Summary
Vi præsenterer en protokol til brug af et normotermt ex vivo sanguinous perfusionssystem til levering af terapi til en hel hjerte allograft i en porcin heterotopisk hjertetransplantationsmodel.
Abstract
Hjertetransplantation er guldstandardbehandlingen for hjertesvigt i slutstadiet. Det er dog fortsat begrænset af antallet af tilgængelige donorhjerter og komplikationer såsom primær graftdysfunktion og transplantatafstødning. Den nylige kliniske anvendelse af en ex vivo perfusionsenhed i hjertetransplantation introducerer en unik mulighed for behandling af hjertealliancer med terapeutiske interventioner for at forbedre funktionen og undgå skadelige modtagerresponser. Etablering af en translationel model med store dyr til terapeutisk levering til hele allograften er afgørende for at teste nye terapeutiske tilgange til hjertetransplantation. Den svin, heterotopiske hjertetransplantationsmodel i intraabdominal position tjener som en fremragende model til vurdering af virkningerne af nye interventioner og immunopatologien af transplantatafstødning. Denne model tilbyder desuden langsigtet overlevelse for grisen, da transplantatet ikke er nødvendigt for at opretholde modtagerens cirkulation. Formålet med denne protokol er at tilvejebringe en reproducerbar og robust tilgang til opnåelse ex vivo levering af en terapeutisk til hele hjerte allograft før transplantation og give tekniske detaljer til at udføre en overlevelse heterotopisk transplantation af ex vivo perfunderet hjerte.
Introduction
Hjertesvigt er en tilstand, der påvirker anslået 6 millioner voksne i USA og forventes at stige til 8 millioner voksne inden år 20301. Hjertetransplantation er guldstandardbehandlingen for hjertesvigt i slutstadiet. Det er dog ikke uden sine begrænsninger og komplikationer. Det er fortsat begrænset af antallet af tilgængelige donorhjerter, primær transplantatdysfunktion, afvisning af hjertet og bivirkningerne af langvarig immunsuppression2. Disse begrænsninger er især vigtige hos unge modtagere, der kan opleve allograftsvigt og kræve efterfølgende gentransplantation for at opnå normal forventet levetid.
En ideel intervention for at overvinde disse begrænsninger ville behandle hele hjertealkotransplantater med terapi inden implantation i modtageren, der kan forbedre allotransplantatens levedygtighed og give "kardiobeskyttelse". Sådanne indgreb ville blive givet profylaktisk for at minimere forekomsten af iskæmiske fornærmelser, allograftafstødning, hjerte allograft vaskulopati og endda reparere marginale allotransplantater. Translationelle undersøgelser til udvikling af disse typer interventioner kræver en stor dyremodel af hjertetransplantation for at muliggøre langsigtet overvågning af hjertetransplantatet. Den svin, heterotopiske hjertetransplantationsmodel i intraabdominal position har vist sig ideel til dette formål. Hjertetransplantation i denne position giver mulighed for at teste virkningerne af nye terapier og vurdere immunopatologien af transplantatafstødning. Derudover er den heterotopiske model fordelagtig i forhold til den ortopiske model på grund af bedre samlet overlevelse af modtageren, intet krav om kardiopulmonal bypass og intet krav om transplantat for at opretholde modtagerens cirkulation3.
Effektiv levering af terapeutiske interventioner til hjertet, såsom gen-, celle- eller immunterapi, er en væsentlig barriere for klinisk anvendelse 4,5. Den teknologi, der introduceres af ex vivo-perfusionsanordninger, gør det muligt kontinuerligt at perfundere transplantater og opretholde dem i en ikke-fungerende, men metabolisk aktiv tilstand 6,7,8,9. Dette giver en unik mulighed for at behandle et helt hjerte med avanceret terapi, samtidig med at de potentielle bivirkninger af systemisk levering minimeres 10,11,12,13. En anden fordel ved at bruge ex vivo perfusionsanordninger til terapeutisk levering er, at de tillader administration af medicin til koronarcirkulationen over længere perioder, der ikke er mulige ved hjælp af traditionelle koldstatiske opbevaringsmetoder. Dette giver mulighed for mere global levering af terapien til transplantatet14. Ved hjælp af den protokol, der præsenteres her, leverede vi med succes firefly luciferase-genet til et helt svinehjertetransplantat ved hjælp af adenovirale vektorer15. Formålet med denne protokol er at tilvejebringe en reproducerbar og robust tilgang til opnåelse af en terapeutisk behandling til hele hjertealliancen inden transplantation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: To kvindelige Yucatan-grise vælges, hvor den ene er udpeget til at være hjertetransplantatdonor og den anden modtageren. Grise i alderen 6-8 måneder, der vejer ca. 30 kg og har kompatible blodtyper, anbefales. Oversigten over protokollen fremgår af figur 1. Stald- og behandlingsprocedurerne for svinene udføres i overensstemmelse med retningslinjerne fra Animal Care and Use Committee of Duke University Medical Center.
1. Klargøring af ex vivo-perfusionsanordningen
- Forbered ex vivo-perfusionsenheden og en cellesparerenhed til brug i henhold til producentens retningslinjer.
- Hav en tempoboks og hjertestarter til rådighed og sæt dem op.
- Har en point-of-care (POC) testenhed til rådighed for at kontrollere et komplet blodtal (CBC), grundlæggende metabolisk panel (BMP) og arteriel blodgas (ABG).
- Tilsæt følgende lægemidler til perfusionsprimingopløsningen leveret af producenten, hvis den ikke allerede er til stede i producentens perfusionsopløsning: 100 ml 25% albumin, 10 ml 200 mg / 100 ml ciprofloxacin, 1 g cefazolinnatrium, to 5 ml hætteglas med multi-vitamininjektion, 250 mg methylprednisolon, 10.000 IE heparin og 50 IE insulin.
- Udfør POC-test af ex vivo-enhedens primingopløsning for at sikre, at elektrolytniveauerne ligger inden for det normale fysiologiske område. Hvis ikke, administreres calciumgluconat, dextrose og / eller natriumbicarbonat i overensstemmelse hermed for at supplere eventuelle subterapeutiske elektrolyt- eller glukoseniveauer.
- For at tilføje primingopløsningen med de tilsatte lægemidler skal du spike opløsningen og aflufte linjen, der leverer opløsningen til ex vivo-perfusionsanordningen.
BEMÆRK: Gå til afsnit 6 for instruktioner om grunding af ex vivo-perfusionsanordningen.
2. Initiering af anæstesi og IV-adgang i donorsvinet
- Efter at have fastet grisen i 8-12 timer, præmedicineres den med ketamin (5-33 mg / kg, intramuskulær) og midazolam (0,2-0,5 mg / kg, intramuskulær) og administrere isofluran (1-4%) ved hjælp af en ansigtsmaske.
- Placer grisen i en liggende stilling og intuber med et endotrachealt rør (ETT) (5,5-6,5 mm indvendig diameter) for at beskytte luftvejen. Fastgør ETT ved at binde den til grisens snude. Placer ekstremiteterne ved hjælp af tunge bånd fastgjort til bordet.
- Påfør dyrlæge salve på øjnene for at forhindre tørhed under anæstesi.
- Placer et intravenøst (IV) kateter (20-22 G) i en ørevene.
- Initier vedligeholdelse IV væsker (Lactated Ringer's opløsning ved 10 ml ·( kg·h)-1).
- Buprenorphin administreres intramuskulært (IM) 0,005-0,01 mg/kg for analgesi.
3. Vitale skilte og centrale linjeindstillinger
- Start mekanisk ventilation ved et tidevandsvolumen på 10 ml· (kg·min) -1 og en hastighed på 10-15 vejrtrækninger i minuttet med isofluran (1-3%) opretholdt under hele proceduren, således at reflekser er fraværende, og hjertefrekvensen (>60 bpm, <100 bpm) og blodtryk (systolisk blodtryk >90 mmHg, <130 mmHg) forbliver inden for det fysiologiske område.
BEMÆRK: Tilføjelsen af en paralytisk er valgfri. - Overvåg kontinuerligt iltmætning og puls under hele operationen.
4. Median sternotomi af donorgrisen
- Palper brystbenet fra manubrium til xiphoid. Marker midterlinjen ved hjælp af en steril kirurgisk markør. Barber ethvert hår fra stedet med en hårklipper og steriliser området ved hjælp af 4% chlorhexidin til i alt 3 runder sterilisering. Påfør en steril kirurgisk drapering omkring det umiddelbare kirurgiske sted.
BEMÆRK: Kirurger skal vaske hænder og arme med en alkohol- eller jodbaseret vask og iføre sig sterile kjoler og handsker. - Brug et blad nr. 10 til at lave et snit fra manubriet ned til xiphoid, der måler 20-30 cm afhængigt af grisens størrelse.
- Brug elektrocautery til at opdele pectoralis major ned fra brystbenet til xiphoid, og vær forsigtig med at gøre dette langs brystbenets midterlinje. Når du er nede til brystbenet, scorer midterlinjen og begynder sternotomien fra xiphoid ved at dele den med tunge sakse.
- Udvid sternotomi cephalad med tunge saks. Efter hvert snit skal du straks adskille hjertet fra brystbenet ved hjælp af fingerfejninger. På denne måde skal du fuldføre sternotomien gennem manubriumet.
- Efter afslutning af sternotomi opnås hæmostase ved at anvende elektrocautery på de afskårne knoglekanter.
- Placer en sternal retraktor og åbn den for at optimere eksponeringen af det kirurgiske felt. Identificer og fjern thymus med elektrocautery. Indtast perikardiet i længderetningen fra membranen til aorta. Opret en perikardial vugge ved hjælp af 5-6 størrelse: 2-0, silke suturer.
5. Hjertestop og kardektomi af donorsvinet
- Del vævet fuldt ud mellem aorta og lungearterien (PA) og visualiser placeringen af aortabuen og brachiocephalic stammen for at lette korrekt placering af aortakrydsklemmen.
BEMÆRK: Den stigende aorta er meget kortere i grisen versus mennesket. - Omkredsfri den overlegne vena cava (SVC) ved hjælp af saks og stump dissektion. Pass to, størrelse: 0, silkebånd omkring SVC.
- Omkredsfri den ringere vena cava (IVC) ved hjælp af saks og stump dissektion. På samme måde skal du passere to 0 silkebånd rundt om IVC.
- Påfør en U-søm, størrelse: 4-0, polypropylen sutur til den stigende aorta.
- Påfør en pungstreng, størrelse: 4-0, polypropylen sutur til højre atrium (RA).
- Administrer en bolus af heparin IV ved hjælp af en startdosis på 300 U/kg.
- Indsæt en pædiatrisk 4-Fr aorta rodkanyle, sikret af den tidligere placerede U-søm. Luft kanylen ud, og fastgør den på plads med en Rummel-tourniquet.
- Tilslut aortarodskanylen til kardioplegirøret, efter at slangen er skyllet med del Nido kardioplegi. Skyl med den nødvendige mængde for at fjerne eventuelle luftbobler i slangen.
BEMÆRK: Kommunikation med perfusionsteamet er afgørende på dette tidspunkt for korrekt udførelse af hjertestoppet.- Sørg for, at perfusionisten eller -erne har installeret engangsbrugene til cellesparer på en steril måde, grundet udstyret som anbefalet af producenten (se punkt 6) og er klar til at behandle det opsamlede blod.
- Bekræft, at cellesparerkardiomien (plastbeholder fastgjort til cellespareranordningen, hvor blod opbevares efter vask) er klar med 10.000 U heparin, og at kardiotomien er forbundet med sugning, ikke at overstige -150 mmHg tryk.
BEMÆRK: Dette er for at undgå hæmolyse af røde blodlegemer.
- Opret en højre atriotomi inden for den tidligere placerede pungstreng, indsæt en 24 Fr venøs kanyle i RA, og fastgør med en Rummel tourniquet.
- Tilslut den venøse kanyle til en steril sugeledning forbundet med cellesparerkardiomien og saml ca. 1-1,3 liter blod. Påfør derefter aortakrydsklemmen, og sørg omhyggeligt for, at klemmen helt okkluderer den stigende aorta. Administrer 500 ml Del Nido kardioplegi i roden ved et tryk på 100-150 mmHg ved hjælp af en trykpose.
BEMÆRK: Hjertet vil blanchere og arrestere. - Placer steril isslush på hjertet.
- Når kardioplegien er leveret, skal du fjerne aortarodskanylen og RA venøs kanyle og binde pungstrengsuturerne ned.
- Opdel følgende: IVC, SVC bare proximal til azygos venen, aorta på niveauet af buen lige distal til innomominate arterien, den vigtigste PA ved bifurcation og venstre azygogos vene, når den kommer ind i koronar sinus.
BEMÆRK: Grise har en venstre azygot vene, der dræner ind i koronar sinus. - Identificer lungevenerne og ligat dem med størrelse: 2-0, silkebånd eller store klip. Lad en lungevene være åben til indsættelse af LV-udluftningen.
- Fjern hjertet fra brystet og læg det i en beholder med steril isslush.
- Flyt hjertet til bagbordet for at forberede transplantatet til placering på ex vivo perfusionsanordningen.
6. Vask af donorblod og grunding af ex vivo perfusionsanordningen
BEMÆRK: Dette trin er nødvendigt for at fjerne eventuelle komponenter fra donorserumet, der kan neutralisere leveringen af det terapeutiske, når det introduceres til perfusatet. Udfør dette trin under eksplotationen af donorhjertet for at minimere den allotransplanmiske iskæmiske tid.
- Gennemfør en cellesparerprime- og vaskecyklus.
- Installer engangskomponenterne i enheden i henhold til producentens anvisninger.
- Prime cellesparerenheden ved at stikke Plasmalyte A og vælge prime-funktionen på enheden. Tilsæt lige så meget Plasmalyte A som mængden af blod indsamlet fra donorgrisen på en 1:1 måde.
BEMÆRK: Når enheden er færdig med grundcyklussen, er den klar til tilsætning af blod. Se pkt. 5.9-5.11 for, hvordan blodet fra donorgrisen tilsættes. - Når blodet er i enheden, skal du vælge vaskecyklussen på cellesparerenheden.
BEMÆRK: Under denne proces centrifugeres blodet, mens plasmalytten A introduceres for at vaske blodet. Dette trin koncentrerer og vasker blodet.
- Overfør det vaskede blod til en blodopsamlingspose til overførsel til ex vivo-enheden .
- Tilsæt det vaskede blod til ex vivo-perfusionsanordningen i henhold til producentens retningslinjer.
- Der fremstilles en epinephrinopløsning ved at injicere 0,25 mg adrenalin og 30 IE insulin i 500 ml 5% dextrose i vand under grunding af ex vivo-maskinen . Spike opløsningen og de-air linjen, der leverer løsningen til ex vivo-enheden .
- Tilsæt 10.000 U heparin til ex vivo-perfusionsenheden.
- Tilsæt 5% albumin for at rekonstituere blodet.
BEMÆRK: Volumenet af 5% albumin tilsat til enheden svarer til mængden af plasma, der fjernes af cellesparerenheden. Dette gøres for at hjælpe med at opnå et fysiologisk onkotisk tryk og hæmatokrit. - Tænd pumpen for at strømme ved 1-1,5 l / min for at prime kredsløbet med det klare primtal, lægemidler og blod, der administreres i reservoiret. Når du har tændt for pumpestrømmen og cirkuleret primtallet gennem perfusionsmodulet, skal du sikre dig, at kredsløbets linjer er luftfrie.
BEMÆRK: Det endelige vedligeholdelsesopløsningsvolumen er 1000 ml ud over mængden af vasket blod. - Få en baseline perfusat POC kemi og lactat ved hjælp af POC test enhed. Genopfyld elektrolytter efter behov.
- Tilsæt nok dextrose til at opretholde et minimum glukoseniveau på 100 mg / dL.
- Tilsæt nok natriumbicarbonat til at opretholde et minimum pH-mål på 7,4.
BEMÆRK: Det er vigtigt, at tilsat natriumbicarbonat ikke kan fjernes fra perfusatet. Overskydende natriumniveauer vil bidrage til, at hjertet bliver edematøst og skal undgås. Der skal udvises forsigtighed ved behandling af basisunderskuddet, da hjertet vil begynde at korrigere basisunderskuddet ved genoplivning. - Tilsæt nok calciumgluconat til at opretholde et minimum ioniseret calciumniveau på 0,8 mmol / L.
- Indstil temperaturen til 37 °C.
- Indstil gasstrømningshastigheden til 150 ml / min , og juster efter behov for at opnå et fysiologisk pCO2-niveau .
- Indstil målet for det gennemsnitlige arterielle tryk (MAP) til 60-70 mmHg.
- Skru ned for pumpeflowet til 0,6 l/min.
7. Backtable forberedelse af donorhjertet og genoplivning af hjertet
- Oversew the SVC. Placer fire pantsatte, størrelse: 4-0, polypropylen suturer på en simpel vandret madras måde omkring indersiden af den distale aorta, 5 mm under den afskårne kant og binde dem ned.
- Mens du holder 4, størrelse: 4-0, pantsatte aorta suturer op, indsæt aortastikket i aorta og bind et navlebånd rundt om aorta for at sikre stikket.
- Placer en størrelse: 4-0, polypropylenpungstreng omkring den distale snitkant af hovedPA'en. Indsæt PA-kanylen, og bind enderne af pungstrengen for at fastgøre kanylen.
- Tag det forberedte transplantat fra bagbordet til ex vivo-perfusionsenheden , og tilslut aortastikket til enheden. Sørg for at aflufte aorta/aortastikket, før du fastgør hjertet til enheden.
- Start perfusionsuret, hold pumpeflowet omkring 0,6 l/min, og sænk temperaturindstillingspunktet til 34 °C.
- Start epinephrin og vedligeholdelsesdråber i henhold til producentens anbefalinger.
- Tilslut PA-kanylen til PA-stikket på enheden, og fastgør den med et slips.
- Placer venstre ventrikel (LV) udluftningsafløb gennem den ubundne lungevene ind i venstre atrium og over mitralventilen i LV. Fastgør udluftningen på plads med en enkelt søm for at forankre den korrekt.
- Placer to hjerte pacing ledninger på LV fri væg.
- Kontroller laktat, ABG, CBC og BMP hver time. Administrer kalium, 50% dextrose og calcium efter behov for at opretholde normale fysiologiske niveauer.
BEMÆRK: Hyppigere laktatprøvetagning kan være hensigtsmæssig under tidlig stabilisering for at etablere tilstrækkelig perfusion baseret på laktat. - Hvis tempo er påkrævet, skal du indstille ventrikulært tempo til 80 slag i minuttet ved 10 mA (atrie pacing bruges typisk ikke).
- Hvis defibrillering er påkrævet, skal du starte ved 10 J, efter at temperaturen på enheden har nået 34 ° C. Må ikke overstige 50 J.
BEMÆRK: Målets samlede gennemsnitlige flow er 600 ml / min, og den gennemsnitlige koronarstrøm er 400 ml / min.
8. Administration af den terapeutiske
- Tegn terapien op i en sprøjte på en steril måde.
- Luft kardioplegiporten ud ved hjælp af en steril 3 ml sprøjte til at trække blod gennem porten. Administrer den terapeutiske i kardioplegiporten (eller tilsvarende), således at den terapeutiske indføres direkte i aortaroten.
- Udskynd porten med mængden af opsamlet blod, der trækkes i trin 8.2, når porten afluftes; pas på ikke at skylle luft med det.
BEMÆRK: Dette er for at sikre, at terapien administreres i hjertets aortarod.
BEMÆRK: Dette afsnit er tidligere beskrevet detaljeret i Bishawi et al. at indføre virale vektorer til luciferaseekspression15. - Perfuse transplantatet på enheden i 2 timer efter introduktion af terapien.
9. Forberedelse af recipienten og laparotomi med vaskulær eksponering
- Når hjertealograften er fastgjort til enheden, og den terapeutiske indføres i kredsløbet, skal induktionen af anæstesi og præoperativ forberedelse påbegyndes som beskrevet i afsnit 2 for modtagergrisen.
- Initier infusion af immunsuppressionsmedicin: cyclosporin 50 mg/kg i alt som en langsom drypinfusion under hele proceduren og methylprednisolon 1 g IV bolus.
- Administrer antibiotika: enrofloxacin IM (5 mg/kg) og cefazolin 1 g IV bolus.
- Indsæt et Foley kateter i blæren.
BEMÆRK: Dekomprimering af blæren hjælper med at opnå en optimal eksponering af infrarenal aorta og IVC. - Marker abdominal midterlinjen fra midten af maven til pubis ved hjælp af en steril kirurgisk markør. Barber ethvert hår fra stedet med en hårklipper og steriliser området ved hjælp af 4% chlorhexidin til i alt 3 runder sterilisering. Påfør en steril kirurgisk drapering omkring det umiddelbare kirurgiske sted.
BEMÆRK: Kirurger skal vaske hænder og arme med en alkohol- eller jodbaseret vask og iføre sig sterile kjoler og handsker. - Brug en 10-klinge til at skære huden (20-30 cm snit) og skift til elektrocautery for at dissekere ned til fasciaen.
- Brug to Kocher-klemmer til at løfte fascia og peritoneum og lav forsigtigt et lille snit (1 cm) ind i peritonealhulen ved hjælp af Metzenbaum saks.
- Forlæng peritonealåbningen i hele snittets længde ved hjælp af elektrokauteri, og læg en finger nedenunder for at beskytte de underliggende indvolde. Placer en Balfour-retraktor for at optimere eksponeringen. Træk tyndtarmen krynedeligt og med våde håndklæder.
- Åbn det retroperitoneale rum, der er ringere end nyrerne, med omhu rettet mod at identificere urinlederne og undgå skade.
- Bær dissektionen ned til abdominal aorta og IVC. Ligat lymfatikken med mellemstore og store klip.
- Disseker fartøjerne omkreds og udsæt et stort nok segment til at passe en stor Satinsky-klemme omkring hvert fartøj. Pas på at undgå forstyrrelse af lændearteriegrene, der kommer ud af den bageste del af aorta. Anbring to beholdersløjfer omkring aorta og IVC i de proksimale og distale ender af eksponeringen.
10. Endelig anholdelse og fjernelse af hjertet fra ex vivo perfusionsanordningen
- I slutningen af 2 timers ex vivo-perfusion tilsluttes varmekølermaskinen til ex vivo-enheden . Indstil varmelegemets køligere temperatur til 34 °C.
- På en steril og luftfri måde skal du tilslutte den udluftede kardioplegi-leveringslinje til ex vivo-enheden ved aortaadgangsporten.
- Slå temperaturindstillingspunktet på ex vivo-enheden fra.
- Reducer varmekølertemperaturen til 24 °C , og reducer pumpeflowet for at opretholde MAP mellem 60 og 70 mmHg (typisk en ændring i pumpeflowet fra 1 L/min ned til 0,9 L/min).
- Når temperaturaflæsningen på ex vivo-perfusionsanordningen når 24-26 °C, reduceres varmekølertemperaturen yderligere til 14 °C , og pumpeflowet reduceres yderligere med 100 ml/min.
- Når temperaturen når 14-16 °C, skal du fjerne PA-kanylen fra PA-porten, starte leveringen af antegrade del Nido (500 ml), lukke AO-ledningsventilen, stoppe pumpen og hurtigt klemme AO-udluftningsledningen.
BEMÆRK: Kardioplegi leveringstryk skal titreres for at opretholde et gennemsnitligt leveringstryk på 45-65 mmHg som vist på ex vivo-enhedens skærm. - Fjern hjertet fra ex vivo-perfusionsenheden ved at frakoble PA-kanylen og aortastikket og skære pacingtrådene.
- Læg hjertet i en spand fyldt med steril isslush.
- På bagbordet oversås lungevenen/venstre atriotomi, hvor LV-udluftningen var indsat. Trim (1 eller 2 mm) af det distale aspekt af aorta og PA, hvor fastgørelse til kanylerne kan have knust vævet.
BEMÆRK: Hjertet er nu klar til intraabdominal, heterotopisk implantation.
11. Heterotopisk implantation af hjertetransplantatet
- Før du placerer Satinsky-klemmerne, skal du administrere 300 U / kg IV-heparin til modtagergrisen.
- Placer en Satinsky-klemme på IVC'en, og opret en langsgående venotomi, der måler ~ 1,5 cm ved hjælp af en 11-klinge og Potts saks.
- Anastomose transplantat PA til modtagerens infrarøde IVC på en ende-til-side måde ved hjælp af en løbende, størrelse: 4-0, polypropylen sutur. Udfør den indre del af anastomosen først og forstærk efter behov med afbrudte suturer, før du afslutter den ydre del af anastomosen.
BEMÆRK: PA til IVC anastomose udføres først, og aorta-til-aorta anastomose udføres sidst for at reducere varigheden af aorta okklusion. - Placer en Satinsky-klemme på aorta og opret en langsgående aortotomi, der måler ~ 1,5 cm ved hjælp af en 11-klinge og Potts saks.
BEMÆRK: Få en ABG inden klemplacering. Kontroller det igen umiddelbart efter frigivelse af klemmen og igen 15-30 minutter senere for at vurdere eventuelle ændringer i hyperkaliæmi, hyperlaktæmi eller acidæmi, der tyder på iskæmisk skade hos modtageren. - Anastomose transplantatet aorta til modtagerens infra-renale aorta på en ende-til-side-måde ved hjælp af en løbende, størrelse: 4-0, polypropylen sutur. Udfør den indre del af anastomosen først og forstærk efter behov med afbrudte suturer, før du afslutter den ydre del af anastomosen.
- Fjern Satinsky-klemmerne for at genoprette hjertet; Fjern først IVC-klemmen efterfulgt af aortaklemmen.
- Placer en 18 G angiocath i LV-toppen af transplantatet for at aflufte. Når du er færdig, skal du fjerne angiocath og lukke stedet med en pantsat sutur.
- Kontroller omhyggeligt anastomoserne for enhver blødning.
- Placer forsigtigt hjertet i det rigtige retroperitoneale rum, således at der ikke er nogen spænding på anastomoserne og ingen kinking af karrene. Udskift tyndtarmen.
12. Lukning af laparotomi
- Luk fasciaen med looped, størrelse: 0, Maxon sutur på en løbende måde, der starter fra begge ender af snittet og binder i midten. Pas på at undgå skade på tarmen.
- Luk det dybe dermale lag med størrelse: 2-0, Vicryl på løbemåde og huden med størrelse: 4-0, Monocryl på løbemåde.
- Rengør hudsnittet og påfør hudlim.
13. Postkirurgisk behandling og eutanasi
- Efter afslutningen af operationen skal du slukke for isofluranstrømmen og overvåge grisen for tilbagevenden af muskeltonus og neuromuskulære reflekser (hornhinderefleks, tilbagetrækning til smertefulde stimuli, indtagelse).
- Når du har bekræftet genoprettelsen af disse funktioner, skal du slukke for mekanisk ventilation og observere for spontan vejrtrækning. Hvis der er spontan vejrtrækning, skal du fjerne endotrachealrøret; Hvis der ikke er det, skal du tilslutte endotrachealrøret til mekanisk ventilation.
- Overfør grisen fra operationsbordet til et isoleret kabinet, hvor dets vitale tegn (rektal temperatur, blodtryk, puls) kan overvåges nøje. Brug en varmelampe til at varme grisen efter behov. Giv en IV-væskebolus på 250 ml lactated ringeropløsning i indstillingen af hypotension (systolisk blodtryk < 100 mmHg). Fortsæt med at overvåge grisen, indtil den kan opretholde sternal recumbency og vitale tegn er fuldt normaliseret.
BEMÆRK: Dyret efterlades ikke uden opsyn, før det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed. Derudover returneres dyret ikke til selskabet med andre dyr, før det er fuldt genoprettet. - Til smertebehandling administreres en engangsdosis buprenorphin (vedvarende frigivelse) subkutan injektion 0,12 mg/kg for 72 timers analgesi.
- I slutningen af forsøgsperioden aflives grisen til udredning af det indfødte (thorax) hjerte og allograft (abdominal) hjerte.
- Forbered grisen som beskrevet i afsnit 2 og 3 til proceduren. Forbered to poser del Nido og to kardioplegilinjer til at arrestere hvert hjerte.
- Udsæt thoraxhjertet som beskrevet i afsnit 4. Når du er færdig, skal du fortsætte med at udføre en laparotomi som beskrevet i afsnit 9.
- Når aorto-aorta- og PA-IVC-anastomoserne er eksponeret, skal du placere en Satinsky-klemme på modtagerens aorta og en anden på modtagerens IVC for at isolere allograften fra den systemiske cirkulation.
- Indsæt en pædiatrisk 4-Fr aorta rodkanyle i allograftens aortarod og tilslut en kardioplegilinje til kateteret. Administrer 500 ml del Nido kardioplegi i roden ved et tryk på 100-150 mmHg ved hjælp af en trykpose. Når infusionen er startet, skal du bruge Metzenbaum saks til at lave et 2 cm snit på niveauet af PA-IVC anastomose for at udlufte allograften.
- Når allograften er arresteret, skal du fortsætte med at eksplorere allograften ved at bruge Metzenbaum-saks til punktafgift på niveauet for aorto-aorta-anastomosen og resten af PA-IVC-anastomosen. Fjern ikke nogen af Satinsky-klemmerne.
- Fortsæt med fjernelsen af thoraxhjertet som beskrevet i afsnit 5.
BEMÆRK: Den eneste væsentlige forskel er, at lungevenerne ikke behøver at blive omhyggeligt ligeret og i stedet kan dissekeres groft ved hjælp af Metzenbaum saks, når kardioktomi udføres.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne gruppe har med succes overlevet 9 grise mellem 5 og 35 dage efter protokollen som præsenteret her, afhængigt af undersøgelsesdesignet. Ud af 10 grise, der har gennemgået denne protokol, døde kun 1 for tidligt af kirurgiske komplikationer, hvilket gav en overlevelsesrate på 90%. Demonstreret i figur 2 er et diagram over konfigurationen af et heterotopisk hjerte transplanteret i den intraabdominale position i et svin. Når du bestemmer stedet for anastomose af allograften, skal du vælge et sted, der minimerer enhver spænding eller kinking på anastomosen. Dette sikrer, at anastomoserne heler ordentligt, og at allograften modtager optimal perfusion og dræning af blod.
Et repræsentativt billede af en hjertealkograft, der perfunderes på en normoterm ex vivo-perfusionsanordning , er vist i figur 3. Figur 4 skitserer repræsentative perfusionsparametre erhvervet under et vellykket eksperiment (kredsløbsstrømningshastighed, aortatryk, puls, temperatur, blandet venøs iltmætning og hæmatokrit). Manglende evne til at opnå de parameterværdier, der er demonstreret her, kan føre til kompromitteret allograftfunktion efter transplantation. Figur 5 viser et billede af et intraabdominalt heterotopisk hjerte in situ 35 dage efter vellykket transplantation. Repræsentative resultater af effektiviteten af at anvende den protokol, der præsenteres her til terapeutisk levering, blev tidligere demonstreret af denne gruppe15. Hjerteallotransplanterne (n = 3) blev perfunderet med perfusat behandlet med en adenoviral vektor, der bærer transgenet til luciferase. Genekspression viste sig at være global og robust inden for allotransplantogene 5 dage efter behandlingen og transplantationen. Figur 6 viser et atlas over luciferaseproteinaktivitet målt og præsenteret som gennemsnitlig foldændring i aktivitet fra hver region af den udplantede hjertealliance sammenlignet med modtagernes thoraxhjerte.
Figur 1: Protokolskema for terapeutisk levering til en hel hjertealkograft ved hjælp af normoterm ex vivo sangvinsk perfusion. (A) Hjertet og blodet udtages fra donorsvinet. (B) Blodet vaskes ved hjælp af en cellespareranordning til fjernelse af eventuelle terapeutiske neutraliserende komponenter fra donorserumet. (C) Hjertealograften monteres på den normoterme ex vivo perfusionsanordning og perfunderes i 2 timer. (D) Kort efter at allograften er monteret, tilsættes den terapeutiske af interesse til perfusatet. (E) Efter den tildelte ex vivo-perfusionsperiode transplanteres allograften i recipientgrisen i den intraabdominale, heterotopiske position. Dette tal er ændret fra15. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Porcin heterotopisk hjertemodel i intraabdominal position. Diagram over den heterotopiske hjertemodel, hvor allograften transplanteres i den intraabdominale position, mens modtagerens oprindelige hjerte forbliver på sin naturlige placering. Allograftens lungearterie er anastomoseret til den infra-renale ringere vena cava, mens allograftens aorta er anastomoseret til modtagerens infra-renale aorta. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Hjerte allograft på ex vivo perfusionsanordning. Hjertealograften monteret på en normoterm, ex vivo perfusionsanordning, hvor den perfunderes med terapeutisk infunderet perfusat i 2 timer før implantation i modtageren. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative ex vivo perfusionsparametre. (A) Kredsløbsstrømningshastigheder målt fra lungearterien (blå), aorta (grøn) og kranspulsårerne (rød). (B) Repræsentative aortatrykmålinger: middeltryk (blå), systolisk tryk (rød), diastolisk tryk (grøn). (C) Hjertefrekvens af en hjerteallotransplantat under ex vivo perfusion. (D) Registreret temperatur af hjerte allograft under ex vivo perfusion. (E) påviser værdierne afSvO2 målt ud fra perfusatet i perfusionsperioden. (F) Hæmatokritværdier målt ud fra perfusatet i perfusionsperioden. Forkortelser: hct = hæmatokrit; SvO2 = blandet venøs iltmætning. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Hjertealliance transplanteret hos modtageren. En hjerte allograft på postoperativ dag 35 behandlet med terapeutisk på tidspunktet for implantation. Donoren blev udvalgt til at være et perfekt SLA-match med modtageren. Forkortelse: SLA = Svin leukocytantigen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Luciferaseaktivitet efter transduktion af hjerteallotransplantater. Præsenteret er resultaterne af tre hjerte allotransplantater, der blev transduceret med adenovirale vektorer, der bærer et luciferasetransgen. Demonstreret er den gennemsnitlige foldændring i luciferaseproteinaktivitet i hvert område af hjerteallotransplant. Dette tal er blevet ændret fra Bishawi et al. 15. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Levering af terapi under ex vivo perfusion i hjertetransplantation tilbyder en strategi til at ændre allograften og potentielt forbedre transplantationsresultaterne. Protokollen, der præsenteres her, inkorporerer den avancerede normoterme ex vivo sanguinous perfusionsopbevaring og giver lovende potentiale til at teste isoleret levering af celle-, gen- eller immunterapier til allograft 11,12,13. Til dato har hjerteleveringsteknikker til disse formodede terapier til hjerte-kar-sygdomme og hjertesvigt i slutstadiet været afhængige af systemisk administration, intracoronær perfusion via kateterisering og direkte intramyokardiale injektioner, som alle har opnået dårlige resultater med hensyn til myokardieafgivelse 5,16. Vi havde tidligere demonstreret robust og global ekspression af et reportergen til hele hjerteallotransplantater, når en viral vektor blev administreret i perfusatet under ex vivo perfusion før transplantation15. Dette er især vigtigt i forbindelse med hjertetransplantation, hvor det globale udtryk og effekten af den terapeutiske bør nå alle områder af allograften for at opnå den ønskede "kardiobeskyttelse" af hele allograften. Denne protokol opnår dette på en måde, der ikke tidligere er opnået ved hjælp af traditionelt beskrevne administrationsveje til terapi.
Der er flere kritiske trin præsenteret i denne protokol for at fremhæve. (1) Der skal træffes alle forholdsregler for at minimere blodtab under udtagning af hjertet fra donoren. Mindst 1 liter blod skal opnås fra donoren til perfusionsanordningen for at opnå tilstrækkelige strømningshastigheder. (2) Ved terapeutisk levering ved hjælp af normoterm ex vivo sanguinous perfusion er det nødvendigt at vaske donorblodet, før det tilsættes til perfusatet for at fjerne eventuelle neutraliserende komponenter i donorserumet, der kan påvirke leveringen af det terapeutiske til hjertet negativt. (3) Minimer dissektion af hjertet i donoren indtil efter kardioplegisk anholdelse for at undgå dødelige arytmier. (4) Når terapien indføres i perfusionsanordningen, er det vigtigt at indføre den gennem porten tættest på aortaroden og altid skylle porten for at sikre fuldstændig levering af suspensionen. Dette er for at minimere ethvert potentielt tab af det terapeutiske til oxygenatoren eller slangen i kredsløbet og sikre, at transplantatet modtager så høj en terapeutisk koncentration som muligt. (5) Endelig er det ved valg af sted for transplantatimplantation afgørende, at placeringen minimerer spændingspotentialet på anastomosen, og at der ikke er nogen kinking af blodkarrene / anastomoserne.
Det anbefales også, at svinene er svineleukocytter (SLA)-typede (dvs. svinehoved histokompatibilitetskompleks, MHC) for på forhånd at vælge den passende grad af matchning/mismatching på tværs af SLA-haplotyper, der omfatter celleoverfladeklasse I (SLA-1, SLA-2 og SLA-3) og/eller klasse II-antigener (DR og DQ) baseret på investigatorens behov (SLA-typning udført af SH som tidligere beskrevet med mindre ændringer af typningsprimerpanelerne)17 18. For eksempel minimerer sikring af, at svin matcher på tværs af alle SLA-antigener, risikoen for allograftafstødning, mens brug af svin med mismatch på tværs af alle SLA-antigener maksimerer forekomsten af allograftafstødning.
En begrænsning af denne model er, at mens den giver mulighed for undersøgelse af de immunologiske virkninger på hjertetransplantatet, tillader den ikke en fuldstændig vurdering af transplantatets evne til at understøtte det kardiovaskulære system efter en intervention. For at opnå det skal transplantatet implanteres ortopisk. Ortopisk transplantation i store dyremodeller har imidlertid højere tilknyttet dødelighed og kræver kardiopulmonal bypass3. En anden begrænsning af denne model er begrænset adgang til en ex vivo perfusionsenhed til at udføre effektiv genlevering til transplantatet. Efterhånden som disse enheder bliver mere tilgængelige inden for organtransplantation, forventes adgangen at blive bedre. Desuden kan ikke-kommercielt udstyr være en mulighed til forsøgsformål.
Hjertetransplantation tilbyder en unik ramme, hvor terapi kan introduceres til allograften via ex vivo perfusion inden implantation i modtageren. Anvendelsen af en ex vivo-perfusionsanordning gør det muligt at overføre transplantater fra donor til recipient i perioder, der er meget længere end det, der er sikkert ved hjælp af traditionel kold statisk opbevaring6. Denne forlængede perfusionsperiode muliggør effektiv isoleret levering af terapi. Denne model fungerer som et translationelt trin mellem præklinisk dyreforsøg af terapi og transformative kliniske terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Paul Lezberg er ansat hos TransMedics, Inc. Carmelo Milano modtog en økonomisk gave fra TransMedics, Inc. til finansiering af heterotopiske hjertetransplantationsoperationer. Michelle Mendiola Pla støttes af T32HL007101. De øvrige forfattere har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Duke Large Animal Surgical Core og Duke Perfusion Services for deres hjælp under disse procedurer. Vi vil også gerne takke Paul Lezberg og TransMedics, Inc. for støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0 Looped Maxon suture | Covidien | GMM-341L | Used to close fascia of the laparotomy incision |
| 0 Silk ties | Medtronic, Inc | S346 | |
| 18 G Angiocath | BD | 381144 | Used to de-air the left ventricle of the donor heart after implantation |
| 20 Fr LV vent | Medtronic, Inc | 12002 | |
| 2-0 Silk sutures | Ethicon, Inc. | SA11G | |
| 2-0 Silk ties | Ethicon, Inc. | SA65H | |
| 2-0 Vicryl suture | Ethicon, Inc. | J259H | |
| 24 Fr venous cannula | Medtronic, Inc | 68124 | |
| 3-0 Prolene sutures | Ethicon, Inc. | 8522 | |
| 4-0 Monocryl suture | Ethicon, Inc. | Y469G | |
| 4-0 Prolene sutures | Ethicon, Inc. | 8521 | |
| Animal hair cutting clipper | Wahl | 8786-452 | |
| Aortic clamp | V. Mueller | CH6201 | |
| Army Navy retractor | V. Mueller | SU3660 | |
| ATF 40, Cell saver disposable set | Fresenius Kabi | 9108494 | Cell saver device insert |
| Balfour retractor | V. Mueller | SU3042 | Used as an abdominal wall retractor |
| C.A.T.S cell saver | Fresenius Kabi | ES0019 | Cell saver device used to wash donor blood |
| Cardiac defibrillator | Zoll | M Series | Cardiac defibrillator |
| Castro needle holder | V. Mueller | CH8589 | |
| CG4 iStat cartridges | Abbott | 03P85-25 | POC testing |
| CG8 iStat cartridges | Abbott | 03P88-25 | POC testing |
| DeBakey forceps | V. Mueller | CH5902 | |
| Electrocautery disposable pencil | Covidien | E2450H | |
| Gerald forceps | V. Mueller | NL1451 | |
| Hemotherm 400CE Dual Reservoir Cooler/Heater | Cincinnati Sub-Zero | 86022 | Heater cooler used to regulate perfusion temperature on the ex vivo perfusion device |
| iSTAT 1 | Abbott | 04P75-03 | POC testing device |
| Kocher clamp | V. Mueller | SU2790 | |
| Large clip applier | Sklar | 50-4300 | |
| Large clips | Teleflex | 4200 | |
| Large soft pledgets | Covidien | 8886867901 | |
| Medium clip applier | Sklar | 50-4335 | |
| Medium clips | Teleflex | 2200 | |
| Metzenbaum scissor | V. Mueller | CH2006-001 | |
| No. 10 scalpel blade | Swann-Mortan | 301 | Used for skin incision |
| No. 11 scalpel blade | Kiato Plus | 18111 | Used for vascular incision |
| OCS device with base | TransMedics, Inc. | Ex vivo perfusion device | |
| OCS disposable | TransMedics, Inc. | Ex vivo perfusion device insert with perfusion kits | |
| Pacing cable | Remington Medical | FL-601-97 | |
| Pediatric cardioplegia catheter (4Fr) | Medtronic, Inc | 10218 | Used to deliver cardioplegia to the donor aortic root |
| Pediatric Foley catheter | Teleflex | RSH170003080 | Placed pre-op to decompress the recipient's bladder |
| Potts scissors | V. Mueller | CH13038 | |
| Pressure bag x2 (1,000 mL) | Novaplus | V4010H | Used to deliver cardioplegia at a set pressure |
| Satinsky clamp | V. Mueller | CH7305 | Vascular clamp used for creating anastomoses between donor heart and recipient vessels |
| Scissors | Felco | FELCO 200A-50 | Used to perform sternotomy |
| Small hard pledgets | Covidien | 8886867701 | |
| Sternal retractor | V. Mueller | CH6950-007 | |
| Temporary cardiac pacing wires | Ethicon, Inc. | TPW32 | |
| Temporary dual chamber pacemaker | Medtronic, Inc | 5388 | Cardiac pacing device |
| Tourniquet kit | Medtronic, Inc | 79005 | Rummel tourniquets |
| Umbilical tape | Covidien | 8886861903 | |
| Vessel loops | Covidien | 31145686 |
References
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 143 (8), 254 (2021).
- Stehlik, J., Kobashigawa, J., Hunt, S. A., Reichenspurner, H., Kirklin, J. K. Honoring 50 years of clinical heart transplantation in circulation: in-depth state-of-the-art review. Circulation. 137 (1), 71-87 (2018).
- Kadner, A., Chen, R. H., Adams, D. H. Heterotopic heart transplantation: experimental development and clinical experience. European Journal of Cardiothorac Surgery. 17 (4), 474-481 (2000).
- Hastings, C. L., et al. Drug and cell delivery for cardiac regeneration. Advanced Drug Delivery Reviews. 84, 85-106 (2015).
- Sahoo, S., Kariya, T., Ishikawa, K. Targeted delivery of therapeutic agents to the heart. Nature Reviews. Cardiology. 18 (6), 389-399 (2021).
- Stamp, N. L., et al. Successful heart transplant after ten hours out-of-body time using the TransMedics Organ Care System. Heart, Lung & Circulation. 24 (6), 611-613 (2015).
- Ragalie, W. S., Ardehali, A. Current status of normothermic ex-vivo perfusion of cardiac allografts. Current Opinion in Organ Transplantation. 25 (3), 237-240 (2020).
- Koerner, M. M., et al. Normothermic ex vivo allograft blood perfusion in clinical heart transplantation. Heart Surgery Forum. 17 (3), 141-145 (2014).
- Rosenbaum, D. H., et al. Perfusion preservation versus static preservation for cardiac transplantation: effects on myocardial function and metabolism. Journal of Heart and Lung Transplantation. 27 (1), 93-99 (2008).
- Cullen, P. P., Tsui, S. S., Caplice, N. M., Hinchion, J. A. A state-of-the-art review of the current role of cardioprotective techniques in cardiac transplantation. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 32 (5), 683-694 (2021).
- Rurik, J. G., Aghajanian, H., Epstein, J. A. Immune cells and immunotherapy for cardiac injury and repair. Circulation Research. 128 (11), 1766-1779 (2021).
- Rincon, M. Y., VandenDriessche, T., Chuah, M. K. Gene therapy for cardiovascular disease: advances in vector development, targeting, and delivery for clinical translation. Cardiovascular Research. 108 (1), 4-20 (2015).
- Kieserman, J. M., Myers, V. D., Dubey, P., Cheung, J. Y., Feldman, A. M. Current landscape of heart failure gene therapy. Journal of the American Heart Association. 8 (10), 012239 (2019).
- Perin, E. C. Stem cell and gene therapy for cardiovascular disease. Perin, E. C., Miller, L. W., Taylor, D. A., Wilkerson, J. T. , Academic Press. 279-287 (2016).
- Bishawi, M., et al. A normothermic ex vivo organ perfusion delivery method for cardiac transplantation gene therapy. Scientific Reports. 9 (1), 8029 (2019).
- Hulot, J. S., Ishikawa, K., Hajjar, R. J. Gene therapy for the treatment of heart failure: promise postponed. European Heart Journal. 37 (21), 1651-1658 (2016).
- Ho, C. S., et al. Molecular characterization of swine leucocyte antigen class I genes in outbred pig populations. Animal Genetics. 40 (4), 468-478 (2009).
- Ho, C. S., et al. Molecular characterization of swine leucocyte antigen class II genes in outbred pig populations. Animal Genetics. 41 (4), 428-432 (2010).
