Summary
Aquí, describimos la radiosíntesis de 1-(2-[18F]Fluoroethyl)-L-triptófano, un agente de imágenes por emisión de positrones para estudiar el metabolismo del triptófano, utilizando una estrategia de una olla y dos pasos en un sistema de síntesis de radioquímica con buenos rendimientos radioquímicos, alto exceso enantiomérico y alta confiabilidad.
Abstract
La vía de la quinurenina (KP) es una ruta primaria para el metabolismo del triptófano. La evidencia sugiere fuertemente que los metabolitos del KP desempeñan un papel vital en la proliferación de tumores, la epilepsia, las enfermedades neurodegenerativas y las enfermedades psiquiátricas debido a sus efectos inmunomoduladores, neuromoduladores y neurotóxicos. El agente de tomografía por emisión de positrones (PET) más utilizado para mapear el metabolismo del triptófano, α-[11C]metil-L-triptófano ([11C]AMT), tiene una vida media corta de 20 min con laboriosos procedimientos de radiosíntesis. Se requiere un ciclotrón in situ para radiosintetizar [11C]AMT. Solo un número limitado de centros produce [11C]AMT para estudios preclínicos e investigaciones clínicas. Por lo tanto, se necesita urgentemente el desarrollo de un agente de imagen alternativo que tenga una vida media más larga, una cinética in vivo favorable y que sea fácil de automatizar. La utilidad y el valor de 1-(2-[18F]fluoroetilo)-L-triptófano, un análogo de triptófano marcado con flúor-18, se ha reportado en aplicaciones preclínicas en xenoinjertos derivados de líneas celulares, xenoinjertos derivados de pacientes y modelos de tumores transgénicos.
Este artículo presenta un protocolo para la radiosíntesis de 1-(2-[18F]fluoroetilo)-L-triptófano utilizando una estrategia de una olla y dos pasos. Utilizando este protocolo, el radiotrazador se puede producir en un rendimiento radioquímico del 20 ± 5% (desintegración corregida al final de la síntesis, n > 20), con pureza radioquímica y exceso enantiomérico de más del 95%. El protocolo presenta una pequeña cantidad de precursor con no más de 0,5 ml de disolvente de reacción en cada paso, baja carga de 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabiciclo[8.8.8]hexacosano potencialmente tóxico (K222) y una fase móvil ambientalmente benigna e inyectable para la purificación. El protocolo se puede configurar fácilmente para producir 1-(2-[18F]fluoroetilo)-L-triptófano para la investigación clínica en un módulo disponible comercialmente.
Introduction
En los seres humanos, el triptófano es un componente esencial de la dieta diaria. El triptófano se metaboliza principalmente a través de la vía de la quinurenina (KP). El KP es catalizado por dos enzimas limitantes de velocidad, indolamina 2, 3-dioxigenasa (IDO) y triptófano 2, 3-dioxigenasa (TDO). Más del 95% del triptófano se convierte en quinurenina y sus metabolitos aguas abajo, generando en última instancia nicotinamida adenina dinucleótido, que es esencial para la transducción de energía celular. El KP es un regulador clave del sistema inmune y un importante regulador de la neuroplasticidad y los efectos neurotóxicos1,2. El metabolismo anormal del triptófano está implicado en varios trastornos neurológicos, oncológicos, psiquiátricos y metabólicos; por lo tanto, los análogos de triptófano radiomarcados se han utilizado ampliamente en la investigación clínica. Los dos radiotrazadores de triptófano más comúnmente investigados clínicamente son 11C-α-metil-L-triptófano ([11C]AMT) y 11C-5-hidroxitriptófano (11C-5-HTP)3.
En la década de 1990, se utilizó 11C-5-HTP para visualizar tumores neuroendocrinos secretores de serotonina4 y para diagnosticar y monitorizar la terapia del adenocarcinoma prostático metastásico refractario a las hormonas5. Posteriormente, se utilizó como herramienta de imagen para la cuantificación del sistema serotoninérgico en el páncreas endocrino6. 11 C-5-HTP también ha sido un trazador prometedor para la detección no invasiva de islotes viables en el trasplante intraportal de islotes y diabetes tipo 27,8. En las últimas dos décadas, muchos aminoácidos radiomarcados han avanzado a la investigación clínica9,10. En particular, el análogo de triptófano marcado con carbono-11 [11C]AMT ha recibido una amplia atención por mapear la síntesis de serotonina cerebral11,12,13,14 y por localizar focos epilépticos, tumores epileptogénicos, complejo de esclerosis tuberosa, gliomas y cánceres de mama15,16,17,18,19,20 ,21,22,23,24,25,26. [11C] La AMT también tiene una alta captación en varios tumores de bajo y alto grado en niños27. Además, se ha utilizado el análisis de trazadores cinéticos de [11C]AMT en sujetos humanos para diferenciar y clasificar diversos tumores y diferenciar el glioma de la lesión tisular inducida por radiación15. [11C] Las imágenes guiadas por AMT muestran beneficios clínicos significativos en los trastornos cerebrales3,25. Sin embargo, debido a la corta vida media del carbono-11 (20 min) y los laboriosos procedimientos de radiosíntesis, el uso de [11C]AMT está restringido a los pocos centros de PET con un ciclotrón en el sitio y una instalación de radioquímica.
El flúor-18 tiene una vida media favorable de 109,8 min, en comparación con la vida media de 20 min del carbono-11. Cada vez más, los esfuerzos se han centrado en el desarrollo de radiotrazadores marcados con flúor-18 para el metabolismo del triptófano3,28. Se han reportado un total de 15 radiotrazadores de triptófano radiomarcados con flúor-18 únicos en términos de radiomarcado, mecanismos de transporte, estabilidad in vitro e in vivo, biodistribución y captación de tumores en xenoinjertos. Sin embargo, se observó una rápida defluoración in vivo para varios trazadores, incluidos el fluorotriptófano 4, 5 y 6-[18F], lo que impidió una mayor traducción clínica29. 5-[18F]Fluoro-α-metiltriptófano (5-[18F]FAMT) y 1-(2-[18F]fluoroetilo)-L-triptófano (L-[18F]FETrp, también conocido como (S)-2-amino-3-(1-(2-[18F]fluoroetilo)-1H-indol-3-il)ácido propanoico, peso molecular 249,28 g/mol), son los dos radiotrazadores más prometedores con cinética in vivo favorable en modelos animales y gran potencial para superar [111 C]AMT para la evaluación de condiciones clínicas con metabolismo de triptófano desregulado28. 5-[18F]FAMT mostró una alta captación en xenoinjertos tumorales IDO1 positivos de ratones inmunocomprometidos y es más específico para obtener imágenes del KP que [11C]AMT28,30. Sin embargo, la estabilidad in vivo de 5-[18F]FAMT sigue siendo una preocupación potencial ya que no se han reportado datos de defluoración in vivo más allá de los 30 minutos posteriores a la inyección del trazador30.
Un estudio preclínico en un modelo de ratón con meduloblastoma modificado genéticamente mostró que, en comparación con la 18F-fluorodesoxiglucosa (18F-FDG), L-[18F]FETrp tenía una alta acumulación en tumores cerebrales, una defluoración in vivo insignificante y una baja absorción de fondo, lo que demuestra una relación superior entre objetivos y no objetivos31,32. Los estudios de dosimetría de radiación en ratones indicaron que L-[18F]FETrp tenía una exposición a dosimetría favorable aproximadamente un 20% menor que el trazador clínico de PET 18F-FDG33. De acuerdo con los hallazgos de otros investigadores, los datos de los estudios preclínicos proporcionan evidencia sustancial para apoyar la traducción clínica de L-[18F]FETrp para la investigación del metabolismo anormal del triptófano en humanos con trastornos cerebrales como epilepsia, neurooncología, autismo y esclerosis tuberosa28,31,32,33,34,35,36 . En la Tabla 1 se muestra una comparación general entre los tres trazadores más ampliamente investigados para el metabolismo del triptófano, 11C-5-HTP, [11C]AMT y L-[18F]FETrp. Tanto 11C-5-HTP como [11C]AMT tienen una vida media corta y procedimientos de radioetiquetado laboriosos. Aquí se describe un protocolo para la radiosíntesis de L-[18F]FETrp utilizando un enfoque de un solo pot y dos pasos. El protocolo incluye el uso de una pequeña cantidad de precursor de radiomarcado, un pequeño volumen de disolventes de reacción, baja carga de K222 tóxico y una fase móvil ambientalmente benigna e inyectable para la purificación y la fácil formulación.
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Protocol
PRECAUCIÓN: El protocolo involucra materiales radiactivos. Cualquier dosis adicional de materiales radiactivos podría conducir a un aumento proporcional en la probabilidad de efectos adversos para la salud como el cáncer. Los investigadores deben seguir las prácticas de dosis "tan bajas como sea razonablemente posible" (ALARA) para guiar el protocolo de radiosíntesis con la protección adecuada en la celda caliente o la campana de plomo. Minimizar el tiempo de contacto directo, usar un escudo de plomo y mantener la distancia máxima para cualquier paso de exposición a la radiación en el proceso de radiosíntesis son esenciales. Use una insignia de dosimetría de radiación y anillos de monitoreo de manos durante todo el experimento, y con frecuencia monitoree las superficies potencialmente contaminadas, como guantes, mangas y pies. Se deben seguir las regulaciones de la Comisión Reguladora Nuclear (NRC), locales e institucionales para el uso, envío y eliminación de cualquier material radiactivo.
1. Preparativos iniciales
- Prepare etanol al 10% en fase móvil de acetato de sodio/ácido acético de 50 mM para cromatografía líquida semipreparativa de alto rendimiento (HPLC).
- Coloque 3 ml de ácido acético glacial en un matraz aforado limpio de 1000 ml. Añadir 900 ml de agua ultrapura (resistividad de 18 millones de ohmio-cm a 25 °C) en el matraz aforado; agregue aproximadamente 8 ml de solución de hidróxido de sodio de 6 M y ajuste el pH a 5.5 usando un medidor de pH calibrado y una tira de pH. Después de que la solución se enfríe a temperatura ambiente, aumente el volumen a 1000 ml con agua ultrapura para preparar la solución de 50 mM de acetato de sodio / ácido acético (pH 5.5).
- Filtre al vacío la solución a través de un filtro de membrana de 0,2 μm y transfiera la solución a dos botellas de disolvente de 500 ml.
- Coloque aproximadamente 250 ml del tampón anterior en un matraz aforado de 500 ml. Use un cilindro graduado para medir 50 ml de etanol de la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) y agregue el etanol al matraz volumétrico. Aumente el volumen a 500 ml con 50 mM de acetato de sodio / ácido acético, y mida el valor de pH con una tira de pH.
- Preparar soluciones de control de calidad (QC) para una prueba de idoneidad del sistema.
- Vuelva a llenar las botellas de disolvente HPLC con agua fresca ultrapura (disolvente A) y etanol (disolvente B). Imprima la bomba HPLC y cargue el programa HPLC con un caudal de 1 ml/min que consiste en un 30% de disolvente A y un 70% de disolvente B (v/v).
- Haga una solución de control (solución en blanco) para el control de calidad. Agregue 5 ml de cloruro de sodio al 0,9% en un vial de vidrio de 20 ml. Agregue 0.15 ml de cloruro de sodio al 23.4% en la solución anterior. Añadir 6 ml de fase móvil de HPLC semipreparativa preparada en el paso 1.1.3 (etanol al 10% en acetato de sodio/ácido acético de 50 mM, pH 5,5) al vial de vidrio.
- Preparar 1 μg/ml de L-FETrp no radiomarcado y 5 μg/ml de mezclas racémicas de L-FETrp y D-FETrp (soluciones estándar).
- Construir una curva de calibración utilizando soluciones L-FETrp estándar (0,1 μg/mL, 0,5 μg/mL, 1,0 μg/mL, 10 μg/mL, 100 μg/mL).
- Configure la secuencia HPLC. Asegúrese de que la secuencia incluya una tirada de la solución de muestra en blanco, dos tiradas del L-FETrp estándar (1 μg/mL), una tirada de las mezclas racémicas L-FETrp y D-FETrp (5 μg/mL) y una tirada del radiofármaco final.
- Ejecute la secuencia parcial de HPLC para probar la idoneidad del sistema antes de analizar las muestras radiactivas utilizando una columna analítica de HPLC (250 x 4,6 mm).
- Ejecute una muestra en blanco y asegúrese de que el cromatograma de la muestra en blanco muestre picos nulos o insignificantes entre el volumen vacío y los 10 minutos del cromatograma.
- Ejecute dos réplicas de la solución estándar (contiene 1 μg/mL de L-FETrp). Asegúrese de que las áreas del L-FETrp en las dos réplicas estén dentro del ±5% del valor medio.
- Ejecute una muestra de las mezclas L-FETrp y D-FETrp (5 μg/mL de L-FETrp y D-EFTrp, respectivamente). Asegúrese de que L-FETrp y D-FETrp se puedan identificar en el cromatograma y se resuelvan la línea de base.
- Preparar las soluciones de radioetiquetado y otros suministros.
- Agregue las siguientes soluciones a cinco viales de 1,5 ml en forma de V, respectivamente. Vial 1: 1 ml de solución de carbonato de potasio (K2CO3)/K222 (5 mg/ml de K222 y 1 mg/ml de K2CO3 en una solución de agua/acetonitrilo, 1/99, v/v) para la elución de [18F]fluoruro; Vial 2: 0,4 ml de acetonitrilo anhidro para el secado con fluoruro [18F]; Vial 3: precursor de radiomarcado en acetonitrilo anhidro (1-2 mg en 0,5 ml de acetonitrilo anhidro) para la incorporación de [18F]fluoruro; Vial 4: ácido clorhídrico (2 M, 0,25 ml) en acetonitrilo (0,25 ml) para acidólisis; Vial 5: 2 M de hidróxido de sodio (0,25 ml) para la neutralización de las mezclas de reacción.
- Active un cartucho ligero de metilamonio cuaternario (QMA) pasando primero a través de 10 ml de solución saturada de bicarbonato de sodio, seguido de 10 ml de agua ultrapura, y luego enjuague el cartucho con un flujo de nitrógeno. Acondicione un cartucho C8 ligero y un cartucho de óxido de aluminio neutro pasando a través de 10 ml de etanol, seguido de 10 ml de agua ultrapura.
- Agregue 0,15 ml de cloruro de sodio al 23,4% y 5 ml de cloruro de sodio al 0,9% a un vial de formulación estéril de 30 ml para ajustar la tonicidad y diluir la fracción de HPLC.
- Preparar una solución (1 ml de tampón de acetato de sodio/ácido acético, 50 mM, pH = 5,5 preparado en la etapa 1.1.1, 1 ml de etanol y 0,5 ml de agua [total 2,5 ml]) en una jeringa para enjuagar el recipiente de reacción; cargar en un vial estéril de 10 ml.
2. Ensamble los suministros de radioetiquetado y radiosíntesis L-[18F]FETrp
- Ensamble los suministros de radioetiquetado.
- Encienda la alimentación del módulo, el dióxido de carbono, el aire comprimido, las líneas de argón y la alimentación del controlador lógico programable (PLC). Haga clic en el botón mod_pscf18 para activar el programa del sistema de síntesis de radioquímica. Inicialice el MVP de entrada, salida y formulación, y asegúrese de que los MVP estén en las posiciones 4, 1, 1, respectivamente.
- Asegúrese de que el bucle HPLC esté en la posición de inyección y el cartucho de luz QMA en la posición de captura de fluoruro [18F].
- Instale el frasco de fase móvil hpLC semipreparativo (que contiene la solución preparada en el paso 1.1.3). Equilibre el sistema HPLC pasando la fase móvil a través de la columna quiral de HPLC (250 x 10 mm) y la columna C18 (100 x 10 mm) a un caudal de 2 ml / min durante al menos 30 minutos, luego cambie la válvula de desviación, deje que el móvil HPLC pase solo a través de la columna quiral de HPLC y aumente la velocidad de flujo a 3 ml / min.
- Instale el cartucho ligero QMA en la línea de captura/liberación de fluoruro [18F]. Instale los cartuchos de alúmina/C8 apilados entre la posición MVP 6 de entrada y el vial intermedio, que es un vial en forma de V de 10 ml conectado al bucle de muestra de HPLC. Instale un vial vacío de 10 ml (vial de ventilación) en la posición MVP 4 de salida con otra aguja conectada al vial como ventilación. Instale los viales de reactivo 1-5 en las posiciones MVP de entrada 1-5, respectivamente.
- Instale el vial que contiene la solución de enjuague preparada en el paso 1.3.4 hasta la posición MVP de salida 6.
- Instale una botella de residuos de 500 ml (para recoger los residuos de HPLC que pasan a través de las columnas quiral y C18) en la posición MVP 1 de la formulación. Instale otra botella de residuos de 500 ml (para recoger los residuos de HPLC que pasan a través de la columna quiral) en el extremo de recogida de residuos de la válvula de cuatro puertos y dos posiciones.
- Conecte el vial de recogida de fracciones (solución precargada preparada en el paso 1.3.3) a la posición MVP 2 de la formulación. Conecte la salida MVP posición 3 (línea de gas) y la línea de entrega del producto final a la formulación MVP posición 2 viales para recuperar el producto final formulado. Instale un vial estéril vacío de 10 ml en la posición MVP 3 de la formulación, que se utilizará como vial de respaldo para la recolección de la fracción objetivo.
- Instale la columna corta C18 entre la válvula de desvío de cuatro puertos y dos posiciones y la formulación MVP.
NOTA: Durante la instalación de los viales de reactivo y formulación, asegúrese de que el suministro de argón en el panel de control esté apagado y que la presión del argón sea cero para evitar cualquier transferencia inesperada de líquido durante el montaje del vial. Verifique dos veces todas las conexiones de la aguja, las posiciones de los viales y las posiciones MVP para una radiosíntesis reproducible.
- Radiosíntesis de L-[18F]FETrp
- Recibir y encuestar [18F]fluoruro.
- Al recibir la solución de fluoruro [18F] (15 ± 3 gigabecquerel (GBq) al comienzo de la síntesis, consulte la Tabla de materiales), inspeccione la caja de plomo en la superficie y a 1 m para registrar las tasas máximas de exposición a la radiación. Haga una prueba de limpieza para asegurarse de que la caja de envío no esté contaminada. Registre la dosis y el tiempo de fluoruro [18F].
- Transfiera [18F]fluoruro.
- Transferir la radiactividad al sistema de síntesis de radioquímica.
- Conecte la línea de argón con una aguja corta y la línea de transferencia de fluoruro [18F] con una aguja larga al vial de fluoruro [18F]. Cierre la puerta de vidrio de celda caliente y la puerta de plomo.
PRECAUCIÓN: Use una abrazadera larga para empujar ambas agujas; asegúrese de que la punta larga de la aguja se encuentre en la parte inferior del vial de fluoruro [18F] para que todo el fluoruro [18F] pueda transferirse. Por lo general, se solicita un vial en forma de V para la administración de fluoruro [18F].
- Atrapa, eluye y fluoruro azeotropicalmente seco [18F].
- Haga clic en Suministro ar para encender la línea de suministro de argón, aumentar la presión del argón, encender la línea de empuje de fluoruro [18F] y empujar el fluoruro acuoso [18F] a través del cartucho de luz QMA. Después de que toda la radiactividad quede atrapada en el cartucho de luz QMA y la lectura del detector de radiactividad sea constante, aumente la presión del argón y sople argón a través del cartucho durante otros 5 minutos para eliminar el exceso de agua.
- Apague la línea de empuje de fluoruro [18F], disminuya la presión del argón a cero, cambie la válvula de dos posiciones de seis puertos de la posición de captura de fluoruro [18F] a la posición de elución. Abra el vial de reacción, encienda la línea de argón de la posición MVP 1 de entrada, empuje la solución K222/K2CO3 en el vial de entrada MVP posición 1 a través del cartucho de luz QMA para eliminar la radiactividad en el vial de reacción. Cambie la posición de elución de fluoruro [18F] a la posición de captura.
- Haga clic en el botón Calor para calentar el reactor a 110 °C, encienda la línea de argón mvp de salida 4 (línea de barrido) que se conecta al reactor y evapore el disolvente en el vial de salida MVP posición 4.
- Haga clic en el botón Enfriar para enfriar el reactor a temperatura ambiente con dióxido de carbono comprimido, apague la línea de barrido, cambie la posición MVP de entrada 1 a la posición 2 y agregue el acetonitrilo anhidro en el vial 2. Encienda la línea de barrido y el calentador para secar azeotropicalmente [18F]fluoruro a 110 °C.
- Añadir el precursor de radiomarcado e incorporar [18F]fluoruro.
- Enfríe el reactor a temperatura ambiente, apague la línea de barrido, cambie la posición MVP de entrada 2 a la posición 3 y agregue el precursor de radioetiquetado de tosilato en el vial 3. Cierre el reactor y caliente las mezclas de reacción a 100 °C durante 10 min.
- Evaporar el disolvente de reacción y acidolisis.
- Enfríe y abra el reactor, encienda la línea de barrido y evapore el disolvente de reacción a 100 °C.
- Enfríe el reactor, apague la línea de barrido, cambie la posición MVP de entrada 3 a la posición 4 y agregue la mezcla de ácido clorhídrico / acetonitrilo (0.5 mL, 1/1, v / v). Calentar la reacción a 100 °C durante 10 min para desproteger los grupos protectores de terc-butilo y terc-butiloxicarbonilo en el precursor de radiomarcado.
- Neutralizar la reacción.
- Enfríe el reactor a temperatura ambiente y cambie la posición MVP de entrada 4 a la posición 5 para agregar hidróxido de sodio de 2 M para neutralizar la mezcla de reacción. Apague la línea de argón MVP de entrada.
- Transfiera la mezcla de reacción al vial intermedio.
- Haga clic en el botón F del MVP de salida para cambiar el MVP de salida de la posición de ventilación 4 a la posición 5 y, a continuación, haga clic en el botón F del MVP de entrada para cambiar el MVP de entrada de la posición 5 a la posición 6. Encienda la línea de argón MVP de salida. Empuje la mezcla de reacción a través de los cartuchos de óxido de aluminio neutro apilado y C8 hasta el vial intermedio instalado antes del bucle de muestra de HPLC.
- Enjuague el reactor y transfiera la solución.
- Cambie la posición MVP de salida 5 a la posición 6, empuje la solución de enjuague en el vial de salida MVP posición 6 a través del vial de reacción y los cartuchos al vial intermedio, sucesivamente. Tenga en cuenta que el volumen de la mezcla combinada es de aproximadamente 3,5 ml. Cierre el recipiente de reacción.
- Cargue la mezcla combinada en el bucle hpLC y purifique la mezcla.
- Cambie el bucle HPLC de la posición de inyección a la posición de carga, encienda la línea de argón MVP de entrada y cargue las mezclas en el bucle HPLC de 5 ml. Cuando se complete la carga, cambie el botón de carga para inyectar y haga clic en Inyectar HPLC para iniciar el cromatograma de HPLC a un caudal de 3 ml/min. Haga clic en el botón del monitor HPLC para acceder al cromatograma HPLC en tiempo real.
- Desvíe la fracción de destino a la columna C18.
- Haga clic en el botón MVP de desvío para desviar la fracción de HPLC objetivo a la columna corta C18 a aproximadamente 12 min.
- Enjuague la columna quiral de HPLC y purifique la fracción en la columna C18.
- Después de que la radiactividad objetivo se recoja en la columna C18 (y la fase móvil hpLC fluya hacia la botella de residuos de la posición MVP 1 de la formulación), cambie la válvula de desviación de cuatro puertos y dos posiciones a la posición de recolección de residuos. Enjuague la columna quiral a 4 ml/min durante 6 min para eliminar el enantiómero menor D-[18F]FETrp y otras impurezas ultravioletas (UV).
- Haga clic en el botón MVP de desvío para desviar la fase móvil de HPLC a la posición MVP 1 de la formulación a un caudal de 3 ml/min. Observe que la fase móvil pasa a través de la columna quiral y la columna C18 para purificar L-[18F]FETrp retenido en la columna C18.
- Recopile la fracción objetivo.
- Recoger el eluyente aproximadamente a los 32-34 min en el vial de formulación MVP posición 2.
NOTA: Por lo general, se recolecta una fracción de HPLC de 2 minutos, y el volumen total más la solución de cloruro de sodio precargada es de 8-15 ml.
- Recoger el eluyente aproximadamente a los 32-34 min en el vial de formulación MVP posición 2.
- Administre la dosis a un vial estéril de producto final.
- Empuje la solución en el vial de formulación MVP posición 2 a través de la línea de administración y el filtro estéril en el vial de dosis final (a través de la aguja del filtro de ventilación estéril preinstalada).
NOTA: Los pasos del protocolo 2.2.9-2.2.13 son pasos utilizados para la purificación HPLC de L-[18F]FETrp.
- Empuje la solución en el vial de formulación MVP posición 2 a través de la línea de administración y el filtro estéril en el vial de dosis final (a través de la aguja del filtro de ventilación estéril preinstalada).
- Ensayo de la radiactividad y el volumen de dosis.
- Retire el filtro estéril y analice la actividad y el volumen de la dosis final.
- Enjuague el sistema con agua ultrapura seguida de etanol a 4 ml / min durante al menos 15 minutos cada uno. Apague la bomba HPLC y la caja del PLC; cerrar el programa; apagar la línea de aire comprimido, la línea de argón y la línea de dióxido de carbono; y apagar la alimentación principal del módulo.
- Retire la dosis de control de calidad y ejecute las muestras de control de calidad.
- Retire aproximadamente 0,1 ml de la dosis final en un inserto de 0,2 ml de un vial de control de calidad. Ejecute el ejemplo activo como el programa de "secuencia parcial" después de la prueba de idoneidad del sistema descrita en el paso 1.2.6 .
- Analice los datos de control de calidad y libere la dosis.
- Calcular las purezas químicas y radioquímicas, el exceso de valor enantiomérico y la actividad molar; determinar el valor de pH.
- Libere la dosis si todos los resultados de las pruebas pasan el rango aceptable.
- Recibir y encuestar [18F]fluoruro.
3. Limpieza del sistema después de la ejecución
- Inspeccione el módulo de radioetiquetado utilizando un medidor de reconocimiento Geiger-Mueller (GM) para asegurarse de que la radiactividad se descomponga adecuadamente (al menos 24 h) antes de que el sistema se limpie.
- Encienda la alimentación del módulo de radioetiquetado y la alimentación de la caja DEL PLC; activar el programa del sistema de síntesis de radioquímica; e inicialice el MVP de entrada, el MVP de salida y el MVP de formulación. Cambie el selector de columnas a la posición de derivación.
- Separe los cartuchos QMA light, alúmina y C8.
- Enjuague primero todos los viales y líneas con agua ultrapura, seguida de etanol. Seque los viales y las líneas con argón de alta pureza.
- Selle cada ventilación de la línea con una aguja estéril con una tapa. Reemplace los viales de reactivo y el recipiente de reacción con viales quemados al horno y el recipiente de reacción, respectivamente.
- Apague la bomba HPLC y la caja del PLC; cerrar el programa; apagar la línea de aire comprimido, la línea de argón y la línea de dióxido de carbono; y apagar la alimentación principal del módulo.
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Representative Results
El esquema de reacción se muestra en la Figura 1. El radioetiquetado incluye los dos pasos siguientes: 1) reacción del precursor de radiomarcado de tosilato con [18F]fluoruro proporciona el intermedio marcado con 18F, y 2) la desprotección de los grupos tert-butiloxicarbonilo y terc-butilo-protector en el intermedio proporciona el producto final L-[18F]FETrp. Ambos pasos de reacción continúan a 100 °C durante 10 min.
Antes de recibir [18F]fluoruro del vendedor comercial, ensamble los viales de reactivos, viales de formulación y cartuchos; equilibrar los sistemas semi-preparativos, de control de calidad; y ejecute una prueba de idoneidad del sistema de control de calidad. El flujo de trabajo detallado para la radiosíntesis de L-[18F]FETrp se describe en la Figura 2. En resumen, la radiactividad se estudia y se transfiere al sistema de síntesis de radioquímica, y el fluoruro [18F] se seca azeotropicalmente en el recipiente de reacción después de los pasos de captura / liberación. Después de la incorporación de fluoruro [18F] en el primer paso, se agrega ácido para desproteger los dos grupos funcionales, seguido de neutralización de la base. La mezcla de reacción se transfiere a un vial intermedio y el recipiente de reacción se enjuaga con una solución mixta. La mezcla combinada se carga en el bucle HPLC para su purificación. Se utiliza una combinación de columnas quirales y C18 hpLC para eliminar las impurezas químicas. La fracción objetivo se recoge en un vial de formulación prellenado con cloruro de sodio para ajustar la concentración de la dosis y la tonicidad. El producto final se filtra estérilmente en un vial de dosis final, se ensaya y se alicita para el control de calidad antes de que se liberen las dosis.
El diagrama esquemático de la configuración del sistema se muestra en la Figura 3. El módulo consta de los siguientes componentes principales: 1) MVP de entrada para la adición de reactivos, 2) MVP de salida para ventilación y enjuague del reactor, 3) MVP de formulación para la recolección de fracciones de HPLC y formulación de dosis, 4) MVP de captura y liberación de fluoruro [18F] y 5) sistema de purificación de HPLC. Las tendencias de radiactividad, temperatura de reacción y presión se pueden monitorear en tiempo real a través del panel de control. En la Figura 4 se muestra un cromatograma hpLC semipreparativo típico. La fracción objetivo que contiene impurezas UV se desvía a una columna corta C18 (la traza negra se superpone con la traza UV roja, Figura 4). Las impurezas en el componente objetivo se pueden eliminar pasando la fracción a través de una columna C18. La fracción de HPLC purificada eluida de la columna C18 se recoge en el vial de formulación. La dosis se ensaya y se alicita para el control de calidad.
Los cromatogramas representativos de HPLC para el control de calidad se muestran en la Figura 5. El cromatograma de la muestra en blanco muestra picos insignificantes entre el volumen vacío y 10 min del programa. La referencia estándar no radiomarcada L-FETrp muestra un solo isómero, bien separado de la referencia estándar de su contraparte D. La dosis final de L-[18F]FETrp muestra alta pureza química y pureza radioquímica. Las pruebas de estabilidad del producto final a la concentración de dosis más alta durante un máximo de 8 h muestran que L-[18F]FETrp es estable en términos de pureza química, pureza radioquímica, exceso enantiomérico y valor de pH (Tabla 2)37. Este protocolo para la radiosíntesis de un solo pot y dos pasos de L-[18F]FET tarda aproximadamente 100 min. El rendimiento corregido por descomposición es del 20 ± 5%, con purezas químicas y radioquímicas superiores al 95%. A partir de 12-18 GBq de [18F]fluoruro, la actividad molar de L-[18F]FET es de 88-118 GBq/μmol. La concentración de masa es típicamente inferior a 0,5 μg/ml, con la concentración de dosis en el rango de 37-185 MBq/mL.
Figura 1: Esquema de reacción para la radiosíntesis de un solo pot y dos pasos de L-[18F]FETrp. Abreviaturas: MeCN = acetonitrilo; L-[18F]FETrp = 1-(2-[18F]Fluoroetil)-L-triptófano; K222 = 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabiciclo[8.8.8]hexacosano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Descripción general del flujo de trabajo de radiosíntesis L-[18F]FETrp. *Se seguirá un control de calidad completo de acuerdo con USP823, USP797 para uso humano de L-[18F]FETrp. Abreviaturas: QC = control de calidad; MecN = acetonitrilo; L-[18F]FETrp = 1-(2-[18F]Fluoroetilo)-L-triptófano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Producción de L-[18F]FETrp. Diagrama esquemático de configuración (izquierda) y la fotografía de la plataforma de radiosíntesis (derecha). La configuración incluye los siguientes componentes principales: 1. MVP de entrada; 2. MVP de salida; 3. Formulación MVP; 4. [18F]MVP de captura/liberación de fluoruro; 5. Cartucho QMA; 6. Vial intermedio; 7. Cartuchos de alúmina/C8; 8. Reactor; 9. Columna quiral de HPLC; 10, columna C18; 11. Botella de residuos de HPLC a la columna quiral; 12. MVP de desvío; 13. Botella de residuos de HPLC a las columnas quiral y C18; 14. Formulación vial; 15. Vial de respaldo. Abreviaturas: L-[18F]FETrp = 1-(2-[18F]Fluoroethyl)-L-triptófano; MVP = posicionador modular de viales; QMA = metilamonio cuaternario. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Cromatograma semipreparativo típico para la purificación de L-[18F]FETrp. Traza roja, canal UV a 254 nm. Rastro negro, canal de radiactividad. Las flechas 1, 2 indican el inicio y el final de desviar la fracción radiactiva que contiene L-[18F]FETrp a la columna C18, respectivamente. Las flechas 3, 4 indican el inicio y el final de la recolección de la fracción objetivo purificada L-[18F]FETrp eluida de la columna C18, respectivamente. Abreviatura: L-[18F]FETrp = 1-(2-[18F]Fluoroethyl)-L-triptófano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Cromatograma analítico típico de HPLC para el control de calidad de L-[18F]FETrp. 1) Solución en blanco, 2) solución estándar de L-FETrp, 3) solución estándar de mezclas L-FETrp y D-FETrp, 4) traza UV de L-FETrp a 230 nm, 4) traza de radiactividad de la formulación L-[18F]FETrp. Abreviatura: L-[18F]FETrp = 1-(2-[18F]Fluoroethyl)-L-triptófano; L-FETrp = 1-(2-fluoroetilo)-L-triptófano; D-FETrp = 1-(2-fluoroetilo)-D-triptófano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Trazador | Investigación clínica | Principales indicaciones | Pros | Contras | |||
| 11 C-5-HTP | Sí | Imágenes de tumores neuroendocrinos productores de serotonina, enfermedades neuropsiquiátricas | Sensible en la detección de pequeños tumores neuroendocrinos | Necesita un ciclotrón in situ, vida media corta, procedimientos laboriosos, radiosíntesis multienzimática, sensible a la concentración de precursores y al pH de la solución, absorción inespecífica en áreas dopaminérgicas y noradrenérgicas | |||
| [11C] OFICINA | Sí | Localización de tejido epileptogénico y tumores cerebrales basados en fuertes activaciones de la vía de la quinurenina | Producción de cGMP disponible, no incorporada a la síntesis de proteínas | Necesita un ciclotrón in situ, vida media corta, procedimientos laboriosos, cuantificación complicada en condiciones patológicas | |||
| L-[18F]FETrp | No | Obtención de imágenes de la vía de la quinurenina, incluidos los focos epilépticos, los tumores cerebrales y la detección de anomalías neuroinflamatorias asociadas a la epilepsia | Vida media favorable, disponible para la administración de satélites, radiosíntesis cGMP, alta estabilidad hacia la defluoración y dosimetría de radiación favorable | Absorción facilitada tanto por el transportador de L-aminoácidos como por el transportador de alanina-serina-cisteína, aún no hay investigaciones en humanos | |||
Tabla 1: Comparación de 11C-5-HTP, [11C]AMT y L-[18F]FETrp. Abreviaturas: cGMP = buenas prácticas de fabricación actuales; α-[11C]metil-L-triptófano; L-[18F]FETrp = 1-(2-[18F]Fluoroetil)-L-triptófano; 11 C-5-HTP = 11C-5-hidroxitriptófano.
| Horas después del final de la síntesis del ensayo | Pureza radioquímica por HPLC (%) | Pureza química (%) | Exceso enantiomérico (%) | Valor de pH |
| 0 | 99 | >95 | 98 | 5.5 |
| 1 | 99 | >95 | 99 | 5.5 |
| 2 | 99 | >95 | 99 | 5.5 |
| 4 | 99 | >95 | 98 | 5.5 |
| 6 | 98 | >95 | 98 | 5.5 |
| 8 | 97 | >95 | 97 | 5.5 |
Tabla 2: Prueba de estabilidad de L-[18F]FETrp en un lote típico a la concentración de dosis más alta. Abreviatura: L-[18F]FETrp = 1-(2-[18F]Fluoroethyl)-L-triptófano.
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Discussion
El triptófano es un aminoácido esencial para los seres humanos. Juega un papel importante en la regulación del estado de ánimo, la función cognitiva y el comportamiento. Los derivados del triptófano radiomarcados, en particular el [11C]AMT marcado con carbono-11, han sido ampliamente estudiados debido a su papel único en el mapeo de la síntesis de serotonina38,39, la detección y clasificación de tumores40, la guía de la cirugía de epilepsia41,42 y la evaluación de la respuesta al tratamiento en la diabetes43. Sin embargo, la corta vida media y los laboriosos procedimientos de radiomarcado limitan la aplicación generalizada de [11C]AMT. Se están realizando esfuerzos para desarrollar agentes marcados con flúor-18 para el metabolismo del triptófano. Dos artículos de revisión recientes resumen el desarrollo y las propiedades de imagen de los agentes de imágenes de triptófano marcados con flúor-183,28.
En comparación con su predecesor marcado con 11C, L-[18F]FETrp demuestra propiedades de imagen in vivo favorables, buena estabilidad metabólica y resistencia a la defluoración33. Además, L-[18F]FETrp demuestra un perfil de dosimetría favorable en comparación con 18F-FDG y se ha propuesto como un agente de imagen de triptófano prometedor para la traducción clínica32,33. La metodología descrita aquí utiliza una estrategia de un solo bote y dos pasos para la radiosíntesis de L-[18F]FETrp en un sistema de síntesis de radioquímica. L-[18F]FETrp se produjo con alta pureza química, pureza radioquímica y exceso enantiomérico. La masa total de L-FETrp no radiomarcada en la dosis final no es más de 5 μg, y el contenido de etanol no es más del 10%. L-[18F]FETrp se produce rutinariamente en el centro de PET para la obtención de imágenes del metabolismo del triptófano en un modelo de tumor cerebral de ratón meduloblastoma transgénico y ha mostrado resultados de imagen favorables32. En comparación con el método informado para L-[18F]FETrp, el protocolo actual incluye los beneficios que se detallan a continuación.
En primer lugar, se utiliza un vaso de reacción pequeño y menos disolventes precursores y de reacción para el radioetiquetado en comparación con otros módulos y métodos de radiomarcado notificados (en los que se utilizaron 9 mg de precursor en 1,1 ml de disolvente)35, y solo se añaden a la reacción 1-2 mg de precursor de radiomarcado en 0,5 ml de disolvente, pero con un rendimiento mucho mayor del enantiómero. Se ha reportado un rendimiento inferior al 1% para una radiosíntesis de dos ollas y tres pasos de L-[18F]FETrp sin ningún informe del exceso de valor enantiomérico44.
En segundo lugar, se utiliza la cantidad más baja de K222 tóxico, en comparación con los procedimientos informados para L-[18F]FETrp o racemic [18F]FETrp. Por lo general, se utilizan 4-5 mg de K222 en comparación con 37,5 mg utilizados por otros35. K222 es un catalizador de transferencia de fase utilizado con frecuencia en la radiosíntesis de trazadores de PET marcados con 18F. El límite especificado en el USP para K222 es inferior a 50 μg/mL. Se debe realizar una prueba de manchas de color para la detección de la concentración residual de K222 para cumplir con los criterios antes de liberar la dosis final para uso clínico45.
En tercer lugar, solo se introduce un 1% de agua en la solución K2CO3/K222 para la elución de fluoruro [18F], lo que acelera el proceso de secado del fluoruro acuoso [18F]. [18F]Los aniones de fluoruro están muy hidratados y se vuelven químicamente inertes en medios acuosos46. Por lo tanto, se requiere mejorar la nucleofilia mediante la desolvación del fluoruro [18F] y el secado azeotrópico de la solución acuosa para la incorporación de fluoruro [18F]. El agua también competirá con el fluoruro [18F] para hidrolizar en lugar de la sustitución nucleófila deseada [18F] de fluoruro del precursor de radiomarcado.
Cuarto, se utiliza una fase móvil inyectable para la purificación de L-[18F]FETrp. El etanol al diez por ciento en acetato de sodio / ácido acético de 50 mM, pH 5.5, se utiliza como la fase móvil para purificar el radiotrazador, llevando fácilmente el contenido de etanol a menos del 10% en la dosis final para uso clínico. Si bien se ha informado que el 90% de etanol en el agua resuelve los enantiómeros, se necesita más tiempo para evaporar el contenido de etanol a menos del 10% a 78 ° C34.
El estudio preclínico de L-[18F]FETrp en un modelo de ratón con meduloblastoma transgénico muestra que 1-L-[18F]FETrp tenía una alta acumulación de tumores cerebrales con cinética favorable, defluoración in vivo insignificante y baja captación de fondo32. 1-L-[18F]FETrp también muestra una relación objetivo-no objetivo superior a 18F-FDG31. Además, el protocolo es fácil de configurar para la producción de L-[18F]FETrp para la investigación clínica37. Se pueden realizar fácilmente pruebas de control de calidad adicionales y completas, que incluyen integridad del filtro, pureza radionucleídica, niveles de disolvente residual, concentración de K222, nivel de endotoxinas bacterianas y pruebas de esterilidad, para la dosis final del radiofármaco. El proceso de aprobación regulatoria para la utilización clínica de L-[18F]FETrp en sujetos humanos está activamente en curso.
El método tiene algunas limitaciones. Se utilizan dos columnas de HPLC para obtener una pureza química adecuada y un exceso enantiomérico de L-[18F]FETrp. Para la purificación se utiliza un caudal de la fase móvil a 3 ml/min. Un caudal más alto da como resultado una alta contrapresión, mientras que un caudal más bajo conduce a un tiempo prolongado para la purificación y una resolución de referencia deficiente de los picos. Las columnas alternativas de HPLC que son compatibles con la fase móvil y muestran una mejor selectividad hacia los enantiómeros y una buena resolución sobre las impurezas pueden simplificar los pasos de purificación.
El módulo de síntesis de radioquímica es un sistema no comercial. La radiosíntesis totalmente automatizada de RACEMIC [18F]FETrp se ha reportado en un sintetizador comercial GE FASTlab. La separación quiral de los enantiómeros se realiza con una columna de HPLC analítica quiral; los isómeros finales L y D se formulan en un segundo casete FASTLab35. Xin y Cai34 informaron de la radiosíntesis automática de L-[18F]FETrp ópticamente puro utilizando un sistema GE FX-N. Si bien los dos enantiómeros se pueden separar fácilmente con la columna quiral semipreparativa de HPLC, la fase móvil con un alto contenido de etanol (90% de etanol en agua) no es adecuada para la inyección humana directa34. El uso de un radiosíntesis comercial y una fase móvil inyectable para L-[18F]FETrp con alto exceso enantiomérico es altamente deseable para una fácil investigación clínica.
En conclusión, un análogo de triptófano marcado con flúor 18 L-[18F]FETrp se sintetizó en un sistema de síntesis de radioquímica utilizando un enfoque de una olla y dos pasos con alta confiabilidad y reproducibilidad. La radiosíntesis presenta pequeñas cantidades de precursores y disolventes de radiomarcado, una fase móvil inyectable y una fácil implementación para la producción clínica de L-[18F]FETrp para uso humano. El protocolo facilitará una utilización más generalizada de este radiotrazador para trastornos neurológicos y cánceres implicados con el metabolismo del triptófano.
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Disclosures
Los autores declaran que no existen intereses financieros contrapuestos.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Centro de Diagnóstico e Investigación PET / MRI, y por los Departamentos de Investigación Biomédica y Radiología en Nemours / Alfred I. duPont Hospital for Children.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| [18F]Fluoride in [18O]H2O | PETNET Solutions Inc. | N/A | |
| 4,7,13,16,21,24-hexaoxa-1,10-diazabicyclo[8.8.8]hexacosane | ACROS | 291950010 | Kryptofix 222 or K222, 98% |
| Acetic acid | ACROS | 222142500 | 99.8% |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004 | anhydrous, 99.8% |
| Agilent 1260 HPLC system | Agilent Technologies | Agilent 1260 | Agilent 1260 series |
| Analytcial chiral HPLC column | Sigma-Aldrich | 12024AST | Astec CHIROBIOTIC T, 25 cm × 4.6 mm |
| Carbon dioxide, 60 LBS | Airgas | REFR744R200S | 99.99% |
| D-FETrp standard reference | Affinity Research Chemicals Inc | N/A | Custom synthesis |
| Empty sterile vial | Jubilant HollisterStier | 7515 | 20 mm closure, 10 mL |
| Ethanol | Decon Labs | 2716 | 200 proof, USP grade. ≥99.9% |
| Fisherbrand 13 mm Syringe Filter, 0.22 µm, PVDF, sterile | Fisher Scientific | 09-720-3 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 30721 | ≥37% |
| Isopropanol | Decon Labs | 8316 | 70%, sterile |
| L-[18F]FETrp radiolabeling precursor | Affinity Research Chemicals Inc | N/A | Custom synthesis |
| L-FETrp standard reference | Affinity Research Chemicals Inc | N/A | Custom synthesis |
| Light C8 cartridge | Waters | WAT036770 | Sep-Pak C8 plus light cartridge |
| Needle, 20 G x 1 | Becton-Dickinson & Co. | 305175 | |
| Needle, 20 G x 1 ½ | Becton-Dickinson & Co. | 305176 | |
| Needle, 21 G x 2 | Becton-Dickinson & Co. | 305129 | |
| Neutral aluminum oxide | Waters | WAT023561 | Sep-Pak alumina N plus light |
| Nylon membrane (0.20 µm ) | MilliPore | GNWP04700 | 47 mm |
| Pall Acrodisc 25 mm syringe sterile filter | Pall Corporation | 4907 | |
| PETCHEM radiochemistry synthesis system | PETCHEM Solutions Inc. Pinckney, MI | N/A | Radiosynthesizer |
| pH strips 2.0 - 9.0 | EMD Millipore | 1.09584.0001 | |
| Potassium carbonate | Sigma-Aldrich | 367877 | 99.995% |
| Quaternary methylammonium light cartridge | Waters | 186004051 | Sep-Pak QMA light |
| Semi-preparative C18 HPLC column | Phenomenex | 00D-4253-N0 | 100 × 10 mm |
| Semi-preparative chiral HPLC column | Sigma-Aldrich | 12034AST | Astec CHIROBIOTIC T, 25 cm × 10 mm |
| Sodium chloride injection 23.4% | APP Pharmaceutical, LLC | 18730 | USP grade |
| Sodium chloridei injection 0.9% | Hospira | NDC 0409-4888-10 | USP grade |
| Sodium hydroxide | Honeywell | 306576 | 99.99% |
| Spinal needle, 20 G x 3 ½ | Becton-Dickinson & Co. | 405182 | |
| Sterile alcohol prep pads | BioMed Resource Inc. | PC661 | |
| Sterile empty vials, 2 mL | Hollister Stier | 7505ZA | 13 mm closure |
| Sterile empty vials, 30 mL | Jubilant HollisterStier | 7520ZA | 20 mm closure |
| Syringe PP/PE, 3 mL, Luer Lock | Air-Tite | 4020-X00V0 | |
| Syringe PP/PE, 5 mL, Luer Lock | Becton-Dickinson & Co. | 309646 | |
| Syringe, PP/PE, 10 mL, NORM-JECT | Air-Tite | 4100-000V0 | |
| Syringe, 1 mL, Luer Slip | Becton-Dickinson & Co. | 309659 | |
| Syringe, 3 mL, Luer-Lock | Becton-Dickinson & Co. | 309657 | |
| Ultra high purity argon | Airgas | AR UHP300 | 99.999% |
| Ultrapure water | MilliporeSigma | ZRQSVP300 | Direct-Q 3 tap to pure and ultrapure water purification system |
References
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![Radiosíntesis de 1-(2-[<sup>18F</sup>]Fluoroetilo)-L-Triptófano usando un protocolo de una olla y dos pasos](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/63025.jpg)
