Summary
Мы представляем протокол использования нормотермической системы сангвинической перфузии ex vivo для доставки терапевтических средств ко всему сердечному аллотрансплантату в модели гетеротопной трансплантации сердца свиней.
Abstract
Трансплантация сердца является золотым стандартом лечения терминальной стадии сердечной недостаточности. Тем не менее, он остается ограниченным количеством доступных донорских сердец и осложнений, таких как первичная дисфункция трансплантата и отторжение трансплантата. Недавнее клиническое использование перфузионного устройства ex vivo при трансплантации сердца открывает уникальную возможность для лечения сердечных аллотрансплантатов терапевтическими вмешательствами для улучшения функции и предотвращения вредных реакций реципиентов. Создание трансляционной модели крупного животного для терапевтической доставки ко всему аллотрансплантату имеет важное значение для тестирования новых терапевтических подходов в трансплантации сердца. Свиная гетеротопная модель трансплантации сердца в интраабдоминальном положении служит отличной моделью для оценки эффектов новых вмешательств и иммунопатологии отторжения трансплантата. Эта модель дополнительно обеспечивает долгосрочную выживаемость для свиньи, учитывая, что трансплантат не требуется для поддержания кровообращения реципиента. Целью этого протокола является обеспечение воспроизводимого и надежного подхода к достижению ex vivo доставки терапевтического средства ко всему сердечному аллотрансплантату до трансплантации и предоставление технических деталей для выполнения гетеротопной трансплантации выживаемого перфузированного сердца ex vivo .
Introduction
Сердечная недостаточность - это состояние, которое затрагивает примерно 6 миллионов взрослых в Соединенных Штатах и, по прогнозам, увеличится до 8 миллионов взрослых к 2030 году1. Трансплантация сердца является золотым стандартом лечения терминальной стадии сердечной недостаточности. Однако она не лишена своих ограничений и сложностей. Он остается ограниченным количеством доступных донорских сердец, первичной дисфункцией трансплантата, отторжением сердца и побочными эффектами длительной иммуносупрессии2. Эти ограничения особенно важны для молодых реципиентов, которые могут испытывать недостаточность аллотрансплантата и нуждаются в последующей повторной трансплантации для достижения нормальной продолжительности жизни.
Идеальным вмешательством для преодоления этих ограничений было бы лечение целых сердечных аллотрансплантатов с помощью терапевтических средств до имплантации реципиенту, которые могут улучшить жизнеспособность аллотрансплантата и придать «кардиопротекцию». Такие вмешательства будут проводиться профилактически, чтобы свести к минимуму частоту ишемических инсультов, отторжения аллотрансплантата, васкулопатии сердечного аллотрансплантата и даже восстановления маргинальных аллотрансплантатов. Трансляционные исследования для разработки этих типов вмешательств требуют модели трансплантации сердца на крупных животных, чтобы обеспечить долгосрочное наблюдение за сердечным трансплантатом. Свиная гетеротопная модель трансплантации сердца в интраабдоминальном положении оказалась идеальной для этой цели. Трансплантация сердца в этом положении позволяет проверить эффекты новых методов лечения и оценить иммунопатологию отторжения трансплантата. Кроме того, гетеротопная модель является преимуществом перед ортотопической моделью из-за лучшей общей выживаемости реципиента, отсутствия требований к сердечно-легочному шунтированию и отсутствия требований к трансплантату для поддержания кровообращения реципиента3.
Эффективная доставка терапевтических вмешательств к сердцу, таких как генная, клеточная или иммунотерапия, является значительным барьером для клинического применения 4,5. Технология, внедренная перфузионными устройствами ex vivo, позволяет постоянно перфузировать трансплантаты, поддерживая их в нерабочем, но метаболически активном состоянии 6,7,8,9. Это дает уникальную возможность лечить все сердце передовыми терапевтическими средствами, сводя к минимуму потенциальные побочные эффекты системной доставки 10,11,12,13. Еще одним преимуществом использования перфузионных устройств ex vivo для терапевтической доставки является то, что они позволяют вводить лекарства в коронарную циркуляцию в течение длительных периодов времени, которые невозможны при использовании традиционных методов холодного статического хранения. Это позволяет обеспечить более глобальную доставку терапевтических средств к трансплантату14. Используя протокол, представленный здесь, мы успешно доставили ген люциферазы светлячка на целый сердечный трансплантат свиньи с использованием аденовирусных векторов15. Целью этого протокола является обеспечение воспроизводимого и надежного подхода к достижению доставки терапевтического средства ко всему сердечному аллотрансплантату до трансплантации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Отбираются две самки юкатанских свиней, одна из которых назначена донором сердечного трансплантата, а другая - реципиентом. Рекомендуются свиньи в возрасте 6-8 месяцев, весом около 30 кг и имеющие совместимые группы крови. Обзор протокола показан на рисунке 1. Содержание и процедуры лечения свиней выполняются в соответствии с руководящими принципами Комитета по уходу и использованию животных Медицинского центра Университета Дьюка.
1. Приготовление перфузионного устройства ex vivo
- Подготовьте перфузионное устройство ex vivo и устройство сохранения ячеек к использованию в соответствии с рекомендациями производителя.
- Имейте в наличии кардиостимулятор и дефибриллятор и настройте их.
- Иметь устройство для тестирования в месте оказания медицинской помощи (POC) для проверки полного анализа крови (CBC), базовой метаболической панели (BMP) и газов артериальной крови (ABG).
- Добавьте следующие лекарства к перфузионному грунтовочному раствору, предоставленному производителем, если они еще не присутствуют в перфузионном растворе производителя: 100 мл 25% альбумина, 10 мл 200 мг/100 мл ципрофлоксацина, 1 г цефазолина натрия, два флакона по 5 мл мультивитамина для инъекций, 250 мг метилпреднизолона, 10000 МЕ гепарина и 50 МЕ инсулина.
- Проведите тестирование POC раствора для грунтовки устройства ex vivo , чтобы убедиться, что уровни электролитов находятся в пределах нормального физиологического диапазона. Если нет, вводите глюконат кальция, декстрозу и / или бикарбонат натрия соответственно, чтобы дополнить любые субтерапевтические уровни электролита или глюкозы.
- Чтобы добавить грунтующий раствор с добавленными лекарственными препаратами, шипуйте раствор и обезвреживайте линию, доставляющую раствор к перфузионному устройству ex vivo .
ПРИМЕЧАНИЕ: Перейдите к разделу 6 для получения инструкций по грунтовке перфузионного устройства ex vivo .
2. Начало анестезии и внутривенного доступа у свиньи-донора
- После голодания свиньи в течение 8-12 ч премедикация ее кетамином (5-33 мг/кг, внутримышечно) и мидазоламом (0,2-0,5 мг/кг, внутримышечно) и введение изофлурана (1-4%) с использованием маски для лица.
- Поместите свинью в положение лежа на спине и интубируйте эндотрахеальной трубкой (ETT) (внутренний диаметр 5,5-6,5 мм) для защиты дыхательных путей. Закрепите ETT, привязав его к морде свиньи. Расположите конечности с помощью тяжелых стяжек, прикрепленных к столу.
- Нанесите ветеринарную мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость под наркозом.
- Поместите внутривенный (IV) катетер (20-22 г) в ушную вену.
- Инициируйте поддержание внутривенных жидкостей (раствор Лактированного Рингера при 10 мл·( кг·ч)-1).
- Вводят внутримышечно (в/м) бупренорфин 0,005-0,01 мг/кг для обезболивания.
3. Жизненно важные показатели и настройки центральной линии
- Запуск искусственной вентиляции легких при приливном объеме 10 мл· (кг·мин) -1 и скорость 10-15 вдохов в минуту с изофлураном (1-3%) поддерживаются на протяжении всей процедуры таким образом, что рефлексы отсутствуют, а частота сердечных сокращений (>60 уд/мин, <100 уд/мин) и артериальное давление (систолическое артериальное давление >90 мм рт.ст., <130 мм рт.ст.) остаются в пределах физиологического диапазона.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление паралитика является необязательным. - Непрерывно контролируйте насыщение кислородом и частоту сердечных сокращений на протяжении всей операции.
4. Срединная стернотомия свиньи-донора
- Пальпировать грудину от манубрия до мечевидной. Отметьте среднюю линию с помощью стерильного хирургического маркера. Сбрите любые волосы с участка с помощью машинки для стрижки волос и стерилизуйте область, используя 4% хлоргексидина в общей сложности 3 раунда стерилизации. Нанесите стерильную хирургическую драпировку вокруг непосредственного места операции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хирурги должны мыть руки и кисти с помощью мытья на спиртовой или йодной основе и надевать стерильные халаты и перчатки. - Используйте лезвие No 10, чтобы сделать разрез от манубриума до мечевидного, размером 20-30 см, в зависимости от размера свиньи.
- Используйте электрокоагуляцию, чтобы разделить большую грудную клетку вниз от грудины к мечевидной, осторожно делая это вдоль средней линии грудины. Спустившись до грудины, забейте среднюю линию и начните стернотомию от мечевидной, разделив ее тяжелыми ножницами.
- Удлините стернотомию цефалады тяжелыми ножницами. После каждого разреза тупо отделяйте сердце от грудины с помощью пальцевых разверток. Таким образом, завершите стернотомию через манубрий.
- После завершения стернотомии добиться гемостаза путем применения электрокоагуляции к разрезанным краям кости.
- Поместите стернальный втягиватель и откройте его, чтобы оптимизировать экспозицию хирургического поля. Выявляют и удаляют тимус с помощью электрокоагуляции. Вводят перикард продольно от диафрагмы до аорты. Создайте перикардиальную колыбель с помощью 5-6 размеров: 2-0, шелковых швов.
5. Остановка сердца и кардиэктомия донорской свиньи
- Полностью разделить ткань между аортой и легочной артерией (ПА) и визуализировать расположение дуги аорты и брахиоцефального ствола, чтобы облегчить правильное размещение поперечного зажима аорты.
ПРИМЕЧАНИЕ: Восходящая аорта намного короче у свиньи по сравнению с человеком. - По окружности освободите верхнюю полую вену (SVC) с помощью ножниц и тупого рассечения. Проход два, размер: 0, шелковые завязки вокруг SVC.
- По окружности освобождает нижнюю полую вену (IVC) с помощью ножниц и тупого рассечения. Аналогично пройдите два 0 шелковых галстука вокруг IVC.
- Нанесите U-образный стежок, размер: 4-0, полипропиленовый шов на восходящую аорту.
- Наложить кошелек-струну, размер: 4-0, полипропиленовый шов к правому предсердию (РА).
- Вводят болюс гепарина в/в, используя начальную дозу 300 Ед/кг.
- Вставьте детскую канюлю с корнем аорты 4-Fr, закрепленную ранее поставленным U-стежком. Проветривайте канюлю и закрепите ее на месте жгутом Руммеля.
- Подключите канюлю корня аорты к кардиоплегической трубке после того, как трубка была промыта кардиоплегией дель Нидо. Промыть необходимое количество, чтобы удалить пузырьки воздуха внутри трубки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Связь с командой перфузии имеет решающее значение на данном этапе для правильного выполнения остановки сердца.- Убедитесь, что перфузиолог (перфузионисты) установили одноразовые средства для сохранения клеток стерильным способом, загрунтовали устройство в соответствии с рекомендациями производителя (см. раздел 6) и были готовы к обработке собранной крови.
- Подтвердите, что кардиотомия клеточной экономии (пластиковый контейнер, прикрепленный к устройству сохранения клеток, где кровь хранится после промывки) готова с 10 000 Е гепарина и что кардиотомия подключена к всасыванию, не превышающему -150 мм рт.ст. давления.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это делается для того, чтобы избежать гемолиза эритроцитов.
- Создайте правую атриотомию в ранее помещенной сумочке,вставьте венозную канюлю 24 Fr в РА и закрепите жгутом Руммеля.
- Соедините венозную канюлю со стерильной линией всасывания, соединенной с кардиотомией клеточного сбережения, и соберите примерно 1-1,3 л крови. Затем нанесите аортальный поперечный зажим, тщательно следя за тем, чтобы зажим полностью закрывал восходящую аорту. Вводят 500 мл кардиоплегии Дель Нидо в корень при давлении 100-150 мм рт.ст. с помощью напорного мешка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сердце побледнеет и остановит. - Поместите стерильную ледяную слякоть на сердце.
- Как только кардиоплегия будет доставлена, удалите канюлю корня аорты и венозную канюлю РА и завяжите швы кошелька вниз.
- Разделите следующее: IVC, SVC только проксимально к азигосной вене, аорта на уровне дуги только дистальна к безымянной артерии, главная ПА при бифуркации и левая азиготная вена, когда она входит в коронарный синус.
ПРИМЕЧАНИЕ: Свиньи имеют левую азиготную вену, которая стекает в коронарный синус. - Определите легочные вены и обложите их размером: 2-0, шелковые завязки или клипсы большого размера. Оставьте одну легочную вену открытой для введения вентиляционного отверстия LV.
- Извлеките сердце из грудной клетки и поместите его в емкость со стерильной ледяной слякотью.
- Переместите сердце на задний стол, чтобы подготовить трансплантат к размещению на перфузионном устройстве ex vivo .
6. Промывка донорской крови и праймирование перфузионного устройства ex vivo
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим для удаления любых компонентов из донорской сыворотки, которые могут нейтрализовать доставку терапевтического средства при его введении в перфусат. Выполняйте этот этап во время эксплантации донорского сердца, чтобы свести к минимуму ишемическое время аллотрансплантата.
- Завершите цикл праймирования и промывки ячеек.
- Установите одноразовые компоненты в устройство в соответствии с инструкциями производителя.
- Загрунтуйте устройство сохранения ячеек, включив плазмолит A и выбрав основную функцию на устройстве. Добавьте столько плазмолита А, сколько объем крови, собранной у донорской свиньи, в соотношении 1:1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как только устройство завершает цикл прайминга, оно готово к добавлению крови. См. разделы 5.9-5.11 о том, как добавить кровь от свиньи-донора. - Как только кровь попадет в устройство, выберите цикл промывки на устройстве сохранения клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Во время этого процесса кровь центрифугируется, в то время как плазмолит А вводится для промывания крови. Этот шаг концентрирует и промывает кровь.
- Переложите промытую кровь в мешок для сбора крови для переноса в устройство ex vivo .
- Добавьте промытую кровь в перфузионное устройство ex vivo в соответствии с рекомендациями производителя.
- Готовят раствор адреналина путем введения 0,25 мг адреналина и 30 МЕ инсулина в 500 мл 5% декстрозы в воде во время прайминга аппарата ex vivo . Подключите решение и обезвреживайте линию, доставляющую раствор к устройству ex vivo .
- Добавьте 10 000 ЕД гепарина в перфузионное устройство ex vivo .
- Добавьте 5% альбумина для восстановления крови.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем 5% альбумина, добавленного в устройство, равен количеству плазмы, удаленной устройством сохранения клеток. Это делается для того, чтобы помочь достичь физиологического онкотического давления и гематокрита. - Включите насос, чтобы он тек со скоростью 1-1,5 л /мин, чтобы загрунтовать контур прозрачным праймом, лекарствами и кровью, вводимыми в резервуар. После включения потока насоса и циркуляции прайма через перфузионный модуль убедитесь, что линии контура свободны от воздуха.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конечный объем поддерживающего раствора составляет 1000 мл в дополнение к объему промытой крови. - Получите исходный уровень химического состава перфузата POC и лактата с помощью устройства для тестирования POC. Пополняйте электролиты по мере необходимости.
- Добавьте достаточное количество декстрозы , чтобы поддерживать минимальный уровень глюкозы 100 мг / дл.
- Добавьте достаточное количество бикарбоната натрия , чтобы поддерживать минимальную цель рН 7,4.
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно отметить, что добавленный бикарбонат натрия не может быть удален из перфузата. Избыточный уровень натрия будет способствовать тому, что сердце станет отечным, и его следует избегать. Необходимо соблюдать осторожность при лечении дефицита основания, так как сердце начнет корректировать дефицит основания при реанимации. - Добавьте достаточное количество глюконата кальция для поддержания минимального уровня ионизированного кальция 0,8 ммоль/л.
- Установите температуру на уровне 37 °C.
- Установите скорость потока газа на уровне 150 мл/мин и отрегулируйте ее по мере необходимости для достижения физиологического уровня pCO2 .
- Установите целевое значение среднего артериального давления (MAP) на уровне 60-70 мм рт.ст.
- Уменьшите расход насоса до 0,6 л/мин.
7. Закладная подготовка донорского сердца и реанимация сердца
- За пределами SVC. Поместите четыре залоговых, размера: 4-0, полипропиленовые швы простым горизонтальным матрасом вокруг внутренней части дистальной аорты, на 5 мм ниже края среза и завяжите их.
- При удержании 4, размер: 4-0, заложенные аортальные швы, вставьте аортальный разъем в аорту и завяжите пупочную ленту вокруг аорты, чтобы закрепить разъем.
- Поместите размер: 4-0, полипропиленовый кошелек-нить вокруг дистального края разреза основного ПА. Вставьте канюлю PA и завяжите концы кошелька-веревки, чтобы закрепить канюлю.
- Возьмите подготовленный трансплантат от задней стола к перфузионному устройству ex vivo и подключите аортальный разъем к устройству. Обязательно обезвредите соединитель аорты/аорты, прежде чем крепить сердце к устройству.
- Запустите часы перфузии, поддерживайте расход насоса около 0,6 л/мин и уменьшите заданное значение температуры до 34 °C.
- Запустите адреналин и подкармливайте капельницу в соответствии с рекомендациями производителя.
- Подключите канюлю PA к разъему PA на устройстве и закрепите его с помощью стяжки.
- Поместите дренаж вентиляционного отверстия левого желудочка (LV) через развязанную легочную вену в левое предсердие и через митральный клапан в LV. Закрепите вентиляционное отверстие на месте одним швом, чтобы правильно закрепить его.
- Поместите два провода для кардиостимуляции на стену, свободную от РН.
- Проверяйте лактат, ABG, CBC и BMP каждый час. Вводите калий, 50% декстрозы и кальций по мере необходимости для поддержания нормального физиологического уровня.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более частый отбор проб лактата может быть целесообразным во время ранней стабилизации для установления адекватной перфузии на основе лактата. - Если требуется кардиостимуляция, установите желудочковый темп на уровне 80 ударов в минуту при 10 мА (стимуляция предсердий обычно не используется).
- Если требуется дефибрилляция, начинайте с 10 Дж после того, как температура на приборе достигнет 34 °C. Не превышайте 50 Дж.
ПРИМЕЧАНИЕ: Целевой общий средний расход составляет 600 мл/мин, а средний коронарный поток составляет 400 мл/мин.
8. Введение терапевтического
- Оформите терапевтическое средство в шприц стерильным способом.
- Обезвреживание порта кардиоплегии с помощью стерильного шприца объемом 3 мл для забора крови через порт. Введите терапевтическое средство в порт кардиоплегии (или эквивалент) таким образом, чтобы терапевтическое средство вводилось непосредственно в корень аорты.
- Промывайте порт объемом собранной крови, взятой на этапе 8.2 при обезвоживании порта; будьте осторожны, чтобы не смыть с ним воздух.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это делается для того, чтобы гарантировать, что терапевтическое средство вводится в корень аорты сердца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раздел был ранее подробно описан в Bishawi et al. ввести вирусные векторы экспрессии люциферазы15. - Перфузируют трансплантат на приборе в течение 2 ч после введения терапевтического.
9. Подготовка реципиента и лапаротомия с сосудистым воздействием
- Как только сердечный аллотрансплантат закреплен на устройстве и терапевтическое средство введено в схему, начинают индукцию анестезии и предоперационную подготовку, как описано в разделе 2 для свиньи-реципиента.
- Начинают инфузию иммуносупрессионных препаратов: циклоспорина 50 мг/кг всего в виде медленной капельной инфузии на протяжении всей процедуры и метилпреднизолона 1 г в/в болюса.
- Назначают антибиотики: энрофлоксацин в/м (5 мг/кг) и цефазолин 1 г в/в болюс.
- Вставьте катетер Фолея в мочевой пузырь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Декомпрессия мочевого пузыря помогает получить оптимальное воздействие инфраренальной аорты и IVC. - Пометьте брюшную среднюю линию от середины живота до лобка с помощью стерильного хирургического маркера. Сбрите любые волосы с участка с помощью машинки для стрижки волос и стерилизуйте область, используя 4% хлоргексидина в общей сложности 3 раунда стерилизации. Нанесите стерильную хирургическую драпировку вокруг непосредственного места операции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Хирурги должны мыть руки и кисти с помощью мытья на спиртовой или йодной основе и надевать стерильные халаты и перчатки. - Используйте лезвие 10, чтобы разрезать кожу (разрез 20-30 см) и переключиться на электрокоагуляцию, чтобы рассечь до фасции.
- Используйте два зажима Кохера, чтобы поднять фасцию и брюшину и аккуратно сделать небольшой разрез (1 см) в брюшной полости с помощью ножниц Метценбаума.
- Вытяните перитонеальное отверстие на всю длину разреза с помощью электрокоагуляции, поместив палец под него, чтобы защитить нижележащие внутренности. Поместите втягивающее устройство Balfour для оптимизации экспозиции. Втягивайте тонкую кишку краниально и влажными полотенцами.
- Вскрывайте забрюшинное пространство, уступающее почкам, с осторожностью, направленной на выявление мочеточников и избежание травм.
- Проведите рассечение вниз к брюшной аорте и IVC. Лигировать лимфатики средними и крупными клипсами.
- Рассекните сосуды по окружности и обнажите достаточно большой сегмент, чтобы поместить большой зажим Сатинского вокруг каждого сосуда. Позаботьтесь о том, чтобы избежать нарушения поясничных артериальных ветвей, которые отрываются от задней части аорты. Поместите две петли сосудов вокруг аорты и IVC на проксимальном и дистальном концах экспозиции.
10. Окончательная остановка и удаление сердца из перфузионного устройства ex vivo
- В конце 2 ч перфузии ex vivo подключите нагреватель-охладитель к устройству ex vivo . Установите температуру охладителя нагревателя на 34 °C.
- Стерильным и безвоздушным способом подключите линию доставки деаэрированной кардиоплегии к устройству ex vivo в порту доступа аорты.
- Выключите заданное значение температуры на устройстве ex vivo.
- Уменьшите температуру нагревателя-охладителя до 24 °C и уменьшите расход насоса для поддержания MAP между 60 и 70 мм рт.ст. (обычно изменение расхода насоса с 1 л / мин до 0,9 л / мин).
- Как только показания температуры на перфузионном устройстве ex vivo достигнут 24-26 °C, уменьшите температуру нагревателя-охладителя до 14 °C и уменьшите расход насоса еще на 100 мл /мин.
- Как только температура достигнет 14-16 °C, отсоедините канюлю PA от порта PA, начните подачу antegrade del Nido (500 мл), закройте клапан линии AO, остановите насос и быстро зажмите вентиляционную линию AO.
ПРИМЕЧАНИЕ: Давление доставки кардиоплегии должно быть титровано для поддержания среднего давления доставки 45-65 мм рт.ст., отображаемого на мониторе устройства ex vivo . - Извлеките сердце из перфузионного устройства ex vivo , отсоединив канюлю PA и разъем аорты и отрезав провода стимуляции.
- Поместите сердце в ведро, наполненное стерильной ледяной слякотью.
- На заднем столе выходит за пределы легочной вены / левой атриотомии, где было вставлено вентиляционное отверстие LV. Обрезка (1 или 2 мм) дистального аспекта аорты и ПА, где прикрепление к канюлям могло раздавить ткань.
ПРИМЕЧАНИЕ: Сердце теперь готово к интраабдоминальной, гетеротопной имплантации.
11. Гетеротопная имплантация сердечного трансплантата
- Перед установкой зажимов Сатинского введите 300 ЕД/кг внутривенного гепарина свинье-получателю.
- Поместите зажим Satinsky на IVC и создайте продольную венотомию размером ~1,5 см с помощью 11 лезвий и ножниц Потта.
- Анастомозировать трансплантат ПА к инфра-почечному ИВЦ реципиента сквозным способом с использованием бегущего, размер: 4-0, полипропиленового шва. Сначала выполните внутреннюю часть анастомоза и укрепите по мере необходимости прерванными швами перед завершением наружной части анастомоза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Анастомоз от ПА до IVC выполняется в первую очередь, а анастомоз аорты к аорте делается последним, чтобы уменьшить продолжительность окклюзии аорты. - Поместите зажим Сатинского на аорту и создайте продольную аортотомию размером ~ 1,5 см с помощью 11 лезвий и ножниц Потта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Получите ABG до установки зажима. Повторите его сразу после освобождения зажима и снова через 15-30 мин, чтобы оценить любые изменения в гиперкалиемии, гиперлактатемии или ацидемии, указывающие на ишемическое повреждение у реципиента. - Анастомозируйте трансплантат аорты к инфра-почечной аорте реципиента сквозным способом с использованием бегущего, размер: 4-0, полипропиленового шва. Сначала выполните внутреннюю часть анастомоза и укрепите по мере необходимости прерванными швами перед завершением наружной части анастомоза.
- Снимите сатинские зажимы, чтобы отрыгнуть сердце; Сначала снимите зажим IVC, а затем аортальный зажим.
- Поместите ангиокат 18 G в вершину LV трансплантата для удаления воздуха. Когда это будет сделано, удалите ангиокарт и закройте участок заложенным швом.
- Тщательно проверьте анастомозы на наличие кровотечений.
- Осторожно поместите сердце в правое забрюшинное пространство, чтобы не было напряжения на анастомозах и не было перегиба сосудов. Замените тонкую кишку.
12. Закрытие лапаротомии
- Закройте фасцию петлеобразным, размер: 0, Maxon швом в бегущей манере, начиная с обоих концов разреза и завязывая посередине. Позаботьтесь о том, чтобы избежать травм кишечника.
- Закройте глубокий кожный слой размером: 2-0, Vicryl в беговой манере и кожу с размером: 4-0, Monocryl в беговой манере.
- Очистите разрез кожи и нанесите кожный клей.
13. Послеоперационное лечение и эвтаназия
- После завершения операции отключите поток изофлурана и контролируйте свинью на предмет возвращения мышечного тонуса и нервно-мышечных рефлексов (рефлекс роговицы, уход на болевые раздражители, глотание).
- После подтверждения восстановления этих функций выключите искусственную вентиляцию легких и наблюдайте за спонтанным дыханием. При наличии спонтанного дыхания удаляют эндотрахеальную трубку; если нет, повторно подключите эндотрахеальную трубку к искусственной вентиляции легких.
- Перенесите свинью с операционного стола в изолированный вольер, где можно тщательно контролировать ее жизненно важные показатели (ректальная температура, артериальное давление, частота сердечных сокращений). Используйте нагревательную лампу, чтобы согреть свинью по мере необходимости. Обеспечивают внутривенное введение жидкостного болюса 250 мл раствора Лактированного Рингера в условиях гипотензии (систолическое артериальное давление < 100 мм рт.ст.). Продолжайте следить за свиньей до тех пор, пока она не сможет поддерживать стернальную упругость и жизненно важные показатели полностью нормализуются.
ПРИМЕЧАНИЕ: Животное не остается без присмотра до тех пор, пока оно не придет в достаточное сознание. Кроме того, животное не возвращается в компанию других животных до полного выздоровления. - Для лечения боли вводят одноразовую дозу бупренорфина (замедленного высвобождения) подкожной инъекцией 0,12 мг/кг в течение 72 ч анальгезии.
- В конце экспериментального периода усыпляют свинью для эксплантации нативного (грудного) сердца и аллотрансплантата (брюшного) сердца.
- Подготовьте свинью, как описано в разделах 2 и 3, к процедуре. Подготовьте два пакетика дель Нидо и две линии кардиоплегии для остановки каждого сердца.
- Обнажите грудное сердце, как описано в разделе 4. После завершения приступайте к выполнению лапаротомии, как описано в разделе 9.
- Как только анастомозы аорто-аорты и PA-IVC обнажаются, поместите зажим Сатинского на аорту реципиента и еще один на реципиент IVC, чтобы изолировать аллотрансплантат от системного кровообращения.
- Вставьте детскую канюлю корня аорты 4-Fr в корень аорты аллотрансплантата и подключите линию кардиоплегии к катетеру. Вводят 500 мл кардиоплегии дель Нидо в корень при давлении 100-150 мм рт.ст. с помощью напорного мешка. После начала инфузии используйте ножницы Метценбаума, чтобы сделать разрез 2 см на уровне анастомоза PA-IVC для вентиляции аллотрансплантата.
- После того, как аллотрансплантат арестован, приступайте к эксплантации аллотрансплантата с помощью ножниц Метценбаума для иссечения на уровне аорто-аортального анастомоза и остальной части анастомоза PA-IVC. Не снимайте ни одного из зажимов Сатинского.
- Приступают к удалению грудного отдела сердца, как описано в разделе 5.
ПРИМЕЧАНИЕ: Единственное существенное различие заключается в том, что легочные вены не нуждаются в тщательном перевязке и вместо этого могут быть грубо рассечены с использованием ножниц Метценбаума при выполнении кардиэктомии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эта группа успешно пережила 9 свиней в течение 5-35 дней после протокола, представленного здесь, в зависимости от дизайна исследования. Из 10 свиней, прошедших этот протокол, только 1 умерла преждевременно от хирургических осложнений, что дало 90% выживаемость. На фиг.2 показана диаграмма конфигурации гетеротопного сердца, пересаженного в интраабдоминальном положении у свиньи. При определении места для анастомоза аллотрансплантата выберите участок, который минимизирует любое напряжение или изгиб на анастомозе. Это гарантирует, что анастомозы заживают должным образом и что аллотрансплантат получает оптимальную перфузию и дренаж крови.
Репрезентативное изображение сердечного аллотрансплантата, перфузионного на нормотермическом перфузионном устройстве ex vivo , показано на рисунке 3. На рисунке 4 показаны репрезентативные параметры перфузии, полученные в ходе успешного эксперимента (скорость кровотока, аортальное давление, частота сердечных сокращений, температура, смешанное венозное насыщение кислородом и гематокрит). Неспособность достичь значений параметров, продемонстрированных здесь, может привести к нарушению функции аллотрансплантата после трансплантации. На рисунке 5 показано изображение интраабдоминального гетеротопного сердца in situ через 35 дней после успешной трансплантации. Репрезентативные результаты эффективности использования представленного здесь протокола для терапевтической доставки были ранее продемонстрированы этой группой15. Сердечные аллотрансплантаты (n = 3) перфузировали перфусатом, обработанным аденовирусным вектором, несущим трансген для люциферазы. Экспрессия генов оказалась глобальной и надежной в аллотрансплантатах через 5 дней после лечения и трансплантации. На рисунке 6 показан атлас активности белка люциферазы, измеренный и представленный как среднее складчатое изменение активности из каждой области эксплантированного сердечного аллотрансплантата по сравнению с грудным сердцем реципиентов.
Рисунок 1: Схема протокола терапевтической доставки ко всему сердечному аллотрансплантату с использованием нормотермической сангвинической перфузии ex vivo . (А) Сердце и кровь закупаются у донорской свиньи. (B) Кровь промывают с помощью устройства для сохранения клеток для удаления любых терапевтических нейтрализующих компонентов из донорской сыворотки. (C) Сердечный аллотрансплантат устанавливается на нормотермическое перфузионное устройство ex vivo и перфузионируется в течение 2 ч. (D) Вскоре после установки аллотрансплантата к перфусату добавляется терапевтический препарат, представляющий интерес. (E) После отведенного периода перфузии ex vivo аллотрансплантат пересаживают свинье-реципиенту в интраабдоминальном, гетеротопном положении. Эта цифра была изменена с15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Гетеротопная модель сердца свиней в интраабдоминальном положении. Диаграмма гетеротопной модели сердца, где аллотрансплантат пересаживается в внутриабдоминальном положении, в то время как родное сердце реципиента остается в своем естественном расположении. Легочная артерия аллотрансплантата анастомозируется до инфра-почечной нижней полой вены, в то время как аорта аллотрансплантата анастомозируется к инфра-почечной аорте реципиента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Сердечный аллотрансплантат на перфузионном устройстве ex vivo . Сердечный аллотрансплантат установлен на нормотермическом перфузионном устройстве ex vivo , где его перфузионируют с терапевтическим перфусатом в течение 2 ч до имплантации реципиенту. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативные параметры перфузии ex vivo . (A) Скорость кровотока, измеренная из легочной артерии (синий), аорты (зеленый) и коронарных артерий (красный). (B) Репрезентативные измерения аортального давления: среднее давление (синий), систолическое давление (красный), диастолическое давление (зеленый). (C) Частота сердечных сокращений сердечного аллотрансплантата во время перфузии ex vivo . (D) Зарегистрированная температура сердечного аллотрансплантата во время перфузии ex vivo . (E) демонстрирует значения SvO2 , измеренные из перфусата в течение перфузионного периода. (F) Значения гематокрита, измеренные из перфусата в течение перфузионного периода. Сокращения: hct = гематокрит; SvO2 = смешанное венозное насыщение кислородом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Сердечный аллотрансплантат пересажен реципиенту. Сердечный аллотрансплантат на 35-й послеоперационный день лечат терапевтическим препаратом в момент имплантации. Донор был выбран таким образом, чтобы идеально соответствовать SLA реципиенту. Аббревиатура: SLA = Свиной лейкоцитарный антиген. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Активность люциферазы после трансдукции сердечных аллотрансплантатов. Представлены результаты трех сердечных аллотрансплантатов, которые были трансдуцированы аденовирусными векторами, несущими трансген люциферазы. Продемонстрировано среднее изменение активности белка люциферазы в каждой области сердечного аллотрансплантата. Эта цифра была изменена по сравнению с Bishawi et al. 15. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Доставка терапевтических средств во время перфузии ex vivo при трансплантации сердца предлагает стратегию модификации аллотрансплантата и потенциального улучшения результатов трансплантации. Протокол, представленный здесь, включает в себя современное нормотермическое хранение сангвинической перфузии ex vivo и предлагает многообещающий потенциал для тестирования изолированной доставки клеточной, генной или иммунотерапии к аллотрансплантату 11,12,13. На сегодняшний день методы сердечной доставки для этих предполагаемых методов лечения сердечно-сосудистых заболеваний и терминальной стадии сердечной недостаточности основаны на системном введении, интракоронарной перфузии с помощью катетеризации и прямых инъекциях интрамиокарда, все из которых достигли плохих результатов с точки зрения доставки миокарда 5,16. Ранее мы продемонстрировали надежную и глобальную экспрессию репортерного гена для целых сердечных аллотрансплантатов, когда вирусный вектор вводился в перфусат во время перфузии ex vivo до трансплантации15. Это особенно важно в контексте трансплантации сердца, где глобальная экспрессия и эффект терапевтического средства должны достигать всех областей аллотрансплантата для достижения желаемой «кардиопротекции» всего аллотрансплантата. Этот протокол достигает этого способом, который ранее не был достигнут с использованием традиционно описанных путей введения для терапевтических средств.
В этом протоколе представлено несколько важных шагов, которые следует выделить. (1) Должны быть приняты все меры предосторожности, чтобы свести к минимуму кровопотерю во время забора сердца у донора. По крайней мере, 1 л крови должен быть получен от донора для перфузионного устройства для достижения адекватных скоростей потока. (2) Для терапевтической доставки с использованием нормотермической сангвинической перфузии ex vivo необходимо промыть донорскую кровь перед добавлением ее в перфусат, чтобы удалить любые нейтрализующие компоненты в донорской сыворотке, которые могут негативно повлиять на доставку терапевтического средства к сердцу. (3) Свести к минимуму рассечение сердца у донора до остановки кардиоплегии, чтобы избежать фатальных аритмий. (4) При введении терапевтического средства в перфузионное устройство важно вводить его через порт, ближайший к корню аорты, и всегда промывать порт, чтобы обеспечить полную доставку суспензии. Это делается для того, чтобы свести к минимуму любую потенциальную потерю терапевтического вещества в кислородатор или трубку в цепи и обеспечить, чтобы трансплантат получал как можно более высокую терапевтическую концентрацию. (5) Наконец, при выборе места для имплантации трансплантата крайне важно, чтобы местоположение сводило к минимуму вероятность напряжения при анастомозе и чтобы не было перегиба кровеносных сосудов / анастомозов.
Также рекомендуется, чтобы свиньи были типами лейкоцитарного антигена свиней (SLA) (т.е. основной комплекс гистосовместимости свиней, MHC) заранее, чтобы выбрать соответствующую степень соответствия/несоответствия между гаплотипами SLA, включающими антигены класса I клеточной поверхности (SLA-1, SLA-2 и SLA-3) и / или класса II (DR и DQ) на основе потребностей исследователя (SLA-типирование, выполненное SH, как ранее описано, с небольшими изменениями, внесенными в панели типирования праймера)17, 18. Например, обеспечение того, чтобы свиньи соответствовали всем антигенам SLA, сводит к минимуму риск отторжения аллотрансплантата, тогда как использование свиней с несоответствием по всем антигенам SLA максимизирует частоту отторжения аллотрансплантата.
Ограничением этой модели является то, что, хотя она позволяет изучать иммунологические эффекты на сердечный трансплантат, она не позволяет полностью оценить способность трансплантата поддерживать сердечно-сосудистую систему после вмешательства. Чтобы достичь этого, трансплантат должен быть имплантирован ортотопически. Тем не менее, ортотопическая трансплантация на моделях крупных животных имеет более высокую связанную смертность и требует сердечно-легочного шунтирования3. Другим ограничением этой модели является ограниченный доступ к перфузионному устройству ex vivo для проведения эффективной доставки генов к трансплантату. По мере того, как эти устройства становятся все более доступными в области трансплантации органов, ожидается, что доступ улучшится. Кроме того, некоммерческое устройство может быть вариантом для экспериментальных целей.
Трансплантация сердца предлагает уникальную обстановку, где терапевтические средства могут быть введены в аллотрансплантат с помощью перфузии ex vivo до имплантации реципиенту. Использование перфузионного устройства ex vivo позволяет трансплантатам проходить транзитом от донора к реципиенту в течение периодов, которые намного дольше, чем то, что безопасно при использовании традиционного холодного статического хранения6. Этот длительный период перфузии обеспечивает эффективную изолированную доставку терапевтических средств. Эта модель служит трансляционным шагом между доклиническим тестированием терапии на животных и преобразующей клинической терапией.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Пол Лезберг работает в TransMedics, Inc. Кармело Милано получил финансовый подарок от TransMedics, Inc. для финансирования гетеротопических операций по пересадке сердца. Michelle Mendiola Pla поддерживается T32HL007101. У других авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Duke Large Animal Surgical Core и Duke Perfusion Services за их помощь во время этих процедур. Мы также хотели бы поблагодарить Пола Лезберга и TransMedics, Inc. за поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0 Looped Maxon suture | Covidien | GMM-341L | Used to close fascia of the laparotomy incision |
| 0 Silk ties | Medtronic, Inc | S346 | |
| 18 G Angiocath | BD | 381144 | Used to de-air the left ventricle of the donor heart after implantation |
| 20 Fr LV vent | Medtronic, Inc | 12002 | |
| 2-0 Silk sutures | Ethicon, Inc. | SA11G | |
| 2-0 Silk ties | Ethicon, Inc. | SA65H | |
| 2-0 Vicryl suture | Ethicon, Inc. | J259H | |
| 24 Fr venous cannula | Medtronic, Inc | 68124 | |
| 3-0 Prolene sutures | Ethicon, Inc. | 8522 | |
| 4-0 Monocryl suture | Ethicon, Inc. | Y469G | |
| 4-0 Prolene sutures | Ethicon, Inc. | 8521 | |
| Animal hair cutting clipper | Wahl | 8786-452 | |
| Aortic clamp | V. Mueller | CH6201 | |
| Army Navy retractor | V. Mueller | SU3660 | |
| ATF 40, Cell saver disposable set | Fresenius Kabi | 9108494 | Cell saver device insert |
| Balfour retractor | V. Mueller | SU3042 | Used as an abdominal wall retractor |
| C.A.T.S cell saver | Fresenius Kabi | ES0019 | Cell saver device used to wash donor blood |
| Cardiac defibrillator | Zoll | M Series | Cardiac defibrillator |
| Castro needle holder | V. Mueller | CH8589 | |
| CG4 iStat cartridges | Abbott | 03P85-25 | POC testing |
| CG8 iStat cartridges | Abbott | 03P88-25 | POC testing |
| DeBakey forceps | V. Mueller | CH5902 | |
| Electrocautery disposable pencil | Covidien | E2450H | |
| Gerald forceps | V. Mueller | NL1451 | |
| Hemotherm 400CE Dual Reservoir Cooler/Heater | Cincinnati Sub-Zero | 86022 | Heater cooler used to regulate perfusion temperature on the ex vivo perfusion device |
| iSTAT 1 | Abbott | 04P75-03 | POC testing device |
| Kocher clamp | V. Mueller | SU2790 | |
| Large clip applier | Sklar | 50-4300 | |
| Large clips | Teleflex | 4200 | |
| Large soft pledgets | Covidien | 8886867901 | |
| Medium clip applier | Sklar | 50-4335 | |
| Medium clips | Teleflex | 2200 | |
| Metzenbaum scissor | V. Mueller | CH2006-001 | |
| No. 10 scalpel blade | Swann-Mortan | 301 | Used for skin incision |
| No. 11 scalpel blade | Kiato Plus | 18111 | Used for vascular incision |
| OCS device with base | TransMedics, Inc. | Ex vivo perfusion device | |
| OCS disposable | TransMedics, Inc. | Ex vivo perfusion device insert with perfusion kits | |
| Pacing cable | Remington Medical | FL-601-97 | |
| Pediatric cardioplegia catheter (4Fr) | Medtronic, Inc | 10218 | Used to deliver cardioplegia to the donor aortic root |
| Pediatric Foley catheter | Teleflex | RSH170003080 | Placed pre-op to decompress the recipient's bladder |
| Potts scissors | V. Mueller | CH13038 | |
| Pressure bag x2 (1,000 mL) | Novaplus | V4010H | Used to deliver cardioplegia at a set pressure |
| Satinsky clamp | V. Mueller | CH7305 | Vascular clamp used for creating anastomoses between donor heart and recipient vessels |
| Scissors | Felco | FELCO 200A-50 | Used to perform sternotomy |
| Small hard pledgets | Covidien | 8886867701 | |
| Sternal retractor | V. Mueller | CH6950-007 | |
| Temporary cardiac pacing wires | Ethicon, Inc. | TPW32 | |
| Temporary dual chamber pacemaker | Medtronic, Inc | 5388 | Cardiac pacing device |
| Tourniquet kit | Medtronic, Inc | 79005 | Rummel tourniquets |
| Umbilical tape | Covidien | 8886861903 | |
| Vessel loops | Covidien | 31145686 |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 143 (8), 254 (2021).
- Stehlik, J., Kobashigawa, J., Hunt, S. A., Reichenspurner, H., Kirklin, J. K. Honoring 50 years of clinical heart transplantation in circulation: in-depth state-of-the-art review. Circulation. 137 (1), 71-87 (2018).
- Kadner, A., Chen, R. H., Adams, D. H. Heterotopic heart transplantation: experimental development and clinical experience. European Journal of Cardiothorac Surgery. 17 (4), 474-481 (2000).
- Hastings, C. L., et al. Drug and cell delivery for cardiac regeneration. Advanced Drug Delivery Reviews. 84, 85-106 (2015).
- Sahoo, S., Kariya, T., Ishikawa, K. Targeted delivery of therapeutic agents to the heart. Nature Reviews. Cardiology. 18 (6), 389-399 (2021).
- Stamp, N. L., et al. Successful heart transplant after ten hours out-of-body time using the TransMedics Organ Care System. Heart, Lung & Circulation. 24 (6), 611-613 (2015).
- Ragalie, W. S., Ardehali, A. Current status of normothermic ex-vivo perfusion of cardiac allografts. Current Opinion in Organ Transplantation. 25 (3), 237-240 (2020).
- Koerner, M. M., et al. Normothermic ex vivo allograft blood perfusion in clinical heart transplantation. Heart Surgery Forum. 17 (3), 141-145 (2014).
- Rosenbaum, D. H., et al. Perfusion preservation versus static preservation for cardiac transplantation: effects on myocardial function and metabolism. Journal of Heart and Lung Transplantation. 27 (1), 93-99 (2008).
- Cullen, P. P., Tsui, S. S., Caplice, N. M., Hinchion, J. A. A state-of-the-art review of the current role of cardioprotective techniques in cardiac transplantation. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 32 (5), 683-694 (2021).
- Rurik, J. G., Aghajanian, H., Epstein, J. A. Immune cells and immunotherapy for cardiac injury and repair. Circulation Research. 128 (11), 1766-1779 (2021).
- Rincon, M. Y., VandenDriessche, T., Chuah, M. K. Gene therapy for cardiovascular disease: advances in vector development, targeting, and delivery for clinical translation. Cardiovascular Research. 108 (1), 4-20 (2015).
- Kieserman, J. M., Myers, V. D., Dubey, P., Cheung, J. Y., Feldman, A. M. Current landscape of heart failure gene therapy. Journal of the American Heart Association. 8 (10), 012239 (2019).
- Perin, E. C. Stem cell and gene therapy for cardiovascular disease. Perin, E. C., Miller, L. W., Taylor, D. A., Wilkerson, J. T. , Academic Press. 279-287 (2016).
- Bishawi, M., et al. A normothermic ex vivo organ perfusion delivery method for cardiac transplantation gene therapy. Scientific Reports. 9 (1), 8029 (2019).
- Hulot, J. S., Ishikawa, K., Hajjar, R. J. Gene therapy for the treatment of heart failure: promise postponed. European Heart Journal. 37 (21), 1651-1658 (2016).
- Ho, C. S., et al. Molecular characterization of swine leucocyte antigen class I genes in outbred pig populations. Animal Genetics. 40 (4), 468-478 (2009).
- Ho, C. S., et al. Molecular characterization of swine leucocyte antigen class II genes in outbred pig populations. Animal Genetics. 41 (4), 428-432 (2010).
