Summary
Denne protokollen presenterer et nytt reportergensystem og det eksperimentelle oppsettet for å oppdage transkripsjon ved DNA-dobbeltstrengsbrudd med følsomhet for enkeltmolekyler.
Abstract
DNA-dobbeltstrengsbrudd (DSB) er den mest alvorlige typen DNA-skade. Til tross for de katastrofale konsekvensene av genomintegritet, er det fortsatt så langt unnvikende hvordan DSB-er påvirker transkripsjonen. En årsak til dette var mangelen på egnede verktøy for samtidig å overvåke transkripsjon og induksjon av en genic DSB med tilstrekkelig tidsmessig og romlig oppløsning. Dette arbeidet beskriver et sett med nye reportere som direkte visualiserer transkripsjon i levende celler umiddelbart etter induksjonen av en DSB i DNA-malen. Bakteriofage RNA-stammeløkker brukes til å overvåke transkripsjonen med følsomhet for enkeltmolekyler. For å målrette DSB mot en bestemt genregion, er reportergenene konstruert for å inneholde en enkelt anerkjennelsessekvens av homing endonuclease I-SceI, ellers fraværende fra det menneskelige genom. En enkelt kopi av hvert reportergen ble integrert i genomet til menneskelige cellelinjer. Dette eksperimentelle systemet gjør det mulig å oppdage enkelt RNA-molekyler generert av den kanoniske gentranskripsjonen eller ved DNA-bruddindusert transkripsjonsstart. Disse reporterne gir en enestående mulighet til å tolke de gjensidige interaksjonene mellom transkripsjon og DNA-skade og å avsløre hittil ikke-verdsatte aspekter ved DNA-bruddindusert transkripsjon.
Introduction
DNA dobbeltstrengsbrudd (DSB) er giftige DNA-lesjoner som forstyrrer cellefunksjonen og bidrar til opprør av flere sykdommer og aldring1. Mutasjoner som følge av unøyaktig reparasjon av DSB påvirker genuttrykk og legger grunnlaget for cellens funksjonelle nedgang. Det fremvoksende synet på at DSB-er driver de novo break-indusert transkripsjon på lesjonsstedet2,3,4,5,6,7 antyder at DSB-er også kan påvirke cellulær funksjon gjennom break-duced RNAer. Flere nyere studier tyder på at DSB-er er tilstrekkelige til å initiere programmerte (f.eks. ved stimulus-inducible gener) og uplanlagt (f.eks. hos ikke-kanoniske promotører) transkripsjon4,5,7. Til tross for flere studier som undersøkte sammenhengene mellom DNA-skade og transkripsjon, la feltet seg imidlertid fortsatt i sin evne til å levere en presis (dvs. enkeltmolekyl) karakterisering av transkripsjonshendelsene på DNA-pausesteder. En viktig årsak til dette var mangelen på passende eksperimentelle verktøy. Cellebestråling (γ-stråler, røntgenstråler, tunge ioner) og narkotikabehandlinger (f.eks. topoisomerasehemmere eller interkalerende midler) mangler romlig presisjon og induserer andre DNA-lesjoner enn DSB-er, inkludert enkeltstrengsbrudd og DNA-addukter8. Endonucleases, som I-PpoI og AsiSI, genererer lokusspesifikke DSBer, men har ikke blitt kombinert med et system som tillater samtidig live-celle visualisering av transkripsjon med et enkelt locus med høy temporal presisjon8. For å omgå denne begrensningen, ledet laboratoriet vårt med å utvikle et sett med banebrytende reportere som direkte visualiserer transkripsjon med enkeltmolekyloppløsning ved kontrollert induksjon av en unik DSB4. Her beskriver vi disse reporterne, gir en detaljert protokoll for live-celle avbildning av transkripsjon ved DSB-er og viser data som avslører transkripsjonsstart ved en enkelt DSB.
Reportergensystemene som brukes i denne protokollen er basert på det godt karakteriserte muse-IgM-reportergenet og inneholder eksonene M1 og M2 i den membranbundne formen (μm) til IgM-μ tung kjede9,10,11. En hybrid intron skiller de to eksonene med den sterke adenovirus store sen transkripsjon (AdML) PY tract12. Uttrykket av reportergenene styres av den menneskelige cytomegaloviruspromotoren (CMV), der to tandemkopier av Tet-operatøren (TetO) er satt inn. Reportergenene settes inn i en plasmidvektor som inneholder et FLP Recombination Target (FRT)-nettsted og settes inn i et bestemt FRT-målsted i genomet til en HEK293-vertscellelinje. Denne cellelinjen uttrykker også tet-repressorproteinet for å regulere uttrykket av reportergenet via tilstedeværelse eller fravær av tetracyklin / doxycyklin. For å tillate visualisering av reportergentranskripsjonen ble 24 tandem repetisjoner av MS2-stammeløkkesekvensen og 24 tandem repetisjoner av PP7-stammeløkkesekvensen satt inn i forskjellige posisjoner med hensyn til transkripsjonsstartsted og exon / intronstruktur av reportergenet. MS2/PP7 RNA-stammeløkkene dannes ved transkripsjon og er spesielt bundet av ektopisk uttrykte MS2/PP7-frakkproteiner merket med grønne og røde fluorescerende proteiner, en strategi som er mye brukt før til bildetranskripsjon13,14,15. I tillegg ble en enkelt kopi av 18 bp-anerkjennelsessekvensen satt inn for homing endonuclease I-SceI som er direkte flankert av RNA-stamcellesekvensmatrisene i reportergenene. Standard kloningsteknikker ble brukt til å generere alle plasmider, fragmentet som inneholder I-SceI-24xMS2-stammeløkken til PROP-reportergenet ble syntetisert av en kommersiell gensyntetiseringstjeneste.
Det promotor-proksimale DSB-reportergenet (PROP) ble konstruert ved å sette inn I-SceI-skjærestedet 45 basepar (bp) nedstrøms for det putative transkripsjonsstartstedet i exon I, etterfulgt av 149 bp til starten av den 24x MS2 stamcellekassetten, som ble de novo designet med to vekslende ikke-identiske stammesløyfesekvenser16 og ytterligere fem ikke-repeterende 20 bp avstandsstykker sekvenser for å redusere redundans. MS2-stammeløkkematrisen etterfølges av 72 bp til begynnelsen av 1844 bp intron og 1085 bp exon II til spaltings- og polyadenyleringsstedet. Exon II koder et cyan fluorescerende protein (CFP) smeltet sammen til en C-terminal peroksisomisk målrettingssekvens (PTS) fra den humane peroksisomale acyl CoA-oksidasen for å tillate en uavhengig screening av reportergenuttrykket (figur 1A).
Exon II DSB reporter genet (EX2) består av en 167 bp exon jeg etterfulgt av intron og exon II koding CFP-PTS. Lenger nedstrøms i en avstand på 169 bp ble det satt inn en kassett som inneholder 24x MS2-stammeløkker, etterfulgt av en 84 bp linker-sekvens med et I-SceI-sted i midten, etterfulgt av 24x PP7-stammeløkker og 221 bp til spaltings- og polyadenyleringsstedet17 (figur 1B).
Til slutt er exon II DSB-reportergenet med antisense transkripsjonsmerking (EX2AS) basert på human ubiquitin B (UBB) gentranskripsjon UBB-201 og inneholder to eksoner og en intron. Den exon jeg har en total lengde på 1534 bp med en omvendt innsetting av 24x MS2 stem-loop sekvens. Derfor vil den riktige MS2-stamme-loop RNA-sekvensen bli transkribert i en antisense retning med hensyn til følelsestranskripsjonen av reportergenet fra CMV-promotoren. Intronen har en lengde på 490 bp, etterfulgt av exon II med I-SceI-området , og en kodingsregion ble satt inn for to in-frame ubiquitin subenheter. Nedstrøms UBB-genet er en sekvens som danner en 24x PP7-stamme-løkke ved transkripsjon av reportergenet i en fornuftig retning (figur 1C).
Den forbigående transfeksjonen av en induserbar konstruksjon av homing endonuclease I-SceI gjør det mulig å kontrollere opprettelsen av en DSB på det innsatte anerkjennelsesstedet i hvert reportergen18. I-SceI endonuclease er smeltet sammen i ramme med ligandbindende domenet til glukokortikoidreseptoren og et fjernt rødt fluorescerende protein iRFP713. Denne konstruksjonen er cytoplasmatisk i fravær av triamcinolon acetonid (TA), men migrerer raskt inn i kjernen ved tilsetning av TA til vekstmediet til cellene (figur 1D). Induksjonen av DSBer av I-SceI-systemet er robust, som vist før18,19,20. Reportergentranskripsjonen kan overvåkes parallelt ved å visualisere de fluorescerende merkede RNA-stamcellesystemene MS2 og PP7.
Protocol
1. Forberedelse og transfeksjon av celler for levende cellemikroskopi
- Forbered en 25 cm2 cellekulturflaske av reportercellelinjen (EX2, EX2-AS eller PROM) med 5 ml DMEM for å oppnå 80-90% samløp dagen før live-cellemikroskopieksperimentet.
- Aspirer mediet med en pipette fra 25 cm2 cellekulturflasken og vask cellene med 2,5 ml 1x PBS.
- Tilsett 1 ml trypsin-EDTA (0,05%) og inkuber ved 37 °C i 2-3 minutter for celleavløsning.
- Etter celleavløsning, tilsett 4 ml DMEM uten fenolrød som inneholder HEPES-buffer, supplert med 10% (v / v) kull-strippet foster bovint serum, og forsiktig resuspend cellene.
- Plate 1 ml av celleoppløsningen i en 35 mm rund tallerken med 10 mm glassbunnsbrønn (diameter nr. 1,5) og homogeniser. Oppbevar den 35 mm runde retten inne i en 100 mm standard cellekulturfat og inkuber den ved 37 °C i en fuktig atmosfære med 5 % CO2.
- ~6 timer etter sådd, transfekt cellene i glassbunnsfatet. For hver transfeksjonsblanding, lag to løsninger på følgende måte:
- I et 1,5 ml mikrosenterfugerør, klargjør løsning A som inneholder 150 μL redusert serum minimalt essensiell medium (MEM), plasmid DNA (som beskrevet i tabell 1), og 2,5 μg/μL DNA av transfeksjonshjelperreagens (se tabell over materialer).
- Parallelt, forbered løsning B, som inneholder 150 μL redusert serum MEM og 1,5 μg/μL DNA av et lipidbasert transfeksjonsreagens (se materialtabellen).
- Inkuber begge løsningene ved romtemperatur (RT) i 5 min. Tilsett deretter løsning A forsiktig til løsning B og inkuber 20 min ved RT.
- For å transfekte cellene, tilsett 300 μL løsning A + B dråpevis til hver tallerken og fordel forsiktig. Oppbevar glassbunnsfatet inne i en 100 mm standard cellekulturfat og inkuber den ved 37 °C i en fuktig atmosfære med 5 % CO2.
- Forbered et 1,5 ml mikrosenterrør med 200 μL DMEM med HEPES, uten fenolrødt supplert med 10% (v / v) kull-strippet foster bovint serum og legg TA til en konsentrasjon på 7,5 x 10-7 M.
2. Eksperimentelt oppsett
- Still inn temperaturen på det store plexiglassmikroskopinkubasjonskammeret og inkubasjonskammeret i øverste trinn til 37 °C ved den vanlige kontrollenheten. Sett miljøforholdene inne i trinninkubasjonskammeret til 5% CO2 og 100% fuktighet.
MERK: Mikroskopburet og sceneinkubatortemperaturen må settes opp minst 1 time før du starter eksperimentet for å tillate oppvarming av hele systemet for å minimere temperatursvingninger. Start alle andre mikroskopkontroll- og driftsenheter samtidig. - Induser transkripsjonen av reportergenene ved å tilsette doxycyklin (0,5 μg/ml) til vekstmediet og bland forsiktig ved å pipettere opp og ned med en 200 μL mikropipette ~ 1 time før du starter mikroskopisk observasjon.
MERK: Hold glassbunnsfatet med de transfiserte cellene inne i en 100 mm standard cellekulturrett for enkel håndtering og transport fra cellekulturen til mikroskoprommet i en styrofoambeholder for å opprettholde temperaturen så stabil som mulig. - Transporter cellene til mikroskopet minst 30 min før du starter observasjonen, og ved ankomst, plasser 100 mm parabolen med cellene umiddelbart inne i det forvarmede store mikroskopinkubasjonskammeret.
- Plasser mikrocentrifugerøret med den forvannede TA fra trinn 1.7. inne i det store mikroskopets miljøkammer for å varme opp til 37 °C.
- Sett på lokket på glassbunnsfatet på samme måte som den som ble tilberedt før, med et hull med diameter på 3 mm boret inn i lokket (figur 2A).
MERK: TA legges senere til cellene gjennom det lille hullet i lokket uten å manipulere retten som er montert på mikroskopstadiet. - Velg 100x (apochromatic objective, 1.4 numerisk blenderåpning) olje nedsenking mål i mikroskopet kontrollpanel. Påfør en dråpe nedsenkningsolje på målet.
- Sett glassbunnsfatet med cellene inne i mikroskopets inkubasjonskammer og lås det på plass. Lukk lokket på trinninkubatoren og alle dørene til mikroskophuset.
- Start mikroskopets drifts- og kontrollprogramvare, åpne Fokuskontroll-vinduet (figur 2B), klikk omfangsruten, og klikk 100 % øyeboks i ruten Valg av utslipp for å angi okulær strålebane for direkte prøveobservasjon for øyet.
- Bytt til Øyefiltersett på Filtersett-menyen, klikk Brightfield, og trykk Åpne Brightfield-knappen.
- Beveg mikroskopmålet mot glassbunnsfatet til oljen berører glasset. Se deretter gjennom okularene og fokuser manuelt på cellenes plan. Slå av Åpne Brightfield-knappen .
- La cellene stå i 30 minutter før du starter de eksperimentelle observasjonene for å tilpasse seg miljøforholdene og forhindre brenndrift under avbildning ved temperaturgradienter.
- Plasser en 200 μL mikropipette og 200 μL filtertips klar til bruk til side ved romtemperatur.
3. Bildeoppkjøp
- I fokuskontrollvinduet i mikroskopkontrollprogramvaren setter du laserintensiteten til 5 % og angir en verdi på 50 ms for eksponeringstiden (figur 2B).
- Åpne Capture-vinduet for å justere innstillingene for å utføre en automatisert bildeanskaffelse av tredimensjonale (3D) tidsforløp (figur 2C).
- Velg anskaffelsestypen for 3D-opptak og sett 12 til 16 optiske stykker atskilt med 0,4 μm, merk av for Område rundt gjeldende og Gå tilbake til gjeldende posisjon etter opptak.
- I ruten Tidsforløpsregistrering angir du en verdi på 120 for antall tidspunkter og 30 s for intervallet.
- Velg det konfiskeringsfiltersettet i henhold til de transfiserte fluorescerende proteinetikettene med λ = 488 nm for GFP, λ = 561 nm for TagRFPt, og λ = 640 nm for iRFP713 og sett eksponeringstiden for hver kanal til 50 ms.
- Bruk innstillingen Strøm for laserkraften til å bruke verdien 5 % som er valgt i fokusvinduet (figur 2C).
- Gå til Kamera-ruten i Fokuskontroll-vinduet, velg Skjermkontroll for skalering av bilde og velg Manuell-knappen for å konfigurere et fast område med bildeintensiteter som skal vises. Angi verdier for Lav: 500 og Høy: 5000 (se figur 2B).
MERK: Denne innstillingen begrenser det dynamiske området for kameraopptaket som vises i live view, for å velge celler innenfor samme område av fluorescensintensiteter (figur 2D). - Velg cellene for 3D-tidsforløpavbildning av transkripsjonssteder ved induksjon av en DSB. Screen cellene og velg tre synsfelt i henhold til betingelsene som er beskrevet i diskusjonen.
- Fokuser hver valgte celle som tidligere var plassert i midten av synsfeltet, med transkripsjonsstedet i midtplanet til Z-stabelen.
MERK: Sentrering av cellen og transkripsjonsstedet i XYZ har plass til en viss bevegelse av cellen. - Merk hver XYZ-posisjon i XY-ruten i fokuskontrollvinduet ved å klikke Angi punkt.
MERK: Besøk de valgte stillingene 2-3 ganger i løpet av følgende 5 minutter for å bekrefte kontinuerlig transkripsjon av reportergenene og relativ posisjonsstabilitet av cellenes posisjoner i XYZ-dimensjoner. - Tilsett 200 μL av den forfortynnede TA fra trinn 1.7. cellene som vist i figur 2F.
MERK: Vær svært forsiktig så du ikke berører glassbunnsfatet eller lokket mens du legger til TA for å forhindre at skiftet skifter fra de markerte XY-posisjonene. Etter DSB-induksjon, bekreft at cellene er sentrert innenfor synsfeltet, og transkripsjonsstedet er i sentrum av Z-flyet. Refokusering og posisjonsoppdatering bør ikke ta mer enn 1-2 min. - Start 3D-tidsserieavbildningen ved å klikke på Start i Capture-vinduet .
- Lagre bildedataene i dataformatet for mikroskopkontrollprogramvare på datamaskinens harddisk for mikroskopkontroll.
4. Dataanalyse
- Åpne bildedataene i mikroskopkontrollprogramvaren og eksporter som 16-biters TIFF-formatfiler.
- Åpne de eksporterte filene med StaQtool21-programvaren . Velg Single Spot 3D-modus og last inn bildefilene ved å trykke på Gå til.
MERK: Den valgte tidsserien åpnes i Max Projection Timelapse Viewer, som viser en maksimal intensitetsprojeksjon av z-stabelen for første gangs punkt (figur 3A). - Juster bildeintensitetsvisningen med den vertikale MAX-glidebryteren på venstre side.
- Velg tidspunktet som skal analyseres med den vannrette glidebryteren for tidspunkt .
- Hold markøren over posisjonen til det merkede transkripsjonsstedet for manuell merking, eller bruk funksjonen Automatisk registrering , og trykk på det respektive transkripsjonsstedet hvis flere objekter ble oppdaget.
- Bruk Auto Track-funksjonen til å bestemme XYZ-posisjonene til transkripsjonsstedet over tid.
MERK: Hvis en gitt posisjon ikke ble sporet riktig, velger du transkripsjonsstedet manuelt i henhold til StaQtool-programvarehåndboken. - Trykk på Auto-knappen for å utføre Gauss-armaturen for hvert tidspunkt og måle den totale fluorescensintensiteten (TFI).
MERK: Hvis transkripsjonsaktiviteten opphører, forblir sporingsverktøyet i den siste posisjonen der et diffraksjonsbegrenset objekt (et merket transkripsjonssted) ble oppdaget. Hvis cellen beveger seg i XY-retning etter at etiketten på transkripsjonsstedet forsvinner, kreves det en manuell omplassering av søketorget . - Når du er ferdig med TFI-verditilpasningen for hvert tidspunkt, trykker du på Avslutt tidsforløp-knappen for å lukke gjeldende bildefil for tidsserier og fortsette til neste fil.
MERK: TFI-verdiene eksporteres og lagres automatisk i en Excel-fil.
5. Mikroskopikalibreringsmålinger og analyse
- Frøceller i 35 mm glassbunnsretter og transfekt med fluorescerende merkede MS2- og PP7-frakkproteiner som beskrevet i avsnitt 1.
MERK: For kalibreringsmålingene bruker du de samme reportergencellelinjene som er beskrevet i innledningen. - Tilsett 0,5 μg/ml doxycyklin i vekstmediet til cellene 1 t før du starter oppkjøpet av mikroskopibildet.
- Monter glassbunnsfatet inne i mikroskoptrinnets inkubasjonskammer og klargjør bildeanskaffelsen som før (se avsnitt 2).
MERK: Det originale lokket på glassbunnsfatet er ikke byttet ut for kalibreringsforsøkene. - Bruk samme laserintensitet og eksponeringsinnstillinger som beskrevet i punkt 3.1.
- Angi opptaksinnstillingene for 2D-tidsserier (fjern merket for 3D-alternativet i Opptakstype-ruten ) og angi 120 tidspunkter med intervaller på 500 ms i Timelapse Capture-panelet (figur 2C).
MERK: Denne innstillingen for bildeanskaffelse vil resultere i tidsserier i ett enkelt optisk plan med svært korte intervaller. - Hent dusinvis av kalibreringstidsserier fra flere posisjoner for å generere datasett for å telle flere hundre TFI-målinger for enkeltutskrifter.
- For analyse av kalibreringstidsserien konverterer du filene til 16-biters TIFF-formatfiler tilsvarende punkt 4.1.
- Åpne de eksporterte filene med StaQtool21-programvaren (figur 3). Trykk på Velg LOG-fil-knappen , velg loggfilen for den respektive 2D-tidsserien som er anskaffet som beskrevet i punkt 4.2.
- Merk av for Flere spot 2D , og trykk på GO-knappen for å laste inn tidsserien i analyseprogramvaren.
- I tidsforløpvisningsvinduet (figur 3A) setter inndatafeltet inn verdien som beregnes for mikroskopsystemet og målet som beskrevet21, i PSF FWHM.
- Når du skal starte analyseprosessen, trykker du på Knappen Automatisk søk for å finne alle diffrakitetsbegrensede objekter for gjeldende tidspunkt som vises. Klikk deretter på Beste tilpassing for å utføre gaussisk tilpasning for å bestemme TFI-verdien for hvert objekt (figur 3A).
- Alternativt kan du peke markøren over et diffraksjonsbegrenset objekt og klikke for å merke det (grønn sirkel i en hvit firkant vises), og trykk på den gaussiske tilpasningsknappen for manuell merking og Gauss-tilpasningsprosedyren.
MERK: Den siste modusen anbefales å ekskludere objekter som ikke telles, for eksempel lyse transkripsjonssteder med flere ekkel transkripsjoner til stede i samme kjerne. - Trykk på Avslutt tidsforløp-knappen for å fullføre forrige trinn.
MERK: Resultatene lagres automatisk i et Microsoft Excel-filformat i samme mappe som bildefilen. - Start TFI- og W-distribusjonsmodulen for flere punkter ved å trykke på den respektive knappen (figur 3B).
- Last inn Excel-filer via Legg til fil-knappen og start TFI-analysen ved å trykke på Gå til-knappen.
MERK: Utgangen er den gjennomsnittlige TFI-verdien som bestemmes av TFI-er med flere målte enkeltutskrifter. - Start W-analysen ved å sette inn PSF FWHM som tidligere ble brukt i punkt 5.10. og trykk på Gå til-knappen med standardverdien for papirkurven.
MERK: W-parameteren er kvalitetskontroll for TFI-målinger med én transkripsjon for å overholde riktig PSF FWHM-verdi for mikroskopsystemet som brukes.
6. Data- og kalibreringssammenslåing
- Angi TFI-verdiene for tidsserien hentet fra Excel-arket som er lagret i punkt 4.8. i et nytt Excel-ark og del hver tidspunktverdi med gjennomsnittlig TFI for enkelttranskripsjoner oppnådd i punkt 5.15.
MERK: For standardisering av denne prosessen ble det brukt spesiallagde Excel-malskjemaer.
Representative Results
Cellelinjene som huser reportergenene beskrevet i figur 1A-C tillater studiet av transkripsjonsdynamikk ved en enkelt DSB i levende celler. Tallene i figur 1A-C under hver grafiske reportergenrepresentasjon angir lengden i kilobasepar (kbp). CMV indikerer cytomegaloviruspromotoren, TetO er Tet-operatørsekvensene, pA fremhever 3' spaltings- og poly-adenyleringsstedet ved genendenden. CFP-PTS er det kodede cyan fluorescerende proteinet smeltet sammen til et peroksisomalt målrettingssignal, og 2UBB er den kodede humane allestedsnærværende B-tandemenheten. Ved å følge protokoll- og analyseprosedyrene beskrevet ovenfor, er det mulig å få grafer som viser antall fluorescerende merkede reportergentranskripsjoner over tid, med en tidsmessig oppløsning på sekunder over perioder på opptil timer (figur 4A-D). Grafen i figur 4A viser tidsforløpet for TFI-verdier på et PROM-reporter gentranskripsjonssted merket av akkumulering av MS2-GFP-molekyler på ekkel transkripsjoner. Denne grafen representerer et kontrolleksperiment uten TA-tillegg; Derfor er ingen DSB indusert. Transkripsjonen fortsetter med bristelignende topper og 2-8 transkripsjoner om gangen over hele observasjonsperioden på 60 min. Lignende resultater ble oppnådd for EX2- og EX2-AS-reportergenene (data som ikke er vist her)4. Induksjonen av en enkelt DSB i reportergenene (ved hjelp av I-SceI-GR-iRFP) gjør det mulig å studere virkningen av DSB på den pågående reportergentranskripsjonen og overvåkingen av transkripsjonshendelser som kommer fra DSB-nettstedet, nemlig bruddindusert transkripsjon (figur 4B-D).
Dynamikken i DNA-bruddindusert transkripsjon avhenger av plasseringen av DSB i genet
Induksjonen av en enkelt DSB av I-SceI-GR-iRFP i reportergenet med et promotor-proksimalt I-SceI-anerkjennelsessted fører til transkripsjonell silencing av reportergenet etter rundt 11 minutter etter TA-tillegg, og transkripsjonen gjenopprettes ikke innen observasjonsperioden på 60 minutter (figur 4B). Ved overholdelse av EX2-reportergentranskripsjonen ble fullstendig undertrykkelse av den kanoniske promotordrevne transkripsjonen oppdaget ved samtidig fullstendig tap av både MS2-GFP- og PP7-RFP-signaler rundt 30 minutter etter TA-tillegg. Innen 10 minutter starter transkripsjonen imidlertid på nytt, som avslørt av re-tilsynelatende topper av PP7-RFP fluorescens. Fullstendig gjenoppretting av PP7-RFP-signalet (og ikke MS2-GFP-fluorescensen) viser bruddindusert transkripsjonsstart (figur 4C). Den break-induserte transkripsjonen er ikke stabil over lange perioder; Det ser ut til å være burst-lignende og lav toppintensitet, noe som indikerer at bare noen få break-duced transkripsjoner ble initiert fra DSB-nettstedet.
EX2AS-reportergenet, som inneholder en 24x PP7 stamcellematrise i exon II nedstrøms på I-SceI-nettstedet for å oppdage følelsestranskripsjonen, viser den kanoniske promotordrevne transkripsjonen som avsluttes i EX2AS-reportergenet innen omtrent 25 minutter etter TA-tillegg. Det erstattes deretter av antisense break-duced transkripsjon, som avslørt ved akkumulering av MS2-GFP proteinbinding til RNA generert fra antisense MS2 stamcellesekvenser (figur 4D). Antisense transkripsjonsaktiviteten var fraværende før avbruddet av sanstranskripsjonen på grunn av induksjonen av DSB og viser i dette eksemplet at flere transkripsjoner ble initiert fra pausestedet innen rundt 15 minutter. De representative dataene som er innhentet her, viser at DSB-er har forskjellige effekter på transkripsjon avhengig av deres plassering i genet, som nylig ble rapportert4. Dataene viser også en celle til cellevariabilitet i tidspunktet for DSB-induksjonen av I-SceI-GR-iRFP, som varierer fra 12 til 30 minutter etter TA-tillegg. Videre tillater deteksjon av individuelle transkripsjoner oppdagelsen av celle til celle og bryter stedsforskjeller mot intensiteten av den break-induserte transkripsjonsaktiviteten. Den break-induserte transkripsjonen oppdages bare ved DSB-er i genet. Det er fraværende ved promotor-proksimale DSBer, hvor den kanoniske transkripsjonen opphører på en DSB for den gjenværende observasjonsperioden.
Figur 1: Reportergener og systemet for å indusere DNA-dobbeltstrengsbrudd. Den skjematiske representasjonen i (A) til (C) viser strukturen til de tre reportergenene som brukes til å studere transkripsjon ved induksjon av et DNA-dobbeltstrengsbrudd. Reportergenet med det promotor-proksimale I-SceI-nettstedet i den første exon (PROM) flankert nedstrøms av en 24x MS2-stamme-loop (MS2-SL) sekvensmatrise er avbildet i (A). Reportergenet med I-SceI-nettstedet i den andre exon (EX2) flankert oppstrøms med en 24x MS2 stamcellesekvens og nedstrøms med en 24x PP7 stamcelle (PP7-SL) matrise vises i (B). Reportergenet med I-SceI-nettstedet som ligger i exon II med en anti-parallell innsetting av 24x MS2-stammeløkkesekvensen oppstrøms for I-SceI-nettstedet for å oppdage antisense transkripsjon (EX2-AS) er vist i (C). Funksjonen til I-SceI-GR-iRFP fusjonsproteinkonstruksjonen er avbildet i (D) av en grafisk visning og tilsvarende bilder av levende celler nedenfor. Ved forbigående uttrykk for konstruksjonen (rød farge) i reportergencellelinjene er proteinet utelukkende cytoplasmisk, noe som forhindrer en for tidlig spalting av målstedet av I-SceI-endonuklease . Ved tilsetning av TA begynner fusjonsproteinet å migrere inn i cellekjernen (indikert med en stiplet linje) og begynner å samle seg mellom 5-15 min. Scalebar = 10 μm Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Velge celler for 3D-tidsforløpavbildning av transkripsjonsområder. Bildet i (A) viser en 35 mm glassbunnsfat som brukes til levende celleavbildning, med et tilpasset modifisert lokk, der et hull med 3 mm diameter ble boret for å legge til TA fortynnet i vekstmedium direkte. Hullplasseringen er merket med en rød sirkel. Panelet i (B) viser et skjermbilde av "Fokus" -vinduet i mikroskopkontrollprogramvaren for å sette opp eksponeringstid for live view, filterinnstilling, laserintensitet og skalabildevisning til skjerm for celler for etterfølgende tidsforløpavbildning i (C), skjermbildet av det tilsvarende "Capture" -vinduet for å justere alle innstillinger for live cells 3D-tidsforløpanskaffelse. De spesifikke innstillingene for rutene Filter, Opptakstype, Tidsforløpsregistrering og 3D-opptak er beskrevet i del 3. I visningen som vises her, justeres innstillingene for å skaffe seg en 3D-tidsforløp av PROM-reportergenlinjen transfektet med MS2-GFP- og I-SceI-GR-iRFP-konstruksjonene for avbildningstranskripsjon ved induksjon av et DNA-dobbeltstrengsbrudd i den promotor-proksimale regionen til reportergenet. Bildet i (D) slås sammen for GFP- og iRFP-kanalene og viser et synsfelt sett gjennom mikroskopsystemet, med flere celler i gencellelinjen til 293-PROM-reporteren. Cellene ble co-transfektert med tandem dimer MS2-frakkproteinkonstruksjonen smeltet sammen til en kjernefysisk lokaliseringssekvens, to grønne fluorescerende proteiner (GFP-MS2CP) og I-SceI-GR-iRFP-konstruksjonen. Flere celler viser uttrykk for GFP-MS2CP-konstruksjonen, og fremhever dermed kjernene og I-SceI-GR-iRFP-konstruksjonen som fremhever cytoplasmaet. Den stiplede firkanten angir det forstørrede området som vises i (E). For 3D-tidsforløpavbildningen velges celler i henhold til kravene som er gitt i diskusjonen, for eksempel cellen med større kjerne i det forstørrede området i (D). Denne cellen er transfektert med både fluorescerende konstruksjoner og viser et sterkt merket transkripsjonssted (pilspiss) ved å samle GFP-MS2CP på de novo transkribert reportergen pre-mRNAs (venstre bilde). Vekstmediet til cellene inneholder ikke TA; Derfor er I-SceI-GR-iRFP-konstruksjonen utelukkende cytoplasmatisk (høyre bilde). I (F) er glassbunnsfatet montert i mikroskopstadiet inkubasjonskammer for 3D-tidsforløpavbildningsforsøk og utstyrt med det tilpassede lokket som inneholder TA-lastehullet. Mikropipettespissen på 200 μL settes forsiktig inn i hullet for å påføre den fortynnede TA på vekstmediet til cellene. Scalebar = 10 μm Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Programvare for bildeanskaffelse og analyse. Panelet i (A) viser et skjermbilde av STaQTool: Spotsporing og kvantifiseringsverktøy. Bildet viser et eksempel på en tidsserie av PROM-reportergencellelinjen med merket transkripsjonsside merket med en grønn sirkel / hvit firkant i den maksimale intensitetsprojeksjonsvisningen i midten. Vinduene på høyre side viser en forstørret visning av det valgte transkripsjonsstedet, den tilsvarende 3D-skyggelagte intensitetsoverflateplottet med det 2D Gaussian fit-rutenettet for gjeldende tidspunkt samt plott av transkripsjonsstedet Z-posisjon i z-stabelen, den gaussiske passformbredden (W) og TFI-målingen over tid. Det mikroskopiske bildet i (B) viser et zoomet enkelt optisk plan av en kjerne av en PROM-reporter gencellelinje transfektert med MS2-GFP. Bildet representerer et engangspunkt i en 2D-kalibreringstidsserie med 120 tidspunkter. Kjernen viser flere fluorescerende merkede transkripsjoner som vises som diffraksjonsbegrensede gjenstander i nukleoplasma (merket med hvite firkanter). Panelet til høyre viser et skjermbilde av TFI- og W-distribusjonsverktøyet i STaQTool for å analysere flere steder i 2D-tidsforløpanskaffelser. I denne eksempelanalysen oppdaget verktøyet 408 diffraksjonsbegrensede flekker som representerer reportergentranskripsjoner merket med MS2-GFP som diffuserer i nukleoplasma. Grafene til høyre viser TFI og Gaussian tilpass breddefordelings histogrammer av objektene og gaussiske tilpasningskurver. TFI- og W-gjennomsnittsverdiene som er avledet fra posisjonen til den midterste toppen av den gaussiske tilpasningskurven og de beregnede konfidensintervallene, vises i den respektive ruten. Scalebar = 10 μm Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative resultater av transkripsjonsdeteksjon på steder med DNA-dobbeltstrengsbrudd. Grafene i (A) til (D) representerer den kalibrerte TFI-kurven på ett transkripsjonssted over tid. TFI-verdiene konverteres til transkripsjoner ved hjelp av gjennomsnittlig TFI for enkelttranskripsjoner målt i kalibreringseksperimentene for den respektive reportergenkonstruksjonen og fluorescerende merket RNA-stamcellebindingsprotein MS2 eller PP7 som brukes i det respektive eksperimentet. I (A) vises en graf fra et kontrolleksperiment ved hjelp av PROM-reportergenet uten TA-tillegg. Transkripsjoner merket med MS2-GFP indikerer kontinuerlig transkripsjonsaktivitet over hele observasjonsperioden. Grafen i (B) representerer PROM-reportergenet ved TA-tillegg og induksjon av en DSB som fører til en undertrykkelse av transkripsjon for den gjenværende observasjonstiden. EX2-reportergengrafen i (C) viser en transkripsjonsundertrykking av kanonisk promotordrevet transkripsjon ved TA-tillegg. Senere i samme tidsforløp dukker det bare opp PP7-RFP-merket transkripsjonsaktivitet. I grafen i (D) undertrykkes EX2-AS-reportergentranskripsjonen fra den kanoniske promotoren i forstand på samme måte ved TA-tillegg til EX2-reportergenet i (C). Utseendet til MS2-RFP-merkede transkripsjoner som stammer fra den inverse innsatte MS2-stammeløkkesekvensen indikerer imidlertid antisense transkripsjon fraværende under følelsestranskripsjonsaktivitet før TA-tillegg. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Reporter-cellelinje | EX2 og EX2-AS | PROMENADEKONSERT |
| Plasmider å transfektere | 1,5 μg pI-SceI-GR-iRFP | 1,5 μg pI-SceI-GR-iRFP |
| 0,65 μg pUBC-mCherry-nls-tdPP7-mCherry | 0,5 μg pUBC-GFP-nls-tdMS2-GFP | |
| 0,35 μg pUBC-GFP-nls-tdMS2-GFP |
Tabell 1: Transfeksjon av reportergencellelinjene. Tabellen beskriver transfeksjonsordningene og mengdene av de forskjellige plasmidene som brukes til å transfektere de forskjellige reportergencellelinjene forbigående.
Discussion
Konflikter mellom essensielle biologiske prosesser som replikasjon, transkripsjon, DNA-skade og DNA-reparasjon er identifisert som en kritisk kilde til genom ustabilitet22. Disse studiene har også ført til oppdagelsen av transkripsjon på steder med DNA-skade og tilskrevet en funksjonell rolle til de break-induserte transkripsjonene i regulering av DNA-skadereparasjonsprosesser23. De nye verktøyene og protokollen som er beskrevet her, tillater videre undersøkelse av RNA Pol II transkripsjonsdynamikk ved DSB-er. Et kritisk punkt i denne protokollen er genereringen av cellelinjer som inneholder en enkelt kopi av reportergenet integrert i genomet. Denne nøkkelfunksjonen eliminerer støyen som skapes ved transkripsjon av flere reportergener integrert med flere kopier i et enkelt genomisk locus og tillater innsamling av kinetiske parametere for transkripsjonsdynamikk og individuelle RNA-transkripsjoner. Et avgjørende teknisk krav for å observere transkripsjon av enkeltreportergenintegrasjoner er tilgjengeligheten av et mikroskopsystem som gjør det mulig å oppdage enkle RNA-transkripsjoner merket med MS2- eller PP7-systemet i levende celler4,12. Her utføres levende cellemikroskopi på et Confocal Spinning Disk-system montert på et invertert mikroskop, utstyrt med 100 mW solid state Lasers koblet til et akustiskoptisk justerbart filter som beskrevet andre steder24. Videre, for å studere transkripsjon ved en enkelt DSB ved hjelp av reporterne, må individuelle celler overvåkes nøye for å oppnå den høyeste tidsoppløsningen, noe som krever bildeceller i flere timer, noe som gjør dette til en lav gjennomstrømningsanalyse. Likevel observerer vi flere celler parallelt med posisjoneringen som styres av et piezodrevet mikroskopstadium. For å sikre optimale miljøforhold for levende celleobservasjon over timer, plasseres mikroskopkroppen, inkludert prøvestadiet, inne i et plexiglass miljøkammer. I tillegg er et lukket inkuberingskammer montert på mikroskopstadiet og koblet til CO2- og fuktighetstilførselskontrollere.
Det første kritiske trinnet i protokollen er valg av interesseområder med celler for avbildning. Hver XY-posisjon merket for avbildning må inneholde en eller flere celler som viser transfeksjon med fluorescerende RNA-stamcellebindingsproteiner i henhold til reportergenet og transfeksjonsordningen beskrevet i avsnitt 1, tabell 1, samt i figur 2D, E. Videre må cellene vise lyse merkede transkripsjonssteder må være co-transfektert med I-SceI-GR-iRFP713-konstruksjonen, og proteinet må først lokaliseres i cytoplasma (figur 2D og E).
Cellene skal vise et fluorescensintensitetsnivå av ubundet fluorescerende merket MS2- og/eller PP7-frakkprotein som er lavt nok til å oppdage enkeltmerkede transkripsjoner over bakgrunnsfluorescensnivået. Samtidig er et robust fluorescensintensitetsnivå av fluorescerende merket MS2 og / eller PP7-frakkproteiner nødvendig for å tillate avbildning over minst 60 minutter uten å miste for mye fluorescens på grunn av noe bleking som oppstår. "Skalabildevisning" med et fast område som beskrevet i avsnitt 3.7, brukes til å tillate et standardisert utvalg av celler i henhold til fluorescensintensitetsnivået.
Et annet kritisk protokolltrinn er å legge TA til cellene på forhåndsbestemte XY-posisjoner gjennom det lille hullet i lokket på glassbunnsfatet. Enhver manipulering av glassbunnsfatet vil føre til et skifte fra den markerte XY-posisjonen til cellene og må unngås. Derfor er nøye håndtering av mikropipetten mens du legger til TA fortynnet i det cellulære vekstmediet viktig for forhåndsvalgte cellers vellykkede observasjon, som vist i figur 2F. Tilpasningen av forskjellige systemer for å legge til stoffer i celler montert på et mikroskopstadium, for eksempel et perfusjonssystem, ville kreve et eget trinn inkubasjonskammer med rørinngang og utgangsåpninger og et pumpe- eller injeksjonssystem for å administrere legemidler. Andre metoder som kanalsklier med dekslerlip-lignende bunnflater resulterer i en langsom spredning av administrerte legemidler inn i kanalen og forårsaker en ekstra forsinkelse mellom legemiddeltilsetning og effekt. Til slutt kan utilsiktet pipettering inn i en kanalsklieåpning også forskyve prøveposisjonen. Derfor er det nåværende systemet med et tilpasset boret hull i lokket på en glassbunnsfat grei å tilpasse, lav pris og egnet for administrering av forskjellige vekstmedier, stoffer og komponenter. Den lille diameteren på hullet og den fuktede atmosfæren i trinninkubasjonskammeret forhindrer også tørking ut av cellemediet.
Et tredje kritisk skritt i denne protokollen er dataanalysen, som krever en manuell inspeksjon av tidspunktene når transkripsjonen opphører på grunn av induksjon av en DSB. Tidspunktet for avsluttende transkripsjon indikeres ved å frigjøre de siste transkripsjonene fra det tidligere lyse merkede stedet for reportergentranskripsjonen. På samme måte må hendelsene ved break-duced transkripsjon initiering inspiseres med forsiktighet for å oppdage individuelle transkripsjonshendelser med det relativt lave signal-til-støy-forholdet mellom enkelt fluorescerende merket mRNAer.
Dynamikken i reparasjon av den induserte DSB legger et ekstra lag av kompleksitet til analysene av data generert ved hjelp av disse reporterne, og begrenser dem til de første minuttene umiddelbart etter induksjon av DSB. Den transgene naturen til reportergener og den repeterende rike naturen til MS2- og PP7-stamløkkematrisene kan sette sammen et unikt kromatinlandskap, som forstyrrer etableringen av putative stabile break-induserte transkripsjonsprogrammer. Likevel, sammenlignet med ioniserende- eller UV-bestråling, er I-SceI mediert induksjon av en DSB i reportergener et mye mer robust system for å undersøke transkripsjon ved individuelle DSB-er.
Ulike endonukleasesystemer som I-CreI, I-PpoI eller AsiSI som har eller ikke har ytterligere anerkjennelsessteder i det menneskelige genom, kan kombineres med dagens reportergensystemer for en mulig høyere effektivitet ved å generere DSB-er. Imidlertid krever de først å introdusere endonuclease anerkjennelsesstedet i reportergenene. For det andre kan de ha en lignende variasjon på tidspunktet og effektivitetsinduksjonen av en DSB i individuelle celler. På den annen side kan innsetting av tandemkopier av endonuclease anerkjennelsessteder øke effektiviteten til DSB-induksjon. Videre vil testing av de presenterte reportergensystemene i forskjellige cellelinjer tillate sammenligning av transkripsjonsdynamikk på DSB-nettsteder mellom forskjellige cellulære bakgrunner og tilgjengeligheten av forskjellige DNA-skadereparasjonsveier som i kreftceller, primærceller og differensierte ikke-sykkelceller. Imidlertid begrenser byggingen av reportergenene som skal være kompatible med Flp / FRT-systemet for tiden integrasjonen i tilgjengelige Flp / FRT-vertscellelinjer.
I tillegg til mikroskopibaserte anvendelser, kan de nåværende reportergenene også kombineres med biokjemiske analyser, for eksempel kromatinimmunoprecipitation, for å studere rekruttering av DNA-reparasjons- eller transkripsjonsfaktorer til en enkelt DSB eller for å vurdere nukleosombelegg, histone modifikasjoner og kromatintilstand rundt DSB-nettstedet. Videre vil en kombinasjon med ulike reportersystemer tillate studiet av funksjonelle koblinger mellom DNA-skade og prosesser som genomorganisasjon eller DNA-replikasjon.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikt å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker RH Singer, J.A. Chao, T. Misteli, M. Carmo-Fonseca for gaver av plasmider og reagenser. Vi står også i gjeld til iMM Bioimaging Facility ansatte, A. Temudo, A. Nascimento, og J. Rino, for kritisk lesing av manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av PTDC/MED-OUT/32271/2017, PTDC/BIA-MOL/30438/2017 og PTDC/MED-OUT/4301/2020 fra Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Portugal og lisboa-01-0145-FEDER-007391, prosjekt cofunded av FEDER gjennom POR Lisboa, Portugal 2020-Programa Operacional Regional de Lisboa, og FCT. Støtten ble også mottatt fra EU Horizon 2020 Research and Innovation Programme (RiboMed 857119). M.A. er mottaker av FCT Ph.D. fellowship 2020.05899.BD.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100 mW solid-state Lasers | Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA | ||
| 3i Marianas SDC Confocal Spinning Disk system | Intelligent Imaging Innovations Inc. | ||
| Air-cooled EMCCD Camera Evolve 512 | Photometrics, Tucson, AZ USA | ||
| Axio Observer Z1 inverted microscope | Carl Zeiss MicroImaging, Germany | ||
| Blasticidin | InvivoGen | ant-bl-1 | |
| charcoal-stripped fetal bovine serum | Sigma-Aldrich | F6765-500 ML | |
| CO2 module S | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
| CSU-X1 confocal spinning disk unit | Yokogawa Electric, Tokyo, Japan | ||
| DMEM | Gibco | 41966029 | |
| DMEM with Hepes no PhenolRed | Gibco | 21063-029 | |
| Doxicyclin | Sigma-Aldrich | D9891 | for induction of reporter gene expression; stock solution of 0.5 mg/ml was used at 1:1000 dillution in cell growth medium |
| FBS | Gibco | 10270106 | |
| Flp-In T-REx 293 cell line | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | R75007 | |
| I-SceI-24x MS2 stem loop sequence | GeneArt, Thermo Fischer Scientific | custom synthesized DNA fragment containing a single I-SceI recognition sequence and 24 tandem MS2 stem loop sequences | |
| Heating Device Humidity 2000 | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
| Hygromycin B | Roche | 10843555001 | |
| Immersion oil Immersol 518 F | Carl Zeiss MicroImaging Inc.) | 444960-0000-000 | |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | |
| Lipofectamin 3000 helper reagent P3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | transfection helper reagent |
| Lipofectamine 3000 reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000001 | lipid-based transfection reagent |
| MatTek 35 mm dish, Glass bottom No. 1.5 | MatTek Corporation, Ashland, MA, USA | P35G-1.5-10-C | |
| microscope incubation chamber | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
| pcDNA5/FRT/TO | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | V652020 | |
| pOG44 plasmid | Thermo Fischer Scientific Invitrogen | V600520 | |
| SlideBook 6.0 Software | Intelligent Imaging Innovations Inc. | ||
| stage incubation chamber PeCon P-Set 2000 | PeCon GmbH, Erbach, Germany | ||
| StaQtool Software | iMM-JLA Lisbon, Portugal | available at: https://imm.medicina.ulisboa.pt/facility/bioimaging/lib/exe/fetch.php?media=STaQTool_setup.zip | |
| triamcinolone acetonide (TA) | Sigma-Aldrich | T6501 | synthetic glucocorticoid; induces the glucocorticoid receptor to migrate from the cytoplasm to the nucleus |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Thermo Fisher Scientific | R001100 |
References
- Jackson, S. P., Bartek, J. The DNA-damage response in human biology and disease. Nature. 461 (7267), 1071-1078 (2009).
- Capozzo, I., Iannelli, F., Francia, S., d'Adda di Fagagna, F. Express or repress? The transcriptional dilemma of damaged chromatin. FEBS Journal. 284 (14), 2133-2147 (2017).
- Michelini, F., et al. Damage-induced lncRNAs control the DNA damage response through interaction with DDRNAs at individual double-strand breaks. Nature Cell Biology. 19 (12), 1400-1411 (2017).
- Vítor, A. C., et al. Single-molecule imaging of transcription at damaged chromatin. Science Advances. 5 (1), (2019).
- Michalik, K. M., Böttcher, R., Förstemann, K. A. Small RNA response at DNA ends in Drosophila. Nucleic Acids Research. 40 (19), 9596-9603 (2012).
- Wei, W., et al. A role for small RNAs in DNA double-strand break repair. Cell. 149 (1), 101-112 (2012).
- Francia, S., et al. Site-specific DICER and DROSHA RNA products control the DNA-damage response. Nature. 488 (7410), 231-235 (2012).
- Vítor, A. C., Huertas, P., Legube, G., de Almeida, S. F. Studying DNA double-strand break repair: An ever-growing toolbox. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 24 (2020).
- Alt, F. W., et al. Synthesis of secreted and membrane-bound immunoglobulin mu heavy chains is directed by mRNAs that differ at their 3' ends. Cell. 20 (2), 293-301 (1980).
- Watakabe, A., Tanaka, K., Shimura, Y. The role of exon sequences in splice site selection. Genes & Development. 7 (3), 407-418 (1993).
- Guth, S., Martínez, C., Gaur, R. K., Valcárcel, J. Evidence for substrate-specific requirement of the splicing factor U2AF(35) and for its function after polypyrimidine tract recognition by U2AF(65). Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8263-8271 (1999).
- Martin, R. M., Rino, J., Carvalho, C., Kirchhausen, T., Carmo-Fonseca, M. Live-cell visualization of pre-mRNA splicing with single-molecule sensitivity. Cell Reports. 4 (6), 1144-1155 (2013).
- Peabody, D. S. The RNA binding site of bacteriophage MS2 coat protein. The EMBO Journal. 12 (2), 595-600 (1993).
- Lim, F., Peabody, D. S. RNA recognition site of PP7 coat protein. Nucleic Acids Research. 30 (19), 4138-4144 (2002).
- Chao, J. A., Patskovsky, Y., Almo, S. C., Singer, R. H. Structural basis for the coevolution of a viral RNA-protein complex. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (1), 103-105 (2008).
- Bertrand, E., Chartrand, P., Schaefer, M., Shenoy, S. M., Singer, R. H., Long, R. M. Localization of ASH1 mRNA particles in living yeast. Molecular Cell. 2 (4), 437-445 (1998).
- Larson, D. R., Zenklusen, D., Wu, B., Chao, J. A., Singer, R. H. Real-time observation of transcription initiation and elongation on an endogenous yeast gene. Science. 332 (6028), 475-478 (2011).
- Soutoglou, E., et al. Positional stability of single double-strand breaks in mammalian cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 675-682 (2007).
- Rouet, P., Smih, F., Jasin, M. Introduction of double-strand breaks into the genome of mouse cells by expression of a rare-cutting endonuclease. Molecular and Cellular Biology. 14 (12), 8096 (1994).
- Roukos, V., Voss, T. C., Schmidt, C. K., Lee, S., Wangsa, D., Misteli, T. Spatial Dynamics of Chromosome Translocations in Living Cells. Science. 341 (6146), New York, N.Y. 660 (2013).
- Rino, J., de Jesus, A. C., Carmo-Fonseca, M. STaQTool: Spot tracking and quantification tool for monitoring splicing of single pre-mRNA molecules in living cells. Methods. 98, 143-149 (2016).
- Hamperl, S., Bocek, M. J., Saldivar, J. C., Swigut, T., Cimprich, K. A. Transcription-replication conflict orientation modulates R-Loop levels and activates distinct DNA damage responses. Cell. 170 (4), 774-786 (2017).
- D'Alessandro, G., d'Adda di Fagagna, F. Transcription and DNA Damage: Holding Hands or Crossing Swords. Journal of Molecular Biology. 429 (21), 3215-3229 (2017).
- Boulant, S., Kural, C., Zeeh, J. C., Ubelmann, F., Kirchhausen, T. Actin dynamics counteract membrane tension during clathrin-mediated endocytosis. Nature Cell Biology. 13 (9), 1124-1131 (2011).
