Summary
Este protocolo demuestra cómo usar la planta huésped para detectar proteínas salivales de saltahojas y proteínas virales vegetales liberadas por vectores saltahojas.
Abstract
Los insectos vectores transmiten horizontalmente muchos virus vegetales de importancia agrícola. Más de la mitad de los virus de las plantas son transmitidos por insectos hemípteros que tienen piezas bucales perforadoras y chupadoras. Durante la transmisión viral, la saliva del insecto une el virus-vector-huésped porque los vectores de saliva los virus, y las proteínas del insecto, desencadenan o suprimen la respuesta inmune de las plantas de los insectos a los huéspedes de las plantas. La identificación y el análisis funcional de las proteínas salivales se están convirtiendo en una nueva área de enfoque en el campo de investigación de las interacciones arbovirus-huésped. Este protocolo proporciona un sistema para detectar proteínas en la saliva de los saltahojas utilizando la planta huésped. El vector saltahojas Nephotettix cincticeps infectado con el virus enano del arroz (RDV) sirve como ejemplo. La vitelogenina y la principal proteína P8 de la cápside externa del RDV vectorizada por la saliva de N. cincticeps se pueden detectar simultáneamente en la planta de arroz de la que se alimenta N. cincticeps. Este método es aplicable para probar las proteínas salivales que se retienen transitoriamente en el huésped de la planta después de la alimentación de insectos. Se cree que este sistema de detección beneficiará el estudio de las interacciones hemíptero-virus-planta o hemíptero-planta.
Introduction
El modo de transmisión vector-huésped de los arbovirus, un problema fundamental, está en la frontera de la ciencia biológica. Muchos virus vegetales de importancia agrícola son transmitidos horizontalmente por insectos vectores1. Más de la mitad de los virus de las plantas son vectorizados por insectos hemípteros, incluidos pulgones, moscas blancas, saltahojas, saltamontes y trips. Estos insectos tienen características distintivas que les permiten transmitir eficientemente los virus de las plantas1. Poseen piezas bucales perforadoras-chupadoras y se alimentan de la savia del floema y el xilema, y secretan su saliva 1,2,3,4. Con el desarrollo y la mejora de las técnicas, la identificación y el análisis funcional de los componentes salivales se están convirtiendo en un nuevo foco de investigación intensiva. Las proteínas salivales conocidas en la saliva incluyen numerosas enzimas, como pectinesterasa, celulasa, peroxidasa, fosfatasa alcalina, polifenol oxidasa y sacarasa, entre otras 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Las proteínas en la saliva también incluyen elicitores que desencadenan la respuesta de defensa del huésped, alterando así el rendimiento de los insectos, y efectores que suprimen la defensa del huésped, lo que mejora la aptitud del insecto y los componentes que inducen respuestas patológicas del huésped14,15,16,17. Por lo tanto, las proteínas de la saliva son materiales vitales para la comunicación entre insectos y huéspedes. Durante la transmisión de virus, la saliva secretada por las glándulas salivales de los insectos virulíferos penetrantes y chupadores también contiene proteínas virales. Los componentes virales utilizan el flujo de saliva para liberarlos del insecto al huésped de la planta. Por lo tanto, la saliva del insecto une la interacción tritrófica virus-vector-huésped. Investigar la función biológica de las proteínas de la saliva secretadas por insectos virulíferos ayuda a comprender la relación virus-vector-huésped.
Para los virus animales, se informa que la saliva de los mosquitos media la transmisión y patogenicidad del virus del Nilo Occidental (VNO) y el virus del dengue (DENV). La proteína salival AaSG34 promueve la replicación y transmisión del virus del dengue-2, mientras que la proteína salival AaVA-1 promueve la transmisión del virus DENV y Zika (ZIKV) mediante la activación de la autofagia18,19. La proteína salival D7 de los mosquitos puede inhibir la infección por DENV in vitro e in vivo a través de la interacción directa con los viriones DENV y la proteína20 de la envoltura DENV recombinante. En virus vegetales, el begomovirus tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) induce la proteína salival de mosca blanca Bsp9, que suprime la inmunidad mediada por WRKY33 de la planta huésped, para aumentar la preferencia y el rendimiento de las moscas blancas, aumentando eventualmente la transmisión de virus21. Debido a que los estudios sobre el papel que desempeñan las proteínas salivales de los insectos en los huéspedes de las plantas se han quedado atrás de los de los huéspedes animales, se requiere urgentemente un sistema estable y confiable para detectar las proteínas salivales en los huéspedes de las plantas.
El virus vegetal conocido como virus enano del arroz (RDV) es transmitido por el saltahojas Nephotettix cincticeps (Hemiptera: Cicadellidae) con alta eficiencia y de manera persistentemente propagativa22,23. Se informó por primera vez que el RDV era transmitido por un insecto vector y causa una enfermedad grave del arroz en Asia24,25. El virión es icosaédrico y esférico de doble capa, y la capa externa contiene la proteína22 de la cápside externa P8. El período de transmisión circulativa de RDV en N. cincticeps es de 14 días 26,27,28,29,30. Cuando el RDV llega a las glándulas salivales, los viriones se liberan en las cavidades almacenadas en saliva en las glándulas salivales a través de un mecanismo similar a la exocitosis23. La vitelogenina (Vg) es el precursor proteico vitelino esencial para el desarrollo de ovocitos en insectos hembra31,32,33. La mayoría de las especies de insectos tienen al menos una transcripción Vg de 6-7 kb, que codifica una proteína precursora de aproximadamente 220 kDa. Los precursores proteicos de Vg generalmente se pueden escindir en fragmentos grandes (140 a 190 kDa) y pequeños (<50 kDa) antes de ingresar al ovario18,19. Análisis proteómicos previos revelaron la presencia de los péptidos derivados de Vg en la saliva secretada del saltahojas Recilia dorsalis, aunque se desconoce su función (datos inéditos). Se ha informado recientemente que Vg, que es secretada por vía oral de los saltamontes, funciona como un efector para dañar las defensas de las plantas34. Se desconoce si el Vg de N. cincticeps también podría liberarse al huésped de la planta con flujo salival, y luego podría desempeñar un papel en la planta para interferir con las defensas de la planta. Para abordar si N. cincticeps explota proteínas salivales, como Vg, para inhibir o activar las defensas de la planta, el primer paso es identificar las proteínas liberadas a la planta durante la alimentación. Comprender el método para identificar las proteínas salivales presentes en la planta es potencialmente esencial para explicar la función de las proteínas de la saliva y las interacciones entre los hemípteros y las plantas.
En el protocolo presentado aquí, N. cincticeps se utiliza como ejemplo para proporcionar un método para examinar la presencia de proteínas salivales en la planta huésped introducidas a través de la alimentación de insectos. El protocolo detalla principalmente la recolección y detección de proteínas salivales y es útil para una mayor investigación en la mayoría de los hemípteros.
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Protocol
Los saltahojas adultos no virulíferos se propagaron en el Centro de Investigación de Virus Transmitidos por Vectores en la Universidad de Agricultura y Silvicultura de Fujian, China.
1. Cría de insectos no virulíferos
- Críe a los adultos en plántulas de arroz en una jaula cúbica de 40 cm x 35 cm x 20 cm (largo x ancho x alto). Mantenga un lado de la jaula cubierto con una red a prueba de insectos para ventilación.
- Mantener las jaulas con saltahojas en una incubadora que contenga un controlador de humedad incorporado a 26 °C con una humedad relativa del 60-75% bajo un fotoperiodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad.
- Use un aspirador para transferir suavemente a todos los adultos de su jaula a una nueva jaula que contenga plántulas de arroz fresco cada semana.
- Deje que más de 200 adultos se apareen y pongan huevos en el arroz.
- Retenga las viejas plántulas de arroz para que emerjan las ninfas. Cría a estas nuevas ninfas no virulíferas a la etapa de 2 estrellas.
2. Adquisición de virus y recolección de insectos virulíferos
- Transfiera cuidadosamente las ninfas no virulíferas de 2 estadios a un tubo de cultivo de vidrio (2,5 cm de diámetro por 15 cm de alto) durante 1-2 h para la inanición con el aspirador.
- Libere a las ninfas en una jaula que contenga una planta de arroz infectada con RDV cultivada en una maceta.
- Permita que las ninfas se alimenten de la planta de arroz infectada durante 2 días.
NOTA: Riegue cuidadosamente la planta de arroz y evite lavar las ninfas. Las ninfas de 2 estrellas miden aproximadamente 1.6-2 mm de largo.
- Transfiera cuidadosamente estas ninfas a una nueva jaula que contenga plántulas de arroz frescas libres de virus con una humedad relativa del 60-75% bajo un fotoperíodo de 16 h de luz y 8 h de oscuridad. Permita que las ninfas se alimenten de la planta de arroz infectada durante 12 días para completar el período de transmisión circulativa de RDV.
3. Recolección de proteínas salivales usando una jaula de alimentación
- Prepare cinco pequeñas jaulas de alimentación en forma de tubo (2,5 cm de diámetro por 4 cm de alto) en las que un extremo esté cubierto con una red a prueba de insectos.
- Confine 15-20 saltahojas en cada jaula de alimentación, y luego cubra el otro extremo de la jaula con una estera de espuma delgada.
- Fije una plántula de arroz (5-6 cm de altura) entre el extremo de la jaula y una estera de espuma con cintas. Asegúrese de que los saltahojas en la jaula de alimentación puedan alimentarse de las plántulas de arroz expuestas al interior de la jaula.
- Sumerja las raíces de las plántulas en agua para que la planta de arroz permanezca viva. Permita que los saltahojas se alimenten de ellos durante 2 días.
- Retire los saltahojas de sus jaulas de alimentación y recoja las plántulas de arroz de las que se alimentaron. Corte las partes de las plántulas fuera de la jaula y recupere las regiones de alimentación de las plántulas.
NOTA: Esta muestra se puede almacenar a -80 °C durante 3 meses como máximo, si no se utiliza instantáneamente para la detección.
4. Preparación del reactivo
- Disuelva 15.1 g de Tris-base, 94 g de glicina y 5 g de SDS en 1 L de agua estéril para preparar 5xTris-glicina tampón. Diluir 200 ml de tampón 5xTris-glicina con 800 mL de agua estéril para preparar 1xTampón Tris-glicina (ver Tabla 1 para la composición tampón).
- Disuelva 80 g de NaCl, 30 g de Tris-base y 2 g de KCl en 1 L de agua estéril para preparar 10xTris-buffered saline (TBS). Autoclave de la solución a 121 °C durante 15 min.
- Disolver 8 g de SDS, 4 ml de ß-mercaptoetanol, 0,02 g de azul de bromofenol y 40 ml de glicerol en 40 ml de 0,1 M de Tris-HCl (pH 6,8) para preparar 4x tampón de muestra de proteína.
- Mezcle 800 ml de tampón de tris-glicina con 200 ml de metanol para preparar el tampón de transferencia.
- Agregue 100 ml de solución de 10xTBS y 3 ml de Tween 20 a 900 ml de agua estéril para preparar el tampón TBS con solución de Tween 20 (TBST).
5. Western blot para detectar la saliva y las proteínas virales
- Moler 0,1 g de las muestras de arroz con nitrógeno líquido hasta que el tejido se convierta en polvo. Agregue 200 μL de tampón de muestra de proteína 4x a la muestra y hiérvala durante 10 minutos. Centrifugar las muestras a 12.000 x g durante 10 min a temperatura ambiente.
- Retire el sobrenadante y colóquelo en un vial nuevo. Cargue 10 μL de la muestra en un gel SDS-PAGE y ejecútela en tampón Tris-glicina a 150 V durante 45-60 min.
NOTA: El residuo después de la centrifugación puede desecharse.
- Retire el sobrenadante y colóquelo en un vial nuevo. Cargue 10 μL de la muestra en un gel SDS-PAGE y ejecútela en tampón Tris-glicina a 150 V durante 45-60 min.
- Coloque una membrana de nitrocelulosa de 0,45 μm y otros suministros sándwich en el búfer de transferencia durante 30 minutos.
NOTA: Este paso se puede hacer antes de que el gel haya completado su ejecución. - Coloque el gel en un sándwich y transfiéralo durante 90-120 min a 100 V en el búfer de transferencia.
- Tome la membrana y colóquela en una solución bloqueadora de leche en polvo sin grasa al 7% en solución TBST durante 20 minutos. Agregue el anticuerpo específico contra RDV P8 o Vg a una solución al 7% de leche en polvo descremada en TBST. Incubar con el anticuerpo para teñir la membrana durante 2 h o durante la noche.
- Lave la membrana con solución TBST tres veces, con 5 minutos de lavado cada vez.
- Agregue la IgG anti-conejo de cabra como anticuerpo secundario a la leche en polvo descremada al 7% con TBST. Incubar con el anticuerpo durante 60-90 min a temperatura ambiente.
- Lave la membrana con solución TBST tres veces durante 5 minutos cada vez.
- Utilice el kit ECL Western para el método quimioluminiscente. Reactivos de detección de mezcla 1 y 2 en el kit en una proporción de 1:1 en un tubo. Coloque el reactivo mezclado en la membrana e incube el blot durante 5 min.
- Drene el exceso de reactivo y tome una imagen colorimétrica de la imagen quimioluminiscente. Combínalos para ver la escalera con bandas de proteínas.
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Representative Results
La Figura 1 ilustra todos los pasos de este protocolo: la cría de insectos, la adquisición de virus, la recolección de proteínas salivales a través de la alimentación con arroz y el western blot. Los resultados de Western blots mostraron que se observaron bandas específicas y esperadas de aproximadamente 220 kDa en las muestras de arroz y glándulas salivales de alimentación de insectos en la membrana incubada con anticuerpos contra Vg. En contraste, no se observó ninguna banda en la muestra de arroz no alimentado. El resultado en la Figura 2 indica que Vg fue liberado a la planta huésped como una proteína salival. En la membrana incubada con anticuerpos contra RDV P8, también se observó una banda específica y esperada de aproximadamente 46 kDa en las muestras de arroz que habían sido sometidas a alimentación y en los cuerpos de cuerpos de insectos viruliferos. En contraste, no se observó ninguna banda en la muestra de arroz no alimentado y en los cuerpos de saltahojas no viruliferos, como se muestra en la Figura 3. Este resultado demostró que las proteínas virales también podían detectarse en las plantas de alimentación.
Figura 1: Resumen de los pasos en la detección de proteínas salivales. Los pasos incluyen la cría de insectos, la adquisición de virus, la recolección de proteínas salivales a través de la alimentación de plantas y la transferencia occidental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Ensayo de Western blot de Vg en muestras de plantas e insectos. Carril 1, plantas no alimentadoras; Carril 2, plantas virulíferas que se alimentan de saltahojas; Carril 3, glándulas salivales viruliferas del saltahojas; Carril M, marcador. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ensayo Western blot de P8 en muestras de plantas e insectos. Carril 1, plantas no alimentadoras; Carril 2, plantas virulíferas que se alimentan de saltahojas; Carril 3, cuerpos virulíferos de saltahojas; Carril 4, cuerpos de saltahojas no viruliferos; M, marcador. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Búfer | Composición | Comentarios/Descripción |
| 5x tampón de tris-glicina | 15,1 g Base Tris 94 g de glicina 5 g de SDS en 1 L de agua estéril |
Solución de stock |
| 1x tampón de tris-glicina | 200 ml de 5x tampón de tris-glicina 800 ml de agua estéril |
Solución de trabajo, para SDS-PAGE |
| 10 tampones de solución salina tamponada con Tris (TBS) | 80 g de NaCl 30 g de base Tris 2 g de KCl en 1 L de agua estéril |
Solución de stock |
| TBS con solución Tween 20 (TBST) | 100 ml de solución 10x TBS 3 ml de interpolación 20 900 ml de agua estéril |
Solución de trabajo |
| 4x tampón de muestra de proteína | 8 g SDS 4 ml de β-mercaptoetanol 0,02 g de azul de bromofenol 40 ml de glicerol en 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8) |
Para la extracción de proteínas |
| Búfer de transferencia | 800 ml de tampón de tris-glicina 200 ml de metanol |
Para la transferencia de proteínas |
Tabla 1: Tampones, soluciones y reactivos utilizados en el estudio. Se enumeran la composición de los tampones y las soluciones, junto con su uso.
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Discussion
La saliva secretada directamente por las glándulas salivales de los insectos perforadores-chupadores juega un papel fundamental porque predigiere y desintoxica los tejidos del huésped y los factores biológicos de los vectores en los huéspedes 1,3,4. Los factores biológicos entre reinos, incluyendo elicitores, efectores y ARN pequeño, son críticos para la comunicación insecto-huésped14,15,16. Por lo tanto, descubrir más variedades y funciones de componentes salivales promoverá la comprensión de la relación entre insectos y huéspedes. Aquí, se proporcionó un sistema de detección de proteínas salivales en la planta huésped, que permitirá una mayor investigación sobre la función de la proteína salival en los huéspedes de la planta.
Este protocolo proporciona técnicas para detectar las proteínas salivales de los saltahojas con piezas bucales perforadoras-chupadoras mediante la recolección de las plantas de alimentación. Se deben tener en cuenta algunos puntos notables para obtener los mejores y confiables resultados. (1) La carga viral en las plantas de arroz infectadas es crítica. Los títulos virales en las plantas de arroz afectan directamente la adquisición de insectos. Cuando la colonia de insectos es altamente virulifera, la probabilidad de recolectar proteínas virales en la saliva in vitro aumentará. Por lo tanto, las proteínas virales liberadas de la saliva a la planta huésped serán mucho más fáciles de detectar. Se recomienda elegir plantas infectadas que muestren síntomas significativos para que sirvan como fuente de virus. (2) Tiempo de detección. Se cree que algunas de las proteínas salivales son transitorias en la planta huésped porque están sujetas a degradación por el huésped vegetal o diluidas en la planta. Se recomienda la detección instantánea de las plantas de alimentación después de la alimentación de 2 días. También se plantea la hipótesis de que un tiempo de retención más largo sería mejor para algunas proteínas salivales específicas en la planta. Por lo tanto, el momento de detección de algunas proteínas salivales podría determinarse en estudios adicionales. (3) Asegúrese de que haya suficientes réplicas. El número de insectos que sobreviven disminuirá porque los insectos confinados en la jaula de alimentación tienen una actividad y capacidad limitadas para alimentarse. Usar suficientes réplicas ayudará a enriquecer las proteínas salivales. De tres a cinco réplicas suelen ser suficientes. Si solo hay una réplica, sería mejor confinar 15-20 saltahojas para alimentarse de una plántula de arroz.
Estos resultados representativos mostraron la presencia de proteína viral P8 en la planta de alimentación de saltahojas viruliferos. Se reveló que el virus mezclado con el flujo de saliva se libera de las glándulas salivales. Luego fue liberado del insecto a la planta huésped, terminando finalmente la transmisión horizontal viral. Sin embargo, todavía se desconoce si Vg desempeña el papel de elicitor o efector en el proceso de alimentación de insectos y si desencadena o suprime la respuesta inmune del huésped de la planta. Anteriormente, la saliva de más de 10.000 R. dorsalis se recolectaba mediante alimentación por membrana y se analizaba utilizando LC-MS/MS (datos no publicados). Se verificó la presencia de Vg en la saliva, aunque se desconoce su función. Aquí, se ha demostrado que Vg también existe en la saliva de N. cincticeps e incluso se libera a la planta. Combinado con los estudios sobre saltamontes16, se presume que la presencia de Vg en la saliva hemíptera es universal. Un nuevo hallazgo informa que el Vg de la saliva del saltamontes es un efector para dañar el sistema de defensa de las plantas34. Se necesitan más estudios para abordar si la Vg en la mayoría de los hemípteros de saliva funciona como un efector. Se cree que este protocolo proporciona una metodología estable y confiable para examinar la presencia de proteínas salivales secretadas por los saltahojas en las plantas. Se espera que este protocolo sea aplicable para la detección de proteínas salivales de la mayoría de los hemípteros.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31772124 y 31972239) y la Universidad de Agricultura y Silvicultura de Fujian (subvención KSYLX014).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Tris base | Roche | D609K69032 | For 5×Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5×Tris-glycine buffer preparation |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10×TBS buffer preparation |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10×TBS buffer preparation |
| ß-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4× protein sample buffer preparation |
| bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4× protein sample buffer preparation |
| glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4× protein sample buffer preparation |
| methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
| non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
| goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
| ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
| nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
| Buffers and Solutions | |||
| Buffer | Composition | Comments/Description | |
| 5×Tris-glycine buffer | 15.1 g Tris base 94 g glycine 5 g SDS in 1 L sterile water |
Stock solution | |
| 1×Tris-glycine buffer | 200 mL of 5×Tris-glycine buffer 800 mL sterile water |
Work solution, for SDS-PAGE | |
| 10×Tris-buffered saline (TBS) buffer | 80 g NaCl 30 g Tris base 2 g KCl in 1 L sterile water |
Stock solution | |
| TBS with Tween 20 (TBST) solution | 100 mL 10×TBS solution 3 mL Tween 20 900 mL sterile water |
Work solution | |
| 4× protein sample buffer | 8 g SDS 4 mL ß-mercaptoethanol 0.02 g bromophenol blue 40 mL glycerol in 40 mL 0.1 M Tris-HCl (pH 6.8) |
For protein extraction | |
| Transfer buffer | 800 mL Tris-glycine buffer 200 mL methanol |
For protein transfer | |
| Instruments | |||
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | SHBL3668 | For 4x protein sample buffer preparation |
| Constant temperature incubator | Ningbo Saifu Experimental Instrument Co., Ltd. | PRX-1200B | For rearing leafhoppers |
| Electrophoresis | Tanon Science & Technology Co.,Ltd. | Tanon EP300 | For SDS-PAGE |
| Electrophoretic transfer core module | BIO-RAD | 1703935 | For SDS-PAGE |
| glycerol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | For 4x protein sample buffer preparation |
| glycine | Sigma-Aldrich | WXBD0677V | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
| goat anti-rabbit IgG | Sangon Biotech | D110058-0001 | Recognization of the primary andtibody |
| High-pass tissue grinding instrument | Shanghai Jingxin Industrial Development Co., Ltd. | JXFSIPRP-24 | For grinding plant tissues |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10016318 | For 10x TBS buffer preparation |
| methanol | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10014118 | For transfer buffer preparation |
| Mini wet heat transfer trough | BIO-RAD | 1703930 | For SDS-PAGE |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | For 10x TBS buffer preparation |
| nitrocellulose membrane | Pall Corporation | 25312915 | For proteins transfer |
| non-fat dry milk | Becton.Dickinso and company | 252038 | For membrane blocking, antibodies dilution |
| Pierce ECL Western kit | ThermoFisher Scientific | 32209 | Chemiluminescent substrate |
| Protein color instrument | GE Healthcare bio-sciences AB | Amersham lmager 600 | For detecting proteins |
| SDS | Sigma-Aldrich | SLCB4394 | For 5x Tris-glycine buffer preparation |
| Tris base | Roche | D609K69032 | For 5x Tris-glycine buffer and 10×TBS buffer preparation |
| Tween 20 | Coolaber SCIENCE&TeCHNoLoGY | CT30111220 | For TBST preparation |
| Vertical plate electrophoresis tank | BIO-RAD | 1658001 | For SDS-PAGE |
| Water bath | Shanghai Jinghong Experimental equipment Co., Ltd. | XMTD-8222 | For boil the protein samples |
| β-mercaptoethanol | Xiya Reagent | B14492 | For 4x protein sample buffer preparation |
References
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