Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल एक कस्टम-डिज़ाइन किए गए 'पैसिव हेड मोशन' सिस्टम का वर्णन करता है, जो कृन्तकों के सिर पर यांत्रिक त्वरण को पुन: उत्पन्न करता है जो मध्यम वेग पर चलने वाले ट्रेडमिल के दौरान उत्पन्न होता है। यह शारीरिक व्यायाम के लाभकारी प्रभावों से यांत्रिक कारकों / तत्वों को विच्छेदित करने की अनुमति देता है।
Abstract
व्यायाम व्यापक रूप से विभिन्न बीमारियों और शारीरिक विकारों के लिए प्रभावी के रूप में मान्यता प्राप्त है, जिसमें मस्तिष्क की शिथिलता से संबंधित लोग भी शामिल हैं। हालांकि, व्यायाम के लाभकारी प्रभावों के पीछे आणविक तंत्र खराब समझे जाते हैं। कई शारीरिक कसरत, विशेष रूप से जो जॉगिंग और चलने जैसे एरोबिक व्यायाम के रूप में वर्गीकृत हैं, जमीन के साथ पैर के संपर्क के समय आवेगपूर्ण बल पैदा करते हैं। इसलिए, यह अनुमान लगाया गया था कि यांत्रिक प्रभाव को इस बात में फंसाया जा सकता है कि व्यायाम जीव होमियोस्टैसिस में कैसे योगदान देता है। मस्तिष्क पर इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए, एक कस्टम-डिज़ाइन किया गया 'निष्क्रिय सिर गति' (इसके बाद पीएचएम के रूप में संदर्भित) प्रणाली विकसित की गई थी जो नियंत्रित और परिभाषित परिमाण और मोड के साथ ऊर्ध्वाधर त्वरण उत्पन्न कर सकती है और यांत्रिक उत्तेजना को पुन: उत्पन्न कर सकती है जिसे मध्यम वेगों पर ट्रेडमिल चलने के दौरान कृन्तकों के सिर पर लागू किया जा सकता है, जानवरों में व्यायाम के प्रभावों का परीक्षण करने के लिए एक विशिष्ट हस्तक्षेप। इस प्रणाली का उपयोग करके, यह प्रदर्शित किया गया था कि पीएचएम चूहों के प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स (पीएफसी) न्यूरॉन्स में सेरोटोनिन (5-हाइड्रॉक्सीट्रिप्टामाइन, जिसे बाद में 5-एचटी) रिसेप्टर उपप्रकार 2 ए (5-एचटी2 ए) सिग्नलिंग के रूप में संदर्भित किया जाता है। यह काम पीएचएम को लागू करने और कृन्तकों के सिर पर इसके परिणामी यांत्रिक त्वरण को मापने के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है।
Introduction
व्यायाम कई शारीरिक विकारों के इलाज या रोकथाम के लिए फायदेमंद है, जिसमें जीवनशैली की बीमारियां जैसे मधुमेह मेलेटस और आवश्यक उच्च रक्तचाप1 शामिल हैं। इससे संबंधित,मस्तिष्क के कार्यों पर व्यायाम के सकारात्मक प्रभावों के बारे में सबूत भी जमा किए गए हैं। हालांकि, मस्तिष्क के लिए व्यायाम के लाभों को अंतर्निहित आणविक तंत्र मुख्य रूप से अस्पष्ट रहते हैं। अधिकांश शारीरिक गतिविधियाँ और कसरत सिर पर यांत्रिक त्वरण उत्पन्न करते हैं, कम से कम कुछ हद तक। जबकि विभिन्न शारीरिक घटनाओं को यांत्रिक रूप से विनियमित किया जाता है, यांत्रिक लोडिंग का महत्व, ज्यादातर मामलों में, मस्कुलोस्केलेटल सिस्टम 3,4,5 में प्रलेखित किया गया है। यद्यपि मस्तिष्क को शारीरिक गतिविधियों के दौरान यांत्रिक बलों के अधीन भी किया जाता है, विशेष रूप से तथाकथित प्रभावित करने वाले व्यायाम, शारीरिक मस्तिष्क समारोह के यांत्रिक विनियमन का शायद ही कभी अध्ययन किया गया है। क्योंकि सिर पर यांत्रिक त्वरण की पीढ़ी शारीरिक कसरत के लिए अपेक्षाकृत आम है, यह अनुमान लगाया गया है कि यांत्रिक विनियमन को मस्तिष्क कार्यों के लिए व्यायाम के लाभों में फंसाया जा सकता है।
5-एचटी2 ए रिसेप्टर सिग्नलिंग तंत्रिका तंत्र में कार्य करने वाले विभिन्न जैव रासायनिक संकेतों के बीच भावनाओं और व्यवहारों को विनियमित करने में आवश्यक है। यह कई मनोरोग रोगों 6,7,8 में शामिल है, जिस पर व्यायाम चिकित्सीय रूप से प्रभावी साबित हुआ है। 5-एचटी2 ए रिसेप्टर 5-एचटी2 रिसेप्टर का एक उपप्रकार है जो सेरोटोनिन परिवार से संबंधित है और जी-प्रोटीन-युग्मित रिसेप्टर (जीपीसीआर) परिवार का सदस्य भी है, जिसका सिग्नलिंग इसके आंतरिककरण द्वारा नियंत्रित होता है, या तो लिगैंड-निर्भर या -स्वतंत्र9। सिर हिलाना कृन्तकों का एक विशिष्ट व्यवहार है, जिसकी मात्रा (आवृत्ति) स्पष्ट रूप से उनके प्रीफ्रंटल कॉर्टेक्स (पीएफसी) न्यूरॉन्स10,11 में 5-एचटी2 ए रिसेप्टर सिग्नलिंग की तीव्रता का प्रतिनिधित्व करती है। प्रशासित 5-एचटी (हेड-ट्विच प्रतिक्रिया, जिसे बाद में एचटीआर के रूप में संदर्भित किया जाता है; पूरक मूवी 1 देखें) के लिए इस हॉलुसिनोजेनिक प्रतिक्रिया की सख्त विशिष्टता का लाभ उठाते हुए, मस्तिष्क के कार्यों पर व्यायाम प्रभावों में यांत्रिक प्रभावों पर ऊपर उल्लिखित परिकल्पना का परीक्षण किया गया था। इस प्रकार, हमने चूहों के एचटीआर का विश्लेषण और तुलना की, जो या तो मजबूर व्यायाम (ट्रेडमिल रनिंग) या व्यायाम-नकल यांत्रिक हस्तक्षेप (पीएचएम) के अधीन थे।
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Protocol
सभी पशु प्रयोगों को विकलांग व्यक्तियों के लिए राष्ट्रीय पुनर्वास केंद्र की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था। ट्रेडमिल रनिंग और पीएचएम के दौरान सिर पर त्वरण को मापने के लिए 8-9 सप्ताह के नर स्प्राग-डॉवले चूहों का उपयोग किया गया था। 9-10 सप्ताह के नर C57BL/6 चूहों का उपयोग व्यवहार परीक्षणों और PFC के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए किया गया था। जानवरों को वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किया गया था ( सामग्री की तालिका देखें)।
1. ट्रेडमिल रनिंग के दौरान एक्स-, वाई-और जेड-अक्षों के साथ त्वरण के परिमाण का मापन
- चूहे को 1.5% आइसोफ्लुरेन के साँस लेने के साथ एनेस्थेटाइज करें।
नोट: चूहों का उपयोग प्रयोगशाला के वातावरण में अनुकूलन के कम से कम 1 सप्ताह के बाद किया गया था। सुनिश्चित करें कि चूहा हिंदलिम्ब पैर की अंगुली चुटकी के प्रति उत्तरदायी नहीं है। - सर्जिकल टेप का उपयोग करके चूहे के सिर के शीर्ष पर एक्सेलेरोमीटर ( सामग्री की तालिका देखें) को ठीक करें।
- संज्ञाहरण से पूरी तरह से ठीक होने के बाद, चूहे को ट्रेडमिल मशीन में रखें ( सामग्री की तालिका देखें), और ट्रेडमिलिंग को मध्यम वेग (20 मीटर / मिनट) 12 (चित्रा 1 ए) में समायोजित करें।
नोट: आइसोफ्लुरेन इनहेलेशन की समाप्ति के बाद एनेस्थीसिया से चूहे की पूरी वसूली की पुष्टि करने और ट्रेडमिल प्रयोग शुरू करने में कम से कम 20 मिनट लगे। सुनिश्चित करें कि चूहा एक हिंदलिम्ब पैर की अंगुली चुटकी के प्रति उत्तरदायी है, स्पष्ट चौंका देने के बिना चलने या दौड़ने में सक्षम है। - निर्माता के निर्देशों के बाद एप्लिकेशन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके चलने वाले चूहे ट्रेडमिल के दौरान ऊर्ध्वाधर त्वरण के परिमाण को मापें ( सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: 10 सीरियल तरंगें निकालें और व्यक्तिगत रूप से 3-आयामी अक्षों (एक्स-, वाई-और जेड-अक्षों, चित्रा 1 बी) के साथ औसत त्वरण की गणना करें। ट्रेडमिल रनिंग-प्रेरित त्वरण (चित्रा 1 सी) के रूप में स्टेपिंग-सिंक्रनाइज़ तरंगों (~ 2 हर्ट्ज आवृत्ति) को परिभाषित करके पीक परिमाण की मात्रा निर्धारित की गई थी। इस अध्ययन के लिए चूहों का उपयोग किया गया था क्योंकि उनके बड़े शरीर का आकार सिर पर ऊर्ध्वाधर त्वरण को मज़बूती से मापने के लिए उपयुक्त था, जो चूहों में संभव नहीं था। हालांकि, चूहों का उपयोग आगे के अध्ययन के लिए किया गया था क्योंकि सिर-ट्विच प्रतिक्रिया के मात्रात्मक विश्लेषण से संबंधित आसानी और विश्वसनीयता थी।
2. पीएचएम प्रणाली का समायोजन और चूहों के लिए पीएचएम का अनुप्रयोग
- पीएचएम सिस्टम (चित्रा 1 डी) में प्लेटफॉर्म के दोलन और प्रोपेलर के आकार के कैम की रोटेशन गति के आयाम को पूर्व-सेट करें ताकि ऊर्ध्वाधर त्वरण का परिमाण और आवृत्ति चरण 1.4 में प्राप्त मूल्यों से मेल खाए।
नोट: पीएचएम प्रणाली में एक धातु ढांचा और लकड़ी का मंच शामिल है। बिल्ड-इन ड्राइवर से जुड़े डायल को समायोजित करके मोटर की गति को बदला और नियंत्रित किया जा सकता है (सामग्री की तालिका देखें)। 600 का डायल स्केल 2 हर्ट्ज, चित्रा 1 ई से मेल खाता है। प्रोपेलर के आकार के कैम में 5 मिमी कदम ऊंचाई (चित्रा 1 एफ) के साथ चार ब्लेड हैं। - 1.2% आइसोफ्लुरेन के साँस के माध्यम से माउस को एनेस्थेटाइज करें।
नोट: चूहों का उपयोग प्रयोगशाला वातावरण में कम से कम 1 सप्ताह के अनुकूलन के बाद किया गया था। सुनिश्चित करें कि माउस हिंदलिम्ब पैर की अंगुली चुटकी के लिए उत्तरदायी नहीं है। - माउस को क्रमशः दोलनीय और स्थिर प्लेटफार्मों पर स्थित सिर और शरीर के बाकी हिस्सों के साथ एक प्रवण स्थिति में रखें।
नोट: माउस को एनेस्थेटाइज्ड रखें (1.2% आइसोफ्लुरेन)। - प्लेटफ़ॉर्म को लंबवत रूप से घुमाने के लिए मोटर चालू करें, और माउस पर PHM लागू करें।
नोट: मोटर गति को 2 हर्ट्ज पर प्लेटफ़ॉर्म को उतारने के लिए समायोजित किया गया था (चरण 2.1 देखें)। एनेस्थेटाइज करें और नियंत्रण माउस को पीएचएम प्लेटफॉर्म पर भी रखें, लेकिन मोटर को बंद छोड़ दें।
3. ट्रेडमिल पर माउस चलाना
- माउस को ट्रेडमिल मशीन पर रखें और ट्रेडमिलिंग को मध्यम वेग (10 मीटर / मिनट) 13 में समायोजित करें।
4. माउस हेड-ट्विच प्रतिक्रिया (एचटीआर) का परिमाणीकरण
- पारदर्शी प्लास्टिक मामले में पूरे स्थान को रिकॉर्ड करने के लिए वीडियो कैमरा (फ्रेम दर: 24 एफपीएस) सेट करें।
नोट: प्लास्टिक पिंजरे का उपयोग वीडियो रिकॉर्डिंग के क्षेत्र में माउस रखने के लिए किया गया था। - इंट्रापरिटोनियल रूप से 5-हाइड्रॉक्सीट्रिप्टोफैन (5-एचटीपी) (100 मिलीग्राम / किग्रा) ( सामग्री की तालिका देखें), 5-एचटी के अग्रदूत, एक माउस को प्रशासित करता है।
- माउस को पारदर्शी पिंजरे में रखें और 30 मिनट के लिए रिकॉर्डिंग शुरू करें।
- रिकॉर्ड किए गए वीडियो (1/2x या 1/3x गति) की समीक्षा करें, सिर को मैन्युअल रूप से गिनें।
नोट: विश्लेषकों को प्रयोगात्मक प्रक्रिया के लिए अंधा नहीं किया गया था। माउस की विशेषता "टिक जैसी" तीव्र गति ( देखें पूरक मूवी 1) को सिर हिलाने के रूप में गिना गया था, जो शायद ही कभी सामान्य प्रजनन वातावरण के तहत होता है।
5. माउस पीएफसी का इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण
- एक बार एचटीआर परीक्षण पूरा हो जाने के बाद, मिडाज़ोलम (4.0 मिलीग्राम / किग्रा), ब्यूटोरफेनोल (4.0 मिलीग्राम / किग्रा), और मेडेटोमिडीन (0.3 मिलीग्राम / किग्रा) के मिश्रण को प्रशासित करके माउस को एनेस्थेटाइज करें, पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ काम करें, और फिर पहले प्रकाशित रिपोर्ट14,15 के बाद मस्तिष्क को एक्साइज करें।
- पीबीएस में 4% पीएफए में दिमाग को 4 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त 24 घंटे के लिए ठीक करें, और डूबने तक 30% सुक्रोज / पीबीएस में स्टोर करें। फिक्स्ड-इन इष्टतम काटने के तापमान यौगिक को फ्रीज करें (ओसीटी यौगिक, सामग्री की तालिका देखें)।
- स्लाइड बॉक्स से माउस मस्तिष्क के क्रायो-सेक्शन पुनर्प्राप्त करें ( सामग्री की तालिका देखें)। कमरे के तापमान पर स्लाइड्स को साफ वाइप्स पर छोड़ दें जब तक कि नमूने पूरी तरह से निर्जलित न हो जाएं।
नोट: बीस-माइक्रोमीटर-मोटी खंड (पार्श्व +0.5-1.5 मिमी) क्रायोस्टैट का उपयोग करके ओसीटी यौगिक में एम्बेडेड जमे हुए नमूनों से तैयार किए गए थे ( सामग्री की तालिका देखें)। - घोल के प्रसार क्षेत्र को सीमित करने के लिए स्लाइड पर क्रायो-सेक्शन ऊतक के चारों ओर एक सर्कल खींचने के लिए एक तरल अवरोधक पेन ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करें (ट्राइस-बफर्ड खारा (टीबीएस-टी) में 0.1% ट्वीन -20)।
- नम वातावरण बनाने के लिए स्लाइड्स को पकड़े हुए ट्रे के तल पर गीले पोंछे रखें।
- टीबीएस-टी के साथ परमेबिलाइजेशन के बाद, 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 4% गधे के सीरम ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ ब्लॉक करें।
- टीबीएस-टी में 5 मिनट के विसर्जन से स्लाइड्स को एक बार धो लें।
- प्रत्येक स्लाइड पर उचित रूप से पतला प्राथमिक एंटीबॉडी और डीएपीआई ( सामग्री की तालिका देखें) मिश्रण के 100 μL लागू करें, नमूने को सूखने से बचने के लिए ट्रे को कवर करें, और कमरे के तापमान पर रात भर इनक्यूबेट करें।
- टीबीएस-टी के साथ तीन बार (प्रत्येक इनक्यूबेशन 5 मिनट) कुल्ला करें।
- प्रत्येक स्लाइड पर उचित रूप से पतला प्रजातियों से मेल खाने वाले फ्लोरोसेंट सेकेंडरी एंटीबॉडी (एलेक्सा फ्लूर 488, 568, या 645 के साथ संयुग्मित) के 100 μL लागू करें ( सामग्री की तालिका देखें) और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
- टीबीएस-टी के साथ तीन बार (प्रत्येक इनक्यूबेशन 5 मिनट) कुल्ला करें।
- माउंटिंग माध्यम के साथ स्लाइड्स को माउंट करें ( सामग्री की तालिका देखें)। स्लाइड्स को कवरलिप्स से कवर करें।
- प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत नमूना देखें।
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Representative Results
मध्यम वेग (20 मीटर /मिनट) पर चलने वाले ट्रेडमिल के दौरान चूहों के सिर पर ऊर्ध्वाधर त्वरण का चरम परिमाण लगभग 1.0 × ग्राम था (चित्रा 1 सी)। पीएचएम प्रणाली (चित्रा 1 डी) कृन्तकों के सिर पर 1.0 × ग्राम की ऊर्ध्वाधर त्वरण चोटियों को उत्पन्न करने के लिए स्थापित की गई थी।
चूहों के लिए पीएचएम आवेदन (2 हर्ट्ज, 7 दिनों के लिए 30 मिनट / दिन) ने नियंत्रित चूहों की तुलना में उनके एचटीआर को काफी कम कर दिया (7 दिनों के लिए 30 मिनट / दिन के लिए पीएचएम के बिना दैनिक एनेस्थेटाइज्ड) (चित्रा 2)। यह पीएफसी न्यूरॉन्स में 5-एचटी2 ए रिसेप्टर सिग्नलिंग पर पीएचएम के दमनकारी प्रभाव का प्रतिनिधित्व करता है।
ट्रेडमिल रनिंग और पीएचएम ने माउस पीएफसी न्यूरॉन्स (चित्रा 3) में 5-एचटी2 ए रिसेप्टर आंतरिककरण को काफी बढ़ाया। लगातार, ट्रेडमिल रनिंग और पीएचएम डाउन-रेगुलेटेड 5-एचटीपी-प्रेरित सी-फॉस अभिव्यक्ति, माउस पीएफसी न्यूरॉन्स में 5-एचटी2 ए रिसेप्टर सक्रियण14 की डाउनस्ट्रीम सेलुलर घटना (चित्रा 4)। इन परिणामों से पता चलता है कि ट्रेडमिल रनिंग और पीएचएम पीएफसी न्यूरॉन्स में 5-एचटी2 ए रिसेप्टर्स को आंतरिक करते हैं, प्रासंगिक सिग्नलिंग को कम करते हैं।
चित्र 1: ट्रेडमिल रनिंग के दौरान त्वरण के परिमाण को मापना। (A) उनके ट्रेडमिल रनिंग के दौरान चूहों के सिर पर उत्पन्न त्वरण के माप के लिए चित्रण। (बी) इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले एक्स-(बाएं-दाएं), वाई-(रोस्ट्रल-कॉडल), और जेड-(पृष्ठीय-उदर) अक्षों की परिभाषा। (C) ट्रेडमिल पर 20 मीटर/मिनट और PHM (आवृत्ति: 2 Hz) (प्रत्येक समूह के लिए n = 3 चूहे) पर चलने के दौरान चूहों के सिर पर त्वरण उत्पन्न हुए थे। पीएचएम प्रणाली को 20 मीटर / मिनट ट्रेडमिल रनिंग (1.0 × ग्राम) के दौरान ऊर्ध्वाधर त्वरण चोटियों का उत्पादन करने के लिए समायोजित किया गया था। समकोण स्केल बार, 0.5 × g / 0.5 s। छवियां समान परिणामों के साथ तीन स्वतंत्र प्रयोगों का प्रतिनिधित्व करती हैं। (डी) पूरे पीएचएम सिस्टम की तस्वीर। € प्रोपेलर के आकार के कैम की तस्वीर एक ड्राइवर से सुसज्जित मोटर से जुड़ी हुई है। (एफ) प्रोपेलर के आकार के कैम की तस्वीर जिसमें 5 मिमी कदम ऊंचाई वाले चार ब्लेड शामिल हैं (डबल-हेड लाल तीर देखें)। यह आंकड़ा रयू एट अल.15 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: चूहों के लिए पीएचएम अनुप्रयोग। (ए) एचटीआर पर पीएचएम के प्रभावों के विश्लेषण के लिए चित्रण। (बी, सी) पीएचएम ने 5-एचटीपी-प्रेरित एचटीआर को कम किया। 5-एचटीपी प्रशासन के बाद हेड ट्विचिंग को 5 मिनट ब्लॉक (बी) और 30 मिनट ब्लॉक (सी) में गिना गया था। नियंत्रण 2 उन चूहों का प्रतिनिधित्व करता है जिन्हें एनेस्थेटाइज्ड किया गया था और पीएचएम प्लेटफॉर्म पर रखा गया था। डेटा को एसईएम *, पी < 0.05, अप्रकाशित टी-टेस्ट (प्रत्येक समूह के लिए एन = 10 चूहे) के ± साधन के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। यह आंकड़ा रयू एट अल.15 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 3: ट्रेडमिल रनिंग और पीएचएम अनुप्रयोग ने माउस पीएफसी न्यूरॉन्स में5-एचटी 2 ए रिसेप्टर आंतरिककरण को बढ़ाया। (ए) दैनिक पीएचएम के एक सप्ताह के बाद5-एचटीपी (या वाहन) के साथ इंजेक्ट किए गए चूहों के पीएफसी के एंटी-5-एचटी 2 ए रिसेप्टर (5-एचटी2 एआर; लाल) और एंटी-न्यून (हरे) इम्यूनोस्टेनिंग के माइक्रोग्राफ। तीर-नुकीले कोशिकाओं के एंटी-5-एचटी2 ए रिसेप्टर इम्यूनोस्टेनिंग की उच्च-आवर्धन छवियों को ग्रेस्केल के साथ दिखाया गया है। पीली रेखाएं न्यून-पॉजिटिव संकेतों द्वारा उल्लिखित सोमा मार्जिन को इंगित करती हैं, और सियान एरोहेड आंतरिक एंटी-5-एचटी2 ए रिसेप्टर इम्यूनोसिग्नल को इंगित करते हैं। स्केल सलाखों, 20 μm. छवियां पांच चूहों के प्रतिनिधि हैं। (बी) माउस पीएफसी न्यूरॉन्स में 5-एचटी2 ए रिसेप्टर आंतरिककरण का परिमाणीकरण। आंतरिक और झिल्ली से जुड़े 5-HT2A रिसेप्टर-पॉजिटिव क्षेत्रों को माउस PFC में NeuN-पॉजिटिव क्षेत्र के सापेक्ष मानों के रूप में निर्धारित किया गया था। नियंत्रण 1 ट्रेडमिल मशीन में रखे गए चूहों का प्रतिनिधित्व करता है, और नियंत्रण 2 उन चूहों का प्रतिनिधित्व करता है जिन्हें एनेस्थेटाइज्ड किया गया था और PHM प्लेटफॉर्म पर रखा गया था। प्रत्येक माउस के लिए पैंतीस से चालीस न्यून-पॉजिटिव न्यूरोनल सोमा का विश्लेषण किया गया (आंतरिक: बाएं चार्ट, पी < 0.001, पोस्ट हॉक बोनफेरोनी परीक्षण के साथ एक-तरफ़ा एनोवा; दाएं चार्ट, पी = 0.0027, अप्रकाशित टी-टेस्ट; झिल्ली से जुड़े: बाएं चार्ट, पी < 0.001, पोस्ट हॉक बोनफेरोनी परीक्षण के साथ एक-तरफ़ा एनोवा; दायां चार्ट, पी = 0.0025, अप्रकाशित टी-टेस्ट; एन = प्रत्येक समूह के लिए 5 चूहे)। डेटा को SEM ± साधन के रूप में दर्शाया जाता है। **P < 0.01, ***P < 0.001; एनएस, महत्वपूर्ण नहीं है। यह आंकड़ा रयू एट अल.15 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्र 4: ट्रेडमिल रनिंग और पीएचएम माउस पीएफसी न्यूरॉन्स में डाउन-रेगुलेटेड 5-एचटीपी-प्रेरित सी-फॉस अभिव्यक्ति को डाउन-रेगुलेट करता है। (ए) एंटी-सी-फॉस (हरा), एंटी-5-एचटी2 ए रिसेप्टर (लाल), और एंटी-न्यून (नीला) चूहों के पीएफसी के माइक्रोग्राफ दैनिक पीएचएम के एक सप्ताह के बाद इंट्रापरिटोनियल रूप से प्रशासित चूहों के पीएफसी के इम्यूनोस्टेनिंग। स्केल बार, 100 μm. छवियां चार से पांच चूहों के प्रतिनिधि हैं। (B) माउस PFC में 5-HT2A रिसेप्टर-पॉजिटिव न्यूरॉन्स में c-Fos अभिव्यक्ति का परिमाणीकरण। नियंत्रण 1 ट्रेडमिल मशीन में रखे गए चूहों का प्रतिनिधित्व करता है, और नियंत्रण 2 उन चूहों का प्रतिनिधित्व करता है जिन्हें एनेस्थेटाइज्ड किया गया था और PHM प्लेटफॉर्म पर रखा गया था। 300 NeuN- और 5-HT2A रिसेप्टर-पॉजिटिव कोशिकाओं की C-Fos-पॉजिटिव कोशिकाओं की सापेक्ष जनसंख्या (%) को दिखाया गया है (बाएं चार्ट: P < 0.001, पोस्ट हॉक बोनफेरोनी परीक्षण के साथ एक तरफ़ा ANOVA; दायां चार्ट: P < 0.001, अप्रकाशित टी-टेस्ट; कॉलम 1 के लिए n = 4 चूहे, कॉलम 2 से 5 के लिए n = 5 चूहे)। डेटा को SEM ± साधन के रूप में दर्शाया जाता है। ***P < 0.001. यह आंकड़ा रयू एट अल.15 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक फिल्म 1: माउस से हेड-ट्विच प्रतिक्रिया। 2 मिनट 46-एस फिल्म एचटीपी इंजेक्शन के 6 मिनट बाद शुरू होती है। सिर का फड़कना 0:03, 0:39, 1:39 और 2:42 के समय बिंदुओं पर देखा जाता है। कृपया इस मूवी को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
विकसित पीएचएम अनुप्रयोग प्रणाली का उपयोग करते हुए, हमने दिखाया है कि उनके पीएफसी न्यूरॉन्स में 5-एचटी सिग्नलिंग यांत्रिक रूप से विनियमित है। व्यायाम प्रभावों की जटिलता के कारण, स्वास्थ्य संवर्धन के संदर्भ में व्यायाम के परिणाम को ठीक से विच्छेदित करना मुश्किल हो गया है। ऊर्जा की खपत जैसी व्यायाम गतिविधियों के साथ या बाद में होने वाली चयापचय घटनाओं की भागीदारी या योगदान को रोकने के लिए यांत्रिक पहलुओं पर ध्यान केंद्रित किया जाता है। यहां वर्णित विधि मस्तिष्क के कार्यों पर व्यायाम प्रभावों के अंतर्निहित तंत्र की खोज करने वाले बायोमेडिकल अनुसंधान में अधिक व्यापक रूप से उपयोगी होने की उम्मीद है।
वर्तमान प्रणाली को प्रयोगात्मक जानवरों को पीएचएम के अधीन करने के लिए संज्ञाहरण की आवश्यकता होती है, जो मस्तिष्क में तंत्रिका कोशिका व्यवहार और प्रक्रियाओं को प्रभावित (या तो हानिकारक या नहीं) कर सकता है। सिस्टम को संशोधित करके संज्ञाहरण के बिना पीएचएम को लागू करना संभव हो सकता है, जिसमें पीएचएम द्वारा उत्पन्न यांत्रिक त्वरण के परिमाण, मोड और तरंग आकार शामिल हैं। उदाहरण के लिए, वर्तमान पीएचएम के 1 × जी आवेगी चोटियों के बजाय साइनसॉइडल तरंगों के साथ छोटे त्वरण चोटियों को जानवरों द्वारा अधिक आरामदायक उत्तेजना के रूप में "महसूस" किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, कम से कम तनाव के साथ ऑसिलेटिंग प्लेटफॉर्म पर प्रयोगात्मक जानवरों को रखने के लिए नई विधि (ओं) को लागू किया जा सकता है। ये संशोधन और सुधार संभव हैं, मुख्य रूप से क्योंकि पीएचएम-जनित त्वरण सिद्धांत रूप में मध्यम व्यायाम से संबंधित हैं और प्रयोगात्मक जानवरों के लिए "दर्दनाक" तनाव होने की संभावना नहीं है।
पिछले कई अध्ययनों ने कई बीमारियों और विकारोंके इलाज या रोकथाम के लिए एक प्रभावी प्रक्रिया के रूप में मध्यम व्यायाम की सूचना दी है। लैक्टेट सीमा, जहां प्लाज्मा लैक्टेट एकाग्रता एड्रेनोकोर्टिकोट्रोफिक हार्मोन (एसीटीएच) स्राव के साथ तेजी से बढ़ती है, एक तनाव संकेतक18, का उपयोग व्यायाम को हल्के या मध्यम19 के रूप में निर्धारित करने के लिए किया जाता है। हालांकि, "इष्टतम" व्यायाम को आणविक स्तर पर परिभाषित किया जाना बाकी है। क्योंकि न केवल मस्तिष्क बल्कि अंततः अन्य सभी शारीरिक अंगों को व्यायाम के दौरान यांत्रिक बलों के अधीन किया जाता है, यांत्रिक गड़बड़ी को नियोजित करने वाला वर्तमान दृष्टिकोण व्यापक संदर्भों में व्यायाम प्रभावों के पीछे आणविक तंत्र को प्रकट करने में सहायक हो सकता है और वैज्ञानिक उपायों द्वारा "इष्टतम व्यायाम क्या है" को परिभाषित करने में मदद कर सकता है।
हालांकि, वर्तमान विधि कुछ सीमाओं से ग्रस्त है। आकार संगतता की कमी के कारण हम माउस सिर पर एक्सेलेरोमीटर को स्थिर रूप से ठीक नहीं कर सके। यद्यपि प्रारंभिक माप इंगित करता है कि माउस हेड पर ट्रेडमिल रनिंग-जनरेटेड मैकेनिकल त्वरण का चरम परिमाण भी लगभग 1.0 × ग्राम है, इसे अधिक सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए आगे के अध्ययन की आवश्यकता है।
वर्तमान प्रोटोकॉल में कस्टम-डिज़ाइन किए गए पीएचएम सिस्टम की प्रक्रियाओं का विवरण दिया गया है, जिसने शारीरिक व्यायाम से यांत्रिक तत्वों / कारकों को विच्छेदित करने की अनुमति दी है। दृष्टिकोण मस्तिष्क के कार्यों के लिए व्यायाम के लाभों में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करता है।
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Disclosures
लेखक घोषणा करते हैं कि इस पेपर में वर्णित काम से जुड़ी कोई प्रतिस्पर्धी रुचि नहीं है।
Acknowledgments
यह काम जापानी स्वास्थ्य, श्रम और कल्याण मंत्रालय से इंट्राम्यूरल रिसर्च फंड द्वारा समर्थित था; जापान सोसाइटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस से वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए सहायता अनुदान (KAKENHI 15H01820, 15H04966, 18H04088, 20K21778, 21H04866, 21K11330, 20K19367); निजी विश्वविद्यालयों में सामरिक अनुसंधान फाउंडेशन के लिए एमईएक्सटी-समर्थित कार्यक्रम, 2015-2019 जापानी शिक्षा, संस्कृति, खेल, विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (एस 1511017); नैटो साइंस एंड इंजीनियरिंग फाउंडेशन। इस शोध को एलायंस फॉर रीजनरेटिव रिहैबिलिटेशन रिसर्च एंड ट्रेनिंग (एआर 3 टी) से भी धन प्राप्त हुआ, जिसे यूनिस कैनेडी श्राइवर नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ चाइल्ड हेल्थ एंड ह्यूमन डेवलपमेंट (एनआईसीएचडी), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डर एंड स्ट्रोक (एनआईएनडीएस), और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ बायोमेडिकल इमेजिंग एंड बायोइंजीनियरिंग (एनआईबीआईबी) द्वारा पुरस्कार संख्या पी 2 सीएचडी086843 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान द्वारा समर्थित किया गया है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-hydroxytryptophan (5-HTP) | Sigma-Aldrich | H9772 | Serotonin (5-HT) precursor |
| Brushless motor driver | Oriental motor | BMUD30-A2 | Speed changer build-in motor driver |
| C57BL/6 mice | Oriental yeast company | C57BL/6J | Mice used in this study |
| Cryostat | Leica | CM33050S | Microtome to cut frozen samples |
| DC Motor | Oriental motor | BLM230-GFV2 | Motor |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11057 | Secondary antibody used for immunohistochemical staining |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-31571 | Secondary antibody used for immunohistochemical staining |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | Secondary antibody used for immunohistochemical staining |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | S30-100ML | Blocker of non-specific binding of antibodies in immunohistochemical staining |
| Fluorescence microscope | Keyence | BZ-9000 | Fluorescence microscope |
| Goat polyclonal anti-5-HT2A receptor | Santa Cruz Biotechnology | sc-15073 | Primary antibody used for immunohistochemical staining |
| Isoflurane | Pfizer | v002139 | Inhalation anesthetic |
| KimWipe | NIPPON PAPER CRECIA | S-200 | Paper cloth for cleaning surfaces, parts, instruments in labratory |
| Liquid Blocker | Daido Sangyo | PAP-S | Marker used to make the slide surface water-repellent |
| Mouse monoclonal anti-NeuN (clone A60) | EMD Millipore (Merck) | MAB377 | Primary antibody used for immunohistochemical staining |
| NinjaScan-Light | Switchscience | SSCI-023641 | Accelerometer to measure accelerations |
| OCT compound | Sakura Finetek | 45833 | Embedding agent for preparing frozen tissue sections |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36934 | Mounting medium to prevent flourscence fading |
| Rabbit polyclonal anti-c-Fos | Santa Cruz Biotechnology | sc-52 | Primary antibody used for immunohistochemical staining |
| Slide box | AS ONE | 03-448-1 | Opaque box to store slides |
| Spike2 | Cambridge electronic design limited (CED) | N/A | Application software used to analyze acceleration |
| Sprague-Dawley rats | Japan SLC | Slc:SD | Rats used in this study |
| Treadmill machine | Muromachi | MK-680 | System used in experiments of forced running of rats and mice |
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