Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt ein speziell entwickeltes "passives Kopfbewegungssystem", das mechanische Beschleunigungen an den Köpfen von Nagetieren reproduziert, die während ihres Laufbandlaufs mit moderaten Geschwindigkeiten erzeugt werden. Es ermöglicht es, mechanische Faktoren / Elemente von den positiven Auswirkungen körperlicher Bewegung zu trennen.
Abstract
Bewegung ist weithin als wirksam für verschiedene Krankheiten und körperliche Störungen anerkannt, einschließlich solcher, die mit Hirnfunktionsstörungen zusammenhängen. Die molekularen Mechanismen hinter den positiven Auswirkungen von Bewegung sind jedoch kaum verstanden. Viele körperliche Trainingseinheiten, insbesondere solche, die als Aerobic-Übungen wie Joggen und Gehen eingestuft werden, erzeugen impulsive Kräfte zum Zeitpunkt des Fußkontakts mit dem Boden. Daher wurde spekuliert, dass mechanische Einflüsse daran beteiligt sein könnten, wie Bewegung zur homöostase des Organismus beiträgt. Um diese Hypothese am Gehirn zu testen, wurde ein maßgeschneidertes "passives Kopfbewegungssystem" (im Folgenden als PHM bezeichnet) entwickelt, das vertikale Beschleunigungen mit kontrollierten und definierten Größenordnungen und Modi erzeugen und mechanische Stimulation reproduzieren kann, die während des Laufbandlaufs mit moderaten Geschwindigkeiten auf die Köpfe von Nagetieren angewendet werden kann, eine typische Intervention, um die Auswirkungen von Bewegung bei Tieren zu testen. Durch die Verwendung dieses Systems wurde gezeigt, dass PHM den Serotonin (5-Hydroxytryptamin, im Folgenden als 5-HT) bezeichnet) Rezeptor Subtyp 2A (5-HT2A) Signalweg in den präfrontalen Kortex (PFC) Neuronen von Mäusen rekapituliert. Diese Arbeit liefert detaillierte Protokolle für die Anwendung von PHM und die Messung der daraus resultierenden mechanischen Beschleunigungen an den Köpfen von Nagetieren.
Introduction
Bewegung ist vorteilhaft, um verschiedene körperliche Störungen zu behandeln oder zu verhindern, einschließlich Zivilisationskrankheiten wie Diabetes mellitus und essentielle Hypertonie1. In diesem Zusammenhang wurden auch Beweise für die positiven Auswirkungen von Bewegung auf die Gehirnfunktionen gesammelt2. Die molekularen Mechanismen, die den Vorteilen von Bewegung für das Gehirn zugrunde liegen, bleiben jedoch weitgehend ungeklärt. Die meisten körperlichen Aktivitäten und Workouts erzeugen zumindest teilweise mechanische Beschleunigungen am Kopf. Während verschiedene physiologische Phänomene mechanisch reguliert werden, ist die Bedeutung der mechanischen Belastung in den meisten Fällen im Bewegungsapparatdokumentiert 3,4,5. Obwohl das Gehirn auch bei körperlichen Aktivitäten, insbesondere sogenannten Schlagübungen, mechanischen Kräften ausgesetzt ist, wurde die mechanische Regulation der physiologischen Gehirnfunktion bisher kaum untersucht. Da die Erzeugung mechanischer Beschleunigungen am Kopf bei körperlichem Training relativ häufig ist, wurde spekuliert, dass mechanische Regulierung an den Vorteilen von Bewegung für die Gehirnfunktionen beteiligt sein könnte.
5-HT2A-Rezeptorsignale sind essentiell für die Regulierung von Emotionen und Verhaltensweisen zwischen verschiedenen biochemischen Signalen, die im Nervensystem funktionieren. Es ist an multiplen psychiatrischen Erkrankungen 6,7,8 beteiligt, bei denen sich Bewegung als therapeutisch wirksam erwiesen hat. 5-HT2A-Rezeptor ist ein Subtyp des 5-HT2-Rezeptors, der zur Serotonin-Familie gehört und auch ein Mitglied der G-Protein-gekoppelten Rezeptorfamilie (GPCR) ist, deren Signalisierung durch seine Internalisierung moduliert wird, entweder ligandenabhängig oder -unabhängig9. Kopfzucken ist ein charakteristisches Verhalten von Nagetieren, dessen Menge (Frequenz) explizit die Intensität der 5-HT2A-Rezeptorsignalisierung in ihren präfrontalen Kortex (PFC) Neuronendarstellt 10,11. Unter Ausnutzung der strengen Spezifität dieser halluzinogenen Reaktion auf verabreichtes 5-HT (Kopfzuckenreaktion, im Folgenden als HTR bezeichnet; siehe Ergänzender Film 1) wurde die oben erwähnte Hypothese über mechanische Auswirkungen von Trainingseffekten auf Gehirnfunktionen getestet. Daher analysierten und verglichen wir die HTR von Mäusen, die entweder erzwungenen Übungen (Laufbandlauf) oder übungsnachahmenden mechanischen Eingriffen (PHM) unterzogen wurden.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des National Rehabilitation Center for Persons with Disabilities genehmigt. 8-9 Wochen alte männliche Sprague-Dawley-Ratten wurden verwendet, um Beschleunigungen am Kopf während des Laufbandlaufs und PHM zu messen. 9-10 Wochen alte männliche C57BL/6 Mäuse wurden für Verhaltenstests und histologische Analysen der PFC verwendet. Die Tiere wurden aus kommerziellen Quellen gewonnen (siehe Materialtabelle).
1. Messung von Beschleunigungen entlang der x-, y- und z-Achse während des Laufbandlaufs
- Anästhesieren Sie die Ratte mit Inhalation von 1,5% Isofluran.
HINWEIS: Die Ratten wurden nach mindestens 1 Woche Akklimatisierung an die Laborumgebung verwendet. Stellen Sie sicher, dass die Ratte nicht auf ein Einklemmen der Hinterbeine reagiert. - Befestigen Sie den Beschleunigungsmesser (siehe Materialtabelle) mit chirurgischem Klebeband auf dem Kopf der Ratte.
- Nach vollständiger Erholung von der Narkose setzen Sie die Ratte in die Laufbandmaschine (siehe Materialtabelle) und stellen Sie das Laufband auf eine moderate Geschwindigkeit (20 m/min)12 ein (Abbildung 1A).
HINWEIS: Es dauerte mindestens 20 Minuten, um die vollständige Erholung der Ratte von der Anästhesie nach Beendigung der Isofluran-Inhalation zu bestätigen und das Laufbandexperiment zu starten. Stellen Sie sicher, dass die Ratte auf eine Zehenklemmung der Hinterbeine reagiert und in der Lage ist, ohne offensichtliches Taumeln zu gehen oder zu laufen. - Messen Sie die Größe der vertikalen Beschleunigungen während des Laufbandlaufs von Ratten mit der Anwendungssoftware gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Extrahieren Sie 10 serielle Wellen und berechnen Sie individuell die durchschnittlichen Beschleunigungen entlang der 3-dimensionalen Achsen (x-, y- und z-Achsen, Abbildung 1B). Die Spitzengrößen wurden quantifiziert, indem schrittsynchronisierte Wellen (~2 Hz-Frequenz) als laufbandinduzierte Beschleunigungen definiert wurden (Abbildung 1C). Für diese Studie wurden Ratten verwendet, da ihre größere Körpergröße geeignet war, die vertikale Beschleunigung am Kopf zuverlässig zu messen, was bei Mäusen nicht möglich war. Mäuse wurden jedoch für weitere Studien verwendet, da die quantitative Analyse der Kopfzuckenreaktion einfach und zuverlässig ist.
2. Anpassung des PHM-Systems und Anwendung von PHM an Mäusen
- Stellen Sie die Amplitude der Schwingung der Plattform und die Rotationsgeschwindigkeit der propellerförmigen Nocke im PHM-System vor (Abbildung 1D), so dass Größe und Frequenz der vertikalen Beschleunigung mit den in Schritt 1.4 erhaltenen Werten übereinstimmen.
HINWEIS: Das PHM-System besteht aus einem Metallrahmen und einer Holzplattform. Die Motordrehzahl kann durch Einstellen des an den eingebauten Treiber angeschlossenen Drehrads geändert und gesteuert werden (siehe Materialtabelle). Die Zifferblattskala von 600 entspricht 2 Hz, Abbildung 1E. Die propellerförmige Nocke hat vier Blätter mit 5 mm Stufenhöhe (Bild 1F). - Betäuben Sie die Maus durch Einatmen von 1,2% Isofluran.
HINWEIS: Mäuse wurden nach mindestens 1 Woche Akklimatisierung an die Laborumgebungen verwendet. Stellen Sie sicher, dass die Maus nicht auf ein Einklemmen der Hinterbeine reagiert. - Platzieren Sie die Maus in einer Bauchlage, wobei sich der Kopf und der Rest des Körpers auf der oszillierbaren bzw. statischen Plattform befinden.
HINWEIS: Halten Sie die Maus betäubt (1,2% Isofluran). - Schalten Sie den Motor ein, um die Plattform vertikal zu oszillieren, und wenden Sie PHM auf die Maus an.
HINWEIS: Die Motordrehzahl wurde so eingestellt, dass die Plattform mit 2 Hz oszilliert wird (siehe Schritt 2.1). Betäuben und platzieren Sie die Steuermaus ebenfalls auf der PHM-Plattform, aber lassen Sie den Motor aus.
3. Laufen der Maus auf dem Laufband
- Setzen Sie die Maus auf das Laufband und stellen Sie das Laufband auf eine moderate Geschwindigkeit (10 m/min)13 ein.
4. Quantifizierung der Kopfzuckenreaktion der Maus (HTR)
- Richten Sie die Videokamera (Bildrate: 24 fps) so ein, dass sie den gesamten Raum im transparenten Kunststoffgehäuse aufzeichnet.
HINWEIS: Der Kunststoffkäfig wurde verwendet, um die Maus im Bereich der Videoaufzeichnung zu halten. - Intraperitoneal 5-Hydroxytryptophan (5-HTP) (100 mg/kg) (siehe Materialtabelle), die Vorstufe von 5-HT, einer Maus verabreichen.
- Legen Sie die Maus in den transparenten Käfig und starten Sie die Aufnahme für 30 Minuten.
- Überprüfen Sie das aufgenommene Video (1/2x oder 1/3x Geschwindigkeit) und zählen Sie das Kopfzucken manuell.
HINWEIS: Die Analytiker waren nicht blind für das experimentelle Verfahren. Die charakteristische "Tic-ähnliche" schnelle Bewegung der Maus (siehe Ergänzender Film 1) wurde als Kopfzucken gezählt, das unter normaler Brutumgebung selten auftritt.
5. Immunhistochemische Analyse von Maus-PFC
- Sobald die HTR-Tests abgeschlossen sind, betäuben Sie die Maus, indem Sie die Mischung aus Midazolam (4,0 mg / kg), Butorphanol (4,0 mg / kg) und Medetomidin (0,3 mg / kg) verabreichen, Perfusion mit 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS und entfernen Sie dann das Gehirn nach zuvor veröffentlichten Berichten14,15.
- Die Gehirne in 4% PFA in PBS für weitere 24 Stunden bei 4 °C nachfixieren und in 30% Saccharose/PBS lagern, bis sie sinken. Frieren Sie die fixierte optimale Schnitttemperaturmischung (OCT-Mischung, siehe Materialtabelle) ein.
- Rufen Sie die Kryoschnitte des Mausgehirns aus der Folienbox ab (siehe Materialtabelle). Lassen Sie die Objektträger auf sauberen Tüchern bei Raumtemperatur, bis die Proben vollständig dehydriert sind.
HINWEIS: Zwanzig Mikrometer dicke sagittale Abschnitte (lateral +0,5–1,5 mm) wurden aus gefrorenen Proben, die in OCT-Verbindung eingebettet sind, unter Verwendung eines Kryostaten hergestellt (siehe Materialtabelle). - Verwenden Sie einen Flüssigkeitsblockerstift (siehe Materialtabelle), um einen Kreis um das kryogeschnittene Gewebe auf dem Objektträger zu zeichnen, um den Ausbreitungsbereich der Lösung einzuschließen (0,1% Tween-20 in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS-T).
- Legen Sie angefeuchtete Tücher auf den Boden eines Tabletts, in dem sich die Objektträger befinden, um eine feuchte Umgebung zu schaffen.
- Nach der Permeabilisierung mit TBS-T mit 4% Eselserum (siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur für 1 h blockieren.
- Spülen Sie die Objektträger einmal durch 5 min Eintauchen in TBS-T.
- Tragen Sie 100 μL entsprechend verdünnten primären Antikörper und DAPI-Mischung (siehe Materialtabelle) auf jeden Objektträger auf, decken Sie das Tablett ab, um ein Austrocknen der Probe zu vermeiden, und inkubieren Sie über Nacht bei Raumtemperatur.
- Dreimal mit TBS-T spülen (jeweils 5 min Inkubation).
- Tragen Sie 100 μL eines entsprechend verdünnten speziespassenden fluoreszierenden Sekundärantikörpers (konjugiert mit Alexa Fluor 488, 568 oder 645) (siehe Materialtabelle) auf jeden Objektträger auf und inkubieren Sie 1 h bei Raumtemperatur.
- Dreimal mit TBS-T spülen (jeweils 5 min Inkubation).
- Montieren Sie die Dias mit Montagemedium (siehe Materialtabelle). Bedecken Sie die Dias mit Deckgläsern.
- Betrachten Sie die Probe unter einem Fluoreszenzmikroskop.
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Representative Results
Die Spitzengröße der vertikalen Beschleunigungen an den Köpfen der Ratten während ihres Laufbandlaufs mit moderater Geschwindigkeit (20 m/min) betrug etwa 1,0 × g (Abbildung 1C). Das PHM-System (Abbildung 1D) wurde eingerichtet, um vertikale Beschleunigungsspitzen von 1,0 × g an den Köpfen der Nagetiere zu erzeugen.
Die PHM-Anwendung (2 Hz, 30 min/Tag für 7 Tage) an Mäusen dämpfte ihre HTR im Vergleich zu den Kontrollmäusen signifikant (täglich anästhesiert ohne PHM für 30 min/Tag für 7 Tage) (Abbildung 2). Dies stellt eine unterdrückende Wirkung von PHM auf die 5-HT2A-Rezeptorsignalisierung in den PFC-Neuronen dar.
Das laufende Laufband und PHM verstärkten signifikant die Internalisierung des 5-HT2A-Rezeptors in PFC-Neuronen der Maus (Abbildung 3). Konsequent regulierten sowohl das Laufband als auch PHM die 5-HTP-induzierte c-Fos-Expression, das nachgeschaltete zelluläre Ereignis der 5-HT2A-Rezeptoraktivierung 14, in PFC-Neuronen der Maus (Abbildung 4). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Laufbandlauf und PHM 5-HT2A-Rezeptoren in den PFC-Neuronen internalisieren und relevante Signale abschwächen.
Abbildung 1: Messung der Beschleunigungen während des Laufbandlaufs. (A) Illustration für die Messung der Beschleunigungen, die an den Köpfen von Ratten während ihres Laufbandlaufs erzeugt werden. (B) Definition von x-(links-rechts), y-(rostral-kaudal) und z-(dorsal-ventral) Achsen, die in dieser Studie verwendet werden. (C) Beschleunigungen wurden an den Köpfen der Ratten während des Laufbandlaufs mit 20 m/min und PHM (Frequenz: 2 Hz) erzeugt (n = 3 Ratten für jede Gruppe). Das PHM-System wurde so eingestellt, dass vertikale Beschleunigungsspitzen erzeugt werden, die denen während des Laufbandlaufs von 20 m/min entsprechen (1,0 × g). Rechtwinkliger Maßstab, 0,5 × g / 0,5 s. Die Bilder stellen drei unabhängige Experimente mit ähnlichen Ergebnissen dar. (D) Foto des gesamten PHM-Systems. € Foto der propellerförmigen Nockenwelle, die mit einem mit einem Fahrer ausgestatteten Motor verbunden ist. (F) Foto des propellerförmigen Nockens mit vier Blättern mit 5 mm Stufenhöhe (siehe roter Doppelpfeil). Die Abbildung wurde von Ryu et al.15 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: PHM-Anwendung bei Mäusen . (A) Illustration zur Analyse der Auswirkungen von PHM auf HTR. (B,C) PHM milderte 5-HTP-induzierte HTR. Das Kopfzucken wurde nach 5-HTP-Verabreichung in 5-Minuten-Blöcken (B) und 30-Minuten-Blöcken (C) gezählt. Control 2 stellt Mäuse dar, die betäubt und unoszilliert auf der PHM-Plattform platziert wurden. Die Daten werden als Mittelwerte ± REM dargestellt. *, P < 0,05, ungepaarter t-Test (n = 10 Mäuse für jede Gruppe). Die Abbildung wurde von Ryu et al.15 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Das Laufband und die PHM-Anwendung verbesserten die Internalisierung des 5-HT 2A-Rezeptors in PFC-Neuronen der Maus. (A) Mikroskopische Aufnahmen des Anti-5-HT 2A-Rezeptors (5-HT2A R; rot) und der Anti-NeuN (grün) Immunfärbung der PFC von Mäusen, denen nach einer Woche täglicher PHM 5-HTP (oder Vehikel) injiziert wurde. Bilder mit höherer Vergrößerung der Anti-5-HT 2A-Rezeptor-Immunfärbung von pfeilspitzen Zellen werden mit einer Graustufe dargestellt. Gelbe Linien zeigen die Soma-Ränder an, die von NeuN-positiven Signalen umrissen werden, und cyanfarbene Pfeilspitzen weisen auf internalisierte Anti-5-HT-2A-Rezeptor-Immunsignale hin. Maßstabsbalken, 20 μm. Die Bilder sind repräsentativ für fünf Mäuse. (B) Quantifizierung der 5-HT2A-Rezeptorinternalisierung in PFC-Neuronen der Maus. Internalisierte und membranassoziierte 5-HT2A-Rezeptor-positive Bereiche wurden als Werte relativ zum NeuN-positiven Bereich in Maus-PFC quantifiziert. Kontrolle 1 stellt Mäuse dar, die links ausgeschaltet in die Laufbandmaschine gelegt wurden, und Kontrolle 2 stellt Mäuse dar, die betäubt und auf der PHM-Plattform platziert wurden, die nicht oszilliert blieben. Fünfunddreißig bis vierzig NeuN-positive neuronale Somas wurden für jede Maus analysiert (Internalisiert: linkes Diagramm, p < 0,001, Einweg-ANOVA mit post-hoc-Bonferroni-Test; rechtes Diagramm, P = 0,0027, ungepaarter t-Test; Membranassoziiert: linkes Diagramm, P < 0,001, Einweg-ANOVA mit post-hoc-Bonferroni-Test; rechtes Diagramm, P = 0,0025, ungepaarter t-Test; n = 5 Mäuse für jede Gruppe). Die Daten werden als Mittelwerte ± REM dargestellt. **P < 0,01, ***P < 0,001; ns, nicht signifikant. Die Abbildung wurde von Ryu et al.15 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Das Laufband und die PHM-Anwendung regulierten die 5-HTP-induzierte c-Fos-Expression in PFC-Neuronen der Maus. (A) Mikroskopische Aufnahmen der Anti-c-Fos-Immunfärbung (grün), des Anti-5-HT-2A-Rezeptors (rot) und der Anti-NeuN-Immunfärbung (blau) der PFC von Mäusen, die intraperitoneal mit 5-HTP (oder Vehikel) nach einer Woche täglicher PHM verabreicht wurden. Maßstabsbalken, 100 μm. Die Bilder sind repräsentativ für vier bis fünf Mäuse. (B) Quantifizierung der c-Fos-Expression in 5-HT2A-Rezeptor-positiven Neuronen in Maus-PFC. Kontrolle 1 stellt Mäuse dar, die ausgeschaltet in die Laufbandmaschine gelegt wurden, und Kontrolle 2 stellt Mäuse dar, die betäubt und auf der PHM-Plattform platziert wurden, die nicht oszilliert blieben. Die relative Population (%) von c-Fos-positiven Zellen von 300 NeuN- und 5-HT2A-Rezeptor-positiven Zellen ist dargestellt (linke Grafik: P < 0,001, Einweg-ANOVA mit post-hoc-Bonferroni-Test; rechte Grafik: P < 0,001, ungepaarter t-Test; n = 4 Mäuse für Spalte 1, n = 5 Mäuse für die Spalten 2 bis 5). Die Daten werden als Mittelwerte ± REM dargestellt. ***P < 0,001. Die Abbildung wurde von Ryu et al.15 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzender Film 1: Die Kopfzuckenreaktion der Maus. Der 2-minütige 46-s-Film beginnt 6 Minuten nach der HTP-Injektion. Kopfzuckungen werden zu den Zeitpunkten 0:03, 0:39, 1:39 und 2:42 beobachtet. Bitte klicken Sie hier, um diesen Film herunterzuladen.
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Discussion
Mit dem entwickelten PHM-Applikationssystem haben wir gezeigt, dass die 5-HT-Signalisierung in ihren PFC-Neuronen mechanisch reguliert wird. Aufgrund der Komplexität der Bewegungseffekte war es schwierig, die Folgen von Bewegung im Rahmen der Gesundheitsförderung genau zu analysieren. Der Fokus liegt auf mechanischen Aspekten, um die Beteiligung oder den Beitrag von Stoffwechselereignissen auszuschließen, die mit oder nach Trainingsaktivitäten auftreten können, wie z.B. Energieverbrauch. Es wird erwartet, dass die hier beschriebene Methode in der biomedizinischen Forschung von größerer Bedeutung sein wird, um die Mechanismen zu untersuchen, die den Auswirkungen von Bewegung auf die Gehirnfunktionen zugrunde liegen.
Das derzeitige System erfordert eine Anästhesie, um die Versuchstiere PHM zu unterziehen, was das Verhalten und die Prozesse der Nervenzellen im Gehirn beeinflussen kann (entweder schädlich oder nicht). Es kann möglich sein, PHM ohne Anästhesie anzuwenden, indem das System modifiziert wird, einschließlich der Größen, Modi und Wellenformen der von PHM erzeugten mechanischen Beschleunigungen. Beispielsweise können kleinere Beschleunigungsspitzen mit sinusförmigen Wellen anstelle von 1 × g impulsiven Spitzen des aktuellen PHM als angenehmere Stimulation durch die Tiere "empfunden" werden. Alternativ können neue Methoden implementiert werden, um Versuchstiere mit minimaler Belastung auf der oszillierenden Plattform zu halten. Diese Modifikationen und Verbesserungen sind machbar, vor allem, weil sich die PHM-erzeugten Beschleunigungen im Prinzip auf moderate Bewegung beziehen und für Versuchstiere wahrscheinlich keinen "schmerzhaften" Stress darstellen.
Viele frühere Studien haben berichtet, dass moderate Bewegung ein wirksames Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung zahlreicher Krankheiten und Störungen ist16,17. Die Laktatschwelle, bei der die Plasmalaktatkonzentration exponentiell mit der Sekretion des adrenocorticotrophen Hormons (ACTH) ansteigt, ein Stressindikator18, wird verwendet, um Übungen als mild oder moderat zu bestimmen19. Das "optimale" Training muss jedoch noch auf molekularer Ebene definiert werden. Da nicht nur das Gehirn, sondern schließlich alle anderen Körperorgane während des Trainings mechanischen Kräften ausgesetzt sind, kann der derzeitige Ansatz mit mechanischen Störungen hilfreich sein, um die molekularen Mechanismen hinter den Belastungseffekten in breiteren Zusammenhängen aufzudecken und durch wissenschaftliche Maßnahmen zu definieren, "was optimale Bewegung ist".
Die derzeitige Methode unterliegt jedoch gewissen Einschränkungen. Wir konnten den Beschleunigungssensor aufgrund der mangelnden Größenkompatibilität nicht stabil am Mauskopf befestigen. Obwohl die vorläufige Messung darauf hindeutet, dass die Spitzengröße der vom Laufband erzeugten mechanischen Beschleunigungen am Mauskopf ebenfalls etwa 1,0 × g beträgt, sind weitere Studien erforderlich, um sie genauer zu quantifizieren.
Das vorliegende Protokoll hat die Verfahren des speziell entwickelten PHM-Systems detailliert beschrieben, das es ermöglichte, mechanische Elemente / Faktoren aus körperlicher Betätigung zu sezieren. Der Ansatz liefert wichtige Einblicke in die Vorteile von Bewegung für die Gehirnfunktionen.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass mit der in diesem Beitrag beschriebenen Arbeit kein konkurrierendes Interesse verbunden ist.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde teilweise durch den Intramural Research Fund des japanischen Ministeriums für Gesundheit, Arbeit und Soziales unterstützt; Zuschüsse für wissenschaftliche Forschung der Japan Society for the Promotion of Science (KAKENHI 15H01820, 15H04966, 18H04088, 20K21778, 21H04866, 21K11330, 20K19367); MEXT-unterstütztes Programm für die Strategic Research Foundation an privaten Universitäten, 2015-2019 vom japanischen Ministerium für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie (S1511017); die Naito Science & Engineering Foundation. Diese Forschung wurde auch von der Alliance for Regenerative Rehabilitation Research & Training (AR3T) finanziert, die vom Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) und National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) der National Institutes of Health unter der Award-Nummer P2CHD086843 unterstützt wird.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-hydroxytryptophan (5-HTP) | Sigma-Aldrich | H9772 | Serotonin (5-HT) precursor |
| Brushless motor driver | Oriental motor | BMUD30-A2 | Speed changer build-in motor driver |
| C57BL/6 mice | Oriental yeast company | C57BL/6J | Mice used in this study |
| Cryostat | Leica | CM33050S | Microtome to cut frozen samples |
| DC Motor | Oriental motor | BLM230-GFV2 | Motor |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11057 | Secondary antibody used for immunohistochemical staining |
| Donkey anti-mouse Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A-31571 | Secondary antibody used for immunohistochemical staining |
| Donkey anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-21206 | Secondary antibody used for immunohistochemical staining |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | S30-100ML | Blocker of non-specific binding of antibodies in immunohistochemical staining |
| Fluorescence microscope | Keyence | BZ-9000 | Fluorescence microscope |
| Goat polyclonal anti-5-HT2A receptor | Santa Cruz Biotechnology | sc-15073 | Primary antibody used for immunohistochemical staining |
| Isoflurane | Pfizer | v002139 | Inhalation anesthetic |
| KimWipe | NIPPON PAPER CRECIA | S-200 | Paper cloth for cleaning surfaces, parts, instruments in labratory |
| Liquid Blocker | Daido Sangyo | PAP-S | Marker used to make the slide surface water-repellent |
| Mouse monoclonal anti-NeuN (clone A60) | EMD Millipore (Merck) | MAB377 | Primary antibody used for immunohistochemical staining |
| NinjaScan-Light | Switchscience | SSCI-023641 | Accelerometer to measure accelerations |
| OCT compound | Sakura Finetek | 45833 | Embedding agent for preparing frozen tissue sections |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36934 | Mounting medium to prevent flourscence fading |
| Rabbit polyclonal anti-c-Fos | Santa Cruz Biotechnology | sc-52 | Primary antibody used for immunohistochemical staining |
| Slide box | AS ONE | 03-448-1 | Opaque box to store slides |
| Spike2 | Cambridge electronic design limited (CED) | N/A | Application software used to analyze acceleration |
| Sprague-Dawley rats | Japan SLC | Slc:SD | Rats used in this study |
| Treadmill machine | Muromachi | MK-680 | System used in experiments of forced running of rats and mice |
References
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