Summary
Presentamos un protocolo para la utilización de un sistema de perfusión sanguínea normotérmica ex vivo para la administración de terapias a un aloinjerto cardíaco completo en un modelo de trasplante de corazón heterotópico porcino.
Abstract
El trasplante cardíaco es el tratamiento estándar de oro para la insuficiencia cardíaca en etapa terminal. Sin embargo, sigue estando limitado por el número de corazones de donantes disponibles y complicaciones como la disfunción primaria del injerto y el rechazo del injerto. El reciente uso clínico de un dispositivo de perfusión ex vivo en el trasplante cardíaco presenta una oportunidad única para tratar los aloinjertos cardíacos con intervenciones terapéuticas para mejorar la función y evitar respuestas perjudiciales del receptor. El establecimiento de un modelo traslacional de animales grandes para la administración terapéutica a todo el aloinjerto es esencial para probar nuevos enfoques terapéuticos en el trasplante cardíaco. El modelo de trasplante cardíaco heterotópico porcino en posición intraabdominal sirve como un excelente modelo para evaluar los efectos de las intervenciones novedosas y la inmunopatología del rechazo del injerto. Este modelo también ofrece supervivencia a largo plazo para el cerdo, dado que el injerto no es necesario para mantener la circulación del receptor. El objetivo de este protocolo es proporcionar un enfoque reproducible y robusto para lograr la administración ex vivo de una terapia a todo el aloinjerto cardíaco antes del trasplante y proporcionar detalles técnicos para realizar un trasplante heterotópico de supervivencia del corazón perfundido ex vivo .
Introduction
La insuficiencia cardíaca es una afección que afecta a un estimado de 6 millones de adultos en los Estados Unidos y se proyecta que aumentará a 8 millones de adultos para el año 20301. El trasplante cardíaco es el tratamiento estándar de oro para la insuficiencia cardíaca en etapa terminal. Sin embargo, no está exento de limitaciones y complicaciones. Sigue estando limitado por el número de corazones de donantes disponibles, la disfunción primaria del injerto, el rechazo del corazón y los efectos secundarios de la inmunosupresión a largo plazo2. Estas limitaciones son particularmente importantes en los receptores jóvenes que pueden experimentar fracaso del aloinjerto y requieren un nuevo trasplante posterior para lograr una esperanza de vida normal.
Una intervención ideal para superar estas limitaciones trataría los aloinjertos cardíacos completos con terapias previas a la implantación en el receptor que pueden mejorar la viabilidad del aloinjerto y conferir "cardioprotección". Tales intervenciones se administrarían profilácticamente para minimizar la incidencia de insultos isquémicos, rechazo de aloinjertos, vasculopatía de aloinjerto cardíaco e incluso reparar aloinjertos marginales. Los estudios traslacionales para desarrollar este tipo de intervenciones requieren un modelo de trasplante cardíaco en animales grandes para permitir la vigilancia a largo plazo del injerto cardíaco. El modelo de trasplante cardíaco heterotópico porcino en posición intraabdominal ha demostrado ser ideal para este propósito. El trasplante de corazón en esta posición permite probar los efectos de las nuevas terapias y evaluar la inmunopatología del rechazo del injerto. Además, el modelo heterotópico es ventajoso sobre el modelo ortotópico debido a una mejor supervivencia general del receptor, sin necesidad de bypass cardiopulmonar y sin requisito del injerto para mantener la circulación del receptor3.
La administración efectiva de intervenciones terapéuticas al corazón, como la terapia génica, celular o inmunoterapia, es una barrera significativa para la aplicación clínica 4,5. La tecnología introducida por los dispositivos de perfusión ex vivo permite perfundir continuamente los injertos, manteniéndolos en un estado no funcional pero metabólicamente activo 6,7,8,9. Esto ofrece una oportunidad única para tratar todo un corazón con terapias avanzadas al tiempo que minimiza los posibles efectos secundarios de la administración sistémica 10,11,12,13. Otra ventaja de utilizar dispositivos de perfusión ex vivo para la administración terapéutica es que permiten la administración de medicamentos a la circulación coronaria durante períodos prolongados que no son factibles utilizando los métodos tradicionales de almacenamiento estático en frío. Esto permite una entrega más global de la terapéutica al injerto14. Usando el protocolo presentado aquí, entregamos con éxito el gen luciferasa de la luciérnaga a un injerto cardíaco porcino completo utilizando vectores adenovirales15. El objetivo de este protocolo es proporcionar un enfoque reproducible y robusto para lograr la administración de una terapia a todo el aloinjerto cardíaco antes del trasplante.
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Protocol
NOTA: Se seleccionan dos hembras de cerdo yucateco, una designada para ser la donante de injerto cardíaco y la otra como receptora. Se recomiendan cerdos de 6 a 8 meses de edad, que pesen aproximadamente 30 kg y tengan tipos de sangre compatibles. La visión general del protocolo se muestra en la Figura 1. El alojamiento y los procedimientos de tratamiento para los cerdos se realizan de acuerdo con las pautas del Comité de Cuidado y Uso de Animales del Centro Médico de la Universidad de Duke.
1. Preparación del dispositivo de perfusión ex vivo
- Prepare el dispositivo de perfusión ex vivo y un dispositivo de ahorro de células para su uso según las pautas del fabricante.
- Tenga una caja de ritmo y un desfibrilador disponibles y configúrelos.
- Tenga un dispositivo de prueba en el punto de atención (POC) disponible para verificar un conteo sanguíneo completo (CBC), un panel metabólico básico (BMP) y un gasometría arterial (ABG).
- Agregue los siguientes medicamentos a la solución de cebado de perfusión proporcionada por el fabricante, si aún no está presente en la solución de perfusión del fabricante: 100 ml de albúmina al 25%, 10 ml de ciprofloxacina de 200 mg / 100 ml, 1 g de cefazolina sódica, dos viales de 5 ml de inyección multivitamínica, 250 mg de metilprednisolona, 10,000 UI de heparina y 50 UI de insulina.
- Realice pruebas POC de la solución de cebado del dispositivo ex vivo para garantizar que los niveles de electrolitos estén dentro del rango fisiológico normal. De lo contrario, administre gluconato de calcio, dextrosa y / o bicarbonato de sodio en consecuencia para complementar cualquier electrolito subterapéutico o niveles de glucosa.
- Para agregar la solución de cebado con los medicamentos agregados, coloque la solución y desairee la línea que entrega la solución al dispositivo de perfusión ex vivo .
NOTA: Vaya a la sección 6 para obtener instrucciones sobre el cebado del dispositivo de perfusión ex vivo .
2. Inicio de la anestesia y acceso intravenoso en el cerdo donante
- Después de ayunar al cerdo durante 8-12 h, premedicarlo con ketamina (5-33 mg /kg, intramuscular) y midazolam (0.2-0.5 mg / kg, intramuscular) y administrar isoflurano (1-4%) usando una máscara facial.
- Coloque al cerdo en posición supina e intuba con un tubo endotraqueal (ETT) (5,5-6,5 mm de diámetro interno) para proteger las vías respiratorias. Asegure el ETT atándolo al hocico del cerdo. Coloque las extremidades usando lazos pesados unidos a la mesa.
- Aplique ungüento veterinario en los ojos para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia.
- Coloque un catéter intravenoso (IV) (20-22 G) en una vena del oído.
- Iniciar el mantenimiento de fluidos intravenosos (Solución de Ringer lactada a 10 mL·( kg·h)-1).
- Administrar buprenorfina intramuscular (IM) 0,005-0,01 mg/kg para la analgesia.
3. Signos vitales y ajustes de la línea central
- Iniciar ventilación mecánica a un volumen corriente de 10 mL· (kg·min) -1 y una tasa de 10-15 respiraciones por minuto con isoflurano (1-3%) mantenida durante todo el procedimiento de tal manera que los reflejos están ausentes y la frecuencia cardíaca (>60 lpm, <100 lpm) y la presión arterial (presión arterial sistólica >90 mmHg, <130 mmHg) permanecen dentro del rango fisiológico.
NOTA: La adición de un paralítico es opcional. - Controle continuamente la saturación de oxígeno y las frecuencias cardíacas durante toda la cirugía.
4. Esternotomía mediana del cerdo donante
- Palpar el esternón desde el manubrium hasta el xifoide. Marque la línea media con un marcador quirúrgico estéril. Afeitar cualquier cabello del sitio con un cortapelos y esterilizar el área usando clorhexidina al 4% para un total de 3 rondas de esterilización. Aplique una cortina quirúrgica estéril alrededor del sitio quirúrgico inmediato.
NOTA: Los cirujanos deben lavarse las manos y los brazos con un lavado a base de alcohol o yodo y ponerse batas y guantes estériles. - Use una cuchilla no. 10 para hacer una incisión desde el manubrium hasta el xifoide, que mide 20-30 cm, dependiendo del tamaño del cerdo.
- Use electrocauterización para dividir el pectoral mayor desde el esternón hasta el xifoide, teniendo cuidado de hacerlo a lo largo de la línea media del esternón. Una vez bajado al esternón, puntúa la línea media y comienza la esternotomía desde la xifoidea dividiéndola con tijeras pesadas.
- Extienda la cefálada de esternotomía con tijeras pesadas. Después de cada corte, separe sin rodeos el corazón del esternón usando barridos de dedos. De esta manera, complete la esternotomía a través del manubrio.
- Después de completar la esternotomía, logre la hemostasia aplicando electrocauterización en los bordes óseos cortados.
- Coloque un retractor esternal y ábralo para optimizar la exposición del campo quirúrgico. Identificar y extraer el timo con electrocauterización. Ingrese el pericardio longitudinalmente desde el diafragma hasta la aorta. Crea una cuna pericárdica usando 5-6 tamaños: 2-0, suturas de seda.
5. Paro cardíaco y cardiectomía del cerdo donante
- Divida completamente el tejido entre la aorta y la arteria pulmonar (AP) y visualice la ubicación del arco aórtico y el tronco braquiocefálico para facilitar la colocación adecuada de la pinza cruzada aórtica.
NOTA: La aorta ascendente es mucho más corta en el cerdo que en el humano. - Libere circunferencialmente la vena cava superior (SVC) usando tijeras y disección roma. Pase dos, tamaño: 0, lazos de seda alrededor del SVC.
- Libere circunferencialmente la vena cava inferior (IVC) usando tijeras y disección roma. Del mismo modo, pase dos corbatas de seda 0 alrededor del IVC.
- Aplique una puntada en U, tamaño: 4-0, sutura de polipropileno a la aorta ascendente.
- Aplique una cuerda de monedero, tamaño: 4-0, sutura de polipropileno en la aurícula derecha (AR).
- Administrar un bolo de heparina IV utilizando una dosis inicial de 300 U/kg.
- Inserte una cánula de raíz aórtica pediátrica de 4-Fr, asegurada por la puntada en U colocada previamente. Desairear la cánula y asegurarla en su lugar con un torniquete Rummel.
- Conecte la cánula de la raíz aórtica al tubo de cardioplejia después de que el tubo se haya enjuagado con cardioplejia del Nido. Enjuague con la cantidad necesaria para eliminar cualquier burbuja de aire dentro del tubo.
NOTA: La comunicación con el equipo de perfusión es fundamental en este punto para ejecutar correctamente el paro cardíaco.- Asegúrese de que el perfusionista o perfusionistas hayan instalado los desechables de ahorro celular de manera estéril, cebado el dispositivo según lo recomendado por el fabricante (ver sección 6) y estén listos para procesar la sangre recolectada.
- Confirme que la cardiotomía de ahorro celular (recipiente de plástico conectado al dispositivo de ahorro de células donde se almacena la sangre después del lavado) está lista con 10,000 U de heparina y que la cardiotomía está conectada a la succión, sin exceder los -150 mmHg de presión.
NOTA: Esto es para evitar la hemólisis de los glóbulos rojos.
- Cree una auritomía derecha dentro de la cuerda del bolso colocada anteriormente, inserte una cánula venosa de 24 Fr en la AR y asegúrela con un torniquete de Rummel.
- Conecte la cánula venosa a una línea de succión estéril conectada a la cardiotomía de ahorro celular y recolecte aproximadamente 1-1.3 L de sangre. Luego, aplique la abrazadera cruzada aórtica, asegurándose cuidadosamente de que la abrazadera ocluya completamente la aorta ascendente. Administrar 500 ml de cardioplejia del Nido en la raíz a una presión de 100-150 mmHg utilizando una bolsa de presión.
NOTA: El corazón se blanqueará y se detendrá. - Coloque granizado de hielo estéril en el corazón.
- Una vez que se administra la cardioplejia, retire la cánula de la raíz aórtica y la cánula venosa de la AR y ate las suturas de la cuerda del bolso hacia abajo.
- Divida lo siguiente: el IVC, el SVC solo proximal a la vena ácigos, la aorta a nivel del arco justo distal a la arteria innominada, la AF principal en la bifurcación y la vena cigoto izquierda a medida que ingresa al seno coronario.
NOTA: Los cerdos tienen una vena acigota izquierda que drena hacia el seno coronario. - Identificar las venas pulmonares y ligarlas con tamaño: 2-0, lazos de seda o clips de gran tamaño. Deje una vena pulmonar abierta para la inserción del respiradero del VI.
- Retire el corazón del pecho y colóquelo en un recipiente con granizado de hielo estéril.
- Mueva el corazón a la mesa posterior para preparar el injerto para su colocación en el dispositivo de perfusión ex vivo .
6. Lavado de la sangre del donante y cebado del dispositivo de perfusión ex vivo
NOTA: Este paso es necesario para eliminar cualquier componente del suero del donante que pueda neutralizar la administración de la terapia cuando se introduce en el perfusato. Realice este paso durante la explantación del corazón del donante para minimizar el tiempo isquémico del aloinjerto.
- Complete un ciclo de preparación y lavado de ahorro de celdas.
- Instale los componentes desechables en el dispositivo según las instrucciones del fabricante.
- Imprima el dispositivo de ahorro de celdas aumentando Plasmalyte A y seleccionando la función principal en el dispositivo. Agregue tanto plasmalito A como el volumen de sangre recolectada del cerdo donante de una manera 1: 1.
NOTA: Una vez que el dispositivo completa el ciclo de cebado, está listo para la adición de sangre. Ver secciones 5.9-5.11 para saber cómo añadir la sangre del cerdo donante. - Una vez que la sangre esté en el dispositivo, seleccione el ciclo de lavado en el dispositivo de ahorro de células.
NOTA: Durante este proceso, la sangre se centrifuga mientras que el plasmalito A se introduce para lavar la sangre. Este paso concentra y lava la sangre.
- Transfiera la sangre lavada a una bolsa de recolección de sangre para transferirla al dispositivo ex vivo .
- Agregue la sangre lavada al dispositivo de perfusión ex vivo según las pautas del fabricante.
- Prepare una solución de epinefrina inyectando 0,25 mg de epinefrina y 30 UI de insulina en 500 ml de dextrosa al 5% en agua durante el cebado de la máquina ex vivo . Pinche la solución y desairee la línea que entrega la solución al dispositivo ex vivo .
- Añadir 10.000 U de heparina al dispositivo de perfusión ex vivo .
- Agregue albúmina al 5% para reconstituir la sangre.
NOTA: El volumen de albúmina al 5% agregado al dispositivo es igual a la cantidad de plasma eliminado por el dispositivo de ahorro celular. Esto se hace para ayudar a lograr una presión oncótica fisiológica y hematocrito. - Encienda la bomba para que fluya a 1-1.5 L/min para cebar el circuito con el primo claro, los medicamentos y la sangre administrados en el depósito. Después de encender el flujo de la bomba y hacer circular el primo a través del módulo de perfusión, asegúrese de que las líneas del circuito estén libres de aire.
NOTA: El volumen de la solución de mantenimiento final es de 1000 ml además del volumen de sangre lavada. - Obtener una química POC de perfusato de referencia y lactato utilizando el dispositivo de prueba POC. Reponga los electrolitos según sea necesario.
- Agregue suficiente dextrosa para mantener un nivel mínimo de glucosa de 100 mg / dL.
- Agregue suficiente bicarbonato de sodio para mantener un objetivo de pH mínimo de 7.4.
NOTA: Es importante destacar que el bicarbonato de sodio agregado no se puede eliminar del perfusato. El exceso de niveles de sodio contribuirá a que el corazón se vuelva edematoso y debe evitarse. Se debe tener precaución al tratar el déficit base, ya que el corazón comenzará a corregir el déficit base al volver a apelar. - Agregue suficiente gluconato de calcio para mantener un nivel mínimo de calcio ionizado de 0.8 mmol / L.
- Ajuste la temperatura a 37 °C.
- Ajuste el caudal de gas a 150 ml/min y ajuste según sea necesario para alcanzar un nivel fisiológico de pCO2 .
- Establezca el objetivo de presión arterial media (PAM) en 60-70 mmHg.
- Baje el caudal de la bomba a 0,6 L/min.
7. Preparación de la mesa posterior del corazón del donante y reanimación del corazón
- Sobrecargado el SVC. Coloque cuatro suturas de polipropileno prometidas, tamaño: 4-0, en una forma de colchón horizontal simple alrededor del interior de la aorta distal, 5 mm por debajo del borde cortado y átelas hacia abajo.
- Mientras sostiene el 4, tamaño: 4-0, suturas aórticas prometidas, inserte el conector aórtico en la aorta y ate una cinta umbilical alrededor de la aorta para asegurar el conector.
- Coloque un tamaño: 4-0, cuerda de polipropileno alrededor del borde de corte distal del PA principal. Inserte la cánula pa y ate los extremos de la cuerda del bolso para asegurar la cánula.
- Lleve el injerto preparado de la mesa posterior al dispositivo de perfusión ex vivo y conecte el conector aórtico al dispositivo. Asegúrese de desairear el conector aorta/aórtico antes de asegurar el corazón al dispositivo.
- Encienda el reloj de perfusión, mantenga el flujo de la bomba alrededor de 0,6 L/min y disminuya el punto de ajuste de temperatura a 34 °C.
- Comience los goteos de epinefrina y mantenimiento según las recomendaciones del fabricante.
- Conecte la cánula de PA al conector de PA del dispositivo y asegúrela con una corbata.
- Coloque el drenaje de ventilación del ventrículo izquierdo (VI) a través de la vena pulmonar desatada hacia la aurícula izquierda y a través de la válvula mitral hacia el VI. Asegure el respiradero en su lugar con una sola puntada para anclarlo adecuadamente.
- Coloque dos cables de estimulación cardíaca en la pared libre de VI.
- Revise el lactato, ABG, CBC y BMP cada hora. Administre potasio, 50% de dextrosa y calcio según sea necesario para mantener los niveles fisiológicos normales.
NOTA: El muestreo de lactato más frecuente puede ser apropiado durante la estabilización temprana para establecer una perfusión adecuada basada en lactato. - Si se requiere estimulación, establezca el ritmo ventricular en 80 latidos por minuto a 10 mA (generalmente no se utiliza el ritmo auricular).
- Si se requiere desfibrilación, comience a 10 J después de que la temperatura en el dispositivo haya alcanzado los 34 ° C. No exceda los 50 J.
NOTA: El flujo promedio total objetivo es de 600 ml / min, y el flujo coronario promedio es de 400 ml / min.
8. Administración de la terapéutica
- Dibuje la terapéutica en una jeringa de manera estéril.
- Desairee el puerto de cardioplejia mediante el uso de una jeringa estéril de 3 ml para extraer sangre a través del puerto. Administrar la terapéutica en el puerto de cardioplejia (o equivalente) de tal manera que la terapéutica se introduzca directamente en la raíz aórtica.
- Enjuague el puerto con el volumen de sangre recolectada extraído en el paso 8.2 al desairear el puerto; tenga cuidado de no enjuagar el aire con él.
NOTA: Esto es para garantizar que la terapéutica se administre en la raíz aórtica del corazón.
NOTA: Esta sección ha sido descrita previamente en detalle en Bishawi et al. introducir vectores virales para la expresión de luciferasa15. - Perfundir el injerto en el dispositivo durante 2 h después de introducir el terapéutico.
9. Preparación del receptor y laparotomía con exposición vascular
- Una vez asegurado el aloinjerto cardíaco al dispositivo y introducido el terapéutico en el circuito, se inicia la inducción de anestesia y preparación preoperatoria como se describe en el apartado 2 para el cerdo receptor.
- Iniciar la infusión de los medicamentos de inmunosupresión: ciclosporina 50 mg/kg total como infusión por goteo lento durante todo el procedimiento y bolo de metilprednisolona 1 g IV.
- Administrar antibióticos: enrofloxacina IM (5 mg/kg) y cefazolina 1 g en bolo IV.
- Inserte un catéter Foley en la vejiga.
NOTA: La descompresión de la vejiga ayuda a obtener una exposición óptima de la aorta infrarrenal y la CIV. - Marque la línea media abdominal desde la mitad del abdomen hasta el pubis con un marcador quirúrgico estéril. Afeitar cualquier cabello del sitio con un cortapelos y esterilizar el área usando clorhexidina al 4% para un total de 3 rondas de esterilización. Aplique una cortina quirúrgica estéril alrededor del sitio quirúrgico inmediato.
NOTA: Los cirujanos deben lavarse las manos y los brazos con un lavado a base de alcohol o yodo y ponerse batas y guantes estériles. - Use una cuchilla de 10 para incidir la piel (incisión de 20-30 cm) y cambie a electrocauterización para diseccionar hasta la fascia.
- Use dos abrazaderas Kocher para levantar la fascia y el peritoneo y haga cuidadosamente una pequeña incisión (1 cm) en la cavidad peritoneal con tijeras Metzenbaum.
- Extienda la abertura peritoneal durante toda la longitud de la incisión con electrocauterización, colocando un dedo debajo para proteger las vísceras subyacentes. Coloque un retractor Balfour para optimizar la exposición. Retraiga el intestino delgado cranealmente y con toallas húmedas.
- Abra el espacio retroperitoneal inferior a los riñones con cuidado dirigido a identificar los uréteres y evitar lesiones.
- Lleve la disección hasta la aorta abdominal y la CIV. Ligar los linfáticos con clips medianos y grandes.
- Diseccionar los vasos circunferencialmente y exponer un segmento lo suficientemente grande como para colocar una abrazadera Satinsky grande alrededor de cada vaso. Tenga cuidado de evitar la interrupción de las ramas arteriales lumbares, que se desprenden de la parte posterior de la aorta. Coloque dos bucles de vasos alrededor de la aorta y la CIV en los extremos proximal y distal de la exposición.
10. Detención final y extracción del corazón del dispositivo de perfusión ex vivo
- Al final de las 2 h de perfusión ex vivo , conecte la máquina calentadora-enfriadora al dispositivo ex vivo . Ajuste la temperatura del enfriador del calentador a 34 °C.
- De manera estéril y sin aire, conecte la línea de administración de cardioplejia desaireada al dispositivo ex vivo en el puerto de acceso aórtico.
- Apague el punto de ajuste de temperatura del dispositivo ex vivo.
- Reduzca la temperatura del calentador-enfriador a 24 °C y disminuya el flujo de la bomba para mantener el MAP entre 60 y 70 mmHg (generalmente un cambio en el flujo de la bomba de 1 L / min a 0.9 L / min).
- Una vez que la lectura de temperatura en el dispositivo de perfusión ex vivo alcanza los 24-26 °C, reduzca aún más la temperatura del calentador-enfriador a 14 °C y disminuya aún más el flujo de la bomba en 100 ml / min.
- Una vez que la temperatura alcance los 14-16 °C, separe la cánula de PA del puerto de PA, inicie la entrega de antegrade del Nido (500 mL), cierre la válvula de línea AO, detenga la bomba y sujete rápidamente la línea de ventilación AO.
NOTA: La presión de administración de cardioplejia debe ajustarse para mantener una presión media de entrega de 45-65 mmHg como se muestra en el monitor del dispositivo ex vivo . - Retire el corazón del dispositivo de perfusión ex vivo desconectando la cánula de PA y el conector aórtico y cortando los cables de estimulación.
- Coloque el corazón en un cubo lleno de granizado de hielo estéril.
- En la tabla posterior, sobresalga la vena pulmonar / auritomía izquierda donde se había insertado el respiradero del VI. Recorte (1 o 2 mm) del aspecto distal de la aorta y PA donde la unión a las cánulas puede haber aplastado el tejido.
NOTA: El corazón ya está listo para la implantación intraabdominal y heterotópica.
11. Implantación heterotópica del injerto cardíaco
- Antes de colocar las abrazaderas Satinsky, administre 300 U/kg de heparina IV al cerdo receptor.
- Coloque una abrazadera Satinsky en el IVC y cree una venotomía longitudinal que mida ~ 1.5 cm usando una hoja de 11 y las tijeras de Pott.
- Anastomose la AP del injerto a la CIV infrarrenal del receptor de extremo a lado utilizando una sutura de polipropileno de tamaño variable: 4-0. Realice primero la parte interna de la anastomosis y refuerce según sea necesario con suturas interrumpidas antes de completar la parte externa de la anastomosis.
NOTA: La anastomosis PA a IVC se realiza primero, y la anastomosis de aorta a aorta se realiza en último lugar para reducir la duración de la oclusión aórtica. - Coloque una abrazadera Satinsky en la aorta y cree una aortotomía longitudinal que mida ~ 1.5 cm usando una hoja de 11 y las tijeras de Pott.
NOTA: Obtenga un ABG antes de colocar la abrazadera. Vuelva a verificarlo inmediatamente después de la liberación de la pinza y nuevamente 15-30 minutos después para evaluar cualquier cambio en la hiperpotasemia, hiperlactatemia o acidemia indicativa de lesión isquémica en el receptor. - Anastomose la aorta del injerto a la aorta infrarrenal del receptor de forma de extremo a lado utilizando una sutura de polipropileno de tamaño variable: 4-0. Realice primero la parte interna de la anastomosis y refuerce según sea necesario con suturas interrumpidas antes de completar la parte externa de la anastomosis.
- Retire las abrazaderas Satinsky para volver a perfundir el corazón; primero, retire la abrazadera IVC seguida de la abrazadera aórtica.
- Coloque un angiocath de 18 G en el ápice del VI del injerto para desairear. Cuando haya terminado, retire la angiocath y cierre el sitio con una sutura prometida.
- Revise cuidadosamente las anastomosis para detectar cualquier sangrado.
- Coloque cuidadosamente el corazón en el espacio retroperitoneal derecho, de modo que no haya tensión en las anastomosis ni torceduras de los vasos. Reemplace el intestino delgado.
12. Cierre de la laparotomía
- Cierre la fascia con bucle, tamaño: 0, sutura Maxon de manera corrida comenzando desde ambos extremos de la incisión y atando en el medio. Tenga cuidado de evitar cualquier lesión en el intestino.
- Cierre la capa dérmica profunda con tamaño: 2-0, Vicryl en forma de correr y la piel con tamaño: 4-0, Monocryl en forma de running.
- Limpie la incisión de la piel y aplique pegamento para la piel.
13. Tratamiento postquirúrgico y eutanasia
- Después de completar la cirugía, apague el flujo de isoflurano y controle al cerdo para detectar el retorno del tono muscular y los reflejos neuromusculares (reflejo corneal, retirada a estímulos dolorosos, deglución).
- Después de confirmar la restauración de estas funciones, apague la ventilación mecánica y observe la respiración espontánea. Si hay respiración espontánea, retire el tubo endotraqueal; si no lo hay, vuelva a conectar el tubo endotraqueal a la ventilación mecánica.
- Transfiera el cerdo de la mesa de operaciones a un recinto aislado donde sus signos vitales (temperatura rectal, presión arterial, frecuencia cardíaca) puedan ser monitoreados de cerca. Use una lámpara de calefacción para calentar al cerdo según sea necesario. Proporcionar un bolo líquido intravenoso de 250 ml de solución de Ringer lactado en el contexto de hipotensión (presión arterial sistólica < 100 mmHg). Continúe monitoreando al cerdo hasta que pueda mantener la reclinación esternal y los signos vitales estén completamente normalizados.
NOTA: El animal no se deja desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente. Además, el animal no es devuelto a la compañía de otros animales hasta que se recupere por completo. - Para el manejo del dolor, administrar una dosis única de buprenorfina (liberación sostenida) inyección subcutánea 0,12 mg/kg durante 72 h de analgesia.
- Al final del período experimental, eutanasia al cerdo para la explantación del corazón nativo (torácico) y el corazón aloinjerto (abdominal).
- Prepare el cerdo como se describe en las secciones 2 y 3 para el procedimiento. Prepara dos bolsas de del Nido y dos líneas de cardioplejia para detener cada corazón.
- Exponer el corazón torácico como se describe en la sección 4. Una vez completado, proceder a realizar una laparotomía como se describe en la sección 9.
- Una vez expuestas las anastomosis aorto-aórticas y PA-IVC, coloque una abrazadera Satinsky en la aorta receptora y otra en la IVC receptora para aislar el aloinjerto de la circulación sistémica.
- Inserte una cánula de raíz aórtica pediátrica de 4-Fr en la raíz aórtica del aloinjerto y conecte una línea de cardioplejia al catéter. Administrar 500 ml de cardioplejia del Nido en la raíz a una presión de 100-150 mmHg utilizando una bolsa de presión. Después de iniciar la infusión, use tijeras Metzenbaum para hacer una incisión de 2 cm a nivel de la anastomosis PA-IVC para ventilar el aloinjerto.
- Una vez detenido el aloinjerto, proceder a explantar el aloinjerto mediante el uso de tijeras Metzenbaum para extirpar a nivel de la anastomosis aorto-aórtica y el resto de la anastomosis PA-IVC. No retire ninguna de las abrazaderas Satinsky.
- Proceder a la extirpación del corazón torácico como se describe en la sección 5.
NOTA: La única diferencia significativa es que las venas pulmonares no necesitan ser ligadas cuidadosamente y en su lugar pueden ser diseccionadas groseramente usando tijeras Metzenbaum al realizar la cardiectomía.
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Representative Results
Este grupo ha sobrevivido con éxito a 9 cerdos entre 5 y 35 días siguiendo el protocolo presentado aquí, dependiendo del diseño del estudio. De cada 10 cerdos que se han sometido a este protocolo, solo 1 murió prematuramente por complicaciones quirúrgicas, lo que arrojó una tasa de supervivencia del 90%. En la Figura 2 se muestra un diagrama de la configuración de un corazón heterotópico trasplantado en posición intraabdominal en un cerdo. Al determinar el sitio para la anastomosis del aloinjerto, seleccione un sitio que minimice cualquier tensión o torcedura en la anastomosis. Esto asegura que las anastomosis sanen adecuadamente y que el aloinjerto reciba una perfusión y drenaje óptimos de la sangre.
En la Figura 3 se muestra una imagen representativa de un aloinjerto cardíaco que se perfunde en un dispositivo de perfusión normotérmica ex vivo. La Figura 4 describe los parámetros de perfusión representativos adquiridos durante un experimento exitoso (caudal circulatorio, presión aórtica, frecuencia cardíaca, temperatura, saturación venosa mixta de oxígeno y hematocrito). La incapacidad para alcanzar los valores de los parámetros demostrados aquí puede conducir a una función de aloinjerto comprometida después del trasplante. La Figura 5 muestra una imagen de un corazón heterotópico intraabdominal in situ 35 días después del trasplante exitoso. Los resultados representativos de la efectividad del uso del protocolo presentado aquí para la administración terapéutica fueron demostrados previamente por este grupo15. Los aloinjertos cardíacos (n = 3) fueron perfundidos con perfusato tratado con un vector adenoviral portador del transgén para la luciferasa. La expresión génica demostró ser global y robusta dentro de los aloinjertos 5 días después del tratamiento y el trasplante. La Figura 6 muestra un atlas de la actividad de la proteína luciferasa medido y presentado como un cambio de pliegue promedio en la actividad de cada región del aloinjerto cardíaco explantado en comparación con el corazón torácico de los receptores.
Figura 1: Esquema de protocolo para la administración terapéutica a un aloinjerto cardíaco completo mediante perfusión sanguínea normotérmica ex vivo . (A) El corazón y la sangre se obtienen del cerdo donante. (B) La sangre se lava con un dispositivo de ahorro de células para eliminar cualquier componente neutralizante terapéutico del suero del donante. (C) El aloinjerto cardíaco se monta en el dispositivo de perfusión normotérmica ex vivo y se perfunde durante 2 h. (D) Poco después de montar el aloinjerto, la terapéutica de interés se agrega al perfusato. (E) Después del período de perfusión ex vivo asignado, el aloinjerto se trasplanta al cerdo receptor en la posición heterotópica intraabdominal. Esta cifra ha sido modificada de15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Modelo cardíaco heterotópico porcino en posición intraabdominal. Diagrama del modelo cardíaco heterotópico donde el aloinjerto se trasplanta en posición intraabdominal mientras el corazón nativo del receptor permanece en su ubicación natural. La arteria pulmonar del aloinjerto se anastomosa a la vena cava inferior infrarrenal, mientras que la aorta del aloinjerto se anastomosa a la aorta infrarrenal del receptor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Aloinjerto cardíaco en dispositivo de perfusión ex vivo . El aloinjerto cardíaco montado en un dispositivo de perfusión normotérmica ex vivo donde se perfunde con perfusato con infusión terapéutica durante 2 h antes de la implantación en el receptor. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Parámetros representativos de perfusión ex vivo . (A) Caudales circulatorios medidos desde la arteria pulmonar (azul), la aorta (verde) y las arterias coronarias (rojo). (B) Mediciones representativas de la presión aórtica: presión media (azul), presión sistólica (rojo), presión diastólica (verde). (C) Frecuencia cardíaca de un aloinjerto cardíaco durante la perfusión ex vivo . (D) Temperatura registrada del aloinjerto cardíaco durante la perfusión ex vivo . (E) demuestra los valores de SvO2 medidos a partir del perfusato durante el período de perfusión. (F) Valores de hematocrito medidos a partir del perfusato durante el período de perfusión. Abreviaturas: hct = hematocrito; SvO2 = saturación venosa mixta de oxígeno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Aloinjerto cardíaco trasplantado en el receptor. Un aloinjerto cardíaco en el postoperatorio día 35 tratado con terapéutica en el momento de la implantación. El donante fue seleccionado para ser una compatibilidad perfecta de SLA con el receptor. Abreviatura: SLA = Antígeno leucocitario porcino. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Actividad de la luciferasa después de la transducción de aloinjertos cardíacos. Se presentan los resultados de tres aloinjertos cardíacos que fueron transducidos con vectores adenovirales portadores de un transgén luciferasa. Se demuestra el cambio de pliegue promedio en la actividad de la proteína luciferasa en cada área del aloinjerto cardíaco. Esta cifra ha sido modificada a partir de Bishawi et al. 15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La administración de terapias durante la perfusión ex vivo en el trasplante cardíaco ofrece una estrategia para modificar el aloinjerto y mejorar potencialmente los resultados del trasplante. El protocolo presentado aquí incorpora el almacenamiento de perfusión sanguínea normotérmica ex vivo de última generación y ofrece un potencial prometedor para probar la administración aislada de células, genes o inmunoterapias al aloinjerto 11,12,13. Hasta la fecha, las técnicas de administración cardíaca para estas supuestas terapias para la enfermedad cardiovascular y la insuficiencia cardíaca en etapa terminal se han basado en la administración sistémica, la perfusión intracoronaria a través de cateterismo y las inyecciones intramiocárdicas directas, todas las cuales han logrado malos resultados en términos de administración miocárdica 5,16. Previamente habíamos demostrado una expresión robusta y global de un gen reportero a aloinjertos cardíacos completos cuando se administró un vector viral en el perfusato durante la perfusión ex vivo antes del trasplante15. Esto es particularmente importante en el contexto del trasplante cardíaco, donde la expresión global y el efecto de la terapéutica deben llegar a todas las áreas del aloinjerto para lograr la "cardioprotección" deseada de todo el aloinjerto. Este protocolo logra esto de una manera que no se ha logrado previamente utilizando las vías de administración tradicionalmente descritas para la terapéutica.
Hay varios pasos críticos presentados en este protocolo para destacar. (1) Se deben tomar todas las precauciones para minimizar la pérdida de sangre durante la obtención del corazón del donante. Se debe obtener al menos 1 L de sangre del donante para que el dispositivo de perfusión logre tasas de flujo adecuadas. (2) Para la administración terapéutica utilizando perfusión sanguínea normotérmica ex vivo , es necesario lavar la sangre del donante antes de agregarla al perfusato para eliminar cualquier componente neutralizante en el suero del donante que pueda afectar negativamente la entrega de la terapéutica al corazón. (3) Minimizar la disección del corazón en el donante hasta después de la parada cardiopléjica para evitar arritmias fatales. (4) Al introducir el terapéutico en el dispositivo de perfusión, es importante introducirlo a través del puerto más cercano a la raíz aórtica y siempre enjuagar el puerto para garantizar la entrega completa de la suspensión. Esto es para minimizar cualquier pérdida potencial de la terapéutica para el oxigenador o tubo dentro del circuito y garantizar que el injerto esté recibiendo una concentración terapéutica lo más alta posible. (5) Finalmente, al seleccionar el sitio para la implantación del injerto, es fundamental que la ubicación minimice el potencial de tensión en la anastomosis y que no haya torceduras de los vasos sanguíneos / anastomosis.
También se recomienda que los cerdos sean de tipo antígeno leucocitario porcino (SLA) (es decir, complejo de histocompatibilidad mayor porcino, MHC) de antemano para seleccionar el grado apropiado de coincidencia / desajuste entre los haplotipos de SLA que comprenden los antígenos de clase I de superficie celular (SLA-1, SLA-2 y SLA-3) y / o clase II (DR y DQ) en función de las necesidades del investigador (tipificación de SLA realizada por SH como se describió anteriormente con ligeras modificaciones realizadas en los paneles de imprimación de tipificación)17, 18. Por ejemplo, asegurarse de que los cerdos coincidan en todos los antígenos SLA minimiza el riesgo de rechazo del aloinjerto, mientras que el uso de cerdos con desajuste en todos los antígenos SLA maximiza la incidencia de rechazo del aloinjerto.
Una limitación de este modelo es que, si bien permite el estudio de los efectos inmunológicos en el injerto cardíaco, no permite una evaluación completa de la capacidad del injerto para apoyar el sistema cardiovascular después de una intervención. Para lograr eso, el injerto necesitaría ser implantado ortotópicamente. Sin embargo, el trasplante ortotópico en modelos de animales grandes tiene una mayor mortalidad asociada y requiere bypass cardiopulmonar3. Otra limitación de este modelo es el acceso limitado a un dispositivo de perfusión ex vivo para llevar a cabo la entrega efectiva de genes al injerto. A medida que estos dispositivos estén más disponibles en el campo del trasplante de órganos, se espera que el acceso mejore. Además, un dispositivo no comercial puede ser una opción con fines experimentales.
El trasplante cardíaco ofrece un entorno único donde se pueden introducir terapias en el aloinjerto a través de la perfusión ex vivo antes de la implantación en el receptor. El uso de un dispositivo de perfusión ex vivo permite que los injertos estén en tránsito desde el donante hasta el receptor durante períodos mucho más largos de lo que es seguro utilizando el almacenamiento estático en frío tradicional6. Este período de perfusión prolongado permite la administración aislada efectiva de terapias. Este modelo sirve como un paso traslacional entre las pruebas preclínicas en animales de terapias y las terapias clínicas transformadoras.
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Disclosures
Paul Lezberg es empleado de TransMedics, Inc. Carmelo Milano recibió una donación financiera de TransMedics, Inc. para financiar cirugías de trasplante de corazón heterotópico. Michelle Mendiola Pla cuenta con el apoyo de T32HL007101. Los demás autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Nos gustaría agradecer a Duke Large Animal Surgical Core y Duke Perfusion Services por su asistencia durante estos procedimientos. También nos gustaría agradecer a Paul Lezberg y TransMedics, Inc. por su apoyo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0 Looped Maxon suture | Covidien | GMM-341L | Used to close fascia of the laparotomy incision |
| 0 Silk ties | Medtronic, Inc | S346 | |
| 18 G Angiocath | BD | 381144 | Used to de-air the left ventricle of the donor heart after implantation |
| 20 Fr LV vent | Medtronic, Inc | 12002 | |
| 2-0 Silk sutures | Ethicon, Inc. | SA11G | |
| 2-0 Silk ties | Ethicon, Inc. | SA65H | |
| 2-0 Vicryl suture | Ethicon, Inc. | J259H | |
| 24 Fr venous cannula | Medtronic, Inc | 68124 | |
| 3-0 Prolene sutures | Ethicon, Inc. | 8522 | |
| 4-0 Monocryl suture | Ethicon, Inc. | Y469G | |
| 4-0 Prolene sutures | Ethicon, Inc. | 8521 | |
| Animal hair cutting clipper | Wahl | 8786-452 | |
| Aortic clamp | V. Mueller | CH6201 | |
| Army Navy retractor | V. Mueller | SU3660 | |
| ATF 40, Cell saver disposable set | Fresenius Kabi | 9108494 | Cell saver device insert |
| Balfour retractor | V. Mueller | SU3042 | Used as an abdominal wall retractor |
| C.A.T.S cell saver | Fresenius Kabi | ES0019 | Cell saver device used to wash donor blood |
| Cardiac defibrillator | Zoll | M Series | Cardiac defibrillator |
| Castro needle holder | V. Mueller | CH8589 | |
| CG4 iStat cartridges | Abbott | 03P85-25 | POC testing |
| CG8 iStat cartridges | Abbott | 03P88-25 | POC testing |
| DeBakey forceps | V. Mueller | CH5902 | |
| Electrocautery disposable pencil | Covidien | E2450H | |
| Gerald forceps | V. Mueller | NL1451 | |
| Hemotherm 400CE Dual Reservoir Cooler/Heater | Cincinnati Sub-Zero | 86022 | Heater cooler used to regulate perfusion temperature on the ex vivo perfusion device |
| iSTAT 1 | Abbott | 04P75-03 | POC testing device |
| Kocher clamp | V. Mueller | SU2790 | |
| Large clip applier | Sklar | 50-4300 | |
| Large clips | Teleflex | 4200 | |
| Large soft pledgets | Covidien | 8886867901 | |
| Medium clip applier | Sklar | 50-4335 | |
| Medium clips | Teleflex | 2200 | |
| Metzenbaum scissor | V. Mueller | CH2006-001 | |
| No. 10 scalpel blade | Swann-Mortan | 301 | Used for skin incision |
| No. 11 scalpel blade | Kiato Plus | 18111 | Used for vascular incision |
| OCS device with base | TransMedics, Inc. | Ex vivo perfusion device | |
| OCS disposable | TransMedics, Inc. | Ex vivo perfusion device insert with perfusion kits | |
| Pacing cable | Remington Medical | FL-601-97 | |
| Pediatric cardioplegia catheter (4Fr) | Medtronic, Inc | 10218 | Used to deliver cardioplegia to the donor aortic root |
| Pediatric Foley catheter | Teleflex | RSH170003080 | Placed pre-op to decompress the recipient's bladder |
| Potts scissors | V. Mueller | CH13038 | |
| Pressure bag x2 (1,000 mL) | Novaplus | V4010H | Used to deliver cardioplegia at a set pressure |
| Satinsky clamp | V. Mueller | CH7305 | Vascular clamp used for creating anastomoses between donor heart and recipient vessels |
| Scissors | Felco | FELCO 200A-50 | Used to perform sternotomy |
| Small hard pledgets | Covidien | 8886867701 | |
| Sternal retractor | V. Mueller | CH6950-007 | |
| Temporary cardiac pacing wires | Ethicon, Inc. | TPW32 | |
| Temporary dual chamber pacemaker | Medtronic, Inc | 5388 | Cardiac pacing device |
| Tourniquet kit | Medtronic, Inc | 79005 | Rummel tourniquets |
| Umbilical tape | Covidien | 8886861903 | |
| Vessel loops | Covidien | 31145686 |
References
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