Summary
Vi presenterer en protokoll for bruk av en normotermisk ex vivo sanguinous perfusjonssystem for levering av terapeutiske behandlinger til en hel hjerte allograft i en porcin heterotop hjertetransplantasjonsmodell.
Abstract
Hjertetransplantasjon er gullstandardbehandlingen for hjertesvikt i sluttfasen. Det forblir imidlertid begrenset av antall tilgjengelige donorhjerter og komplikasjoner som primær graft dysfunksjon og graftavvisning. Den nylige kliniske bruken av en ex vivo perfusjonsenhet i hjertetransplantasjon introduserer en unik mulighet for behandling av hjerte allografts med terapeutiske intervensjoner for å forbedre funksjonen og unngå skadelige mottakerresponser. Etablering av en translasjonell, stordyrmodell for terapeutisk levering til hele allograften er avgjørende for å teste nye terapeutiske tilnærminger i hjertetransplantasjon. Den monotopiske hjertetransplantasjonsmodellen i intraabdominal stilling fungerer som en utmerket modell for å vurdere effekten av nye intervensjoner og immunopaologien til graftavvisning. Denne modellen tilbyr i tillegg langsiktig overlevelse for grisen, gitt at graftet ikke er nødvendig for å opprettholde mottakerens sirkulasjon. Målet med denne protokollen er å gi en reproduserbar og robust tilnærming for å oppnå eks vivo levering av en terapeutisk til hele hjerte allograft før transplantasjon og gi tekniske detaljer for å utføre en overlevelse heterotop transplantasjon av ex vivo perfused hjerte.
Introduction
Hjertesvikt er en tilstand som påvirker anslagsvis 6 millioner voksne i USA og anslås å øke til 8 millioner voksne innen år 20301. Hjertetransplantasjon er gullstandardbehandlingen for hjertesvikt i sluttfasen. Det er imidlertid ikke uten begrensninger og komplikasjoner. Det forblir begrenset av antall tilgjengelige donorhjerter, primær graft dysfunksjon, avvisning av hjertet og bivirkningene av langvarig immunsuppresjon2. Disse begrensningene er spesielt viktige hos unge mottakere som kan oppleve allograftsvikt og krever etterfølgende retransplantasjon for å oppnå normal forventet levealder.
En ideell intervensjon for å overvinne disse begrensningene ville behandle hele hjerte allografts med terapeutiske før implantasjon i mottakeren som kan forbedre levedyktigheten til allograft og konferere "kardioproteksjon." Slike intervensjoner ville bli gitt profylaktisk for å minimere forekomsten av iskemiske fornærmelser, allograft avvisning, hjerte allograft vaskulopati og til og med reparere marginale allografter. Translasjonelle studier for å utvikle denne typen intervensjoner krever en stordyrmodell av hjertetransplantasjon for å tillate langsiktig overvåking av hjertegraftet. Den monotopiske hjertetransplantasjonsmodellen i intraabdominal stilling har vist seg ideell for dette formålet. Hjertetransplantasjon i denne posisjonen gjør det mulig å teste effekten av nye terapier og vurdere immunopathology av graft avvisning. I tillegg er den heterotopiske modellen fordelaktig over den ortotopiske modellen på grunn av mottakerens bedre generelle overlevelse, ikke noe krav om kardiopulmonal bypass, og ingen krav til transplantatet for å opprettholde mottakerens sirkulasjon3.
Effektiv levering av terapeutiske intervensjoner til hjertet, for eksempel gen-, celle- eller immunterapi, er en betydelig barriere for klinisk anvendelse 4,5. Teknologien introdusert av ex vivo perfusjonsenheter gjør at grafts kontinuerlig kan perfunderes, og opprettholder dem i en ikke-arbeidende, men metabolsk aktiv tilstand 6,7,8,9. Dette gir en unik mulighet til å behandle et helt hjerte med avansert terapeutisk behandling samtidig som den minimerer de potensielle bivirkningene av systemisk levering 10,11,12,13. En annen fordel med å bruke ex vivo perfusjonsenheter for terapeutisk levering er at de tillater administrering av medisiner til koronarsirkulasjonen over lengre perioder som ikke er mulig ved hjelp av tradisjonelle kalde statiske lagringsmetoder. Dette gir mulighet for mer global levering av terapeutiske stoffer til graft14. Ved hjelp av protokollen som presenteres her, leverte vi vellykket firefly luciferase genet til en hel porcin hjertetransplantasjon ved hjelp av adenovirale vektorer15. Målet med denne protokollen er å gi en reproduserbar og robust tilnærming for å oppnå levering av en terapeutisk til hele hjerte allograft før transplantasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: To kvinnelige Yucatan griser er valgt, med en utpekt til å være hjertetransplantasjonsdonor og den andre mottakeren. Griser i alderen 6-8 måneder, veier ca 30 kg, og det anbefales å ha kompatible blodtyper. Oversikten over protokollen er vist i figur 1. Boliger og behandlingsprosedyrer for grisene utføres i samsvar med retningslinjene fra Dyrepleie- og brukskomiteen ved Duke University Medical Center.
1. Forberedelse av ex vivo perfusjonsenhet
- Klargjør ex vivo perfusjonsenheten og en cellesparerenhet for bruk i henhold til produsentens retningslinjer.
- Ha en pacing boks og defibrillator tilgjengelig og sette dem opp.
- Ha en point-of-care (POC) testenhet tilgjengelig for å sjekke et komplett blodtall (CBC), grunnleggende metabolsk panel (BMP) og arteriell blodgass (ABG).
- Legg til følgende medisiner til perfusjonsprimingsløsningen levert av produsenten, hvis den ikke allerede er til stede i produsentens perfusjonsløsning: 100 ml 25% albumin, 10 ml 200 mg/100 ml ciprofloxacin, 1 g cefazolinnatrium, to 5 ml hetteglass med multi-vitamin injeksjon, 250 mg metylprednisolon, 10 000 IE heparin og 50 IE insulin.
- Utfør POC-testing av ex vivo-enhetens påfyllingsløsning for å sikre at elektrolyttnivåene er innenfor det normale fysiologiske området. Hvis ikke, administrer kalsiumglukonat, dekstrose og/eller natriumbikarbonat tilsvarende for å supplere eventuelle subterapeutiske elektrolytter eller glukosenivåer.
- For å legge til grunneløsningen med de tilsatte medisinene, topp løsningen og luft linjen som leverer løsningen til ex vivo perfusjonsenheten.
MERK: Gå til avsnitt 6 for instruksjoner om påfylling av ex vivo perfusjonsenhet.
2. Initiering av anestesi og IV-tilgang i donorgrisen
- Etter å ha fastet grisen i 8-12 timer, premedisiner den med ketamin (5-33 mg / kg, intramuskulær) og midazolam (0,2-0,5 mg / kg, intramuskulær) og administrer isofluran (1-4%) ved hjelp av en ansiktsmaske.
- Plasser grisen i en liggende stilling og intuber med et endotrakealrør (ETT) (5,5-6,5 mm innvendig diameter) for å beskytte luftveiene. Sikre ETT ved å binde det til grisens snute. Plasser ekstremitetene ved hjelp av tunge bånd festet til bordet.
- Påfør veterinærsalve på øynene for å forhindre tørrhet mens du er under anestesi.
- Plasser et intravenøst (IV) kateter (20-22 G) i en ørevene.
- Initier vedlikehold IV-væsker (Lactated Ringers løsning på 10 ml·( kg·h)-1).
- Administrer intramuskulær (IM) Buprenorfin 0,005-0,01 mg/kg for analgesi.
3. Vitale skilt og sentrale linjeinnstillinger
- Start mekanisk ventilasjon med et tidevannsvolum på 10 ml· (kg·min) -1 og en hastighet på 10-15 pust per minutt med isofluran (1-3%) opprettholdt gjennom hele prosedyren slik at reflekser er fraværende og hjertefrekvensen (>60 bpm, <100 bpm) og blodtrykk (systolisk blodtrykk >90 mmHg, <130 mmHg) forblir innenfor det fysiologiske området.
MERK: Det er valgfritt å legge til en paralytisk. - Kontinuerlig overvåke oksygenmetning og hjertefrekvens gjennom hele operasjonen.
4. Median sternotomi av donorgrisen
- Palpate brystbenet fra manubrium til xiphoid. Merk midtlinjen ved hjelp av en steril kirurgisk markør. Barber ethvert hår fra stedet med en hårklipper og steriliser området ved hjelp av 4% klorhexidin for totalt 3 runder sterilisering. Påfør en steril kirurgisk gardin rundt det umiddelbare kirurgiske stedet.
MERK: Kirurger må vaske hender og armer med alkohol- eller jodbasert vask og ikke sterile kjoler og hansker. - Bruk et no. 10 blad for å lage et snitt fra manubriumet ned til xiphoid, som måler 20-30 cm, avhengig av grisens størrelse.
- Bruk elektrokautery til å dele pectoralis major ned fra brystbenet til xiphoid, vær forsiktig med å gjøre dette langs midtlinjen av brystbenet. En gang ned til brystbenet, score midtlinjen og begynne sternotomy fra xiphoid ved å dele den med tung saks.
- Utvid sternotomy cephalad med tung saks. Etter hvert kutt skiller du hjertet direkte fra brystbenet ved hjelp av fingerfeier. På denne måten fullfører du sternotomien gjennom manubriumet.
- Etter å ha fullført sternotomien, oppnå hemostase ved å bruke elektrokautery på de kuttede beinkantene.
- Plasser en sternal retraktor og åpne den for å optimalisere eksponeringen av det kirurgiske feltet. Identifiser og fjern thymus med elektrokautery. Angi perikardiumet langsgående fra membranen til aorta. Lag en perikard vugge med 5-6 størrelse: 2-0, silke suturer.
5. Hjertestans og kardiktomi av donorgrisen
- Del vevet mellom aorta- og lungearterien (PA) og visualiser plasseringen av aortabuen og den brachiocephalic stammen for å lette riktig plassering av aorta kryssklemmen.
MERK: Den stigende aorta er mye kortere i grisen kontra mennesket. - Omkrets frigjøre den overlegne vena cava (SVC) ved hjelp av saks og stump disseksjon. Pass to, størrelse: 0, silkebånd rundt SVC.
- Omkretsfri den dårligere vena cava (IVC) ved hjelp av saks og stump disseksjon. På samme måte passerer du to 0 silkebånd rundt IVC.
- Påfør en U-maske, størrelse: 4-0, polypropylen sutur til stigende aorta.
- Påfør en veskestreng, størrelse: 4-0, polypropylen sutur til høyre atrium (RA).
- Administrer en bolus av heparin IV ved hjelp av en innledende dose på 300 U/kg.
- Sett inn en pediatrisk 4-fr aorta rotkanyle, sikret av den tidligere plasserte U-masken. De-air kanylen og sikre den på plass med en Rummel tourniquet.
- Koble aortarotkanylen til kardiolegirørene etter at slangen er spylt med del Nido kardiooplegi. Skyll med den nødvendige mengden for å fjerne eventuelle luftbobler i slangen.
MERK: Kommunikasjon med perfusjonsteamet er avgjørende på dette tidspunktet for å utføre hjertestansen riktig.- Forsikre deg om at perfusjonisten (e) har installert cellesparerens engangsartikler på en steril måte, primet enheten som anbefalt av produsenten (se avsnitt 6), og er klar til å behandle det innsamlede blodet.
- Bekreft at cellesparer kardiomy (plastbeholder festet til cellesparerenheten der blod er lagret etter vask) er klar med 10.000 U heparin og at kardiomy er koblet til sug, ikke å overstige -150 mmHg trykk.
MERK: Dette for å unngå hemolyse av røde blodlegemer.
- Lag en høyre atriotomi i den tidligere plasserte veskestrengen, sett inn en 24 Fr venøs kanyle i RA, og sikre med en Rummel-turniquet.
- Koble den venøse kanylen til en steril sugelinje koblet til cellesparerkardiomyen og samle ca. 1-1,3 L blod. Påfør deretter den aorta kryssklemmen, sørg forsiktig for at klemmen helt okkluderer den stigende aorta. Administrer 500 ml Del Nido kardiooplegi i roten med et trykk på 100-150 mmHg ved hjelp av en trykkpose.
MERK: Hjertet vil blanchere og arrestere. - Plasser steril issluse på hjertet.
- Når kardiooplegien er levert, fjern aortarotkanylen og RA venøs kanyle og bind vesken-streng suturer ned.
- Del følgende: IVC, SVC bare proksimal til azygos vene, aorta på nivået av buen bare distal til Innominate arterien, den viktigste PA ved bifurkasjonen, og venstre azygot vene når den kommer inn i koronar sinus.
MERK: Grisene har en venstre azygot vene som renner ut i koronar sinus. - Identifiser lungeårene og ligat dem med størrelse: 2-0, silkebånd eller store klipp. La en lungevene stå åpen for innsetting av LV-ventilen.
- Fjern hjertet fra brystet og legg det i en beholder med steril issluse.
- Flytt hjertet til backtable for å forberede graft for plassering på ex vivo perfusjonsenhet.
6. Vask donorblodet og grunne ex vivo-perfusjonsenheten
MERK: Dette trinnet er nødvendig for å fjerne eventuelle komponenter fra donorserumet som kan nøytralisere leveringen av terapeutisk når det introduseres til perfusatet. Utfør dette trinnet under utvisning av donorhjertet for å minimere allograft iskemisk tid.
- Fullfør en prim- og vaskesyklus for cellesparing.
- Installer engangskomponentene i enheten i henhold til produsentens instruksjoner.
- Klargjør cellesparerenheten ved å spytte Plasmalyte A og velge hovedfunksjonen på enheten. Tilsett så mye plasmalytt A som volumet av blod samlet fra donorgrisen på en 1:1 måte.
MERK: Når enheten er ferdig med grunnesyklusen, er den klar for tilsetning av blod. Se pkt. 5.9-5.11 for hvordan du tilsetter blodet fra donorgrisen. - Når blodet er i enheten, velger du vaskesyklusen på cellesparerenheten.
MERK: Under denne prosessen sentrifugeres blodet mens plasmalytten A introduseres for å vaske blodet. Dette trinnet konsentrerer seg og vasker blodet.
- Overfør det vaskede blodet til en blodoppsamlingspose for overføring til ex vivo-enheten .
- Tilsett det vaskede blodet i ex vivo perfusjonsenheten i henhold til produsentens retningslinjer.
- Forbered en epinefrinoppløsning ved å injisere 0,25 mg epinefrin og 30 IE insulin i 500 ml 5% dekstrose i vann under påfylling av ex vivo-maskinen . Spikre oppløsningen og luft linjen som leverer løsningen til ex vivo-enheten .
- Legg til 10 000 U heparin i ex vivo-perfusjonsenheten.
- Tilsett 5% albumin for å rekonstituere blodet.
MERK: Volumet på 5% albumin lagt til enheten tilsvarer mengden plasma som fjernes av cellesparerenheten. Dette gjøres for å oppnå et fysiologisk onkotisk trykk og hematokrit. - Slå pumpen på for å strømme ved 1-1,5 l/min for å klargjøre kretsen med klar primtall, legemidler og blod som administreres i reservoaret. Etter å ha slått pumpestrømmen på og sirkulert primet gjennom perfusjonsmodulen, må du sørge for at kretsens linjer er luftfrie.
MERK: Det endelige vedlikeholdsoppløsningsvolumet er 1000 ml i tillegg til volumet av vasket blod. - Få en baseline perfusate POC kjemi og laktat ved hjelp av POC-testenheten. Etterfyll elektrolytter etter behov.
- Tilsett nok dekstrose til å opprettholde et minimum glukosenivå på 100 mg/dl.
- Tilsett nok natriumbikarbonat til å opprettholde et minimum pH-mål på 7,4.
MERK: Det er viktig at tilsatt natriumbikarbonat ikke kan fjernes fra perfusatet. Overflødige natriumnivåer vil bidra til at hjertet blir edematøst og må unngås. Det må utvises forsiktighet ved behandling av grunnunderskuddet, da hjertet vil begynne å korrigere grunnunderskuddet ved reanimasjon. - Tilsett nok kalsiumglukonat til å opprettholde et minimum ionisert kalsiumnivå på 0,8 mmol/l.
- Still inn temperaturen ved 37 °C.
- Sett gassstrømmen til 150 ml/min og juster etter behov for å oppnå et fysiologisk pCO2-nivå .
- Sett målet for gjennomsnittlig arterielt trykk (MAP) til 60-70 mmHg.
- Skru ned pumpestrømmen til 0,6 l/min.
7. Backtable forberedelse av donorhjertet og reanimating hjertet
- Oversew the SVC. Plasser fire pantsatte, størrelse: 4-0, polypropylen suturer i en enkel horisontal mote rundt innsiden av den distale aorta, 5 mm under kuttkanten og bind dem ned.
- Mens du holder opp 4, størrelse: 4-0, pantsatte aorta suturer, sett aorta kontakten inn i aorta, og bind en navlestreng rundt aorta for å sikre kontakten.
- Legg en størrelse: 4-0, polypropylenveskestreng rundt den distale kuttekanten av hoved-PA. Sett inn PA-kanylen og bind ned endene av veskestrengen for å feste kanylen.
- Ta den forberedte transplantatet fra backtable til ex vivo perfusjonsenhet og koble aortakontakten til enheten. Sørg for å avlufte aorta/aortakontakten før du fester hjertet til enheten.
- Start perfusjonsklokken, hold pumpestrømmen rundt 0,6 l/min, og reduser det innstilte temperaturpunktet til 34 °C.
- Start epinefrin og vedlikeholdsdråper i henhold til produsentens anbefalinger.
- Koble PA-kanylen til PA-kontakten på enheten og fest den med et slips.
- Plasser venstre ventrikel (LV) ventilasjonsavløp gjennom den utilslørte lungevenen i venstre atrium og over mitralventilen i LV. Fest ventilen med en enkelt søm for å forankre den riktig.
- Plasser to hjerte pacing ledninger på LV fri vegg.
- Sjekk laktat, ABG, CBC og BMP hver time. Administrer kalium, 50% dekstrose og kalsium etter behov for å opprettholde normale fysiologiske nivåer.
MERK: Hyppigere laktatprøvetaking kan være hensiktsmessig under tidlig stabilisering for å etablere tilstrekkelig perfusjon basert på laktat. - Hvis pacing er nødvendig, sett ventrikulært tempo på 80 slag per minutt ved 10 mA (atrie pacing brukes vanligvis ikke).
- Hvis defibrillering er nødvendig, start ved 10 J etter at temperaturen på enheten har nådd 34 °C. Ikke overskrid 50 J.
MERK: Måltotal gjennomsnittlig strømning er 600 ml/min, og gjennomsnittlig koronarstrøm er 400 ml/min.
8. Administrering av terapeutisk
- Trekk det terapeutiske inn i en sprøyte på en steril måte.
- Avluft cardioplegia-porten ved å bruke en steril 3 ml sprøyte for å trekke blod gjennom porten. Administrer terapeutisk i kardiolegiporten (eller tilsvarende) slik at terapeutisk blir introdusert direkte i aortaroten.
- Skyll porten med volumet av oppsamlet blod trukket i trinn 8.2 når du avlufter porten; vær forsiktig så du ikke spyler luft med den.
MERK: Dette er for å sikre at terapeutisk administreres i hjertets aortarot.
MERK: Denne delen er tidligere beskrevet i detalj i Bishawi et al. å introdusere virale vektorer for luciferase uttrykk15. - Perfuse graft på enheten i 2 timer etter innføring av terapeutisk.
9. Forberedelse av mottaker og laparotomi med vaskulær eksponering
- Når hjerte allograften er festet til enheten og terapeutisk blir introdusert i kretsen, begynner induksjonen av anestesi og preoperativ forberedelse som beskrevet i avsnitt 2 for mottakergrisen.
- Initier infusjon av immunsuppresjonsmedisinene: ciklosporin 50 mg/kg totalt som en langsom dryppinfusjon gjennom hele prosedyren og metylprednisolon 1 g IV bolus.
- Administrer antibiotika: enrofloxacin IM (5 mg/kg) og cefazolin 1 g IV bolus.
- Sett et Foley-kateter inn i blæren.
MERK: Dekomprimering av blærehjelpemidlene for å oppnå optimal eksponering av den infrarenale aorta og IVC. - Merk bukmidlinen fra midten av magen til pubis ved hjelp av en steril kirurgisk markør. Barber ethvert hår fra stedet med en hårklipper og steriliser området ved hjelp av 4% klorhexidin for totalt 3 runder sterilisering. Påfør en steril kirurgisk gardin rundt det umiddelbare kirurgiske stedet.
MERK: Kirurger må vaske hender og armer med alkohol- eller jodbasert vask og ikke sterile kjoler og hansker. - Bruk et 10 blad for å insise huden (20-30 cm snitt) og bytt til elektrokautery for å dissekere ned til fascia.
- Bruk to Kocher klemmer for å løfte fascia og peritoneum og forsiktig gjøre et lite snitt (1 cm) inn i bukhulen ved hjelp av Metzenbaum saks.
- Utvid peritonealåpningen for hele lengden av snittet ved hjelp av elektrokauteri, og plasser en finger under for å beskytte den underliggende viscera. Plasser en Balfour-retraktor for å optimalisere eksponeringen. Trekk tilbake den lille tarmen kranialt og med våte håndklær.
- Åpne retroperitonealrommet dårligere enn nyrene med forsiktighet rettet mot å identifisere urinlederne og unngå skade.
- Bær disseksjonen ned til abdominal aorta og IVC. Ligat lymfatikken med mellomstore og store klipp.
- Disseker fartøyene omkrets og eksponer et stort nok segment til å passe en stor Satinsky-klemme rundt hvert fartøy. Pass på å unngå forstyrrelse av lumbal arterielle grener, som kommer av den bakre delen av aorta. Plasser to karløkker rundt aorta og IVC i de proksimale og distale endene av eksponeringen.
10. Endelig arrestasjon og fjerning av hjertet fra ex vivo perfusjonsenhet
- På slutten av eks vivo-perfusjonen på 2 timer kobler du varmekjølermaskinen til ex vivo-enheten . Sett varmekjølertemperaturen på 34 °C.
- På en steril og luftfri måte kobler du den avluftede cardioplegia-leveringslinjen til ex vivo-enheten ved aortatilgangsporten.
- Slå det innstilte temperaturpunktet på ex vivo-enheten av.
- Reduser varmekjølertemperaturen til 24 °C og reduser pumpestrømmen for å opprettholde MAP mellom 60 og 70 mmHg (vanligvis en endring i pumpestrømmen fra 1 l/min ned til 0,9 l/min).
- Når temperaturavlesningen på ex vivo perfusjonsanordningen når 24-26 °C, reduserer du varmekjølertemperaturen ytterligere til 14 °C og reduserer pumpestrømmen ytterligere med 100 ml/min.
- Når temperaturen når 14-16 °C, løsner du PA-kanylen fra PA-porten, starter leveringen av antegrade del Nido (500 ml), lukker AO-linjeventilen, stopper pumpen og klemmer raskt AO-ventilasjonsledningen.
MERK: Cardioplegia-leveringstrykket må titreres for å opprettholde et gjennomsnittlig leveringstrykk på 45-65 mmHg som vist på ex vivo-enhetsmonitoren . - Fjern hjertet fra ex vivo perfusjonsanordningen ved å koble fra PA-kanylen og aortakontakten og kutte pacing-ledningene.
- Plasser hjertet i en bøtte fylt med steril issluse.
- På baksiden, oversew lunge vene / venstre atriotomy der LV ventilen hadde blitt satt inn. Trim (1 eller 2 mm) av det distale aspektet av aorta og PA der vedlegg til kanylene kan ha knust vevet.
MERK: Hjertet er nå klart for intraabdominal, heterotop implantasjon.
11. Heterotop implantasjon av hjertegraftet
- Før du plasserer Satinsky-klemmene, administrer 300 U / kg IV heparin til mottakergrisen.
- Plasser en Satinsky-klemme på IVC og lag en langsgående venotomi som måler ~ 1,5 cm ved hjelp av en 11-blads og Pots saks.
- Anastomose graft PA til mottakerens infra-renal IVC på en ende-til-side måte ved hjelp av en løpende, størrelse: 4-0, polypropylen sutur. Utfør den indre delen av anastomose først og forsterk etter behov med avbrutte suturer før du fullfører den ytre delen av anastomose.
MERK: PA til IVC anastomose utføres først, og aorta-til-aorta anastomose gjøres sist for å redusere varigheten av aorta okklusjon. - Plasser en Satinsky-klemme på aortaen og lag en langsgående aortotomi som måler ~ 1,5 cm ved hjelp av en 11-blads og Pots saks.
MERK: Få en ABG før klemmeplassering. Kontroller det umiddelbart etter klemmeutløsning og igjen 15-30 min senere for å vurdere eventuelle endringer i hyperkalemi, hyperlaktatemi eller acidemi som indikerer iskemisk skade hos mottakeren. - Anastomose graft aorta til mottakerens infra-renal aorta på en ende-til-side måte ved hjelp av en løpende, størrelse: 4-0, polypropylen sutur. Utfør den indre delen av anastomose først og forsterk etter behov med avbrutte suturer før du fullfører den ytre delen av anastomose.
- Fjern Satinsky-klemmene for å reperfuse hjertet; Fjern først IVC-klemmen etterfulgt av aortaklemmen.
- Plasser en 18 G angiocath i LV-toppen av transplantatet for å de-lufte. Når du er ferdig, fjern angiocath og lukk nettstedet med en lovet sutur.
- Kontroller anastomosene nøye for blødning.
- Plasser forsiktig hjertet i riktig retroperitoneal plass, slik at det ikke er spenning på anastomosene og ingen knekking av karene. Bytt ut den lille tarmen.
12. Lukking av laparotomy
- Lukk fascia med looped, størrelse: 0, Maxon sutur i en løpende måte som starter fra begge ender av snittet og binding i midten. Pass på å unngå skade på tarmen.
- Lukk det dype dermale laget med størrelse: 2-0, Vicryl på løpsmote og huden med størrelse: 4-0, Monocryl på løpende måte.
- Rengjør hudinnsnittet og påfør hudlim.
13. Postsurgisk behandling og eutanasi
- Etter ferdigstillelse av operasjonen, slå av isofluranstrømmen og overvåk grisen for retur av muskelton og nevromuskulære reflekser (hornhinnenrefleks, tilbaketrekking til smertefulle stimuli, svelging).
- Etter å ha bekreftet restaureringen av disse funksjonene, slå av mekanisk ventilasjon og følg for spontan pust. Hvis det er spontan pust, fjern endotrakealrøret; Hvis det ikke er det, kobler du endotrakealrøret til mekanisk ventilasjon.
- Overfør grisen av operasjonsbordet til et isolert kabinett der vitale tegn (rektal temperatur, blodtrykk, hjertefrekvens) kan overvåkes nøye. Bruk en varmelampe for å varme grisen etter behov. Gi en IV væske bolus på 250 ml lakterte Ringers løsning i innstillingen av hypotensjon (systolisk blodtrykk < 100mmHg). Fortsett å overvåke grisen til den kan opprettholde sternal heftelse og vitale tegn er fullstendig normalisert.
MERK: Dyret blir ikke stående uten tilsyn før det har fått tilstrekkelig bevissthet tilbake. I tillegg returneres dyret ikke til selskap med andre dyr før det er fullt gjenopprettet. - For smertebehandling, administrer en engangsdose av buprenorfin (vedvarende frigjøring) subkutan injeksjon 0,12 mg/kg i 72 timer analgesi.
- På slutten av den eksperimentelle perioden euthanize grisen for utvisning av det innfødte (thoracic) hjertet og allograft (abdominal) hjerte.
- Forbered grisen som beskrevet i avsnitt 2 og 3 for prosedyren. Forbered to poser med del Nido og to cardioplegia linjer for å arrestere hvert hjerte.
- Eksponer brysthjertet som beskrevet i avsnitt 4. Når du er ferdig, fortsett å utføre en laparotomi som beskrevet i avsnitt 9.
- Når aorto-aorta og PA-IVC anastomoser er utsatt, plasser en Satinsky-klemme på mottakerens aorta og en annen på mottakeren IVC for å isolere allograften fra den systemiske sirkulasjonen.
- Sett inn en pediatrisk 4-fr aortarotkanyle i aortaroten til allograften og koble en kardiolegilinje til kateteret. Administrer 500 ml del Nido kardiooplegi i roten ved et trykk på 100-150 mmHg ved hjelp av en trykkpose. Etter at infusjonen er startet, bruk Metzenbaum saks for å lage et 2 cm snitt på nivået av PA-IVC anastomose for å lufte allograften.
- Når allograften er arrestert, fortsett å utvise allograften ved å bruke Metzenbaum saks til å utskille på nivået av aorto-aorta anastomose og resten av PA-IVC anastomose. Ikke fjern noen av Satinsky-klemmene.
- Fortsett med fjerning av brysthjertet som beskrevet i avsnitt 5.
MERK: Den eneste signifikante forskjellen er at lungeårene ikke trenger å være nøye ligated og kan i stedet grovt dissekeres ved hjelp av Metzenbaum saks når du utfører kardiktomi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne gruppen har overlevd 9 griser mellom 5 og 35 dager etter protokollen som presentert her, avhengig av studiedesignet. Av 10 griser som har gjennomgått denne protokollen, døde bare 1 for tidlig av kirurgiske komplikasjoner, noe som gir en 90% overlevelsesrate. Demonstrert i figur 2 er et diagram over konfigurasjonen av et heterotopt hjerte transplantert i intraabdominal stilling i en gris. Når du bestemmer stedet for anastomose av allograften, velg et nettsted som minimerer spenning eller knekking på anastomose. Dette sikrer at anastomosene helbreder riktig og at allograften får optimal perfusjon og drenering av blod.
Et representativt bilde av en hjerte allograft som blir perfundert på en normotermisk ex vivo perfusjonsenhet er vist i figur 3. Figur 4 skisserer representative perfusjonsparametere som er oppnådd under et vellykket eksperiment (sirkulasjonsstrømningshastighet, aortatrykk, hjertefrekvens, temperatur, blandet venøs oksygenmetning og hematokrit). Manglende evne til å oppnå parameterverdiene som er demonstrert her, kan føre til kompromittert allograftfunksjon etter transplantasjon. Figur 5 viser et bilde av et intraabdominalt heterotopt hjerte in situ 35 dager etter vellykket transplantasjon. Representative resultater av effektiviteten av å bruke protokollen presentert her for terapeutisk levering ble tidligere demonstrert av denne gruppen15. Hjerte allograftene (n = 3) ble perfundert med perfusat behandlet med en adenoviral vektor som bærer transgene for luciferase. Genuttrykk viste seg å være globalt og robust innen allograftene 5 dager etter behandling og transplantasjon. Figur 6 viser et atlas med luciferaseproteinaktivitet målt og presentert som gjennomsnittlig foldendring i aktivitet fra hver region av den utplantede hjertealograften sammenlignet med mottakernes thoraxhjerte.
Figur 1: Protokollskjematisk for terapeutisk levering til en hel hjerte allograft ved hjelp av normotermisk eks vivo sanguinous perfusjon. (A) Hjertet og blodet anskaffes fra donorgrisen. (B) Blodet vaskes med en cellesparerenhet for å fjerne terapeutiske nøytraliserende komponenter fra donorserumet. (C) Hjerte allograften er montert på den normotermiske ex vivo perfusjonsanordningen og perfundert i 2 timer (D) Kort tid etter at allograften er montert, legges den terapeutiske av interesse til perfusatet. (E) Etter den tildelte eksvivoperfusjonsperioden transplanteres allograften i mottakergrisen i intraabdominal, heterotop stilling. Dette tallet er endret fra15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Porcin heterotop hjertemodell i intraabdominal stilling. Diagram over den heterotopiske hjertemodellen der allograften transplanteres i intraabdominal posisjon mens mottakerens opprinnelige hjerte forblir i sin naturlige plassering. Lungearterien i allograften er anastomosed til infra-renal dårligere vena cava, mens aorta av allograft er anastomosed til infra-renal aorta av mottakeren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Hjerte allograft på ex vivo perfusjonsenhet. Hjerte allograft montert på en normotermisk, ex vivo perfusjonsenhet hvor den er parfymert med terapeutisk tilsatt perfusat i 2 timer før implantasjon i mottakeren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Representative ex vivo perfusjonsparametere. (A) Sirkulasjonsstrømningshastigheter målt fra lungearterien (blå), aorta (grønn) og koronararteriene (rød). (B) Representative aortatrykkmålinger: gjennomsnittlig trykk (blå), systolisk trykk (rød), diastolisk trykk (grønn). (C) Hjertefrekvensen til en hjerte allograft under eks vivo perfusjon. (D) Registrert temperatur på hjerte allograft under ex vivo perfusjon. (E) viser verdiene til SvO2 målt fra perfusatet i perfusjonsperioden. (F) Hematokrittverdier målt fra perfusatet i perfusjonsperioden. Forkortelser: hct = hematokrit; SvO2 = blandet venøs oksygenmetning. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Hjerte allograft transplantert hos mottakeren. En hjerte allograft på postoperativ dag 35 behandlet med terapeutisk på tidspunktet for implantasjon. Donoren ble valgt til å være en perfekt SLA-kamp med mottakeren. Forkortelse: SLA = Svin Leukocyte Antigen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Luciferase-aktivitet etter transduksjon av hjerte-allografter. Presentert er resultatene av tre hjerte allografter som ble transdusert med adenovirale vektorer bærer en luciferase transgene. Demonstrert er den gjennomsnittlige foldeendringen i luciferase proteinaktivitet i hvert område av hjerte allograften. Denne figuren er endret fra Bishawi et al. 15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Levering av terapeutiske behandlinger under ex vivo perfusjon i hjertetransplantasjon tilbyr en strategi for å endre allograft og potensielt forbedre transplantasjonsresultatene. Protokollen som presenteres her inkorporerer den toppmoderne normtermiske ex vivo sanguinous perfusjonslagring og tilbyr lovende potensial til å teste isolert levering av celle-, gen- eller immunterapier til allograft 11,12,13. Til dags dato har hjerteleveringsteknikker for disse putative terapiene for kardiovaskulær sykdom og hjertesvikt i sluttfasen stolt på systemisk administrering, intrakoron perfusjon via kateterisering og direkte intramyokardinjeksjoner, som alle har oppnådd dårlige resultater når det gjelder myokardlevering 5,16. Vi hadde tidligere vist robust og globalt uttrykk for et reportergen til hele hjerte allografts da en viral vektor ble administrert i perfusate under ex vivo perfusjon før transplantasjon15. Dette er spesielt viktig i sammenheng med hjertetransplantasjon, hvor globalt uttrykk og effekt av terapeutisk bør nå alle områder av allograften for å oppnå ønsket "kardiobeskyttelse" av hele allograften. Denne protokollen oppnår dette på en måte som ikke tidligere har blitt oppnådd ved hjelp av tradisjonelt beskrevne administrasjonsveier for terapeutiske behandlinger.
Det er flere kritiske trinn som presenteres i denne protokollen for å utheve. (1) Alle forholdsregler må tas for å minimere blodtap under anskaffelsen av hjertet fra donoren. Minst 1 liter blod må oppnås fra donoren for at perfusjonsanordningen skal oppnå tilstrekkelige strømningshastigheter. (2) For terapeutisk levering ved hjelp av normotermisk ex vivo sanguinous perfusjon, er det nødvendig å vaske donorblodet før du legger det til perfusatet for å fjerne nøytraliserende komponenter i donorserumet som kan påvirke leveringen av terapeutisk til hjertet negativt. (3) Minimer disseksjon av hjertet i donoren til etter kardiolegisk arrestasjon for å unngå dødelige arytmier. (4) Når du introduserer det terapeutiske til perfusjonsanordningen, er det viktig å introdusere det gjennom porten nærmest aortaroten og alltid skylle porten for å sikre fullstendig levering av suspensjonen. Dette er for å minimere potensielt tap av terapeutisk til oksygenatoren eller slangen i kretsen og sikre at transplantatet får så høyt terapeutisk konsentrasjon som mulig. (5) Til slutt, når du velger stedet for graftimplantasjon, er det kritisk at plasseringen minimerer potensialet for spenning på anastomose og at det ikke er noen knekking av blodkarene / anastomosene.
Det anbefales også at grisene er Svin Leukocyte Antigen (SLA)-type (dvs. porcin stor histokompatibilitetskompleks, MHC) på forhånd for å velge riktig grad av matching /mismatching på tvers av SLA haplotyper som består av celleoverflateklasse I (SLA-1, SLA-2 og SLA-3) og/eller klasse II (DR og DQ) antigener basert på undersøkerens behov (SLA-skriving utført av SH som tidligere beskrevet med små modifikasjoner gjort på skriveprimerpanelene)17, 18. For eksempel, å sikre at griser matcher på tvers av alle SLA-antigener minimerer risikoen for allograft avvisning, mens bruk av griser med mismatch på tvers av alle SLA-antigener maksimerer forekomsten av allograftavvisning.
En begrensning av denne modellen er at selv om det tillater studiet av immunologiske effekter på hjertegraftet, tillater det ikke en full vurdering av graftets evne til å støtte kardiovaskulærsystemet etter en intervensjon. For å oppnå det, må transplantatet implanteres ortopisk. Imidlertid har ortotopisk transplantasjon i store dyremodeller høyere assosiert dødelighet og krever kardiopulmonal bypass3. En annen begrensning av denne modellen er begrenset tilgang til en ex vivo perfusjonsenhet for å gjennomføre effektiv genlevering til transplantatet. Etter hvert som disse enhetene blir mer tilgjengelige innen organtransplantasjon, forventes tilgangen å forbedre seg. Videre kan en ikke-kommersiell enhet være et alternativ for eksperimentelle formål.
Hjertetransplantasjon gir en unik setting der terapeutiske behandlinger kan introduseres til allograft via ex vivo perfusjon før implantasjon i mottakeren. Bruken av en ex vivo perfusjonsenhet gjør det mulig for grafts å være i transitt fra donoren til mottakeren i perioder som er mye lengre enn det som er trygt ved hjelp av tradisjonell kald statisk lagring6. Denne utvidede perfusjonsperioden muliggjør effektiv isolert levering av terapeutiske midler. Denne modellen fungerer som et translasjonelt skritt mellom preklinisk dyreforsøk av terapeutiske og transformative kliniske terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Paul Lezberg er ansatt i TransMedics, Inc. Carmelo Milano mottok en økonomisk gave fra TransMedics, Inc. for å finansiere heterotope hjertetransplantasjonsoperasjoner. Michelle Mendiola Pla støttes av T32HL007101. De andre forfatterne har ingen interessekonflikter å erklære.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Duke Large Animal Surgical Core og Duke Perfusion Services for deres hjelp under disse prosedyrene. Vi vil også takke Paul Lezberg og TransMedics, Inc. for støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0 Looped Maxon suture | Covidien | GMM-341L | Used to close fascia of the laparotomy incision |
| 0 Silk ties | Medtronic, Inc | S346 | |
| 18 G Angiocath | BD | 381144 | Used to de-air the left ventricle of the donor heart after implantation |
| 20 Fr LV vent | Medtronic, Inc | 12002 | |
| 2-0 Silk sutures | Ethicon, Inc. | SA11G | |
| 2-0 Silk ties | Ethicon, Inc. | SA65H | |
| 2-0 Vicryl suture | Ethicon, Inc. | J259H | |
| 24 Fr venous cannula | Medtronic, Inc | 68124 | |
| 3-0 Prolene sutures | Ethicon, Inc. | 8522 | |
| 4-0 Monocryl suture | Ethicon, Inc. | Y469G | |
| 4-0 Prolene sutures | Ethicon, Inc. | 8521 | |
| Animal hair cutting clipper | Wahl | 8786-452 | |
| Aortic clamp | V. Mueller | CH6201 | |
| Army Navy retractor | V. Mueller | SU3660 | |
| ATF 40, Cell saver disposable set | Fresenius Kabi | 9108494 | Cell saver device insert |
| Balfour retractor | V. Mueller | SU3042 | Used as an abdominal wall retractor |
| C.A.T.S cell saver | Fresenius Kabi | ES0019 | Cell saver device used to wash donor blood |
| Cardiac defibrillator | Zoll | M Series | Cardiac defibrillator |
| Castro needle holder | V. Mueller | CH8589 | |
| CG4 iStat cartridges | Abbott | 03P85-25 | POC testing |
| CG8 iStat cartridges | Abbott | 03P88-25 | POC testing |
| DeBakey forceps | V. Mueller | CH5902 | |
| Electrocautery disposable pencil | Covidien | E2450H | |
| Gerald forceps | V. Mueller | NL1451 | |
| Hemotherm 400CE Dual Reservoir Cooler/Heater | Cincinnati Sub-Zero | 86022 | Heater cooler used to regulate perfusion temperature on the ex vivo perfusion device |
| iSTAT 1 | Abbott | 04P75-03 | POC testing device |
| Kocher clamp | V. Mueller | SU2790 | |
| Large clip applier | Sklar | 50-4300 | |
| Large clips | Teleflex | 4200 | |
| Large soft pledgets | Covidien | 8886867901 | |
| Medium clip applier | Sklar | 50-4335 | |
| Medium clips | Teleflex | 2200 | |
| Metzenbaum scissor | V. Mueller | CH2006-001 | |
| No. 10 scalpel blade | Swann-Mortan | 301 | Used for skin incision |
| No. 11 scalpel blade | Kiato Plus | 18111 | Used for vascular incision |
| OCS device with base | TransMedics, Inc. | Ex vivo perfusion device | |
| OCS disposable | TransMedics, Inc. | Ex vivo perfusion device insert with perfusion kits | |
| Pacing cable | Remington Medical | FL-601-97 | |
| Pediatric cardioplegia catheter (4Fr) | Medtronic, Inc | 10218 | Used to deliver cardioplegia to the donor aortic root |
| Pediatric Foley catheter | Teleflex | RSH170003080 | Placed pre-op to decompress the recipient's bladder |
| Potts scissors | V. Mueller | CH13038 | |
| Pressure bag x2 (1,000 mL) | Novaplus | V4010H | Used to deliver cardioplegia at a set pressure |
| Satinsky clamp | V. Mueller | CH7305 | Vascular clamp used for creating anastomoses between donor heart and recipient vessels |
| Scissors | Felco | FELCO 200A-50 | Used to perform sternotomy |
| Small hard pledgets | Covidien | 8886867701 | |
| Sternal retractor | V. Mueller | CH6950-007 | |
| Temporary cardiac pacing wires | Ethicon, Inc. | TPW32 | |
| Temporary dual chamber pacemaker | Medtronic, Inc | 5388 | Cardiac pacing device |
| Tourniquet kit | Medtronic, Inc | 79005 | Rummel tourniquets |
| Umbilical tape | Covidien | 8886861903 | |
| Vessel loops | Covidien | 31145686 |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 143 (8), 254 (2021).
- Stehlik, J., Kobashigawa, J., Hunt, S. A., Reichenspurner, H., Kirklin, J. K. Honoring 50 years of clinical heart transplantation in circulation: in-depth state-of-the-art review. Circulation. 137 (1), 71-87 (2018).
- Kadner, A., Chen, R. H., Adams, D. H. Heterotopic heart transplantation: experimental development and clinical experience. European Journal of Cardiothorac Surgery. 17 (4), 474-481 (2000).
- Hastings, C. L., et al. Drug and cell delivery for cardiac regeneration. Advanced Drug Delivery Reviews. 84, 85-106 (2015).
- Sahoo, S., Kariya, T., Ishikawa, K. Targeted delivery of therapeutic agents to the heart. Nature Reviews. Cardiology. 18 (6), 389-399 (2021).
- Stamp, N. L., et al. Successful heart transplant after ten hours out-of-body time using the TransMedics Organ Care System. Heart, Lung & Circulation. 24 (6), 611-613 (2015).
- Ragalie, W. S., Ardehali, A. Current status of normothermic ex-vivo perfusion of cardiac allografts. Current Opinion in Organ Transplantation. 25 (3), 237-240 (2020).
- Koerner, M. M., et al. Normothermic ex vivo allograft blood perfusion in clinical heart transplantation. Heart Surgery Forum. 17 (3), 141-145 (2014).
- Rosenbaum, D. H., et al. Perfusion preservation versus static preservation for cardiac transplantation: effects on myocardial function and metabolism. Journal of Heart and Lung Transplantation. 27 (1), 93-99 (2008).
- Cullen, P. P., Tsui, S. S., Caplice, N. M., Hinchion, J. A. A state-of-the-art review of the current role of cardioprotective techniques in cardiac transplantation. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 32 (5), 683-694 (2021).
- Rurik, J. G., Aghajanian, H., Epstein, J. A. Immune cells and immunotherapy for cardiac injury and repair. Circulation Research. 128 (11), 1766-1779 (2021).
- Rincon, M. Y., VandenDriessche, T., Chuah, M. K. Gene therapy for cardiovascular disease: advances in vector development, targeting, and delivery for clinical translation. Cardiovascular Research. 108 (1), 4-20 (2015).
- Kieserman, J. M., Myers, V. D., Dubey, P., Cheung, J. Y., Feldman, A. M. Current landscape of heart failure gene therapy. Journal of the American Heart Association. 8 (10), 012239 (2019).
- Perin, E. C. Stem cell and gene therapy for cardiovascular disease. Perin, E. C., Miller, L. W., Taylor, D. A., Wilkerson, J. T. , Academic Press. 279-287 (2016).
- Bishawi, M., et al. A normothermic ex vivo organ perfusion delivery method for cardiac transplantation gene therapy. Scientific Reports. 9 (1), 8029 (2019).
- Hulot, J. S., Ishikawa, K., Hajjar, R. J. Gene therapy for the treatment of heart failure: promise postponed. European Heart Journal. 37 (21), 1651-1658 (2016).
- Ho, C. S., et al. Molecular characterization of swine leucocyte antigen class I genes in outbred pig populations. Animal Genetics. 40 (4), 468-478 (2009).
- Ho, C. S., et al. Molecular characterization of swine leucocyte antigen class II genes in outbred pig populations. Animal Genetics. 41 (4), 428-432 (2010).
