Summary
Aqui, descrevemos a radiosíntese de 1-(2-[18F]Fluoroetil)-L-triptofano, um agente de tomografia de emissão de pósitrons para estudar o metabolismo triptofano, usando uma estratégia de dois passos em um sistema de síntese radioquímica com bons rendimentos radioquímicos, alto excesso enantiomemérico e alta confiabilidade.
Abstract
A via kynurenine (KP) é uma rota primária para o metabolismo do triptofano. Evidências sugerem fortemente que os metabólitos do KP desempenham um papel vital na proliferação de tumores, epilepsia, doenças neurodegenerativas e doenças psiquiátricas devido aos seus efeitos imunodemografados, neuro modulatórios e neurotóxicos. O agente de tomografia de emissão de pósitrons mais utilizado (PET) para mapear o metabolismo triptofano, α-[11C]metil-L-triptofano ([11C]AMT), tem uma meia-vida curta de 20 minutos com procedimentos de radiosíntese trabalhosos. Um ciclotron no local é necessário para radiosintthesize [11C]AMT. Apenas um número limitado de centros produz [11C]AMT para estudos pré-clínicos e investigações clínicas. Assim, o desenvolvimento de um agente de imagem alternativo que tenha uma meia-vida mais longa, favorável à cinética in vivo , e é fácil de automatizar é urgentemente necessário. A utilidade e o valor de 1-(2-[18F]fluoroetil)-L-triptofano, um análogo triptofano de flúor-18, foi relatado em aplicações pré-clínicas em xenoenxertos derivados de linha celular, xenoenxertos derivados do paciente e modelos de tumor transgênicos.
Este artigo apresenta um protocolo para a radiosíntese de 1-(2-[18F]fluoroetil)-L-triptofano usando uma estratégia de um pote e duas etapas. Usando este protocolo, o radiotracer pode ser produzido em um rendimento radioquímico de 20 ± 5% (decadência corrigida no final da síntese, n > 20) de produção radioquímica, com pureza radioquímica e excesso enantiomerico de mais de 95%. O protocolo apresenta uma pequena quantidade precursora com no máximo 0,5 mL de solvente de reação em cada etapa, baixa carga de 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabicicclo[8.8.8]hexacosane (K222) e uma fase móvel ambientalmente benigna e injetável para purificação. O protocolo pode ser facilmente configurado para produzir 1-(2-[18F]fluoroetil)-L-triptofano para investigação clínica em um módulo comercialmente disponível.
Introduction
Em humanos, o triptofano é um componente essencial da dieta diária. O triptofano é principalmente metabolizado através da via kynurenine (KP). O KP é catalisado por duas enzimas limitantes de taxa, indoleamina 2, 3-dioxygenase (IDO) e triptofano 2, 3-dioxygenase (TDO). Mais de 95% do triptofano é convertido em kynurenine e seus metabólitos a jusante, gerando, em última análise, dinucleotídeo de nicotinamida adenina, essencial para a transdução de energia celular. O KP é um regulador chave do sistema imunológico e um importante regulador de neuroplasticidade e efeitos neurotóxicos1,2. O metabolismo anormal do triptofano está implicado em vários distúrbios neurológicos, oncológicos, psiquiátricos e metabólicos; portanto, os análogos de triptofano radiolabeled têm sido amplamente utilizados na investigação clínica. Os dois radiotratores triptofanos clinicamente mais procurados clinicamente são 11C-α-metil-L-triptofano ([11C]AMT) e 11C-5-hidroxitryptophan (11C-5-HTP)3.
Na década de 1990, o 11C-5-HTP foi usado para visualizar tumores neuroendócrinos que secretam serotonina4 e para diagnosticar e monitorar a terapia de adenocarcinoma prostático-refratária metastática. Posteriormente, foi utilizado como ferramenta de imagem para a quantificação do sistema serotonérgico no pâncreas endócrino6. 11 C-5-HTP também tem sido um rastreador promissor para a detecção não invasiva de ilhotas viáveis no transplante de ilhotas intraportais e diabetes tipo 27,8. Nas últimas duas décadas, muitos aminoácidos radiolabelados avançaram para a investigação clínica9,10. Em particular, o análogo triptofano com rótulo carbono 11 [11C]AMT recebeu ampla atenção para o mapeamento da síntese de serotonina cerebral11,12,13,14 e para localização de focos epilépticos, tumores epieptogênicos, complexo de esclerose tuberosa, gliomas e câncer de mama15,16,17, 18,19,20 (21,22,23,24,25,26). [11C] A AMT também tem alta absorção em vários tumores de baixo e alto grau em crianças27. Além disso, a análise do rastreador cinético de [11C]AMT em indivíduos humanos tem sido usada para diferenciar e classificar vários tumores e diferenciar glioma da lesão tecidual induzida por radiação15. [11C] A imagem guiada pela AMT mostra benefícios clínicos significativos em distúrbios cerebrais3,25. No entanto, devido à curta meia-vida de carbono-11 (20 min) e aos procedimentos laboriosos de radiosíntese, o uso [11C]AMT é restrito aos poucos centros PET com um ciclotron no local e uma instalação de radioquímica.
A flúor-18 tem uma meia-vida favorável de 109,8 min, em comparação com a meia-vida de 20 min de carbono-11. Cada vez mais, os esforços têm sido focados no desenvolvimento de radiotracers com rótulo flúor-18 para o metabolismo triptofano3,28. Um total de 15 radiofatores triptofanos de flúor únicos-18 foram relatados em termos de radiolabeling, mecanismos de transporte, estabilidade in vitro e in vivo, biodistribução e absorção de tumores em xenoenxertos. No entanto, a rápida defluorinação in vivo foi observada para vários rastreadores, incluindo 4-, 5-, e 6-[18F]fluorotryptophan, impedindo a tradução clínica posterior29. 5-[18F]Fluoro-α-metiltrofano (5-[18F]FAMT) e 1-(2-[18F]fluoroethyl)-L-triptofano (L-[18F]FETrp, também conhecido como (S)-2-amino-3-(1-(2-[18F]fluoroetila)-1S-indol-3-yl)ácido propanoico, peso molecular 249,28 g/mole), são os dois radiotracers mais promissores com cinética viva em modelos animais e grande potencial para superar [11 C]AMT para avaliação de condições clínicas com metabolismo deptofano desregulado28. 5-[18F]FAMT mostrou alta absorção em xenoenxertos tumorais ido1 positivos de camundongos imunocomprometidos e é mais específico para a imagem do KP do que [11C]AMT28,30. No entanto, a estabilidade in vivo de 5-[18F]FAMT continua sendo uma preocupação potencial, uma vez que nenhum dado de defluorização in vivo foi relatado além de 30 min após a injeção do tracer30.
Um estudo pré-clínico em um modelo de camundongos de meduloblastoma geneticamente modificado mostrou que, quando comparado com a fluorodeoxyglucose 18F-fluorodeoxyglucose (18F-FDG), L-[18F]FETrp teve alto acúmulo em tumores cerebrais, defluorina in vivo insignificante e baixa absorção de fundo, demonstrando uma proporção de alvo-não-alvo superior31,32. Estudos de dosimetria de radiação em camundongos indicaram que o L-[18F]FETrp tinha uma exposição de dosimetria favorável aproximadamente 20% menor do que o rastreador PET 18F-FDG 18F-FDG33. De acordo com os achados de outros pesquisadores, os dados pré-clínicos do estudo fornecem evidências substanciais para apoiar a tradução clínica de L-[18F]FETrp para a investigação de metabolismo anormal de triptofanos em humanos com distúrbios cerebrais como epilepsia, neuro-oncologia, autismo e esclerose tuberosa28,31,32,33,34,35,36 . Uma comparação geral entre os três rastreadores mais amplamente investigados para o metabolismo do triptofano, 11C-5-HTP, [11C]AMT e L-[18F]FETrp, é mostrada na Tabela 1. Tanto o 11C-5-HTP quanto o AMT têm um curto meio-período e procedimentos de radiolabelação trabalhosos. Um protocolo para a radiosíntese de L-[18F]FETrp usando uma abordagem de um pote e duas etapas é descrito aqui. O protocolo apresenta o uso de uma pequena quantidade de precursor de radiolabeling, um pequeno volume de solventes de reação, baixo carregamento de K222 tóxico, e uma fase móvel ambientalmente benigna e injetável para purificação e fácil formulação.
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Protocol
ATENÇÃO: O protocolo envolve materiais radioativos. Qualquer dose adicional de materiais radioativos poderia levar a um aumento proporcional na chance de efeitos adversos à saúde, como o câncer. Os pesquisadores devem seguir as práticas de dose "tão baixas quanto razoavelmente alcançáveis" (ALARA) para orientar o protocolo de radiosíntese com proteção adequada na célula quente ou no capô do chumbo. Minimizar o tempo de contato direto, usar um escudo de chumbo e manter a distância máxima para qualquer etapa de exposição à radiação no processo de radiosíntese são essenciais. Use um crachá de dosimetria de radiação e anéis de monitoramento das mãos durante todo o experimento, e frequentemente monitore superfícies potencialmente contaminadas, como luvas, mangas e pés. A Comissão Reguladora Nuclear (NRC), regulamentos locais e institucionais devem ser seguidos para o uso, transporte e descarte de quaisquer materiais radioativos.
1. Preparações iniciais
- Prepare 10% de etanol em fase móvel de acetato/ácido acético de 50 mM para cromatografia líquida semipreparativa de alto desempenho (HPLC).
- Coloque 3 mL de ácido acético glacial em um frasco volumoso limpo de 1000 mL. Adicione 900 mL de água ultrauso (18 milhões de resistência ohm-cm a 25 °C) no frasco volumoso; adicione aproximadamente 8 mL de solução de hidróxido de sódio de 6 M e ajuste o pH para 5,5 usando um medidor de pH calibrado e uma tira de pH. Depois que a solução esfriar até a temperatura ambiente, compõe o volume de 1000 mL com água ultrapura para preparar a solução de acetato/ácido acético de sódio de 50 mM (pH 5.5).
- Filtrar a solução através de um filtro de membrana de 0,2 μm e transferir a solução para duas garrafas de solvente de 500 mL.
- Coloque aproximadamente 250 mL do buffer acima em um frasco volumoso de 500 mL. Use um cilindro graduado para medir 50 mL de etanol farmacopeia dos Estados Unidos (USP) e adicione o etanol ao frasco volumoso. Compoja o volume a 500 mL com acetato/ácido acético de sódio de 50 mM e meça o valor do pH com uma tira de pH.
- Prepare soluções de controle de qualidade (QC) para um teste de adequação do sistema.
- Rechee as garrafas de solvente HPLC com água ultrauso fresca (solvente A) e etanol (solvente B). Prime a bomba HPLC e carregue o programa HPLC com uma taxa de fluxo de 1 mL/min consistindo de 30% de solvente A e 70% de solvente B (v/v).
- Faça uma solução de controle (solução em branco) para QC. Adicione 5 mL de cloreto de sódio de 0,9% em um frasco de vidro de 20 mL. Adicione 0,15 mL de cloreto de sódio de 23,4% na solução acima. Adicione 6 mL de fase móvel semipreparativa HPLC preparada na etapa 1.1.3 (10% etanol em acetato de sódio/ácido acético de 50 mM, pH 5.5) ao frasco de vidro.
- Prepare 1 μg/mL de L-FETrp não rótulo e 5 μg/mL de misturas racemic L-FETrp e D-FETrp (soluções padrão).
- Construa uma curva de calibração utilizando soluções L-FETrp padrão (0,1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 1,0 μg/mL, 10 μg/mL, 100 μg/mL).
- Configure a sequência HPLC. Certifique-se de que a sequência inclui uma execução da solução de amostra em branco, duas corridas do L-FETrp padrão (1 μg/mL), uma corrida das misturas L-FETrp e D-FETrp (5 μg/mL) e uma corrida das misturas radiofarmacêuticas finais.
- Execute a sequência hplc parcial para testar a adequação do sistema antes de analisar as amostras radioativas usando uma coluna HPLC analítica (250 x 4,6 mm).
- Execute uma amostra em branco e certifique-se de que o cromatograma da amostra em branco não mostra picos ou insignificantes entre o volume vazio e 10 minutos do cromatograma.
- Execute duas réplicas da solução padrão (contém 1 μg/mL de L-FETrp). Certifique-se de que as áreas do L-FETrp nas duas réplicas estejam dentro de ±5% do valor médio.
- Execute uma amostra das misturas L-FETrp e D-FETrp (5 μg/mL de L-FETrp e D-EFTrp, respectivamente). Certifique-se de que L-FETrp e D-FETrp possam ser identificados no cromatograma e na linha de base resolvidos.
- Prepare as soluções de rotulagem por rádio e outros suprimentos.
- Adicione as seguintes soluções a cinco frascos em forma de V de 1,5 mL, respectivamente. Frasco 1: 1 mL de carbonato de potássio (K2CO3)/Solução K222 (5 mg/mL K222 e 1 mg/mL K2CO3 em solução de água/acetonitrilo, 1/99, v/v) para eluição de fluoreto [18F]; Frasco 2: 0,4 mL de acetonitrilo anidro para secagem de flúor [18F]; Frasco 3: precursor de radiolagração em acetonitrilo anidro (1-2 mg em 0,5 mL de acetonitrilo anidro) para [18F]incorporação de flúor; Frasco 4: ácido clorídrico (2 M, 0,25 mL) em acetonitrilo (0,25 mL) para acidálise; Frasco 5: hidróxido de sódio de 2 M (0,25 mL) para neutralização das misturas de reação.
- Ative um cartucho de luz de metilaminanium quaternário (QMA) passando primeiro por 10 mL de solução de bicarbonato de sódio saturado, seguido por 10 mL de água ultrapura, e depois lave o cartucho com um fluxo de nitrogênio. Conditam um cartucho C8 leve e um cartucho de óxido de alumínio neutro passando por 10 mL de etanol, seguido por 10 mL de água ultrauso.
- Adicione 0,15 mL de cloreto de sódio de 23,4% e 5 mL de cloreto de sódio de 0,9% a um frasco de formulação estéril de 30 mL para ajustar a tônica e diluir a fração HPLC.
- Prepare uma solução (1 mL de tampão de acetato/ácido acético de sódio, 50 mM, pH = 5,5 preparado na etapa 1.1.1, 1 mL de etanol e 0,5 mL de água [total de 2,5 mL]) em uma seringa para enxaguar o vaso de reação; carregar em um frasco estéril de 10 mL.
2. Monte os suprimentos de radiolafação e o radiosintthesize L-[18F]FETrp
- Reúna os suprimentos de rádio.
- Ligue a potência do módulo, dióxido de carbono, ar comprimido, linhas de argônio e o poder do controlador lógico programável (PLC). Clique no botão mod_pscf18 para ativar o programa do sistema de síntese de radioquímica. Inicialize o MVP de entrada, saída e formulação, e garanta que os MVPs estejam nas posições 4, 1, 1, respectivamente.
- Certifique-se de que o loop HPLC está na posição Inject e no cartucho de luz QMA na posição de trapping de flúor [18F].
- Instale o frasco de fase móvel HPLC semipreparativo (contendo a solução preparada na etapa 1.1.3). Equilibre o sistema HPLC passando a fase móvel através da coluna QUIral HPLC (250 x 10 mm) e coluna C18 (100 x 10 mm) a uma vazão de 2 mL/min por pelo menos 30 minutos, depois troque a válvula de desvio, deixe o celular HPLC passar apenas pela coluna quiral HPLC e aumente a taxa de fluxo para 3 mL/min.
- Instale o cartucho de luz QMA na linha de captura/liberação de flúor [18F]. Instale os cartuchos de alumina/C8 empilhados entre a posição MVP de entrada 6 e o frasco intermediário, que é um frasco em forma de V de 10 mL conectado ao loop de amostra HPLC. Instale um frasco vazio de 10 mL (frasco de ventilação) na posição MVP de saída 4 com outra agulha presa ao frasco como ventilação. Instale os frascos de reagente 1-5 nas posições mvp de entrada 1-5, respectivamente.
- Instale o frasco contendo a solução de enxágue preparada na etapa 1.3.4 para a posição MVP de saída 6.
- Instale uma garrafa de resíduo de 500 mL (para coletar os resíduos HPLC que passam pelas colunas quiral e C18) para a posição MVP de formulação 1. Instale outra garrafa de resíduos de 500 mL (para coletar resíduos HPLC que passam pela coluna quiral) até a extremidade de coleta de resíduos da válvula de duas posições de quatro portas.
- Conecte o frasco de coleta de frações (solução pré-preenchida preparada na etapa 1.3.3) à posição de MVP de formulação 2. Conecte a posição DE SAÍDA MVP 3 (linha de gás) e a linha final de entrega do produto aos frascos de formulação da posição MVP 2 para recuperar o produto formulado final. Instale um frasco estéril vazio de 10 mL na posição MVP de formulação 3, que será usado como o frasco de backup para a coleta de frações de destino.
- Instale a coluna curta C18 entre a válvula de desvio de quatro portas e duas posições e o MVP de formulação.
NOTA: Durante a instalação dos frascos de reagente e formulação, certifique-se de que a oferta de argônio no painel de controle está desligada, e a pressão do argônio é zero para evitar qualquer transferência líquida inesperada durante a montagem do frasco. Verifique duas vezes todas as conexões de agulha, posições de frasco e posições de MVP para radiosíntese reprodutível.
- Radiosíntese de L-[18F]FETrp
- Receber e fazer uma pesquisa [18F]fluoreto.
- Ao receber a solução de flúor [18F](15 ± 3 gigabecquerel (GBq) no início da síntese, consulte a Tabela de Materiais), inspecione a caixa de chumbo na superfície e a 1 m para registrar as taxas máximas de exposição à radiação. Faça um teste de limpeza para garantir que a caixa de transporte não esteja contaminada. Registre a dose de flúor [18F]e o tempo.
- Transferir [18F]fluoreto.
- Transfira a radioatividade para o sistema de síntese de radioquímica.
- Conecte a linha de argônio com uma agulha curta e a linha de transferência de flúor [18F]com uma agulha longa ao frasco de flúor [18F]. Feche a porta de vidro de células quentes e a porta de chumbo.
ATENÇÃO: Use um grampo longo para empurrar para baixo ambas as agulhas; garantir que a ponta da agulha longa fique na parte inferior do frasco de flúor [18F]para que todo o flúor [18F] possa ser transferido. Normalmente, um frasco em forma de V é solicitado para a entrega de flúor [18F].
- Trap, elute e azeotropicamente seco [18F]flúor.
- Clique em Ar Supply para ativar a linha de alimentação de argônio, aumentar a pressão do argônio, ligar a linha de empurramento de flúor [18F]e empurrar o flúor aquoso [18F]através do cartucho de luz QMA. Depois de toda a radioatividade ficar presa no cartucho de luz QMA, e a leitura do detector de radioatividade é constante, aumente a pressão do argônio e exploda argônio através do cartucho por mais 5 minutos para remover o excesso de água.
- Desligue a linha de empurrar o flúor [18F], diminua a pressão do argônio para zero, mude a válvula de duas posições de seis portas da posição de captura de flúor [18F]para a posição de eluição. Abra o frasco de reação, ligue a linha de argon da posição MVP 1, empurre a solução K222/K2CO3 para o frasco de entrada da posição MVP 1 através do cartucho de luz QMA para estocarar a radioatividade no frasco de reação. Alterne a posição de eluição do flúor [18F]para a posição de trapping.
- Clique no botão Aquecer para aquecer o reator a 110 °C, ligue a saída da linha de argon 4 (linha de varredura) que se conecta ao reator e evapore o solvente no frasco de saída MVP posição 4.
- Clique no botão Esfriar para esfriar o reator à temperatura ambiente com dióxido de carbono comprimido, desligue a linha de varredura, mude a posição de MVP de entrada 1 para a posição 2 e adicione o acetonitrilo anidro no frasco 2. Ligue a linha de varredura e o aquecedor para azeotropicamente seco [18F]fluoreto a 110 °C.
- Adicione o precursor da rotulagem por radiolação e incorpore [18F]fluoreto.
- Esfrie o reator à temperatura ambiente, desligue a linha de varredura, mude a posição de MVP de entrada 2 para a posição 3 e adicione o precursor de rotulagem de radiolato no frasco 3. Feche o reator e aqueça as misturas de reação a 100 °C por 10 minutos.
- Evaporar o solvente de reação e acidolyse.
- Esfrie e abra o reator, ligue a linha de varredura e evapore o solvente de reação a 100 °C.
- Esfrie o reator, desligue a linha de varredura, troque a posição MVP de entrada 3 para a posição 4 e adicione a mistura ácido clorídrico/acetonitrilo (0,5 mL, 1/1, v/v). Aqueça a reação a 100 °C por 10 minutos para desprotegir os grupos de proteção tert-butyloxycarbony no precursor de radiolabeling.
- Neutralizar a reação.
- Esfrie o reator à temperatura ambiente e mude a posição de MVP de entrada 4 para a posição 5 para adicionar hidróxido de sódio de 2 M para neutralizar a mistura de reação. Desligue a entrada da linha de argon MVP.
- Transfira a mistura de reação para o frasco intermediário.
- Clique no botão F no MVP de saída para alternar o MVP de saída da posição de ventilação 4 para a posição 5 e, em seguida, clique no botão F no MVP de entrada para alternar o MVP de entrada da posição 5 para a posição 6. Ligue a saída da linha de argon MVP. Empurre a mistura de reação através do óxido de alumínio neutro empilhado e cartuchos C8 para o frasco intermediário instalado antes do loop de amostra HPLC.
- Enxágüe o reator e transfira a solução.
- Mude a posição de MVP de saída 5 para a posição 6, empurre a solução de enxágue no frasco de saída posição MVP 6 através do frasco de reação, e cartuchos para o frasco intermediário, sucessivamente. Observe que o volume da mistura combinada é de aproximadamente 3,5 mL. Feche a nave de reação.
- Carregue a mistura combinada no laço HPLC e purifique a mistura.
- Mude o laço HPLC da posição de injeção para a posição de carga, ligue a linha de argon MVP de entrada e carregue as misturas para o loop HPLC de 5 mL. Quando a carga estiver completa, troque o botão de carga para injetar e clique em Injetar HPLC para iniciar o cromatógrafo HPLC a uma taxa de fluxo de 3 mL/min. Clique no botão monitor HPLC para acessar o cromatograma HPLC em tempo real.
- Desvie a fração de destino para a coluna C18.
- Clique no botão MVP de desvio para desviar a fração HPLC de destino para a curta coluna C18 em aproximadamente 12 minutos.
- Lave a coluna HPLC quiral e purifique a fração na coluna C18.
- Depois que a radioatividade alvo for coletada na coluna C18 (e a fase móvel do HPLC flui para a formulação, a posição 1 do frasco de resíduos) da fórmula MVP, alterne a válvula de desvio de duas posições de quatro portas para a posição de coleta de resíduos. Lave a coluna quiral a 4 mL/min por 6 min para remover as impurezas menores de D-[18F]FETrp e outras impurezas ultravioletas (UV).
- Clique no botão MVP de desvio para desviar a fase móvel HPLC de volta para a posição MVP de formulação 1 a uma taxa de fluxo de 3 mL/min. Observe que a fase móvel passa pela coluna quiral e coluna C18 para purificar L-[18F]FETrp retido na coluna C18.
- Colete a fração alvo.
- Colete o eluente em aproximadamente 32-34 min no frasco de formulação mvp posição 2.
NOTA: Normalmente, uma fração HPLC de 2 min é coletada, e o volume total mais a solução de cloreto de sódio pré-preenchido é de 8-15 mL.
- Colete o eluente em aproximadamente 32-34 min no frasco de formulação mvp posição 2.
- Entregue a dose em um frasco final estéril do produto.
- Empurre a solução na formulação DE OCT posição 2 através da linha de entrega e filtro estéril para o frasco de dose final (através da agulha do filtro de ventilação estéril pré-instalado).
NOTA: As etapas do protocolo 2.2.9-2.2.13 são etapas utilizadas para a purificação do HPLC de L-[18F]FETrp.
- Empurre a solução na formulação DE OCT posição 2 através da linha de entrega e filtro estéril para o frasco de dose final (através da agulha do filtro de ventilação estéril pré-instalado).
- Ensaio a radioatividade e o volume de dose.
- Remova o filtro estéril e teste a atividade e o volume da dose final.
- Lave o sistema com água ultrauso seguida de etanol a 4 mL/min por pelo menos 15 min cada. Desligue a bomba HPLC e a caixa PLC; fechar o programa; desligar a linha de ar comprimido, linha de argônio e linha de dióxido de carbono; e desligar a potência principal do módulo.
- Retire a dose QC e execute as amostras de QC.
- Retire aproximadamente 0,1 mL da dose final em uma inserção de 0,2 mL de um frasco QC. Execute a amostra quente como o programa de "sequência parcial" após o teste de adequação do sistema descrito na etapa 1.2.6 .
- Analise os dados do QC e libere a dose.
- Calcular as purezas químicas e radioquímicas, o valor de excesso enantiomerico e a atividade molar; determinar o valor do pH.
- Libere a dose se todos os resultados dos testes passarem pelo intervalo aceitável.
- Receber e fazer uma pesquisa [18F]fluoreto.
3. Sistema pós-execução limpo
- Inspeções do módulo de radiolabelação usando um medidor de pesquisa Geiger-Mueller (GM) para garantir que a radioatividade esteja adequadamente deteriorada (pelo menos 24 h) antes que o sistema limpe.
- Ligue a energia do módulo de rotulagem por rádio e a potência da caixa PLC; ativar o programa do sistema de síntese radioquímica; e inicialize o MVP de entrada, MVP de saída e MVP de formulação. Mude o seletor da coluna para a posição de desvio.
- Retire os cartuchos de luz QMA, alumina e C8.
- Lave todos os frascos e linhas com água ultrauso primeiro, seguido de etanol. Seque os frascos e linhas com argônio de alta pureza.
- Sele cada ventilação da linha usando uma agulha estéril com uma tampa. Substitua os frascos de reagente e o vaso de reação por frascos queimados no forno e vaso de reação, respectivamente.
- Desligue a bomba HPLC e a caixa PLC; fechar o programa; desligar a linha de ar comprimido, linha de argônio e linha de dióxido de carbono; e desligar a potência principal do módulo.
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Representative Results
O esquema de reação é mostrado na Figura 1. O radiolabeling inclui os seguintes dois passos: 1) a reação do precursor de radiolatos com [18F]fluoreto fornece o intermediário 18F, e 2) deproteção dos grupos tert-butyloxycarbonycarbonyl e tert-butil-protecting grupos no intermediário oferece o produto final L-[18F]FETrp. Ambas as etapas de reação continuam a 100 °C por 10 min.
Antes de receber [18F]fluoreto do fornecedor comercial, monte os frascos de reagente, frascos de formulação e cartuchos; equilibrar os sistemas semi-preparatórios, QC; e executar um teste de adequação do sistema QC. O fluxo de trabalho detalhado para a radiosíntese de L-[18F]FETrp está descrito na Figura 2. Resumindo, a radioatividade é pesquisada e transferida para o sistema de síntese radioquímica, e o flúor [18F]é azeotropicamente seco no vaso de reação após os passos de captura/liberação. Após a incorporação do flúor [18F] na primeira etapa, o ácido é adicionado para desproteir os dois grupos funcionais, seguido pela neutralização da base. A mistura de reação é transferida para um frasco intermediário, e o vaso de reação é enxaguado com uma solução mista. A mistura combinada é carregada no laço HPLC para purificação. Uma combinação de colunas quiral e C18 HPLC é usada para remover as impurezas químicas. A fração alvo é coletada em um frasco de formulação pré-preenchido com cloreto de sódio para ajustar a concentração de dose e a tônica. O produto final é filtrado estéril em um frasco de dose final, avaliado e aliquoed para QC antes que as doses sejam liberadas.
O diagrama esquemático da configuração do sistema é mostrado na Figura 3. O módulo consiste nos seguintes componentes principais: 1) MVP de entrada para adição de reagente, 2) MVP de saída para ventilação e lavagem do reator, 3) MVP de formulação para coleta de frações HPLC e formulação de dose, 4) [18F]captura de flúor e liberação de MVP, e 5) sistema de purificação HPLC. As tendências de radioatividade, temperatura de reação e pressão podem ser monitoradas em tempo real através do painel de controle. Um cromatograma típico de HPLC semipreparativo é mostrado na Figura 4. A fração alvo contendo impurezas UV é desviada para uma breve coluna C18 (o traço preto sobreposto com o traço UV vermelho, Figura 4). As impurezas no componente alvo podem ser removidas passando a fração através de uma coluna C18. A fração HPLC purificada elucida da coluna C18 é coletada no frasco de formulação. A dose é avaliada e aliquoed para QC.
Os cromogramas HPLC representativos para QC são mostrados na Figura 5. O cromatógrafo da amostra em branco mostra picos insignificantes entre o volume vazio e 10 min do programa. A referência padrão não-rotulada L-FETrp mostra um único isômero, bem separado da referência padrão de sua contraparte D. A dose final de L-[18F]FETrp mostra alta pureza química e pureza radioquímica. O teste de estabilidade do produto final na maior concentração de dose por até 8 h mostra que l-[18F]FETrp é estável em termos de pureza química, pureza radioquímica, excesso enantiomerico e valor de pH (Tabela 2)37. Este protocolo para a radiosíntese de um pote e duas etapas de L-[18F]FET leva aproximadamente 100 min. O rendimento corrigido pela decomposição é de 20 ± 5%, com purezas químicas e radioquímicas superiores a 95%. A partir de 12-18 GBq de [18F]fluoreto, a atividade molar de L-[18F]FET é 88-118 GBq/μmol. A concentração de massa é tipicamente inferior a 0,5 μg/mL, com a concentração de dose na faixa de 37-185 MBq/mL.
Figura 1: Esquema de reação para radiosíntese de um pote e duas etapas de L-[18F]FETrp. Abreviaturas: MeCN = acetonitrilo; L-[18F]FETrp = 1-(2-[18F]Fluoroetil)-L-triptofano; K222 = 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabicyclo[8,8,8]hexacosane. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Visão geral do fluxo de trabalho de radiosíntese L-[18F]FETrp. *Um controle completo de qualidade de acordo com a USP823, USP797 será seguido para uso humano de L-[18F]FETrp. Abreviaturas: QC = controle de qualidade; MeCN = acetonitrilo; L-[18F]FETrp = 1-(2-[18F]Fluoroetila)-L-triptofano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Produção de L-[18F]FETrp. Diagrama esquemático da configuração (esquerda) e da fotografia da plataforma de radiosíntese (à direita). A configuração inclui os seguintes componentes principais: 1. MVP de entrada; 2. MVP de saída; 3. MVP da formulação; 4. [18F]Captura/liberação de fluoretos/lançamento de MVP; 5. Cartucho de QMA; 6. Frasco intermediário; 7. Cartuchos Alumina/C8; 8. Reator; 9. Coluna HPLC quiral; 10, coluna C18; 11. Garrafa de resíduo HPLC para a coluna quiral; 12. MVP de desvio; 13. Garrafa de resíduo HPLC para as colunas quiral e C18; 14. Frasco de formulação; 15. Volte para cima do frasco. Abreviaturas: L-[18F]FETrp = 1-(2-[18F]Fluoroethyl)-L-triptofano; MVP = posicionador de frasco modular; QMA = metilamonium quaternário. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Cromatógrafo semipreparativo típico para purificação de L-[18F]FETrp. Traço vermelho, canal UV a 254 nm. Traço negro, canal de radioatividade. As setas 1, 2 indicam o início e o fim do desvio da fração radioativa contendo L-[18F]FETrp para a coluna C18, respectivamente. As setas 3, 4 indicam o início e o fim da coleta da fração de alvo purificada L-[18F]FETrp elucida da coluna C18, respectivamente. Abreviação: L-[18F]FETrp = 1-(2-[18F]Fluoroethyl)-L-triptofano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Cromatógrafo típico analítico HPLC para controle de qualidade de L-[18F]FETrp. 1) Solução em branco, 2) solução padrão de L-FETrp, 3) solução padrão das misturas L-FETrp e D-FETrp, 4) traço UV de L-FETrp a 230 nm, 4) traço de radioatividade da formulação L-[18F]FETrp. Abreviação: L-[18F]FETrp = 1-(2-[18F]Fluoroethyl)-L-triptofano; L-FETrp = 1-(2-Fluoroethyl)-L-triptofano; D-FETrp = 1-(2-Fluoroethyl)-D-triptofano. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Traçador | Investigação Clínica | Principais Indicações | Profissionais | Contras | |||
| 11 C-5-HTP | Sim | Imagem de tumores neuroendócrinos produtores de serotonina, doenças neuropsiquiátricas | Sensível na detecção de pequenos tumores neuroendócrinos | Precisa de um ciclotron no local, meia-vida curta, procedimentos trabalhosos, radiosíntese multienzimática, sensível à concentração precursora e pH de solução, absorção inespecífica em áreas dopaminérgicas e noradrenergicas | |||
| [11C] AMT | Sim | Localização de tecidos epileptogênicos e tumores cerebrais baseados em fortes ativações da via kynurenina | produção de cGMP disponível, não incorporada à síntese proteica | Precisa de um ciclotron no local, meia-vida curta, procedimentos trabalhosos, quantificação complicada em condições patológicas | |||
| L-[18F]FETrp | Não | Via de kynurenina de imagem, incluindo focos epilépticos, tumores cerebrais e detecção de anormalidades neuroinflamatórias associadas à epilepsia | Meia-vida favorável, disponível para entrega por satélite, radiosíntese cGMP, alta estabilidade para defluorinação e dosimetria de radiação favorável | Absorção facilitada tanto pelo transportador de L-aminoácido quanto pelo transportador alanine-serine-cisteína, ainda não há investigações humanas | |||
Tabela 1: Comparação de 11C-5-HTP, [11C]AMT e L-[18F]FETrp. Abreviaturas: cGMP = boas práticas de fabricação atuais; α-[11C]metil-L-triptofano; L-[18F]FETrp = 1-(2-[18F]Fluoroetil)-L-triptofano; 11 C-5-HTP = 11C-5-hidroxitricofófano.
| Horas após o fim da síntese do ensaio | Pureza radioquímica por HPLC (%) | Pureza Química (%) | Excesso inantiomerico (%) | valor de pH |
| 0 | 99 | >95 | 98 | 5.5 |
| 1 | 99 | >95 | 99 | 5.5 |
| 2 | 99 | >95 | 99 | 5.5 |
| 4 | 99 | >95 | 98 | 5.5 |
| 6 | 98 | >95 | 98 | 5.5 |
| 8 | 97 | >95 | 97 | 5.5 |
Tabela 2: Teste de estabilidade de L-[18F]FETrp em um lote típico na maior concentração de dose. Abreviação: L-[18F]FETrp = 1-(2-[18F]Fluoroethyl)-L-triptofano.
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Discussion
Triptofano é um aminoácido essencial para os humanos. Desempenha um papel importante na regulação do humor, função cognitiva e comportamento. Os derivados de triptofano radiolabeled, particularmente os derivados de 11C rotulados por carbono, têm sido extensivamente estudados devido ao seu papel único no mapeamento da síntese de serotonina38,39, detecção e classificação de tumores40, orientando a cirurgia de epilepsia41,42 e avaliando a resposta ao tratamento em diabetes43. No entanto, os curtos procedimentos de meia-vida e de radiolabelação laboriosa limitam a aplicação generalizada de [11C]AMT. Esforços estão em andamento para desenvolver agentes rotulados com flúor-18 para o metabolismo do triptofano. Dois artigos de revisão recentes resumem as propriedades de desenvolvimento e imagem de agentes de imagem triptofano de flúor-18 rotulados3,28.
Em comparação com seu antecessor com a marca 11C, o FETrp demonstra propriedades de imagem in vivo favoráveis, boa estabilidade metabólica e resistência à desfluorinação33. Além disso, o L-[18F]FETrp demonstra um perfil de dosimetria favorável em comparação com o 18F-FDG e foi proposto como um promissor agente de imagem triptofano para tradução clínica32,33. A metodologia descrita aqui utiliza uma estratégia de um pote e dois passos para a radiosíntese de L-[18F]FETrp em um sistema de síntese de radioquímica. O L-[18F]FETrp foi produzido com alta pureza química, pureza radioquímica e excesso enantiomerico. A massa L-FETrp não rotulada total na dose final não é superior a 5 μg, e o teor de etanol não é mais do que 10%. L-[18F]FETrp é rotineiramente produzido no centro PET para a imagem do metabolismo triptofano em um modelo de tumor cerebral de camundongos transgênicos e tem mostrado resultados de imagem favoráveis32. Quando comparado com o método relatado para L-[18F]FETrp, o protocolo atual inclui os benefícios detalhados abaixo.
Primeiro, um pequeno vaso de reação e menos solventes precursores e de reação são usados para o radiolabeling quando comparados com outros módulos e métodos de radiolabeling relatados (em que 9 mg de precursor em 1,1 mL de solvente foi usado)35, e apenas 1-2 mg de precursor de radiolabeling em 0,5 mL de solvente é adicionado à reação, mas com um rendimento muito maior do enantiomer. Menos de 1% de rendimento foi relatado para uma radiosíntese de dois potes e três etapas de L-[18F]FETrp sem qualquer relato do valor de excesso eantiomerico44.
Em segundo lugar, a menor quantidade de K222 tóxico, em comparação com os procedimentos relatados para L-[18F]FETrp ou racemic [18F]FETrp, é usada. Tipicamente 4-5 mgs de K222 é usado em comparação com 37,5 mgs usados por outros35. K222 é um catalisador de transferência de fase frequentemente usado na radiosíntese de rastreadores PET com etiqueta 18F. O limite especificado na USP para K222 é inferior a 50 μg/mL. Um teste de ponto de cor para a detecção da concentração residual de K222 deve ser realizado para atender aos critérios antes de liberar a dose final para uso clínico45.
Em terceiro lugar, apenas 1% de água é introduzida na solução K2CO3/K222 para eluição de flúor [18F], que agiliza o processo de secagem do flúor aquoso [18F]. [18F]ânions de flúor são fortemente hidratados e tornam-se quimicamente inertes em mídia aquosa46. Portanto, é necessário melhorar a nucleofífilidade ao dessolvar o flúor [18F]e a secagem azeotrópica da solução aquosa para a incorporação do flúor [18F]. A água também competirá com o flúor [18F]para hidrolisar em vez da substituição nucleofílica do flúor desejado [18F]do precursor da radiolabelação.
Em quarto lugar, uma fase móvel injetável é usada para a purificação de L-[18F]FETrp. Dez por cento de etanol em acetato de sódio/ácido acético de 50 mM, pH 5,5, é usado como fase móvel para purificar o radiotracer, trazendo prontamente o teor de etanol para menos de 10% na dose final para uso clínico. Embora tenha sido relatado 90% de etanol na água para resolver os enantiomers, leva mais tempo para evaporar o teor de etanol para menos de 10% a 78 °C34.
O estudo pré-clínico do L-[18F]FETrp em um modelo de camundongos meduloblastoma transgênico mostra que 1-L-[18F]FETrp tinha alto acúmulo de tumor cerebral com cinética favorável, insignificante defluorinação in vivo e baixa absorção de fundo32. 1-L-[18F]FETrp também mostra uma relação alvo-não-alvo superior para 18F-FDG31. Além disso, o protocolo é fácil de configurar para a produção de L-[18F]FETrp para investigação clínica37. Testes adicionais e abrangentes de QC, incluindo integridade do filtro, pureza radionuclídica, níveis de solventes residuais, concentração de K222, nível de endotoxina bacteriana e testes de esterilidade, podem ser prontamente realizados para a dose final do radiofarmacêutico. O processo de aprovação regulatória para a utilização clínica do L-[18F]FETrp em seres humanos está ativamente em andamento.
O método tem algumas limitações. Duas colunas HPLC são usadas para obter pureza química adequada e excesso enantiomerico de L-[18F]FETrp. Uma taxa de fluxo da fase móvel a 3 mL/min é usada para a purificação. Uma taxa de fluxo mais alta resulta em alta pressão traseira, enquanto uma taxa de fluxo mais baixa leva a um tempo prolongado para purificação e má resolução da linha de base dos picos. Colunas ALTERNATIVAS DE HPLC compatíveis com a fase móvel e mostram melhor seletividade em relação aos enantiomers e boa resolução sobre as impurezas podem simplificar as etapas de purificação.
O módulo de síntese de radioquímica é um sistema não comercial. A radiossíntese totalmente automatizada do FETrp [18F]foi relatada em um sintetizador ge FASTlab comercial. A separação quiral dos enantiomers é realizada com uma coluna HPLC analítica quiral; os últimos L-e D-isômeros são formulados em uma segunda fita FASTLab35. Xin e Cai34 relataram a radiosíntese automática de L-[18F], usando um sistema GE FX-N. Enquanto os dois enantiomers podem ser prontamente separados com a coluna quiral CVT semipreparativa, a fase móvel com alto teor de etanol (90% de etanol na água) não é adequada para injeção humana direta34. O uso de um radiosintesor comercial e uma fase móvel injetável para L-[18F]FETrp com alto excesso eantiomerico é altamente desejável para uma fácil investigação clínica.
Em conclusão, um análogo de triptofano de flúor-18 L-[18F]FETrp foi sintetizado em um sistema de síntese de radioquímica usando uma abordagem de um pote e duas etapas com alta confiabilidade e reprodutibilidade. A radiosíntese apresenta pequenas quantidades de precursores e solventes de radiolacção, uma fase móvel injetável e fácil implementação para produção clínica de L-[18F]FETrp para uso humano. O protocolo facilitará a utilização mais difundida deste radiotracer para distúrbios neurológicos e cânceres implicados com o metabolismo do triptofano.
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Disclosures
Os autores declaram que não existem interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Centro de Diagnóstico & Pesquisa PET/MRI, e pelos Departamentos de Pesquisa Biomédica e Radiologia do Nemours/Alfred I. duPont Hospital for Children.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [18F]Fluoride in [18O]H2O | PETNET Solutions Inc. | N/A | |
| 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabicyclo[8.8.8]hexacosane | ACROS | 291950010 | Kryptofix 222 or K222, 98% |
| Acetic acid | ACROS | 222142500 | 99.8% |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | anhydrous, 99.8% |
| Agilent 1260 HPLC system | Agilent Technologies | Agilent 1260 | Agilent 1260 series |
| Analytcial chiral HPLC column | Sigma-Aldrich | 12024AST | Astec CHIROBIOTIC T, 25 cm × 4.6 mm |
| Carbon dioxide, 60 LBS | Airgas | REFR744R200S | 99.99% |
| D-FETrp standard reference | Affinity Research Chemicals Inc | N/A | Custom synthesis |
| Empty sterile vial | Jubilant HollisterStier | 7515 | 20 mm closure, 10 mL |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | 200 proof, USP grade. ≥99.9% |
| Fisherbrand 13 mm Syringe Filter, 0.22 µm, PVDF, sterile | Fisher Scientific | 09-720-3 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 30721 | ≥37% |
| Isopropanol | Decon Labs | 8316 | 70%, sterile |
| L-[18F]FETrp radiolabeling precursor | Affinity Research Chemicals Inc | N/A | Custom synthesis |
| L-FETrp standard reference | Affinity Research Chemicals Inc | N/A | Custom synthesis |
| Light C8 cartridge | Waters | WAT036770 | Sep-Pak C8 plus light cartridge |
| Needle, 20 G x 1 | Becton-Dickinson & Co. | 305175 | |
| Needle, 20 G x 1 ½ | Becton-Dickinson & Co. | 305176 | |
| Needle, 21 G x 2 | Becton-Dickinson & Co. | 305129 | |
| Neutral aluminum oxide | Waters | WAT023561 | Sep-Pak alumina N plus light |
| Nylon membrane (0.20 µm ) | MilliPore | GNWP04700 | 47 mm |
| Pall Acrodisc 25 mm syringe sterile filter | Pall Corporation | 4907 | |
| PETCHEM radiochemistry synthesis system | PETCHEM Solutions Inc. Pinckney, MI | N/A | Radiosynthesizer |
| pH strips 2.0 - 9.0 | EMD Millipore | 1.09584.0001 | |
| Potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 367877 | 99.995% |
| Quaternary methylammonium light cartridge | Waters | 186004051 | Sep-Pak QMA light |
| Semi-preparative C18 HPLC column | Phenomenex | 00D-4253-N0 | 100 × 10 mm |
| Semi-preparative chiral HPLC column | Sigma-Aldrich | 12034AST | Astec CHIROBIOTIC T, 25 cm × 10 mm |
| Sodium chloride injection 23.4% | APP Pharmaceutical, LLC | 18730 | USP grade |
| Sodium chloridei injection 0.9% | Hospira | NDC 0409-4888-10 | USP grade |
| Sodium hydroxide | Honeywell | 306576 | 99.99% |
| Spinal needle, 20 G x 3 ½ | Becton-Dickinson & Co. | 405182 | |
| Sterile alcohol prep pads | BioMed Resource Inc. | PC661 | |
| Sterile empty vials, 2 mL | Hollister Stier | 7505ZA | 13 mm closure |
| Sterile empty vials, 30 mL | Jubilant HollisterStier | 7520ZA | 20 mm closure |
| Syringe PP/PE, 3 mL, Luer Lock | Air-Tite | 4020-X00V0 | |
| Syringe PP/PE, 5 mL, Luer Lock | Becton-Dickinson & Co. | 309646 | |
| Syringe, PP/PE, 10 mL, NORM-JECT | Air-Tite | 4100-000V0 | |
| Syringe, 1 mL, Luer Slip | Becton-Dickinson & Co. | 309659 | |
| Syringe, 3 mL, Luer-Lock | Becton-Dickinson & Co. | 309657 | |
| Ultra high purity argon | Airgas | AR UHP300 | 99.999% |
| Ultrapure water | MilliporeSigma | ZRQSVP300 | Direct-Q 3 tap to pure and ultrapure water purification system |
References
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![Radiosíntese de 1-(2-[<sup>18F</sup>]Fluoroethyl)-L-Triptofano usando um Protocolo de Dois Passos de Um pote e Duas etapas](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/63025.jpg)
