus |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Thermo Fisher Scientific | R001100 |
References
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