Summary
We presenteren een protocol voor het gebruik van een normotherme ex vivo sanguineuze perfusiesysteem voor de levering van therapeutica aan een volledig cardiaal allograft in een varkens heterotopisch harttransplantatiemodel.
Abstract
Harttransplantatie is de gouden standaardbehandeling voor hartfalen in het eindstadium. Het blijft echter beperkt door het aantal beschikbare donorharten en complicaties zoals primaire transplantaatdisfunctie en transplantaatafstoting. Het recente klinische gebruik van een ex vivo perfusieapparaat bij harttransplantatie introduceert een unieke kans voor de behandeling van cardiale allografts met therapeutische interventies om de functie te verbeteren en schadelijke reacties van ontvangers te voorkomen. Het opzetten van een translationeel model met grote dieren voor therapeutische toediening aan het gehele allograft is essentieel voor het testen van nieuwe therapeutische benaderingen bij harttransplantatie. Het varkens-, heterotopische harttransplantatiemodel in de intraabdominale positie dient als een uitstekend model voor het beoordelen van de effecten van nieuwe interventies en de immunopathologie van transplantaatafstoting. Dit model biedt bovendien overleving op lange termijn voor het varken, aangezien het transplantaat niet nodig is om de circulatie van de ontvanger te behouden. Het doel van dit protocol is om een reproduceerbare en robuuste aanpak te bieden voor het bereiken van ex vivo toediening van een therapeutisch middel aan het gehele cardiale allograft voorafgaand aan transplantatie en technische details te verstrekken om een overleving heterotope transplantatie van het ex vivo geperfundeerde hart uit te voeren.
Introduction
Hartfalen is een aandoening die naar schatting 6 miljoen volwassenen in de Verenigde Staten treft en naar verwachting zal toenemen tot 8 miljoen volwassenen in het jaar 20301. Harttransplantatie is de gouden standaardbehandeling voor hartfalen in het eindstadium. Het is echter niet zonder beperkingen en complicaties. Het blijft beperkt door het aantal beschikbare donorharten, primaire transplantaatdisfunctie, afstoting van het hart en de bijwerkingen van langdurige immunosuppressie2. Deze beperkingen zijn vooral belangrijk bij jonge ontvangers die allograftfalen kunnen ervaren en daaropvolgende hertransplantatie nodig hebben om een normale levensverwachting te bereiken.
Een ideale interventie om deze beperkingen te overwinnen, zou volledige cardiale allografts behandelen met therapeutica voorafgaand aan implantatie in de ontvanger die de levensvatbaarheid van het allograft kunnen verbeteren en "cardioprotectie" kunnen verlenen. Dergelijke interventies zouden profylactisch worden gegeven om de incidentie van ischemische beledigingen, allograftafstoting, cardiale allograft vasculopathie te minimaliseren en zelfs marginale allografts te repareren. Translationele studies voor het ontwikkelen van dit soort interventies vereisen een groot diermodel van harttransplantatie om de langdurige bewaking van het harttransplantaat mogelijk te maken. Het varkens-, heterotope harttransplantatiemodel in de intraabdominale positie is hiervoor ideaal gebleken. Harttransplantatie in deze positie maakt het mogelijk om de effecten van nieuwe therapieën te testen en de immunopathologie van transplantaatafstoting te beoordelen. Bovendien is het heterotope model voordelig ten opzichte van het orthotopische model vanwege een betere algehele overleving van de ontvanger, geen vereiste voor cardiopulmonale bypass en geen vereiste van het transplantaat om de bloedsomloop van de ontvanger te behouden3.
Effectieve toediening van therapeutische interventies aan het hart, zoals gen-, cel- of immunotherapie, is een belangrijke barrière voor klinische toepassing 4,5. De technologie die door ex vivo perfusie-apparaten wordt geïntroduceerd, maakt het mogelijk om grafts voortdurend te doordrenken, waardoor ze in een niet-werkende maar metabolisch actieve toestandblijven 6,7,8,9. Dit biedt een unieke kans om een heel hart te behandelen met geavanceerde therapieën en tegelijkertijd de potentiële bijwerkingen van systemische bevalling te minimaliseren 10,11,12,13. Een ander voordeel van het gebruik van ex vivo perfusie-apparaten voor therapeutische toediening is dat ze de toediening van medicijnen aan de coronaire circulatie gedurende langere perioden mogelijk maken die niet haalbaar zijn met behulp van traditionele koude statische opslagmethoden. Dit zorgt voor een meer globale levering van de therapeutica aan het transplantaat14. Met behulp van het hier gepresenteerde protocol hebben we met succes het firefly luciferase-gen afgeleverd aan een heel varkensharttransplantaat met behulp van adenovirale vectoren15. Het doel van dit protocol is om een reproduceerbare en robuuste aanpak te bieden voor het bereiken van de levering van een therapeutisch geneesmiddel aan het gehele cardiale allograft voorafgaand aan de transplantatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Twee vrouwelijke Yucatan-varkens worden geselecteerd, waarbij de ene is aangewezen als de harttransplantaatdonor en de andere de ontvanger. Varkens van 6-8 maanden, met een gewicht van ongeveer 30 kg en compatibele bloedgroepen worden aanbevolen. Het overzicht van het protocol is weergegeven in figuur 1. Huisvesting en de behandelingsprocedures voor de varkens worden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Animal Care and Use Committee van Duke University Medical Center.
1. Bereiding van het ex vivo perfusieapparaat
- Bereid het ex vivo perfusieapparaat en een cell saver-apparaat voor gebruik volgens de richtlijnen van de fabrikant.
- Zorg dat je een pacingbox en defibrillator bij de hand hebt en stel ze in.
- Zorg voor een point-of-care (POC) testapparaat om een volledig bloedbeeld (CBC), basismetabool panel (BMP) en arterieel bloedgas (ABG) te controleren.
- Voeg de volgende medicijnen toe aan de perfusie-primingoplossing die door de fabrikant wordt geleverd, indien deze nog niet aanwezig is in de perfusieoplossing van de fabrikant: 100 ml 25% albumine, 10 ml 200 mg / 100 ml ciprofloxacine, 1 g cefazolinenatrium, twee injectieflacons van 5 ml multivitamine-injectie, 250 mg methylprednisolon, 10.000 IE heparine en 50 IE insuline.
- Voer POC-tests uit van de ex vivo-apparaatprimingoplossing om ervoor te zorgen dat de elektrolytniveaus binnen het normale fysiologische bereik liggen. Zo niet, dien dan calciumgluconaat, dextrose en /of natriumbicarbonaat dienovereenkomstig toe om eventuele subtherapeutische elektrolyt- of glucosespiegels aan te vullen.
- Om de primingoplossing met de toegevoegde medicijnen toe te voegen, spiket u de oplossing en ontlucht u de lijn die de oplossing aan het ex vivo perfusieapparaat levert.
OPMERKING: Ga naar rubriek 6 voor instructies over het prikken van het ex vivo perfusieapparaat.
2. Aanvang van anesthesie en IV-toegang bij het donorvarken
- Nadat u het varken gedurende 8-12 uur hebt vastgemaakt, premediceert u het met ketamine (5-33 mg / kg, intramusculair) en midazolam (0,2-0,5 mg / kg, intramusculair) en dient u isofluraan (1-4%) toe met behulp van een gezichtsmasker.
- Plaats het varken in rugligging en intubeer met een endotracheale buis (ETT) (5,5-6,5 mm inwendige diameter) om de luchtweg te beschermen. Zet de ETT vast door hem aan de snuit van het varken te binden. Plaats de ledematen met behulp van zware banden die aan de tafel zijn bevestigd.
- Breng dierenartszalf aan op de ogen om uitdroging te voorkomen terwijl u onder narcose bent.
- Plaats een intraveneuze (IV) katheter (20-22 G) in een oorader.
- Start onderhoud IV vloeistoffen (Lactated Ringer's oplossing op 10 ml ·( kg·h)-1).
- Dien intramusculaire (IM) buprenorfine 0,005-0,01 mg/kg toe voor analgesie.
3. Vitale functies en centrale lijninstellingen
- Start de mechanische ventilatie bij een getijdenvolume van 10 ml· (kg·min) -1 en een snelheid van 10-15 ademhalingen per minuut met isofluraan (1-3%) gehandhaafd gedurende de hele procedure, zodat reflexen afwezig zijn en de hartslag (>60 bpm, <100 bpm) en bloeddruk (systolische bloeddruk >90 mmHg, <130 mmHg) binnen het fysiologische bereik blijven.
OPMERKING: De toevoeging van een verlamde is optioneel. - Controleer continu de zuurstofverzadiging en hartslag tijdens de operatie.
4. Mediane sternotomie van het donorvarken
- Palpeer het borstbeen van het manubrium naar de xiphoid. Markeer de middellijn met een steriele chirurgische marker. Scheer elk haar van de site met een tondeuse en steriliseer het gebied met 4% chloorhexidine voor een totaal van 3 rondes sterilisatie. Breng een steriel chirurgisch gordijn aan rond de onmiddellijke chirurgische plaats.
OPMERKING: Chirurgen moeten handen en armen wassen met een was op alcohol- of jodiumbasis en steriele jassen en handschoenen aantrekken. - Gebruik een mes nr. 10 om een incisie te maken van het manubrium tot aan de xiphoid, van 20-30 cm, afhankelijk van de grootte van het varken.
- Gebruik elektrocauterie om de pectoralis major van het borstbeen naar de xiphoid te verdelen, wees voorzichtig om dit langs de middellijn van het borstbeen te doen. Eenmaal beneden bij het borstbeen, scoor je de middellijn en begin je de sternotomie van de xiphoid door deze te delen met een zware schaar.
- Verleng de sternotomiecephalad met een zware schaar. Scheid na elke snee bot het hart van het borstbeen met behulp van vingervegen. Voltooi op deze manier de sternotomie door het manubrium.
- Na het voltooien van de sternotomie, bereikt u hemostase door elektrocauterie toe te passen op de gesneden botranden.
- Plaats een sternale retractor en open deze om de blootstelling van het chirurgische veld te optimaliseren. Identificeer en verwijder de thymus met elektrocauterisatie. Voer het pericardium in de lengterichting in van het diafragma naar de aorta. Maak een pericardiale wieg met behulp van 5-6 maat: 2-0, zijden hechtingen.
5. Hartstilstand en cardiectomie van het donorvarken
- Verdeel het weefsel volledig tussen de aorta en de longslagader (PA) en visualiseer de locatie van de aortaboog en de brachiocephalische stam om een goede plaatsing van de aorta-dwarsklem te vergemakkelijken.
OPMERKING: De opgaande aorta is veel korter bij het varken versus de mens. - Maak de superieure vena cava (SVC) omtrek vrij met een schaar en stompe dissectie. Passeer twee, maat: 0, zijden banden rond de SVC.
- Maak de inferieure vena cava (IVC) omtrek vrij met een schaar en stompe dissectie. Geef op dezelfde manier twee 0 zijden banden rond het IVC.
- Breng een U-steek aan, maat: 4-0, polypropyleen hechting op de opgaande aorta.
- Breng een portemonnee-string, grootte: 4-0, polypropyleen hechtdraad aan op het rechter atrium (RA).
- Dien een bolus van heparine IV toe met een aanvangsdosis van 300 E/kg.
- Plaats een pediatrische 4-Fr aortawortelcanule, beveiligd door de eerder geplaatste U-steek. Ontlucht de canule en zet hem op zijn plaats met een Rummel tourniquet.
- Sluit de aortawortelcanule aan op de cardioplegiabuis nadat de slang is gespoeld met del Nido cardioplegie. Spoel met de benodigde hoeveelheid om eventuele luchtbellen in de slang te verwijderen.
OPMERKING: Communicatie met het perfusieteam is op dit moment van cruciaal belang om de hartstilstand correct uit te voeren.- Zorg ervoor dat de perfusionist(s) de cell saver disposables op steriele wijze hebben geïnstalleerd, het apparaat hebben voorbereid zoals aanbevolen door de fabrikant (zie rubriek 6) en klaar zijn om het verzamelde bloed te verwerken.
- Controleer of de cell saver cardiotomie (plastic container bevestigd aan het cell saver-apparaat waar bloed wordt opgeslagen na het wassen) klaar is met 10.000 U heparine en dat de cardiotomie is verbonden met zuigkracht, niet meer dan -150 mmHg druk.
OPMERKING: Dit is om hemolyse van rode bloedcellen te voorkomen.
- Maak een rechter atriotomie in de eerder geplaatste portemonnee-string, plaats een 24 Fr veneuze canule in de RA en beveilig met een Rummel tourniquet.
- Sluit de veneuze canule aan op een steriele zuigleiding die is aangesloten op de cell saver cardiotomie en verzamel ongeveer 1-1,3 L bloed. Breng vervolgens de aorta-kruisklem aan en zorg er zorgvuldig voor dat de klem de opgaande aorta volledig afsluit. Dien 500 ml Del Nido cardioplegie toe aan de wortel bij een druk van 100-150 mmHg met behulp van een drukzak.
OPMERKING: Het hart zal blancheren en arresteren. - Plaats steriele ijssmurrie op het hart.
- Zodra de cardioplegie is afgeleverd, verwijdert u de aortawortelcanule en de RA veneuze canule en bindt u de hechtingen van de portemonnee vast.
- Verdeel het volgende: de IVC, de SVC gewoon proximaal aan de azygosader, de aorta ter hoogte van de boog net distale aan de Innominate-slagader, de belangrijkste PA bij de bifurcatie en de linker azygote ader als deze de coronaire sinus binnenkomt.
OPMERKING: Varkens hebben een linker azygote ader die uitmondt in de coronaire sinus. - Identificeer de longaders en verlijd ze met grootte: 2-0, zijden banden of grote clips. Laat één longader open voor het inbrengen van de LV-opening.
- Verwijder het hart van de borst en plaats het in een container met steriele ijssmurrie.
- Verplaats het hart naar de backtable om het transplantaat klaar te maken voor plaatsing op het ex vivo perfusieapparaat.
6. Wassen van het donorbloed en priming van het ex vivo perfusieapparaat
OPMERKING: Deze stap is nodig om componenten uit het donorserum te verwijderen die de afgifte van het therapeutisch middel kunnen neutraliseren wanneer het in het perfusaat wordt geïntroduceerd. Voer deze stap uit tijdens de explantatie van het donorhart om de ischemische tijd van allograft te minimaliseren.
- Voltooi een prime- en wascyclus voor celbesparing.
- Installeer de wegwerponderdelen in het apparaat volgens de instructies van de fabrikant.
- Bereid het celbesparingsapparaat voor door Plasmalyte A te spieteren en de primaire functie op het apparaat te selecteren. Voeg evenveel Plasmalyt A toe als het volume bloed dat op een 1:1-manier van het donorvarken wordt verzameld.
OPMERKING: Zodra het apparaat de primingcyclus heeft voltooid, is het klaar voor de toevoeging van bloed. Zie rubrieken 5.9-5.11 voor het toevoegen van het bloed van het donorvarken. - Zodra het bloed in het apparaat zit, selecteert u de wascyclus op het cell saver-apparaat.
OPMERKING: Tijdens dit proces wordt het bloed gecentrifugeerd terwijl de Plasmalyte A wordt geïntroduceerd om het bloed te wassen. Deze stap concentreert en wast het bloed.
- Breng het gewassen bloed over in een bloedafnamezak voor overdracht naar het ex vivo-apparaat .
- Voeg het gewassen bloed toe aan het ex vivo perfusieapparaat volgens de richtlijnen van de fabrikant.
- Bereid een epinefrine-oplossing door 0,25 mg epinefrine en 30 IE insuline in 500 ml 5% dextrose in water te injecteren tijdens het primen van de ex vivo machine. Prik de oplossing en ontlucht de lijn die de oplossing aan het ex vivo-apparaat levert.
- Voeg 10.000 U heparine toe aan het ex vivo perfusieapparaat.
- Voeg 5% albumine toe om het bloed te reconstitueren.
OPMERKING: Het volume van 5% albumine dat aan het apparaat wordt toegevoegd, is gelijk aan de hoeveelheid plasma die door het cell saver-apparaat wordt verwijderd. Dit wordt gedaan om een fysiologische oncotische druk en hematocriet te helpen bereiken. - Schakel de pomp in om te stromen met 1-1,5 l / min om het circuit te primen met de heldere prime, medicijnen en bloed toegediend in het reservoir. Nadat u de pompstroom hebt ingeschakeld en de prime door de perfusiemodule hebt laten circuleren, moet u ervoor zorgen dat de leidingen van het circuit luchtvrij zijn.
OPMERKING: Het volume van de uiteindelijke onderhoudsoplossing is 1000 ml naast het volume gewassen bloed. - Verkrijg een basislijnperfusaat POC-chemie en lactaat met behulp van het POC-testapparaat. Vul elektrolyten indien nodig aan.
- Voeg voldoende dextrose toe om een minimum glucosespiegel van 100 mg / dL te handhaven.
- Voeg voldoende natriumbicarbonaat toe om een minimum pH-doel van 7,4 te behouden.
OPMERKING: Belangrijk is dat toegevoegd natriumbicarbonaat niet uit het perfusaat kan worden verwijderd. Overtollige natriumspiegels zullen ertoe bijdragen dat het hart oedemateus wordt en moet worden vermeden. Voorzichtigheid is geboden bij de behandeling van het basistekort, omdat het hart het basistekort na reanimatie zal beginnen te corrigeren. - Voeg voldoende calciumgluconaat toe om een minimaal geïoniseerd calciumgehalte van 0,8 mmol / L te handhaven.
- Stel de temperatuur in op 37 °C.
- Stel het gasdebiet in op 150 ml/min en pas indien nodig aan om een fysiologisch pCO2-niveau te bereiken.
- Stel het doel van de gemiddelde arteriële druk (MAP) in op 60-70 mmHg.
- Zet het pompdebiet lager op 0,6 l/min.
7. Backtable voorbereiding van het donorhart en reanimeren van het hart
- Overnaai de SVC. Plaats vier verpande, maat: 4-0, polypropyleen hechtingen op een eenvoudige horizontale matrasachtige manier rond de binnenkant van de distale aorta, 5 mm onder de snijrand en bind ze vast.
- Terwijl u de 4 omhoog houdt, grootte: 4-0, belooft u aorta-hechtingen, plaatst u de aortaconnector in de aorta en bindt u een navelstrengtape rond de aorta om de connector vast te zetten.
- Plaats een maat: 4-0, polypropyleen portemonnee-string rond de distale snijrand van de hoofd-PA. Plaats de PA-canule en bind de uiteinden van het touwtje vast om de canule vast te zetten.
- Neem het voorbereide transplantaat van de backtable naar het ex vivo perfusieapparaat en sluit de aortaconnector aan op het apparaat. Zorg ervoor dat u de aorta/aortaconnector ontlucht voordat u het hart aan het apparaat bevestigt.
- Start de perfusieklok, houd de pompstroom rond 0,6 l/min en verlaag het instelpunt voor de temperatuur tot 34 °C.
- Start de epinefrine en onderhoudsdruppels volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
- Sluit de PA-canule aan op de PA-connector op het apparaat en bevestig deze met een stropdas.
- Plaats de linker ventrikel (LV) ontluchtingsafvoer door de ongebonden longader in het linker atrium en over de mitralisklep in de LV. Zet de ventilatieopening op zijn plaats met een enkele steek om deze goed te verankeren.
- Plaats twee cardiale pacingkabels op de LV-vrije wand.
- Controleer elk uur lactaat, ABG, CBC en BMP. Dien kalium, 50% dextrose en calcium toe als dat nodig is om normale fysiologische niveaus te handhaven.
OPMERKING: Frequentere lactaatbemonstering kan geschikt zijn tijdens vroege stabilisatie om adequate perfusie op basis van lactaat vast te stellen. - Als pacing vereist is, stel dan het ventriculaire tempo in op 80 slagen per minuut bij 10 mA (atriale pacing wordt meestal niet gebruikt).
- Als defibrillatie vereist is, begin dan bij 10 J nadat de temperatuur op het apparaat 34 °C heeft bereikt.
OPMERKING: De totale gemiddelde stroom van het doel is 600 ml / min en de gemiddelde coronaire stroom is 400 ml / min.
8. Toediening van de therapeutische
- Trek het therapeutisch middel op een steriele manier op in een spuit.
- Ontlucht de cardioplegiapoort door een steriele spuit van 3 ml te gebruiken om bloed door de poort te trekken. Dien het therapeutisch middel toe in de cardioplegiepoort (of gelijkwaardig) zodat het therapeutisch middel rechtstreeks in de aortawortel wordt ingebracht.
- Spoel de poort met het volume verzameld bloed dat in stap 8.2 is afgenomen bij het ontluchten van de poort; pas op dat u er geen lucht mee doorspoelt.
OPMERKING: Dit is om ervoor te zorgen dat het therapeutisch middel wordt toegediend in de aortawortel van het hart.
OPMERKING: Deze sectie is eerder in detail beschreven in Bishawi et al. het introduceren van virale vectoren voor luciferase-expressie15. - Perfuseer het transplantaat op het apparaat gedurende 2 uur na introductie van het therapeutisch middel.
9. Voorbereiding van de ontvanger en laparotomie met vasculaire blootstelling
- Zodra het cardiale allograft aan het apparaat is bevestigd en het therapeutische middel in het circuit is geïntroduceerd, begint u met de inductie van anesthesie en preoperatieve voorbereiding zoals beschreven in rubriek 2 voor het ontvangende varken.
- Start infusie van de immunosuppressiemedicijnen: cyclosporine 50 mg / kg totaal als een langzame druppelinfuus gedurende de hele procedure en methylprednisolon 1 g IV bolus.
- Antibiotica toedienen: ENrofloxacine IM (5 mg/kg) en cefazoline 1 g IV bolus.
- Breng een Foley-katheter in de blaas.
OPMERKING: Het decomprimeren van de blaas helpt bij het verkrijgen van een optimale blootstelling van de infraroodaorta en IVC. - Markeer de buikmiddenlijn van de buik tot het schaambeen met behulp van een steriele chirurgische marker. Scheer elk haar van de site met een tondeuse en steriliseer het gebied met 4% chloorhexidine voor een totaal van 3 rondes sterilisatie. Breng een steriel chirurgisch gordijn aan rond de onmiddellijke chirurgische plaats.
OPMERKING: Chirurgen moeten handen en armen wassen met een was op alcohol- of jodiumbasis en steriele jassen en handschoenen aantrekken. - Gebruik een mes van 10 om de huid in te snijden (20-30 cm incisie) en schakel over op elektrocauterisatie om tot aan de fascia te ontleden.
- Gebruik twee Kocher-klemmen om de fascia en het peritoneum op te tillen en maak voorzichtig een kleine incisie (1 cm) in de peritoneale holte met een Metzenbaum-schaar.
- Verleng de peritoneale opening over de volledige lengte van de incisie met behulp van elektrocauterisatie en plaats er een vinger onder om de onderliggende ingewanden te beschermen. Plaats een Balfour-retractor om de belichting te optimaliseren. Trek de dunne darm craniaal en met natte handdoeken in.
- Open de retroperitoneale ruimte inferieur aan de nieren met zorg gericht op het identificeren van de urineleiders en het voorkomen van letsel.
- Draag de dissectie naar de abdominale aorta en IVC. Ligaat de lymfevaten met middelgrote en grote clips.
- Ontleed de vaten omtrek en leg een voldoende groot segment bloot om een grote Satinsky-klem rond elk vat te plaatsen. Zorg ervoor dat u verstoring van lumbale arteriële takken, die van het achterste deel van de aorta komen, vermijdt. Plaats twee vaatlussen rond de aorta en IVC aan de proximale en distale uiteinden van de blootstelling.
10. Definitieve arrestatie en verwijdering van het hart uit het ex vivo perfusieapparaat
- Sluit aan het einde van de 2 uur ex vivo perfusie de verwarmingskoeler aan op het ex vivo-apparaat . Stel de koelertemperatuur van de kachel in op 34 °C.
- Sluit op een steriele en luchtvrije manier de ontluchte cardioplegie-toedieningslijn aan op het ex vivo-apparaat op de aortatoegangspoort.
- Zet het instelpunt voor de temperatuur op het ex vivo-apparaat uit.
- Verlaag de temperatuur van de verwarmingskoeler tot 24 °C en verlaag het pompdebiet om map tussen 60 en 70 mmHg te houden (meestal een verandering in het pompdebiet van 1 l/min naar 0,9 l/min).
- Zodra de temperatuurmeting op het ex vivo perfusieapparaat 24-26 °C bereikt, verlaagt u de temperatuur van de verwarmingskoeler verder tot 14 °C en verlaagt u het pompdebiet verder met 100 ml/min.
- Zodra de temperatuur 14-16 °C bereikt, maakt u de PA-canule los van de PA-poort, start u de levering van antegrade del Nido (500 ml), sluit u de AO-lijnklep, stopt u de pomp en klemt u snel de AO-ontluchtingsleiding.
OPMERKING: De toedieningsdruk van cardioplegie moet worden getitreerd om een gemiddelde afgiftedruk van 45-65 mmHg te behouden, zoals weergegeven op de monitor van het ex vivo apparaat. - Verwijder het hart uit het ex vivo perfusieapparaat door de PA-canule en de aortaconnector los te koppelen en de pacingdraden door te knippen.
- Plaats het hart in een emmer gevuld met steriele ijssmurrie.
- Overnaai op de rugtafel de longader/linker atriotomie waar de LV-ventilatieopening was ingebracht. Trim (1 of 2 mm) van het distale aspect van de aorta en PA waar hechting aan de canules het weefsel kan hebben verpletterd.
OPMERKING: Het hart is nu klaar voor intraabdominale, heterotope implantatie.
11. Heterotope implantatie van het harttransplantaat
- Voordat u de Satinsky-klemmen plaatst, dient u 300 U /kg IV-heparine toe aan het ontvangende varken.
- Plaats een Satinsky-klem op de IVC en maak een longitudinale venotomie van ~ 1,5 cm met behulp van een 11-blad en pott's schaar.
- Anastomoseer de transplantaat PA op de infra-renale IVC van de ontvanger op een end-to-side manier met behulp van een lopende, maat: 4-0, polypropyleen hechting. Voer eerst het binnenste deel van de anastomose uit en versterk indien nodig met onderbroken hechtingen voordat het buitenste deel van de anastomose wordt voltooid.
OPMERKING: De PA naar IVC-anastomose wordt eerst uitgevoerd en de aorta-naar-aorta-anastomose wordt als laatste gedaan om de duur van aorta-occlusie te verminderen. - Plaats een Satinsky-klem op de aorta en maak een longitudinale aortotomie van ~ 1,5 cm met behulp van een 11-blad en pott's schaar.
OPMERKING: Verkrijg een ABG voordat u de klem plaatst. Controleer het onmiddellijk na het loslaten van de klem en opnieuw 15-30 minuten later om eventuele veranderingen in hyperkaliëmie, hyperlactiëmie of acidemie te beoordelen die wijzen op ischemisch letsel bij de ontvanger. - Anastomoseer de graft aorta aan de infra-renale aorta van de ontvanger op een end-to-side manier met behulp van een lopende, maat: 4-0, polypropyleen hechting. Voer eerst het binnenste deel van de anastomose uit en versterk indien nodig met onderbroken hechtingen voordat het buitenste deel van de anastomose wordt voltooid.
- Verwijder de Satinsky-klemmen om het hart opnieuw te bezielen; verwijder eerst de IVC-klem gevolgd door de aortaklem.
- Plaats een 18 G angiocaaf in de LV-top van het transplantaat om te ontluchten. Als u klaar bent, verwijdert u de angiocath en sluit u de site met een verpande hechtdraad.
- Controleer de anastomosen zorgvuldig op eventuele bloedingen.
- Plaats het hart voorzichtig in de juiste retroperitoneale ruimte, zodat er geen spanning op de anastomosen is en geen knikken van de vaten. Vervang de dunne darm.
12. Sluiting van de laparotomie
- Sluit de fascia met lusvormige, maat: 0, Maxon-hechting op een lopende manier, beginnend vanaf beide uiteinden van de incisie en bindend in het midden. Zorg ervoor dat u letsel aan de darm voorkomt.
- Sluit de diepe huidlaag met maat: 2-0, Vicryl op een lopende manier en de huid met maat: 4-0, Monocryl op een lopende manier.
- Reinig de huidincisie en breng huidlijm aan.
13. Postoperatieve behandeling en euthanasie
- Schakel na voltooiing van de operatie de isofluraanstroom uit en controleer het varken op terugkeer van spiertonus en neuromusculaire reflexen (corneareflex, terugtrekking naar pijnlijke stimuli, slikken).
- Na bevestiging van het herstel van deze functies, schakelt u mechanische ventilatie uit en observeert u voor spontane ademhaling. Als er spontane ademhaling is, verwijder dan de endotracheale buis; als dat niet het geval is, sluit u de endotracheale buis opnieuw aan op mechanische ventilatie.
- Breng het varken van de operatietafel naar een geïsoleerde behuizing waar de vitale functies (rectale temperatuur, bloeddruk, hartslag) nauwlettend kunnen worden gecontroleerd. Gebruik een verwarmingslamp om het varken indien nodig op te warmen. Zorg voor een IV-vloeistofbolus van 250 ml lactated Ringer's-oplossing in de setting van hypotensie (systolische bloeddruk < 100 mmHg). Blijf het varken controleren totdat het sternale lighouding kan behouden en de vitale functies volledig zijn genormaliseerd.
OPMERKING: Het dier wordt niet onbeheerd achtergelaten totdat het weer voldoende bij bewustzijn is gekomen. Bovendien wordt het dier niet teruggebracht naar het gezelschap van andere dieren totdat het volledig is hersteld. - Voor pijnbestrijding dient u een eenmalige dosis buprenorfine (aanhoudende afgifte) subcutane injectie 0,12 mg/kg toe gedurende 72 uur analgesie.
- Aan het einde van de experimentele periode, euthanaseer het varken voor explantatie van het inheemse (thoracale) hart en het allograft (buik) hart.
- Bereid het varken voor zoals beschreven in de punten 2 en 3 voor de procedure. Bereid twee zakken del Nido en twee cardioplegialijnen voor om elk hart te arresteren.
- Het thoracale hart blootstellen zoals beschreven in rubriek 4. Zodra dit is voltooid, voert u een laparotomie uit zoals beschreven in rubriek 9.
- Zodra de aorto-aorta en PA-IVC-anastomosen zijn blootgesteld, plaatst u een Satinsky-klem op de aorta van de ontvanger en een andere op de ontvangende IVC om het allograft uit de systemische circulatie te isoleren.
- Breng een pediatrische 4-Fr aortawortelcanule in de aortawortel van het allograft en sluit een cardioplegielijn aan op de katheter. Dien 500 ml del Nido cardioplegie toe aan de wortel bij een druk van 100-150 mmHg met behulp van een drukzak. Nadat de infusie is gestart, gebruikt u een Metzenbaum-schaar om een incisie van 2 cm te maken ter hoogte van de PA-IVC-anastomose om het allograft te ventileren.
- Zodra het allograft is gearresteerd, gaat u verder met het explanteren van het allograft door met behulp van een Metzenbaum-schaar te snijden op het niveau van de aorto-aorta-anastomose en de rest van de PA-IVC-anastomose. Verwijder geen van de Satinsky-klemmen.
- Ga verder met het verwijderen van het thoracale hart zoals beschreven in rubriek 5.
OPMERKING: Het enige significante verschil is dat de longaders niet zorgvuldig hoeven te worden geligeerd en in plaats daarvan grof kunnen worden ontleed met een Metzenbaum-schaar bij het uitvoeren van de cardiectomie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deze groep heeft met succes 9 varkens overleefd tussen 5 en 35 dagen volgens het protocol zoals hier gepresenteerd, afhankelijk van de onderzoeksopzet. Van de 10 varkens die dit protocol hebben ondergaan, stierf er slechts 1 vroegtijdig aan chirurgische complicaties, wat een overlevingspercentage van 90% opleverde. In figuur 2 is een diagram weergegeven van de configuratie van een heterotopisch hart getransplanteerd in de intraabdominale positie bij een varken. Selecteer bij het bepalen van de plaats voor anastomose van het allograft een plaats die eventuele spanning of knikken op de anastomose minimaliseert. Dit zorgt ervoor dat de anastomosen goed genezen en dat het allograft optimale perfusie en afvoer van bloed krijgt.
Een representatief beeld van een cardiaal allograft dat wordt toegediend op een normotherme ex vivo perfusie-apparaat is weergegeven in figuur 3. Figuur 4 schetst representatieve perfusieparameters die tijdens een succesvol experiment zijn verkregen (circulatoire stroomsnelheid, aortadruk, hartslag, temperatuur, gemengde veneuze zuurstofverzadiging en hematocriet). Het onvermogen om de hier aangetoonde parameterwaarden te bereiken, kan leiden tot een gecompromitteerde allograftfunctie na transplantatie. Figuur 5 toont een beeld van een intraabdominaal heterotopisch hart in situ 35 dagen na succesvolle transplantatie. Representatieve resultaten van de effectiviteit van het gebruik van het hier gepresenteerde protocol voor therapeutische toediening werden eerder aangetoond door deze groep15. De cardiale allograften (n = 3) werden doordrenkt met perfusaat behandeld met een adenovirale vector die het transgen voor luciferase droeg. Genexpressie bleek globaal en robuust te zijn binnen de allografts 5 dagen na de behandeling en transplantatie. Figuur 6 toont een atlas van luciferase-eiwitactiviteit gemeten en gepresenteerd als gemiddelde vouwverandering in activiteit van elk gebied van het geëxplanteerde cardiale allograft in vergelijking met het thoracale hart van de ontvangers.
Figuur 1: Protocolschema voor therapeutische toediening aan een volledig cardiaal allograft met behulp van normotherme ex vivo sanguineuze perfusie. (A) Het hart en bloed worden verkregen van het donorvarken. (B) Het bloed wordt gewassen met behulp van een cell saver-apparaat om therapeutische neutraliserende componenten uit het donorserum te verwijderen. (C) Het cardiale allograft wordt op het normotherme ex vivo perfusieapparaat gemonteerd en gedurende 2 h. (D) Kort nadat het allograft is gemonteerd, wordt het therapeutische van belang aan het perfusaat toegevoegd. (E) Na de toegewezen ex vivo perfusieperiode wordt het allograft getransplanteerd in het ontvangende varken in de intraabdominale, heterotope positie. Dit cijfer is gewijzigd van15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Porcine heterotopisch hartmodel in de intraabdominale positie. Diagram van het heterotope hartmodel waarbij het allograft wordt getransplanteerd in de intraabdominale positie terwijl het oorspronkelijke hart van de ontvanger op zijn natuurlijke locatie blijft. De longslagader van het allograft wordt geanostomoseerd tot de infra-renale inferieure vena cava, terwijl de aorta van het allograft wordt geanostomoseerd naar de infra-renale aorta van de ontvanger. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Cardiaal allograft op ex vivo perfusieapparaat. Het cardiale allograft is gemonteerd op een normotherme, ex vivo perfusie-apparaat waar het gedurende 2 uur wordt doordrenkt met therapeutisch geïnfundeerd perfusaat voorafgaand aan implantatie in de ontvanger. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve ex vivo perfusieparameters. (A) Circulatoire stroomsnelheden gemeten vanuit de longslagader (blauw), de aorta (groen) en de kransslagaders (rood). B) Representatieve aortadrukmetingen: gemiddelde druk (blauw), systolische druk (rood), diastolische druk (groen). (C) Hartslag van een cardiaal allograft tijdens ex vivo perfusie. (D) Geregistreerde temperatuur van het cardiale allograft tijdens ex vivo perfusie. (E) toont de waarden van SvO2 gemeten aan de hand van het perfusaat tijdens de perfusieperiode. (F) Hematocrietwaarden gemeten aan de hand van het perfusaat tijdens de perfusieperiode. Afkortingen: hct = hematocriet; SvO2 = gemengde veneuze zuurstofverzadiging. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Cardiale allograft getransplanteerd bij de ontvanger. Een cardiale allograft op postoperatieve dag 35 behandeld met therapeutische behandeling op het moment van implantatie. De donor werd geselecteerd om een perfecte SLA-match te zijn met de ontvanger. Afkorting: SLA = Swine Leukocyte Antigen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Luciferase activiteit na transductie van cardiale allografts. Gepresenteerd zijn de resultaten van drie cardiale allografts die werden getransduceerd met adenovirale vectoren die een luciferasetransgen droegen. Aangetoond is de gemiddelde vouwverandering in luciferase-eiwitactiviteit in elk gebied van het cardiale allograft. Dit cijfer is aangepast van Bishawi et al. 15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Levering van therapeutica tijdens ex vivo perfusie bij harttransplantatie biedt een strategie om het allograft te wijzigen en mogelijk de transplantatieresultaten te verbeteren. Het hier gepresenteerde protocol bevat de state-of-the-art normotherme ex vivo sanguineuze perfusieopslag en biedt veelbelovend potentieel om geïsoleerde afgifte van cel-, gen- of immunotherapieën aan het allograft 11,12,13 te testen. Tot op heden zijn cardiale toedieningstechnieken voor deze vermeende therapieën voor hart- en vaatziekten en hartfalen in het eindstadium afhankelijk van systemische toediening, intracoronaire perfusie via katheterisatie en directe intramyocardiale injecties, die allemaal slechte resultaten hebben opgeleverd in termen van myocardiale bevalling 5,16. We hadden eerder een robuuste en globale expressie van een reporter-gen aangetoond voor volledige cardiale allografts wanneer een virale vector in het perfusaat werd toegediend tijdens ex vivo perfusie voorafgaand aan transplantatie15. Dit is vooral belangrijk in de context van harttransplantatie, waar globale expressie en effect van het therapeutisch middel alle gebieden van het allograft moeten bereiken om de gewenste "cardioprotectie" van het hele allograft te bereiken. Dit protocol bereikt dit op een manier die nog niet eerder is bereikt met behulp van traditioneel beschreven toedieningsroutes voor therapeutica.
Er zijn verschillende kritieke stappen gepresenteerd in dit protocol om te benadrukken. (1) Alle voorzorgsmaatregelen moeten worden genomen om bloedverlies tijdens de verkrijging van het hart bij de donor tot een minimum te beperken. Ten minste 1 L bloed moet van de donor worden verkregen voor het perfusieapparaat om voldoende stroomsnelheden te bereiken. (2) Voor therapeutische toediening met behulp van normotherme ex vivo sanguineuze perfusie, is het noodzakelijk om het donorbloed te wassen voordat het aan het perfusaat wordt toegevoegd om eventuele neutraliserende componenten in het donorserum te verwijderen die de afgifte van het therapeutisch middel aan het hart negatief kunnen beïnvloeden. (3) Minimaliseer dissectie van het hart bij de donor tot na cardioplegische arrestatie om fatale aritmieën te voorkomen. (4) Bij het inbrengen van het therapeutische middel in het perfusieapparaat is het belangrijk om het via de poort die zich het dichtst bij de aortawortel bevindt in te brengen en altijd de poort door te spoelen om volledige levering van de suspensie te garanderen. Dit is om mogelijk verlies van de therapeutische aan de oxygenator of slang in het circuit te minimaliseren en ervoor te zorgen dat het transplantaat een zo hoog mogelijke therapeutische concentratie ontvangt. (5) Ten slotte is het bij het selecteren van de plaats voor transplantaatimplantatie van cruciaal belang dat de locatie het potentieel voor spanning op de anastomose minimaliseert en dat er geen knikken van de bloedvaten / anastomosen zijn.
Het wordt ook aanbevolen dat de varkens van het typeringsantigeen (SLA) van het varkenstype (d.w.z. het belangrijkste histocompatibiliteitscomplex van varkens, MHC) zijn om vooraf te selecteren op de juiste mate van matching /mismatching tussen SLA-haplotypen die het celoppervlakklasse I (SLA-1, SLA-2 en SLA-3) en /of klasse II (DR en DQ) antigenen omvatten op basis van de behoeften van de onderzoeker (SLA-typering uitgevoerd door SH zoals eerder beschreven met kleine wijzigingen in de typeprimerpanelen)17, 18. Door er bijvoorbeeld voor te zorgen dat varkens overeenkomen met alle SLA-antigenen, wordt het risico op afstoting van allograft geminimaliseerd, terwijl het gebruik van varkens met mismatch over alle SLA-antigenen de incidentie van allograftafstoting maximaliseert.
Een beperking van dit model is dat hoewel het de studie van de immunologische effecten op het harttransplantaat mogelijk maakt, het geen volledige beoordeling mogelijk maakt van het vermogen van het transplantaat om het cardiovasculaire systeem na een interventie te ondersteunen. Om dat te bereiken, zou het transplantaat orthotopisch moeten worden geïmplanteerd. Orthotopische transplantatie in modellen met grote dieren heeft echter een hogere geassocieerde mortaliteit en vereist cardiopulmonale bypass3. Een andere beperking van dit model is beperkte toegang tot een ex vivo perfusieapparaat om effectieve genafgifte naar het transplantaat uit te voeren. Naarmate deze apparaten meer beschikbaar komen op het gebied van orgaantransplantatie, zal de toegang naar verwachting verbeteren. Bovendien kan een niet-commercieel apparaat een optie zijn voor experimentele doeleinden.
Harttransplantatie biedt een unieke setting waar therapeutica via ex vivo perfusie in het allograft kunnen worden geïntroduceerd voorafgaand aan implantatie in de ontvanger. Het gebruik van een ex vivo perfusieapparaat maakt het mogelijk dat grafts van de donor naar de ontvanger worden verzonden gedurende perioden die veel langer zijn dan wat veilig is met traditionele koude statische opslag6. Deze verlengde perfusieperiode maakt een effectieve geïsoleerde toediening van therapeutica mogelijk. Dit model dient als een translationele stap tussen preklinische dierproeven van therapeutica en transformatieve klinische therapieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Paul Lezberg is in dienst van TransMedics, Inc. Carmelo Milano ontving een financiële gift van TransMedics, Inc. om heterotopische harttransplantatieoperaties te financieren. Michelle Mendiola Pla wordt ondersteund door T32HL007101. De andere auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Acknowledgments
We willen Duke Large Animal Surgical Core en Duke Perfusion Services bedanken voor hun hulp tijdens deze procedures. We willen ook Paul Lezberg en TransMedics, Inc. bedanken voor hun steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0 Looped Maxon suture | Covidien | GMM-341L | Used to close fascia of the laparotomy incision |
| 0 Silk ties | Medtronic, Inc | S346 | |
| 18 G Angiocath | BD | 381144 | Used to de-air the left ventricle of the donor heart after implantation |
| 20 Fr LV vent | Medtronic, Inc | 12002 | |
| 2-0 Silk sutures | Ethicon, Inc. | SA11G | |
| 2-0 Silk ties | Ethicon, Inc. | SA65H | |
| 2-0 Vicryl suture | Ethicon, Inc. | J259H | |
| 24 Fr venous cannula | Medtronic, Inc | 68124 | |
| 3-0 Prolene sutures | Ethicon, Inc. | 8522 | |
| 4-0 Monocryl suture | Ethicon, Inc. | Y469G | |
| 4-0 Prolene sutures | Ethicon, Inc. | 8521 | |
| Animal hair cutting clipper | Wahl | 8786-452 | |
| Aortic clamp | V. Mueller | CH6201 | |
| Army Navy retractor | V. Mueller | SU3660 | |
| ATF 40, Cell saver disposable set | Fresenius Kabi | 9108494 | Cell saver device insert |
| Balfour retractor | V. Mueller | SU3042 | Used as an abdominal wall retractor |
| C.A.T.S cell saver | Fresenius Kabi | ES0019 | Cell saver device used to wash donor blood |
| Cardiac defibrillator | Zoll | M Series | Cardiac defibrillator |
| Castro needle holder | V. Mueller | CH8589 | |
| CG4 iStat cartridges | Abbott | 03P85-25 | POC testing |
| CG8 iStat cartridges | Abbott | 03P88-25 | POC testing |
| DeBakey forceps | V. Mueller | CH5902 | |
| Electrocautery disposable pencil | Covidien | E2450H | |
| Gerald forceps | V. Mueller | NL1451 | |
| Hemotherm 400CE Dual Reservoir Cooler/Heater | Cincinnati Sub-Zero | 86022 | Heater cooler used to regulate perfusion temperature on the ex vivo perfusion device |
| iSTAT 1 | Abbott | 04P75-03 | POC testing device |
| Kocher clamp | V. Mueller | SU2790 | |
| Large clip applier | Sklar | 50-4300 | |
| Large clips | Teleflex | 4200 | |
| Large soft pledgets | Covidien | 8886867901 | |
| Medium clip applier | Sklar | 50-4335 | |
| Medium clips | Teleflex | 2200 | |
| Metzenbaum scissor | V. Mueller | CH2006-001 | |
| No. 10 scalpel blade | Swann-Mortan | 301 | Used for skin incision |
| No. 11 scalpel blade | Kiato Plus | 18111 | Used for vascular incision |
| OCS device with base | TransMedics, Inc. | Ex vivo perfusion device | |
| OCS disposable | TransMedics, Inc. | Ex vivo perfusion device insert with perfusion kits | |
| Pacing cable | Remington Medical | FL-601-97 | |
| Pediatric cardioplegia catheter (4Fr) | Medtronic, Inc | 10218 | Used to deliver cardioplegia to the donor aortic root |
| Pediatric Foley catheter | Teleflex | RSH170003080 | Placed pre-op to decompress the recipient's bladder |
| Potts scissors | V. Mueller | CH13038 | |
| Pressure bag x2 (1,000 mL) | Novaplus | V4010H | Used to deliver cardioplegia at a set pressure |
| Satinsky clamp | V. Mueller | CH7305 | Vascular clamp used for creating anastomoses between donor heart and recipient vessels |
| Scissors | Felco | FELCO 200A-50 | Used to perform sternotomy |
| Small hard pledgets | Covidien | 8886867701 | |
| Sternal retractor | V. Mueller | CH6950-007 | |
| Temporary cardiac pacing wires | Ethicon, Inc. | TPW32 | |
| Temporary dual chamber pacemaker | Medtronic, Inc | 5388 | Cardiac pacing device |
| Tourniquet kit | Medtronic, Inc | 79005 | Rummel tourniquets |
| Umbilical tape | Covidien | 8886861903 | |
| Vessel loops | Covidien | 31145686 |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 143 (8), 254 (2021).
- Stehlik, J., Kobashigawa, J., Hunt, S. A., Reichenspurner, H., Kirklin, J. K. Honoring 50 years of clinical heart transplantation in circulation: in-depth state-of-the-art review. Circulation. 137 (1), 71-87 (2018).
- Kadner, A., Chen, R. H., Adams, D. H. Heterotopic heart transplantation: experimental development and clinical experience. European Journal of Cardiothorac Surgery. 17 (4), 474-481 (2000).
- Hastings, C. L., et al. Drug and cell delivery for cardiac regeneration. Advanced Drug Delivery Reviews. 84, 85-106 (2015).
- Sahoo, S., Kariya, T., Ishikawa, K. Targeted delivery of therapeutic agents to the heart. Nature Reviews. Cardiology. 18 (6), 389-399 (2021).
- Stamp, N. L., et al. Successful heart transplant after ten hours out-of-body time using the TransMedics Organ Care System. Heart, Lung & Circulation. 24 (6), 611-613 (2015).
- Ragalie, W. S., Ardehali, A. Current status of normothermic ex-vivo perfusion of cardiac allografts. Current Opinion in Organ Transplantation. 25 (3), 237-240 (2020).
- Koerner, M. M., et al. Normothermic ex vivo allograft blood perfusion in clinical heart transplantation. Heart Surgery Forum. 17 (3), 141-145 (2014).
- Rosenbaum, D. H., et al. Perfusion preservation versus static preservation for cardiac transplantation: effects on myocardial function and metabolism. Journal of Heart and Lung Transplantation. 27 (1), 93-99 (2008).
- Cullen, P. P., Tsui, S. S., Caplice, N. M., Hinchion, J. A. A state-of-the-art review of the current role of cardioprotective techniques in cardiac transplantation. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 32 (5), 683-694 (2021).
- Rurik, J. G., Aghajanian, H., Epstein, J. A. Immune cells and immunotherapy for cardiac injury and repair. Circulation Research. 128 (11), 1766-1779 (2021).
- Rincon, M. Y., VandenDriessche, T., Chuah, M. K. Gene therapy for cardiovascular disease: advances in vector development, targeting, and delivery for clinical translation. Cardiovascular Research. 108 (1), 4-20 (2015).
- Kieserman, J. M., Myers, V. D., Dubey, P., Cheung, J. Y., Feldman, A. M. Current landscape of heart failure gene therapy. Journal of the American Heart Association. 8 (10), 012239 (2019).
- Perin, E. C. Stem cell and gene therapy for cardiovascular disease. Perin, E. C., Miller, L. W., Taylor, D. A., Wilkerson, J. T. , Academic Press. 279-287 (2016).
- Bishawi, M., et al. A normothermic ex vivo organ perfusion delivery method for cardiac transplantation gene therapy. Scientific Reports. 9 (1), 8029 (2019).
- Hulot, J. S., Ishikawa, K., Hajjar, R. J. Gene therapy for the treatment of heart failure: promise postponed. European Heart Journal. 37 (21), 1651-1658 (2016).
- Ho, C. S., et al. Molecular characterization of swine leucocyte antigen class I genes in outbred pig populations. Animal Genetics. 40 (4), 468-478 (2009).
- Ho, C. S., et al. Molecular characterization of swine leucocyte antigen class II genes in outbred pig populations. Animal Genetics. 41 (4), 428-432 (2010).
