Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Enkeltmolekylavbildning av EWS-FLI1-kondensater som monteres på DNA

Published: September 8, 2021 doi: 10.3791/62974
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Center for Quantitative Biology, Peking-Tsinghua Center for Life Sciences, Academy for Advanced Interdisciplinary Studies, Peking University
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi bruken av enkeltmolekylavbildningsmetoden, DNA Curtains, for å studere den biofysiske mekanismen til EWS-FLI1-kondensater som settes sammen på DNA.

Abstract

Fusjonsgenene som følge av kromosomal translokasjon er funnet i mange solide svulster eller leukemi. EWS-FLI1, som tilhører FUS / EWS / TAF15 (FET) -familien av fusjonsonkoproteiner, er et av de hyppigst involverte fusjonsgenene i Ewing sarkom. Disse FET-familiefusjonsproteinene har vanligvis et lavkompleksitetsdomene (LCD) av FET-protein ved deres N-endestasjon og et DNA-bindende domene (DBD) ved deres C-endestasjon. EWS-FLI1 har blitt bekreftet å danne biomolekylære kondensater ved målbindingsstedet på grunn av LCD-LCD- og LCD-DBD-interaksjoner, og disse kondensatene kan rekruttere RNA-polymerase II for å forbedre gentranskripsjonen. Hvordan disse kondensatene monteres på bindingsstedene er imidlertid fortsatt uklart. Nylig ble en enkeltmolekylær biofysikkmetode - DNA-gardiner - brukt for å visualisere disse monteringsprosessene av EWS-FLI1-kondensater. Her diskuteres de detaljerte eksperimentelle protokoll- og dataanalysetilnærmingene for anvendelse av DNA-gardiner ved å studere de biomolekylære kondensatene som samles på mål-DNA.

Introduction

Transkripsjonsregulering er et avgjørende skritt for presis genuttrykk i levende celler. Mange faktorer, som kromosomal modifikasjon, transkripsjonsfaktorer (TFs) og ikke-kodende RNA, deltar i denne kompliserte prosessen 1,2,3. Blant disse faktorene bidrar TFs til spesifisiteten av transkripsjonsregulering ved å gjenkjenne og binde seg til spesifikke DNA-sekvenser kjent som promotorer eller forsterkere og deretter rekruttere andre funksjonelle proteiner for å aktivere eller undertrykke transkripsjon 4,5,6,7. Hvordan disse TFene klarer å søke etter sine målsteder i det menneskelige genomet og samhandle med DNA belagt med histoner og ikke-histon DNA-bindende proteiner, har forvirret forskere i flere tiår. I løpet av de siste årene har flere klassiske modeller for målsøkemekanismen til TFs blitt bygget for å beskrive hvordan de "glir", "hopper", "hopper" eller "intersegmentoverføring" langs DNA-kjeden 8,9,10,11. Disse modellene er fokusert på søkeadferden på DNA fra ett enkelt TF-molekyl. Nyere studier viser imidlertid at noen TFer gjennomgår væske-væskefaseseparasjon (LLPS) enten alene i kjernen eller med Mediator-komplekset12. De observerte dråpene av TFs er assosiert med promotor- eller forsterkerregionene, og fremhever rollen som biomolekylær kondensatdannelse i transkripsjon og det tredimensjonale genomet13,14,15. Disse biomolekylære kondensatene er knyttet til membran-manglende rom in vivo og in vitro. De dannes via LLPS, hvor modulære biomakromolekyler og iboende uordnede regioner (IDR) av proteiner er to hoveddrivkrefter for multivalente interaksjoner16. Dermed søker TFs ikke bare DNA, men fungerer også synergistisk innenfor disse kondensatene 4,17,18. Til dags dato er den biofysiske egenskapen til disse transkripsjonskondensatene på DNA fortsatt uklar.

Derfor hadde denne studien som mål å anvende en enkeltmolekylmetode - DNA-gardiner - for direkte å avbilde dannelsen og dynamikken til transkripsjonskondensatene dannet av TFs på DNA in vitro. DNA Curtains, en høy gjennomstrømning in vitro bildebehandlingsplattform for å studere samspillet mellom proteiner og DNA, har blitt brukt i DNA-reparasjon 19,20,21, målsøk22 og LLPS 17,23,24. Strømningscellen til DNA-gardiner er belagt med biotinylerte lipid-dobbeltlag for å passivere overflaten og la biomolekylene diffundere på overflaten. De nanofabrikkerte sikksakkmønstrene begrenser bevegelsen av DNA. Biotinylerte Lambda DNA-substrater kan justeres langs barrierekantene og strekkes av den orienterte bufferstrømmen. De samme start- og sluttsekvensene av alle molekylene tillater sporing av proteinet på DNA og beskriver posisjonsfordelingen av bindingshendelsene25,26. Videre bidrar kombinasjonen av DNA-gardiner med total intern refleksjonsfluorescensmikroskopi (TIRFM) til å minimere bakgrunnsstøyen og oppdage signaler på et enkeltmolekylnivå. Dermed kan DNA Curtains være en lovende metode for å undersøke dynamikken i transkripsjonskondensatdannelse på DNA-motiver. Dette papiret beskriver eksemplet på en FUS / EWS / TAF15 (FET) familiefusjon onkoprotein, EWS-FLI1, generert av kromosomal translokasjon. Lambda-DNA som inneholder 25× GGAA - bindingssekvensen til EWS-FLI127 - ble brukt som DNA-substrat i DNA Curtains-eksperimentene for å observere hvordan EWS-FLI1-molekyler gjennomgår LLPS på DNA. Dette manuskriptet diskuterer eksperimentelle protokoll- og dataanalysemetoder i detalj.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling av lipid dobbeltlags masterblanding

  1. Skyll hetteglass med dobbeltdestillert vann (ddH2O) og 99 % etanol og tørk dem i en 60 °C tørkeovn.
  2. Lag lipidmasterblandingen ved å oppløse 1 g 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfokolin (DOPC), 100 mg polyetylenglykolreagerte (PEGylerte) lipider (18:1 av 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin-N-[metoksy (polyetylenglykol)-2000] (ammoniumsalt) (PEG2000 DOPE) og 25 mg biotinylerte lipider (18:1 av 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin-N-(cap biotinyl) (natriumsalt) (Biotinyl Cap DOPE)) i 10 ml kloroform.
  3. Tilbered 1 ml aliquots av lipidmasterblandingen per hetteglass og oppbevar dem ved -20 °C i rene hetteglass.
    MERK: Oppbevar oppløst lipid i hetteglass og dekk hetteglasshetten med parafilm under oppbevaring.

2. Tilberedning av liposomoppløsning

  1. Skyll et 2 ml hetteglass med ddH2O og 99 % etanol og tørk det grundig i en tørkeovn på 60 °C.
  2. Skyll en 250 μL glasssprøyte med kloroform og overfør deretter 200 μL av lipidmasterblandingen til det tørre hetteglasset.
  3. Bruk en nitrogenspraypistol til å strømme N2 forsiktig mens hetteglasset kontinuerlig roteres i én retning.
    NOTAT: N2 vil bidra til å fordampe kloroformen, og de resterende lipidene vil danne en tynn film på veggen av glassflasken. Juster nitrogenstrømmen til å være veldig forsiktig i begynnelsen og øk strømmen når en hvit film vises i hetteglasset; Fullfør denne fordampningsprosessen innen 5 minutter.
  4. Overfør hetteglasset til en vakuumtørkeovn ved romtemperatur (RT) i 16-24 timer for fullstendig fjerning av kloroformen fra lipidene.
  5. Tilsett 2 ml fersk lipidbuffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5) og 100 mM NaCl) i hetteglasset og løs opp lipidene ved RT i 2 timer. Vortex løsningen flere ganger og overfør den til et 5 ml polypropylenkulturrør.
  6. Sonikere lipidoppløsningen på is med en mikrospiss sonicator for å danne små unilamellære vesikler, ved hjelp av følgende innstillinger: 6 s on-12 s off (20% amplitude) i 6 sykluser, deretter 6 s on-6 s off (30% amplitude) i 3 sykluser, til slutt 10 s på (40% amplitude).
    NOTAT: Temperaturøkningen under sonikering kan føre til sprengning av skum og ødelegge liposomene. Kontroller derfor skummets tilstand og temperaturen og fyll isen ofte.
  7. Filtrer liposomene gjennom et 0,22 μm nylonsprøytefilter, aliquot, og oppbevar det ved 4 °C.
    MERK: Når mobiliteten minker ved langvarig lagring, må liposomene brukes om 2-3 måneder eller tilberedes ferskt før bruk.

3. Sekvenskloning og biotinylering av Lambda DNA

  1. Innsetting av bindingsmotivene i Lambda DNA
    1. Fordøy målfragmentet som inneholder bindingsmotivene og Lambda DNA med NheI og XhoI. Ligate målfragmentet med Lambda DNA ved hjelp av T4 ligase over natten på RT.
    2. Kultur E.coli VCS257 celler i antibiotikafritt LB-medium til OD600 når 0,6. Oppbevar bakteriene ved 4 °C for senere bruk.
    3. Varm opp ligeringsløsningen ved 65 °C i 20 minutter for å denaturere T4-ligasen.
    4. Tine Lambda-fagekstraktet, bland det med det ligerte produktet forsiktig ved pipettering med stumpe spisser, og inkuber blandingen ved RT i 2 timer.
    5. Tilsett 500 μL SM-buffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl og 8 mM MgCl2, filtrert gjennom et 0,22 μm filter) og 20 μL kloroform i emballasjeblandingen fra trinn 3.1.4, bland godt og sentrifuger løsningen.
      MERK: Aktiviteten til emballasjeekstraktet kan opprettholdes ved 4 °C i lengre perioder.
    6. Klargjør reaksjonsblandingen ved å blande 10 μL emballasjeekstrakt med 90 μL SM-buffer og 100 μL av VCS257-cellene (fra trinn 3.1.2) sammen, og inkuber blandingen ved 37 ° C i 15 minutter.
      MERK: Konsentrasjonen av emballasjeløsningen avhenger av tettheten til fagplakkene dagen etter. Det kan fortynnes eller tilsettes etter behov.
    7. Ta ~ 5 ml smeltet topp agar (22 g / L NZCYM kjøttkraft med 15 g / L agar) i et 15 ml rør. Så snart toppagaren avkjøles til ~ 42 ° C, tilsett reaksjonsblandingen (fra trinn 3.1.6) sakte ved hjelp av en stump pipette og hell væsken på en antibiotikafri LB-agarplate. Oppbevar tallerkenen i en 37 °C inkubator over natten.
    8. Bekreft de positive plakettene blant de gjennomsiktige fagplakettene på den øverste agarplaten ved PCR. Overfør de positive plakettene til en ny topp agarplate med pipette og oppbevar platen i en 37 °C inkubator over natten.
    9. Tilsett 400 μL VCS257-celler i 400 μL buffer som inneholder 10 mM MgCl 2 og 10 mM CaCl2, inokuler en plakett i denne celleblandingen, og inkuber den i en 37 ° C shaker ved 250 o / min i 15 minutter.
    10. Tilsett 800 μL av denne suspensjonen som inneholder fagplakk til 200 ml NZCYM-buljong i en 2-liters kolbe og inkuber den i en 37 ° C shaker ved 125 o / min.
    11. Mål OD600 av bakteriesuspensjonen etter ~4 timer med dyrking. Husk at OD600-verdien vil stige først og deretter falle til et trau på ~ 0,2. Stopp inkubasjonen når OD 600-verdien er i ferd med å stige igjen, tilsett500 μL kloroform, og rist ved 80 o / min i ytterligere 5 minutter.
      MERK: Økningen i OD600 etter trauet vil skje raskt; OD600-verdien må derfor måles oftere når den synker til 0,3 for å unngå overdreven VCS257-cellevekst i kulturen.
    12. Overfør fagkulturen til en 500 ml flaske, tilsett 11,7 g NaCl, og rist flasken. Inkuber flasken på is i 10 min.
    13. Overfør suspensjonen likt til fire 50 ml rør. Sentrifuge rørene på 12.000 x g i 10 min.
      MERK: Alle disse sentrifugeringstrinnene i avsnitt 3.1 må gjøres ved 4 °C.
    14. Overfør supernatantene til fire nye 50 ml rør og sentrifuge igjen med samme hastighet i 5 min.
    15. Samle supernatantene, tilsett 10 % (w/v) PEG8000-pulver og roter ved 4 °C for å ruge i 30 minutter.
    16. Sentrifuger suspensjonene fra trinn 3.1.15 ved 12 000 x g i 15 minutter for å oppnå fagpellets.
    17. Resuspend pellets i 1 ml fagfortynningsbuffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCl og 10 mM MgCl2) i fire rør og hell alle 4 ml av disse blandingene i et 50 ml rør.
    18. Tilsett RNase A (10 mg / ml) og DNase I (4 mg / ml) til 20 μg / ml og 5 μg / ml endelige konsentrasjoner og inkuber ved 37 ° C i 30 minutter for å nedbryte overskytende nukleinsyrer.
    19. Tilsett 4,5 ml 300 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2,76 ml 0,5 M etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), 1,67 ml 10 % natriumdodecylsulfat (SDS) og 75 μL proteinase K (10 mg/ml) i slangen, og inkuber ved 65 °C i 10 minutter.
    20. Tilsett 4,5 ml forkjølt 3 M kaliumacetat, og inkuber på is i 10 minutter.
    21. Sentrifuge ved 8 000 x g i 10 minutter, og spinn supernatanten i ytterligere 5 minutter ved 10 000 x g.
    22. Tilsett 70% volum isopropanol i den oppsamlede supernatanten (fra trinn 3.1.21) med tilstrekkelig blanding, inkuber ved RT i 2 min, og sentrifuge deretter ved 8000 x g i 10 minutter. Kast isopropanol og spinn igjen i 5 minutter.
      MERK: DNA-pelleten vil bli smurt før den første 10 min sentrifugering; Pelleten vil bli konsentrert i bunnen av røret etter den andre 5 min sentrifugering.
    23. Vask det utfelte DNA med 2-3 ml 70% etanol og spinn ned igjen i 1 min. Tørk pelleten ved 4 °C i 2 timer, og resuspender deretter DNA i 500 μL te-buffer (10 mM Tris-HCl (pH 8,0) og 1 mM EDTA) over natten ved RT.
    24. Overfør DNA til et 1,5 ml rør og spinn det ved 18 000 x g i 3 minutter. Overfør DNA til et nytt 1,5 ml rør. Aliquot det rensede Lambda-DNA-et og oppbevar det ved -20 °C.
  2. Biotin-Lambda DNA-preparat
    1. Smelt 50 μL renset Lambda-DNA med klonede motiver ved 65 °C i 10 min.
      MERK: Siden Lambda DNA er ~ 48 kbp lang, må den varmes opp før pipettering for å unngå DNA-brudd.
    2. Bland 50 μL lambda DNA, 1 μL biotinprimer (5' - (Phos) - AGG TCG CCG CCC - BIOTEG - 3') (100 μM) og 54 μL ddH2O sammen. Kokuber blandingen ved 65 °C i 5 minutter og la den stå på benken for å kjøle seg ned til RT.
    3. Tilsett 12 μL 10x T4 ligasebuffer og 3 μL T4 ligase, og inkuber ved RT i flere timer eller over natten.
    4. Tilsett et likt volum fenol-kloroform (1: 1) blanding til ligeringsproduktet, bland godt umiddelbart og sentrifuger ved 12 000 x g i 2 minutter ved RT.
    5. Overfør den øvre vandige fasen som inneholder DNA forsiktig til et nytt rør, tilsett et likt volum kloroform, bland godt og sentrifuger deretter ved 12.000 x g i 2 minutter.
    6. Overfør den øvre vandige fasen til et nytt rør, tilsett et likt volum isopropanol og 10% av volumet av 3 M natriumacetat, og inkuber ved RT i 2 minutter. Sentrifuger blandingen ved 12 000 x g i 5 minutter.
    7. Fjern supernatanten, vask pelleten med 75% etanol, og sentrifuger deretter ved 12 000 x g i 5 minutter.
    8. Fjern 75% etanol, lufttørk DNA ved RT i 10 minutter, og bruk 120 μL TE-buffer for å oppløse DNA.
    9. Tilsett 60 μL buffer A (30 % (w/v) PEG8000 og 30 mM MgCl 2) til 120 μL av oppløsningen fra trinn3.2.8, og roter ved 4 °C i 20-24 timer.
    10. Sentrifuger blandingen ved 18 000 g i 5 minutter, og fjern supernatanten.
    11. Bruk 180 μL forkjølt 75% etanol til å vaske pelleten, og gjenta trinn 3.2.10.
    12. Tørk pelleten ved RT, og bruk 100 μL TE150-buffer for å løse opp DNA.

4. Nanofabrikkerte sikksakk-barrierer

  1. Rengjør lysbilder i aceton i 20 minutter ved sonikering og overfør dem til en ny glassbeholder med 1 M NaOH for sonikering i ytterligere 20 minutter. Bland 90 ml H 2 SO4 med 30 ml H 2 O2, og senk lysbildene i denne blandingen i 30 minutter. Skyll lysbildene med aceton og isopropanol og tørk lysbildene med N2.
    MERK: Blanding av H 2 SO4 og H 2 O2er en eksoterm prosess; ta tilstrekkelige sikkerhetstiltak under operasjonen.
  2. Belegg det rensede lysbildet med polymetylmetakrylat (PMMA) 25 kDa, PMMA 49,5 kDa, og det øverste laget av ledende beskyttende belegg etter hverandre. Bruk elektronstrålelitografi til å skrive sikksakkbarrierene (figur 1A).
  3. Vask lysbildene med ddH 2 O forå fjerne det ledende beskyttende belegget og tørk lysbildene med N2.
  4. Sett inn et 30 nm lag krom (Cr) ved hjelp av en magnetron sputtering maskin og fjern de resterende PMMA-lagene med aceton.
    MERK: En flytcelle kan gjenbrukes for mer enn 20 DNA Curtains-eksperimenter. For å gjenbruke flowcellen, vask den med etanol, vaskemiddel og NaOH.

5. Rensing av EWS-FLI1 protein

MERK: Observasjonen av 500 nM EWS-FLI1 på Lambda DNA med 25× GGAA-motiver tjener som et godt eksempel for anvendelse av DNA-gardiner til kondensatdannelse. EWS-FLI1 er et fusjonsprotein som kombinerer N-terminalen til EWSR1 (1-265) og C-terminalen til FLI1 (220-453). En mCherry-tag ble smeltet til N-terminalen til EWS-FLI1-fusjonsproteinet for visualisering.

  1. Klon EWS-FLI1-genet til en rekonstituert pRSF-vektor eller en hvilken som helst annen egnet prokaryote ekspresjonsvektor.
  2. Transformer plasmidkodingen 7x His-mCherry-EWSFLI1 til E.coli BL21 (DE3) -stammen; vokse en enkelt koloni i 5 ml LB-medium ved 37 °C over natten. Når OD600-verdien når 0,6-0,8 etter overføring til 2 liter LB-medium, tilsett 0,5 mM IPTG og rist cellekulturen ved 18 °C i 16-18 timer.
  3. Sentrifuger kulturen for å fjerne supernatanten og resuspendere cellene med lysisbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 M KCl; 1 M urea; 10 mM imidazol; 1,5 mM beta-merkaptoetanol (β-ME); og 5% glyserol).
  4. Etter sonikering og sentrifugering ved 18000 × g i ~ 30 minutter, legg supernatanten på Ni-NTA-harpiks likevektet i et 5 ganger volum lysisbuffer, og vask deretter harpiksen med et 10 ganger volum vaskebuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 M KCl, 1 M urea, 40 mM imidazol, 1,5 mM β-ME og 5% glyserol).
  5. Eluter det bundne proteinet med 15 ml elueringsbuffer (50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 M KCl, 1 M urea, 500 mM imidazol, 1,5 mM β-ME og 5 % glyserol) og konsentrer eluering til ~500 μL.
  6. Legg den konsentrerte proteinløsningen på en gelfiltreringskolonne og analyser produktene ved SDS-polyakrylamidgelelektroforese. Fryses raskt det rensede proteinet i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 °C.

6. Fremstilling av en DNA Gardiner flowcell

  1. Forbered en flytcelle med zig-zag nanofabrikkerte barrierer for et DNA-gardineksperiment og bestem strømningsretningen. For å gjøre dette, koble inngangs- og utgangsrørene i riktig retning.
  2. Vask strømningscellen med 2,5 ml lipidbuffer ved hjelp av to 3 ml sprøyter. Forsikre deg om at det ikke er noen boble i flytcellen.
  3. Fjern sprøyten fra output, og injiser 1 ml liposomoppløsning (40 μL liposom fra seksjon 2 og 960 μL lipidbuffer) tre ganger med 5 min inkubasjon etter hver injeksjon.
  4. For helbredelsestrinnet, vask strømningscellen med 2,5 ml lipidbuffer sakte, og inkuber ved RT i 30 minutter.
    MERK: Helbredelsestiden kan være lengre om nødvendig; Hvis det oppstår bobler, utfører du dobbelthealing ved å gjenta trinn 5.3 og 5.4 for å fjerne boblene.
  5. Klargjør 30 ml bovint serumalbumin (BSA) buffer (40 mM Tris-HCl (pH 7,5), 2 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol og 0,5 mg/ml BSA for overflatepassivering). Etter 30 minutters helbredelse, vask strømningscellen med 2,5 ml BSA-buffer fra utgangssiden.
    MERK: BSA-stamløsningen er en 20 mg/ml oppløsning som oppbevares ved 4 °C og må brukes innen 1-2 uker. BSA-konsentrasjonen i bufferen kan justeres i henhold til overflatetilstanden.
  6. Injiser 800 μL streptavidinbuffer (10 μL av en 1 mg / ml streptavidin-lager, 790 μL BSA-buffer) i strømningscellen fra inngangssiden i to trinn med 10 minutters inkubasjon etter hvert trinn.
    MERK: Streptavidin forankrer DNA på lipidene på grunn av dets multivalens ved å bygge bro mellom biotinylerte lipider og biotinylert DNA.
  7. Vask flowcellen med 2,5 ml BSA-buffer for å fjerne alle frie streptavidinmolekyler.
  8. Fortynn Biotin-Lambda DNA med klonede motiver fra seksjon 3 ved bruk av BSA-buffer (2,5 μL DNA og 998 μL BSA-buffer). Injiser Lambda DNA 4 ganger sakte med 5 minutters mellomrom.
  9. Slå på mikroskopet og det vitenskapelige systemet Complementary Metal Oxide Semiconductor (sCMOS) under injeksjonen. Vask slangen med 10 ml ddH 2 O. Skyll prismet og slangekontakten med vann,2% flytende kyvetterens og 99% etanol. Forbered bildebufferen ved å tilsette KCl og dobbeltstrenget DNA-fargestoff i BSA-bufferen for å oppnå endelige konsentrasjoner på henholdsvis 150 mM og 0,5 nM, og ta opp minst 20 ml av bildebufferen i en 30 ml sprøyte.
  10. Sett opp strømningscellen på mikroskoptrinnet og koble den til det mikrofluidiske systemet.
  11. Bruk en strømningshastighet på 0,03 ml / min for å skylle DNA-molekylene til barrieren i 10 minutter, inkuber i 30 minutter med strømmen stoppet, og slå den deretter av for å la DNA diffundere sideveis.
    MERK: Formålet med denne 30 minutters inkubasjonen er å la DNA-molekylet fordele jevnere foran barrieren gjennom enkel diffusjon fordi DNA-molekyler har en tendens til å samle seg på siden av barrieren som er lukket for inngangen der de skylles inn. Inkubasjonstiden kan justeres etter behov.

7. Avbildning av kondensdannelse av EWS-FLI1 på DNA-gardiner

  1. Åpne bildebehandlingsprogramvaren, finn og merk posisjonene til de 3 × 3 sikksakkmønstrene under lyst felt.
  2. Slå på strømmen ved 0,2 ml / min for å flekke DNA med dobbeltstrenget DNA-fargestoff i 10 minutter.
  3. Fortynn mCherry-EWS-FLI1 med bildebufferen til konsentrasjonen på 100 nM i 100 μL i røret.
  4. Legg proteinprøven gjennom ventilen med en 100 μL glasssprøyte, og endre strømningshastigheten til 0,4 ml / min.
  5. Slå på 488 nm laser og forhåndssøk hver region for å sjekke DNA-distribusjonstilstanden; velg regionen der DNA-molekylene fordeler jevnt. Sett lasereffekten til 10 % for 488 nm laser og 20 % for 561 nm laser. Bruk effektmåleren til å måle den virkelige lasereffekten nær prismet: 4,5 mW for 488 nm laser og 16,0 mW for 561 nm laser.
  6. Bilde anskaffelse
    1. Begynn å hente bilder med 2 s intervaller med både 488 nm og 561 nm lasere samtidig.
    2. Bytt ventilen fra manuell modus til injeksjonsmodus for å la bildebufferen skylle proteinprøven inn i strømningscellen etter 60 s.
      MERK: Denne prosessen vil ta ~ 30 s, og synsfeltet vil bli dekket med mCherry-signaler så snart EWS-FLI1-proteinene når strømningscellen.
    3. For å fjerne fri EWS-FLI1, fortsett å vaske strømningscellen med bildebufferen i 5 minutter med bare 561 nm laser slått på. Stopp gjennomstrømningen og inkuber ved 37 °C i 10 minutter.
    4. Slå på strømmen ved 0,4 ml / min for å la DNA-et utvide seg, og ta bilder med 2 s intervaller mellom forskjellige rammer for å oppnå data med høy gjennomstrømning av EWS-FLI1 kondensatdannelse.

8. Intensitetsanalyse for mCherry-EWS-FLI1

  1. Importer dataene som bildesekvenser til ImageJ-programvaren, velg puncta på 25× GGAA-nettsteder i en 8× 8 piksler firkant, og lagre bildet i .tif format.
  2. Beregn intensiteten som summen av intensiteten i kvadratet på 8×8 piksler, inkludert hele punktumet, og fjern bakgrunnen ved å trekke bakgrunnsintensiteten i et område av samme størrelse nær kvadratet på 8 x 8 piksler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Skjemaet for DNA-gardiner er vist i figur 1A, figur 1B og figur 1D. Den klonede målsekvensen som inneholder 25 uavbrutte repetisjoner av GGAA finnes i NORB1-promotoren i Ewing sarkom. Denne målsekvensen er avgjørende for rekruttering av EWS-FLI128. EWS-FLI1-molekyler ble visualisert ved å oppdage de mCherry-merkede EWS-FLI1-signalene oppnådd med en 561 nm laser (figur 1C og figur 1E). Etter at et DNA Curtains-eksperiment ble satt opp, kunne in vitro-dannelsen av biomolekylære kondensater av EWS-FLI1 på 25× GGAA-stedene til DNA-substratet visualiseres direkte (figur 1B-E). Spesifisiteten til mCherry-EWS-FLI1 brukt i DNA-gardiner ble bekreftet av en elektroforetisk mobilitetsskiftanalyse ved hjelp av en DNA-mal som inneholder 25× GGAA og uten GGAA separat (figur 2A). I tillegg ble konsentrasjonen av EWS-FLI1 titrert fra 20 nM til 500 nM, og intensiteten av puncta på 25× GGAA-stedene ble bestemt. Sammenlignet med intensiteten til mCherry-FLI1DBD økte intensiteten til EWS-FLI1 dramatisk, mens endringen i intensiteten til FLI1DBD var ubetydelig når proteinene ble mettet for å dekke de 25× GGAA-stedene. Derfor tyder disse resultatene sterkt på at EWS-FLI1 dannet kondensater på DNA (figur 2B-E).

Figure 1
Figur 1: EWS-FLI1 kondensatdannelse på Lambda DNA med 25× GGAA-motiver. (a) Skjematisk av DNA-gardiner. (B og D) To strategier for å oppdage EWS-FLI1-kondensater (500 nM) som monteres på Lambda DNA: (B) Fortsett å vaske i 10 minutter;(D)inkubere i 10 min. (C og E) Representativt bredfelt totalt internt refleksjonsfluorescensmikroskopibilde av DNA-gardiner: (C) Deteksjonsstrategi i B; (E) Deteksjonsstrategi i D. C (ii) og E (ii) DNA er zoomet inn for å vise den distinkte puncta dannet på et enkelt DNA-substrat. DNA-substrater er Lambda DNA med 25× GGAA-motiver. Tallene "1, 2, 3, 4" representerer forskjellige posisjoner av puncta på ett Lambda DNA, og "3" er der 25× GGAA mikrosatellittsekvensen ble klonet. Skalastenger = 4,9 μm (C, E (i)) og 0,7 μm (C, E (ii)). Dette tallet er endret fra 24. Forkortelse: dsDNA = dobbeltstrenget DNA. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Bindingshendelser for det frittliggende domenet til mCherry-EWS-FLI1 på 25× GGAA gjentas. (A) (i) mCherry-EWS-FLI1. (ii) Elektroforetisk mobilitetsskiftanalyse av mCherry-EWS-FLI1: 306-bp dsDNA merket med 5' Quasar670 ble inkubert med mCherry-EWS-FLI1 ved forskjellige konsentrasjoner under romtemperatur i 30 minutter i reaksjonsbuffer inneholdende 40 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM KCl, 2 mM MgCl 2, 1 mM DTT og0,2 mg/ml bovint serumalbumin. Prøvene ble lastet og kjørt på 1,3% agarosegel i 25 minutter, 120 V. (B-D) Bredfelt total intern refleksjon fluorescensmikroskopi bilder av 25× GGAA med DNA Gardiner etter inkubasjon med 500 nM mCherry (B), 500 nM mCherry-EWSLCD (C), eller 500 nM mCherry-FLI1DBD (D). (E) Intensitetsfordeling av EWSFLI1 (cyan) og FLI1DBD (svart) signaler på målstedet (25× GGAA) -regionen vs. proteinkonsentrasjon. Dette tallet er endret fra 24. Forkortelser: LCD = lav kompleksitet domene; DBD = DNA-bindende domene. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Siden enkeltmolekyltilnærminger er ekstremt følsomme for innholdet i reaksjonssystemet, må det investeres ekstra innsats for å sikre god kvalitet på alle materialer og løsninger under DNA-gardineksperimentene, spesielt lipidene fremstilt i avsnitt 1 og 2 og bufferne som brukes i avsnitt 5. Reagenser med høyere renhet må brukes til å fremstille buffere, og buffere må tilberedes for enkeltmolekylanalysen

Da 500 nM mCherry-merket EWS-FLI1 ble spylt inn i kammeret, dukket det opp flere magenta puncta på Lambda DNA som inneholdt de 25× GGAA-sekvensene. Legg merke til at det var en påfølgende ikke-spesifikk fordeling av magenta-signaler gjennom hele DNA selv etter 10 minutters vask med tom buffer (figur 1B, C). Interessant nok ble EWS-FLI1-molekyler omorganisert på DNA under 10 minutters inkubasjon uten bufferstrømmen og samlet i flere puncta (figur 1D, E). En av disse puncta ble dannet på det klonede 25× GGAA-stedet, mens alle andre ble dannet i regionene som inneholdt en høy tetthet av påfølgende GGAA-motiver. Dette fenomenet antyder sterkt at ikke-strømningsinkubasjonsprosedyren tillater EWS-FLI1-molekyler å søke i loci og montere på DNA raskere.

Flere kontrolleksperimenter må utføres for å avklare hvordan disse kondensatene dannes på DNA-gardiner. Vi renset mCherry, mCherry-EWSLCD og mCherry-FLI1DBD og fulgte samme prosedyre for å injisere disse proteinene i kammeret. Verken mCherry (figur 2B) eller mCherry-EWSLCD (figur 2C) etterlot noen signaler på DNA, noe som indikerer at FLI1DBD av EWS-FLI1 var nødvendig for interaksjonen med DNA. For å bekrefte at faseseparasjon forekom i DNA-gardiner ved så lave proteinkonsentrasjoner, ble konsentrasjonen av mCherry-EWS-FLI1 titrert fra 25 nM til 500 nM, og intensiteten av hver puncta på ett DNA-molekyl ble bestemt på klonestedet (figur 2E). En sammenligning med intensiteten av fusjon TF FLI1DBD merket med mCherry viste at selv om puncta-intensitetene til EWS-FLI1 og FLI1-DBD var like ved lave proteinkonsentrasjoner, økte intensiteten av EWS-FLI1 dramatisk mens den for FLI1DBD forble lav selv når konsentrasjonen nådde 500 nM. Disse resultatene antyder at EWS-FLI1-molekyler binder seg til 25× GGAA-sekvensen og settes sammen til et kondensat på det gjennom LCD-interaksjoner. En enkelt FLI1DBD kan binde 2x GGAA-motiver, og oligomerer av høyere orden binder seg til svært repeterende lavaffinitetssekvenser27. mCherry-FLI1DBD-signalet på 25× GGAA-sekvensen var fra en proteinklynge i stedet for et individuelt proteinmolekyl. Selv om mCherry-FLI1DBD kunne binde de 25× GGAA-stedene, klarte den ikke å montere som kondensat på DNA, og bekreftet at LCD-LCD-interaksjonen var nødvendig for faseseparasjon (figur 2D, E).

Enkeltmolekylmetoder gjør det mulig for forskere å studere dynamikken i transkripsjonsfaktorkondensater. DNA Curtains-metoden har noen fordeler sammenlignet med andre enkeltmolekylmetoder som enkeltmolekylfluorescensenergioverføring (smFRET)29, superoppløsningsbilde 30 og optisk pinsett31,32. For det første tillater DNA Curtains-metoden rekonstituering av transkripsjonsmaskineriet på langt genomisk DNA in vitro og sanntidsobservasjon av transkripsjonskondensatdannelse med datainnsamling med høy gjennomstrømning. For det andre tillater justerte DNA-molekyler kartlegging av kondensatets posisjon på hver DNA-streng. Dermed kan de foretrukne DNA-sekvensene for puncta-dannelse enkelt bestemmes.

Videre er langsiktig oppkjøp mulig med DNA-gardiner, noe som muliggjør måling av on-rate (k on) og off-rate (koff) av en punctum. Ikke desto mindre har DNA Curtains noen iboende tekniske feil, noe som nødvendiggjør at bevisene fra forskjellige metoder skal undersøkes kollektivt. På den ene siden kan oppløsningen av DNA-gardiner bare nå 0,18 μm eller ~ 1,000-bp fordi den lange Lambda DNA-malen har en begrensning med hensyn til diffraksjonsgrensen, noe som kan hindre differensieringen av to nærliggende fluorescenssignaler. På den annen side brukes strømmen til å utvide dobbeltstrenget DNA (dsDNA), og kraften som påføres biomolekylet kan påvirke diffusjonsegenskapen til proteinene som binder seg til DNA. Dobbeltbundet DNA Gardiner kan forankre begge ender av dsDNA og registrere bevegelsen av proteiner uten strømning, noe som er en bemerkelsesverdig løsning33. For å oppsummere, vil en dypere forståelse av den dynamiske samlingen av biomolekylære kondensater på DNA i sanntid kaste lys over ikke bare den biofysiske mekanismen til LLPS, men også den grunnleggende biologien til LLPS-relaterte cellulære prosesser, for eksempel gentranskripsjonsregulering24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NSFC Grants No. 31670762 (Z.Q.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
488 nm diodepumped solid-state laser Coherent OBIS488LS
561 nm diodepumped solid-state laser Coherent OBIS561LS
Agar Rhawn R003215-50g
biotinylated DOPE Avanti 870273P
Bovine Serum Albumin Sigma A7030
Chloroform Amresco 1595C027
Coating Electra 92 Allresist GmbH AR-PC 5090.02 The conductive protective coating
Deoxyribonuclease I bovine Sigma D5139-2MG
DOPC Avanti 850375P
DTT Sigma D9779
Glass coverslip Fisher Scientific 12-544-7
Hellmanex III Sigma Z805939-1EA
KCl Sigma 60130
Lambda DNA NEB N3013S
Lambda Packing Extracts Epicentre MP5120
MgCl2 Sigma M2670
NaCl Sigma s3014
Nanoport Idex N-333-01
NheI-HF NEB R3131S
Nikon Inverted Microscope Nikon Eclipse Ti
NZCYM Broth Sigma N3643-250G
PEG-2000 DOPE Avanti 880130P-1G
PEG-8000 Amresco 25322-68-3
PMMA 200K, ETHYL LACTATE 4% Allresist GmbH AR-P 649.04
PMMA 950K, ANISOLE 2% Allresist GmbH AR-P 672.02
Prime 95B Scientific CMOS camera PHOTOMETRICS Prime95B
proteinase K NEB P8107S
Silica glass slide G.Finkenbeiner
Six-way injection valve Idex MXP9900-000
Streptavidin Thermo S888 Diluted with ddH2O
Syringe pump Harvard Apparatus Pump11 Elite
T4 DNA Ligase NEB M0202S
Tris base Sigma T6066
XhoI NEB R0146V
YOYO-1 Iodide (491/509) Invitrogen Y3601 Diluted with DMSO

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cramer, P. Organization and regulation of gene transcription. Nature. 573 (7772), 45-54 (2019).
  2. Zhang, Y., Reinberg, D. Transcription regulation by histone methylation: interplay between different covalent modifications of the core histone tails. Genes & Development. 15 (18), 2343-2360 (2001).
  3. Wang, X., et al. Induced ncRNAs allosterically modify RNA-binding proteins in cis to inhibit transcription. Nature. 454 (7200), 126-130 (2008).
  4. Alexander, K. A., et al. p53 mediates target gene association with nuclear speckles for amplified RNA expression. Molecular Cell. 81 (8), 1666-1681 (2021).
  5. Matsui, T., Segall, J., Weil, P. A., Roeder, R. G. Multiple factors required for accurate initiation of transcription by purified RNA polymerase-II. Journal of Biological Chemistry. 255 (24), 1992-1996 (1980).
  6. Stadhouders, R., Filion, G. J., Graf, T. Transcription factors and 3D genome conformation in cell-fate decisions. Nature. 569 (7756), 345-354 (2019).
  7. Peng, Y., Zhang, Y. Enhancer and super-enhancer: Positive regulators in gene transcription. Animal Models and Experimental Medicine. 1 (3), 169-179 (2018).
  8. Lambert, S. A., et al. The human transcription factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
  9. Normanno, D., Dahan, M., Darzacq, X. Intra-nuclear mobility and target search mechanisms of transcription factors: a single-molecule perspective on gene expression. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (6), 482-493 (2012).
  10. Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. Biochemistry. 20 (24), 6929-6948 (1981).
  11. Loverdo, C., et al. Quantifying hopping and jumping in facilitated diffusion of DNA-binding proteins. Physical Review Letters. 102 (18), 188101 (2009).
  12. Boija, A., et al. Transcription factors activate genes through the phase-separation capacity of their activation domains. Cell. 175 (7), 1842-1855 (2018).
  13. Sabari, B. R., et al. Coactivator condensation at super-enhancers links phase separation and gene control. Science. 361 (6400), (2018).
  14. Kim, S., Shendure, J. Mechanisms of interplay between transcription factors and the 3D genome. Molecular Cell. 76 (2), 306-319 (2019).
  15. Shrinivas, K., et al. Enhancer features that drive formation of transcriptional condensates. Molecular Cell. 75 (3), 549-561 (2019).
  16. Banani, S. F., Lee, H. O., Hyman, A. A., Rosen, M. K. Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 18 (5), 285-298 (2017).
  17. Zhou, H., et al. Mechanism of DNA-induced phase separation for transcriptional repressor VRN1. Angewandte Chemie International Edition. 58 (15), 4858-4862 (2019).
  18. Rao, S., Ahmad, K., Ramachandran, S. Cooperative binding between distant transcription factors is a hallmark of active enhancers. Molecular Cell. 81 (8), 1651-1665 (2021).
  19. Qi, Z., et al. DNA sequence alignment by microhomology sampling during homologous recombination. Cell. 160 (5), 856-869 (2015).
  20. Qi, Z., Greene, E. C. Visualizing recombination intermediates with single-stranded DNA curtains. Methods. 105, 62-74 (2016).
  21. Ma, C. J., Gibb, B., Kwon, Y., Sung, P., Greene, E. C. Protein dynamics of human RPA and RAD51 on ssDNA during assembly and disassembly of the RAD51 filament. Nucleic Acids Research. 45 (2), 749-761 (2017).
  22. Sternberg, S. H., Redding, S., Jinek, M., Greene, E. C., Doudna, J. A. DNA interrogation by the CRISPR RNA-guided endonuclease Cas9. Nature. 507 (7490), 62-67 (2014).
  23. Larson, A. G., et al. Liquid droplet formation by HP1 alpha suggests a role for phase separation in heterochromatin. Nature. 547, 236-240 (2017).
  24. Zuo, L., et al. Loci-specific phase separation of FET fusion oncoproteins promotes gene transcription. Nature Communications. 12 (1), 1491 (2021).
  25. Collins, B. E., Ye, L. F., Duzdevich, D., Greene, E. C. DNA curtains: novel tools for imaging protein-nucleic acid interactions at the single-molecule level. Methods in Cell Biology. 123, 217-234 (2014).
  26. Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. -L. DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
  27. Gangwal, K., Close, D., Enriquez, C. A., Hill, C. P., Lessnick, S. L. Emergent properties of EWS/FLI regulation via GGAA microsatellites in Ewing's sarcoma. Genes & Cancer. 1 (2), 177-187 (2010).
  28. Sizemore, G. M., Pitarresi, J. R., Balakrishnan, S., Ostrowski, M. C. The ETS family of oncogenic transcription factors in solid tumours. Nature Reviews. Cancer. 17 (6), 337-351 (2017).
  29. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  30. Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. W. Super-resolution fluorescence microscopy. Annual Review of Biochemistry. 78, 993-1016 (2009).
  31. Bustamante, C., Bryant, Z., Smith, S. B. Ten years of tension: single-molecule DNA mechanics. Nature. 421 (6921), 423-427 (2003).
  32. Bustamante, C., Chemla, Y. R., Moffitt, J. R. High-resolution dual-trap optical tweezers with differential detection. Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. Selvin, P. R., Ha, T. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
  33. Zhao, Y. L., Jiang, Y. Z., Qi, Z. Visualizing biological reaction intermediates with DNA curtains. Journal of Physics D: Applied Physics. 50 (15), 153001 (2017).

Tags

Biokjemi utgave 175
Enkeltmolekylavbildning av EWS-FLI1-kondensater som monteres på DNA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zuo, L., Ding, J., Qi, Z.… More

Zuo, L., Ding, J., Qi, Z. Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA. J. Vis. Exp. (175), e62974, doi:10.3791/62974 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter