Protocole de transplantation cardiaque hétérotopique porcine pour l’administration de produits thérapeutiques à une allogreffe cardiaque

Summary

Nous présentons un protocole pour l’utilisation d’un système de perfusion sanguin ex vivo normotherme pour l’administration de produits thérapeutiques à une allogreffe cardiaque entière dans un modèle de transplantation cardiaque hétérotopique porcine.

Abstract

La transplantation cardiaque est le traitement de référence pour l’insuffisance cardiaque terminale. Cependant, il reste limité par le nombre de cœurs de donneurs disponibles et les complications telles que le dysfonctionnement primaire du greffon et le rejet du greffon. L’utilisation clinique récente d’un dispositif de perfusion ex vivo dans la transplantation cardiaque introduit une occasion unique de traiter les allogreffes cardiaques avec des interventions thérapeutiques pour améliorer la fonction et éviter les réponses délétères du receveur. L’établissement d’un modèle translationnel de gros animaux pour l’administration thérapeutique à l’ensemble de l’allogreffe est essentiel pour tester de nouvelles approches thérapeutiques en transplantation cardiaque. Le modèle de transplantation cardiaque hétérotopique porcine en position intraabdominale constitue un excellent modèle pour évaluer les effets de nouvelles interventions et l’immunopathologie du rejet du greffon. Ce modèle offre en outre une survie à long terme pour le porc, étant donné que le greffon n’est pas nécessaire pour maintenir la circulation du receveur. L’objectif de ce protocole est de fournir une approche reproductible et robuste pour obtenir l’administration ex vivo d’un traitement à l’ensemble de l’allogreffe cardiaque avant la transplantation et de fournir des détails techniques pour effectuer une greffe hétérotopique de survie du cœur perfusé ex vivo .

Introduction

L’insuffisance cardiaque est une maladie qui touche environ 6 millions d’adultes aux États-Unis et devrait atteindre 8 millions d’adultes d’ici 2030¹. La transplantation cardiaque est le traitement de référence pour l’insuffisance cardiaque en phase terminale. Cependant, il n’est pas sans limites et complications. Il reste limité par le nombre de cœurs de donneurs disponibles, le dysfonctionnement primaire du greffon, le rejet du cœur et les effets secondaires de l’immunosuppression à long terme². Ces limitations sont particulièrement importantes chez les jeunes receveurs qui peuvent subir un échec de l’allogreffe et nécessiter une regreffe ultérieure pour atteindre une espérance de vie normale.

Une intervention idéale pour surmonter ces limitations consisterait à traiter des allogreffes cardiaques entières avec des traitements avant l’implantation chez le receveur qui peuvent améliorer la viabilité de l’allogreffe et conférer une « cardioprotection ». De telles interventions seraient administrées à titre prophylactique pour minimiser l’incidence des insultes ischémiques, le rejet de l’allogreffe, la vasculopathie par allogreffe cardiaque et même la réparation des allogreffes marginales. Les études translationnelles pour développer ces types d’interventions nécessitent un modèle de transplantation cardiaque de gros animaux pour permettre la surveillance à long terme du greffon cardiaque. Le modèle de transplantation cardiaque hétérotopique porcine en position intraabdominale s’est avéré idéal à cette fin. La transplantation cardiaque dans cette position permet de tester les effets de nouvelles thérapies et d’évaluer l’immunopathologie du rejet du greffon. De plus, le modèle hétérotopique est avantageux par rapport au modèle orthotopique en raison d’une meilleure survie globale du receveur, de l’absence de pontage cardiopulmonaire et de l’absence d’exigence du greffon pour maintenir la circulation du receveur³.

L’administration efficace d’interventions thérapeutiques au cœur, telles que des gènes, des cellules ou une immunothérapie, constitue un obstacle important à l’application clinique ^4,5. La technologie introduite par les dispositifs de perfusion ex vivo permet aux greffons d’être perfusés en permanence, en les maintenant dans un état non fonctionnel mais métaboliquement actif 6,7,8,9. Cela offre une occasion unique de traiter un cœur entier avec des thérapies avancées tout en minimisant les effets secondaires potentiels de l’administration systémique 10,11,12,13. Un autre avantage de l’utilisation de dispositifs de perfusion ex vivo pour l’administration thérapeutique est qu’ils permettent l’administration de médicaments à la circulation coronaire sur de longues périodes qui ne sont pas réalisables en utilisant les méthodes traditionnelles de stockage statique à froid. Cela permet une livraison plus globale des traitements au greffon¹⁴. En utilisant le protocole présenté ici, nous avons livré avec succès le gène de la luciole luciférase à un greffon cardiaque porcin entier en utilisant des vecteurs adénoviraux¹⁵. L’objectif de ce protocole est de fournir une approche reproductible et robuste pour obtenir l’administration d’un traitement à l’ensemble de l’allogreffe cardiaque avant la transplantation.

Protocol

REMARQUE: Deux porcs femelles du Yucatan sont sélectionnés, l’un étant désigné comme donneur de greffe cardiaque et l’autre comme receveur. Il est recommandé de recommander les porcs âgés de 6 à 8 mois, pesant environ 30 kg et ayant des groupes sanguins compatibles. La figure 1 présente la vue d’ensemble du protocole. Le logement et les procédures de traitement des porcs sont effectués conformément aux directives du comité de soins et d’utilisation des animaux du Duke University Medical Center.

1. Préparation du dispositif de perfusion ex vivo

1. Préparez le dispositif de perfusion ex vivo et un dispositif d’économie de cellules pour une utilisation conforme aux directives du fabricant.
2. Ayez une boîte de stimulation et un défibrillateur à votre disposition et installez-les.
3. Ayez un appareil de test au point de service (POC) disponible pour vérifier une numération globulaire complète (CBC), un panel métabolique de base (BMP) et un gaz sanguin artériel (ABG).
4. Ajouter les médicaments suivants à la solution d’amorçage de perfusion fournie par le fabricant, s’ils ne sont pas déjà présents dans la solution de perfusion du fabricant : 100 mL d’albumine à 25 %, 10 mL de 200 mg/100 mL de ciprofloxacine, 1 g de céfazoline sodique, deux flacons de 5 mL d’injection de multivitamine, 250 mg de méthylprednisolone, 10 000 UI d’héparine et 50 UI d’insuline.
   1. Effectuer des tests POC de la solution d’amorçage ex vivo du dispositif pour s’assurer que les niveaux d’électrolytes se situent dans la plage physiologique normale. Si ce n’est pas le cas, administrer du gluconate de calcium, du dextrose et/ou du bicarbonate de sodium en conséquence pour compléter tout taux d’électrolyte ou de glucose sous-thérapeutique.
5. Pour ajouter la solution d’amorçage avec les médicaments ajoutés, piquez la solution et désaérez la ligne qui délivre la solution au dispositif de perfusion ex vivo .
   REMARQUE: Passez à la rubrique 6 pour obtenir des instructions sur l’amorçage du dispositif de perfusion ex vivo .

2. Initiation de l’anesthésie et accès IV chez le porc donneur

1. Après avoir jeûné le porc pendant 8-12 h, préméditez-le avec de la kétamine (5-33 mg / kg, intramusculaire) et du midazolam (0,2-0,5 mg / kg, intramusculaire) et administrez de l’isoflurane (1-4%) à l’aide d’un masque facial.
2. Placez le porc en position couchée et intubez-le avec un tube endotrachéal (ETT) (5,5-6,5 mm de diamètre interne) pour protéger les voies respiratoires. Fixez l’ETT en l’attachant au museau du cochon. Positionnez les extrémités à l’aide de lourdes attaches attachées à la table.
3. Appliquez une pommade vétérinaire sur les yeux pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
4. Placez un cathéter intraveineux (IV) (20-22 G) dans une veine de l’oreille.
5. Initier des fluides IV d’entretien (solution de Ringer lactée à 10 mL·( kg·h)^-1).
6. Administrer la buprénorphine intramusculaire (IM) 0,005-0,01 mg / kg pour l’analgésie.

3. Signes vitaux et réglages de la ligne centrale

1. Démarrer la ventilation mécanique à un volume courant de 10 mL· (kg·min) ^-1 et un taux de 10-15 respirations par minute avec isoflurane (1-3%) maintenu tout au long de la procédure de sorte que les réflexes sont absents et que la fréquence cardiaque (>60 bpm, <100 bpm) et la pression artérielle (pression artérielle systolique >90 mmHg, <130 mmHg) restent dans la plage physiologique.
   REMARQUE: L’ajout d’un paralytique est facultatif.
2. Surveillez en permanence la saturation en oxygène et la fréquence cardiaque tout au long de la chirurgie.

4. Sternotomie médiane du porc donneur

1. Palper le sternum du manubrium au xiphoïde. Marquez la ligne médiane à l’aide d’un marqueur chirurgical stérile. Rasez tous les cheveux du site avec une tondeuse à cheveux et stérilisez la zone en utilisant 4% de chlorhexidine pour un total de 3 cycles de stérilisation. Appliquez un drap chirurgical stérile autour du site chirurgical immédiat.
   REMARQUE: Les chirurgiens doivent se laver les mains et les bras avec un lavage à base d’alcool ou d’iode et enfiler des blouses et des gants stériles.
2. Utilisez une lame n ° 10 pour faire une incision du manubrium jusqu’au xiphoïde, mesurant 20 à 30 cm, selon la taille du porc.
3. Utilisez l’électrocautérisation pour diviser le grand pectoral du sternum au xiphoïde, en prenant soin de le faire le long de la ligne médiane du sternum. Une fois descendu au sternum, marquez la ligne médiane et commencez la sternotomie du xiphoïde en la divisant avec de lourds ciseaux.
4. Étendez la céphalée de sternotomie avec de lourds ciseaux. Après chaque coupe, séparez carrément le cœur du sternum à l’aide de balayages des doigts. De cette manière, complétez la sternotomie à travers le manubrium.
5. Après avoir terminé la sternotomie, obtenez une hémostase en appliquant l’électrocautérisation sur les bords osseux coupés.
6. Placez un rétracteur sternal et ouvrez-le pour optimiser l’exposition du champ chirurgical. Identifiez et retirez le thymus par électrocautérisation. Entrez dans le péricarde longitudinalement du diaphragme à l’aorte. Créez un berceau péricardique en utilisant 5-6 tailles: 2-0, sutures en soie.

5. Arrêt cardiaque et cardiectomie du porc donneur

1. Divisez complètement le tissu entre l’aorte et l’artère pulmonaire (AP) et visualisez l’emplacement de l’arc aortique et du tronc brachiocéphale pour faciliter le placement correct de la pince transversale aortique.
   REMARQUE: L’aorte ascendante est beaucoup plus courte chez le porc par rapport à l’homme.
2. Libérez circonférentiellement la veine cave supérieure (SVC) à l’aide de ciseaux et d’une dissection émoussée. Passez deux, taille: 0, cravates en soie autour du SVC.
3. Libérez circonférentiellement la veine cave inférieure (IVC) à l’aide de ciseaux et d’une dissection émoussée. De même, passez deux cravates en soie 0 autour de l’IVC.
4. Appliquez un point en U, taille: 4-0, suture en polypropylène sur l’aorte ascendante.
5. Appliquez un cordon de bourse, taille: 4-0, suture en polypropylène sur l’oreillette droite (RA).
6. Administrer un bolus d’héparine IV en utilisant une dose initiale de 300 U/kg.
7. Insérez une canule de racine aortique 4-Fr pédiatrique, sécurisée par le point en U précédemment placé. Désaérez la canule et fixez-la en place avec un garrot Rummel.
8. Connectez la canule de la racine aortique au tube cardioplégique après que le tube a été rincé avec la cardioplégie del Nido. Rincez avec la quantité nécessaire pour éliminer les bulles d’air dans le tube.
   REMARQUE: La communication avec l’équipe de perfusion est essentielle à ce stade pour exécuter correctement l’arrêt cardiaque.
   1. Assurez-vous que le ou les perfusionnistes ont installé les économiseurs de cellules jetables de manière stérile, amorcé l’appareil comme recommandé par le fabricant (voir rubrique 6) et sont prêts à traiter le sang recueilli.
   2. Confirmez que la cardiotomie de l’économiseur de cellules (récipient en plastique attaché au dispositif d’économiseur de cellules où le sang est stocké après le lavage) est prête avec 10 000 U d’héparine et que la cardiotomie est connectée à l’aspiration, ne dépassant pas -150 mmHg de pression.
      REMARQUE: Ceci est pour éviter l’hémolyse des globules rouges.
9. Créez une atriotomie droite dans le cordon de la bourse précédemment placé, insérez une canule veineuse de 24 Fr dans la PR et fixez-la avec un garrot Rummel.
10. Connectez la canule veineuse à une ligne d’aspiration stérile reliée à la cardiotomie de l’économiseur de cellules et collectez environ 1 à 1,3 L de sang. Ensuite, appliquez la pince transversale aortique, en veillant soigneusement à ce que la pince obstrue complètement l’aorte ascendante. Administrer 500 mL de cardioplégie Del Nido dans la racine à une pression de 100-150 mmHg à l’aide d’un sac sous pression.
    REMARQUE: Le cœur blanchira et arrêtera.
11. Placez de la gadoue de glace stérile sur le cœur.
12. Une fois la cardioplégie délivrée, retirez la canule de la racine aortique et la canule veineuse DE LA ET ATTACHEZ LES SUTURES DU CORDON DE LA BOURSE.
13. Divisez les éléments suivants: l’IVC, le SVC juste proximal à la veine azygos, l’aorte au niveau de l’arche juste distale à l’artère innominate, le PA principal à la bifurcation et la veine azygote gauche lorsqu’elle pénètre dans le sinus coronaire.
    REMARQUE: Les porcs ont une veine azygote gauche qui s’écoule dans le sinus coronaire.
14. Identifiez les veines pulmonaires et ligaturez-les avec la taille: 2-0, des cravates en soie ou des clips de grande taille. Laissez une veine pulmonaire ouverte pour l’insertion de l’évent LV.
15. Retirez le cœur de la poitrine et placez-le dans un récipient avec de la gadoue de glace stérile.
16. Déplacez le cœur vers la table arrière pour préparer le greffon à placer sur le dispositif de perfusion ex vivo .

6. Laver le sang du donneur et amorcer le dispositif de perfusion ex vivo

REMARQUE: Cette étape est nécessaire pour éliminer tous les composants du sérum du donneur qui pourraient neutraliser l’administration du traitement lorsqu’il est introduit dans le perfusat. Effectuez cette étape lors de l’explantation du cœur du donneur pour minimiser le temps ischémique d’allogreffe.

1. Terminez un premier cycle d’économiseur de cellules et de lavage.
   1. Installez les composants jetables dans l’appareil conformément aux instructions du fabricant.
   2. Amorcez le dispositif d’économiseur de cellules en piquant Plasmalyte A et en sélectionnant la fonction principale sur l’appareil. Ajoutez autant de plasmalyte A que le volume de sang prélevé sur le porc donneur de manière 1: 1.
      REMARQUE: Une fois que l’appareil a terminé le cycle d’amorçage, il est prêt pour l’ajout de sang. Voir rubriques 5.9-5.11 pour savoir comment ajouter le sang du porc donneur.
   3. Une fois que le sang est dans l’appareil, sélectionnez le cycle de lavage sur l’économiseur de cellules.
      REMARQUE: Au cours de ce processus, le sang est centrifugé tandis que le Plasmalyte A est introduit pour laver le sang. Cette étape concentre et lave le sang.
2. Transférer le sang lavé dans une poche de prélèvement sanguin pour le transférer dans l’appareil ex vivo .
3. Ajouter le sang lavé au dispositif de perfusion ex vivo conformément aux directives du fabricant.
4. Préparer une solution d’épinéphrine en injectant 0,25 mg d’épinéphrine et 30 UI d’insuline dans 500 mL de dextrose à 5 % dans l’eau lors de l’amorçage de la machine ex vivo . Piquez la solution et désaérez la ligne qui fournit la solution à l’appareil ex vivo .
5. Ajouter 10 000 U d’héparine au dispositif de perfusion ex vivo .
6. Ajouter 5% d’albumine pour reconstituer le sang.
   REMARQUE: Le volume d’albumine de 5% ajouté à l’appareil est égal à la quantité de plasma retirée par le dispositif d’économie de cellules. Ceci est fait pour aider à atteindre une pression oncotique physiologique et un hématocrite.
7. Allumez la pompe pour qu’elle s’écoule à 1-1,5 L / min pour amorcer le circuit avec le nombre premier clair, les médicaments et le sang administrés dans le réservoir. Après avoir mis le débit de la pompe en marche et fait circuler le premier à travers le module de perfusion, assurez-vous que les conduites du circuit sont exemptes d’air.
   REMARQUE: Le volume de la solution d’entretien finale est de 1000 mL en plus du volume de sang lavé.
8. Obtenir une substance chimique et un lactate de perfusat de base à l’aide du dispositif d’essai POC. Reconstituer les électrolytes au besoin.
   1. Ajouter suffisamment de dextrose pour maintenir un taux de glucose minimum de 100 mg / dL.
   2. Ajouter suffisamment de bicarbonate de sodium pour maintenir un objectif de pH minimum de 7,4.
      REMARQUE: Il est important de noter que le bicarbonate de sodium ajouté ne peut pas être éliminé du perfusate. Les niveaux excessifs de sodium contribueront à ce que le cœur devienne œdémateux et doivent être évités. La prudence doit être prise lors du traitement du déficit de base, car le cœur commencera à corriger le déficit de base lors de la réanimation.
   3. Ajouter suffisamment de gluconate de calcium pour maintenir un taux minimum de calcium ionisé de 0,8 mmol/L.
9. Réglez la température à 37 °C.
10. Réglez le débit de gaz à 150 mL/min et ajustez-le au besoin pour atteindre un niveau physiologique de pCO₂ .
11. Réglez la pression artérielle moyenne (MAP) cible à 60-70 mmHg.
12. Baissez le débit de la pompe à 0,6 L/min.

7. Préparation en table arrière du cœur du donneur et réanimation du cœur

1. Oversew le SVC. Placez quatre promis, taille: 4-0, sutures en polypropylène dans un simple matelas horizontal autour de l’intérieur de l’aorte distale, à 5 mm sous le bord coupé et attachez-les.
2. Tout en tenant le 4, taille: 4-0, des sutures aortiques promises, insérez le connecteur aortique dans l’aorte et attachez un ruban ombilical autour de l’aorte pour fixer le connecteur.
3. Placez une taille: 4-0, cordon de la bourse en polypropylène autour du bord de coupe distal du PA principal. Insérez la canule PA et attachez les extrémités du cordon de la bourse pour fixer la canule.
4. Prenez la greffe préparée de la table arrière au dispositif de perfusion ex vivo et connectez le connecteur aortique à l’appareil. Assurez-vous de désaérer le connecteur aorte/aortique avant de fixer le cœur à l’appareil.
5. Démarrez l’horloge de perfusion, maintenez le débit de la pompe autour de 0,6 L/ min et diminuez le point de consigne de température à 34 °C.
6. Commencez l’épinéphrine et les gouttes d’entretien selon les recommandations du fabricant.
7. Connectez la canule PA au connecteur PA de l’appareil et fixez-la avec une attache.
8. Placez le drain d’évent du ventricule gauche (LV) à travers la veine pulmonaire non liée dans l’oreillette gauche et à travers la valve mitrale dans la LV. Fixez l’évent en place avec un seul point pour l’ancrer correctement.
9. Placez deux fils de stimulation cardiaque sur la paroi libre de BT.
10. Vérifiez le lactate, l’ABG, le CBC et le BMP toutes les heures. Administrer du potassium, du dextrose à 50 % et du calcium au besoin pour maintenir des niveaux physiologiques normaux.
    REMARQUE: Un prélèvement plus fréquent de lactate peut être approprié au cours de la stabilisation précoce pour établir une perfusion adéquate à base de lactate.
11. Si une stimulation est requise, réglez le rythme ventriculaire à 80 battements par minute à 10 mA (le rythme auriculaire n’est généralement pas utilisé).
12. Si une défibrillation est nécessaire, commencez à 10 J après que la température de l’appareil a atteint 34 °C. Ne pas dépasser 50 J.
    REMARQUE: Le débit moyen total de l’objectif est de 600 mL / min et le débit coronaire moyen est de 400 mL / min.

8. Administration de la thérapie

1. Mettez le produit thérapeutique dans une seringue de manière stérile.
2. Désaérer le port cardioplégique à l’aide d’une seringue stérile de 3 mL pour prélever le sang à travers le port. Administrer le produit thérapeutique dans le port cardioplégique (ou équivalent) de sorte que le produit thérapeutique soit introduit directement dans la racine aortique.
3. Rincer l’orifice avec le volume de sang prélevé à l’étape 8.2 lors du désaération du port; veillez à ne pas rincer l’air avec elle.
   REMARQUE: Ceci est pour s’assurer que le traitement est administré dans la racine aortique du cœur.
   REMARQUE: Cette section a déjà été décrite en détail dans Bishawi et al. introduire des vecteurs viraux pour l’expression de la luciférase¹⁵.
4. Perfuser le greffon sur l’appareil pendant 2 h après l’introduction du traitement.

9. Préparation du receveur et laparotomie avec exposition vasculaire

1. Une fois que l’allogreffe cardiaque est fixée au dispositif et que le traitement est introduit dans le circuit, commencez l’induction de l’anesthésie et de la préparation préopératoire comme décrit à la rubrique 2 pour le porc receveur.
2. Initier la perfusion des médicaments d’immunosuppression: cyclosporine 50 mg / kg au total en perfusion lente tout au long de la procédure et méthylprednisolone 1 g iv bolus.
3. Administrer des antibiotiques : enrofloxacine IM (5 mg/kg) et céfazoline 1 g de bolus IV.
4. Insérez un cathéter de Foley dans la vessie.
   REMARQUE: La décompression de la vessie aide à obtenir une exposition optimale de l’aorte infrarénale et de la CIV.
5. Marquez la ligne médiane abdominale du milieu de l’abdomen au pubis à l’aide d’un marqueur chirurgical stérile. Rasez tous les cheveux du site avec une tondeuse à cheveux et stérilisez la zone en utilisant 4% de chlorhexidine pour un total de 3 cycles de stérilisation. Appliquez un drap chirurgical stérile autour du site chirurgical immédiat.
   REMARQUE: Les chirurgiens doivent se laver les mains et les bras avec un lavage à base d’alcool ou d’iode et enfiler des blouses et des gants stériles.
6. Utilisez une lame 10 pour inciser la peau (incision de 20 à 30 cm) et passez à l’électrocautérisation pour disséquer le fascia.
7. Utilisez deux pinces Kocher pour soulever le fascia et le péritoine et faites soigneusement une petite incision (1 cm) dans la cavité péritonéale à l’aide de ciseaux Metzenbaum.
8. Étendez l’ouverture péritonéale sur toute la longueur de l’incision à l’aide de l’électrocautérisation, en plaçant un doigt en dessous pour protéger les viscères sous-jacents. Placez un rétracteur Balfour pour optimiser l’exposition. Rétracter l’intestin grêle par voie crânienne et avec des serviettes humides.
9. Ouvrez l’espace rétropéritonéal inférieur aux reins avec un soin orienté vers l’identification des uretères et la prévention des blessures.
10. Portez la dissection jusqu’à l’aorte abdominale et la CIV. Ligaturez les lymphatiques avec des clips moyens et grands.
11. Disséquez les vaisseaux de manière circonférentielle et exposez un segment suffisamment grand pour s’adapter à une grande pince Satinsky autour de chaque vaisseau. Prenez soin d’éviter la perturbation des branches artérielles lombaires, qui se détachent de la partie postérieure de l’aorte. Placez deux boucles de vaisseaux autour de l’aorte et de la CIV aux extrémités proximale et distale de l’exposition.

10. Arrêt final et retrait du cœur du dispositif de perfusion ex vivo

1. À la fin des 2 h de perfusion ex vivo , connectez la machine réchauffante au dispositif ex vivo . Réglez la température du refroidisseur de chauffage à 34 °C.
2. De manière stérile et sans air, connectez la ligne d’administration de cardioplégie désaérée au dispositif ex vivo au port d’accès aortique.
3. Éteignez le point de consigne de température de l’appareil ex vivo.
4. Réduisez la température du réchauffeur à 24 °C et diminuez le débit de la pompe pour maintenir la MAP entre 60 et 70 mmHg (généralement un changement du débit de la pompe de 1 L/min à 0,9 L/min).
5. Une fois que la lecture de la température sur le dispositif de perfusion ex vivo atteint 24-26 °C, réduisez encore la température du réchauffeur à 14 °C et diminuez encore le débit de la pompe de 100 mL/min.
6. Une fois que la température atteint 14-16 °C, détachez la canule PA du port PA, démarrez la livraison de l’antegrade del Nido (500 mL), fermez la vanne de conduite AO, arrêtez la pompe et serrez rapidement la conduite d’aération AO.
   REMARQUE: La pression d’administration de la cardioplégie doit être titrée pour maintenir une pression d’administration moyenne de 45 à 65 mmHg, comme indiqué sur le moniteur de l’appareil ex vivo .
7. Retirez le cœur du dispositif de perfusion ex vivo en déconnectant la canule PA et le connecteur aortique et en coupant les fils de stimulation.
8. Placez le cœur dans un seau rempli de gadoue de glace stérile.
9. Sur la table arrière, excèder la veine pulmonaire / atriotomie gauche où l’évent LV avait été inséré. Couper (1 ou 2 mm) de l’aspect distal de l’aorte et du PA où la fixation aux canules peut avoir écrasé le tissu.
   REMARQUE: Le cœur est maintenant prêt pour l’implantation intraabdominale et hétérotopique.

11. Implantation hétérotopique du greffon cardiaque

1. Avant de placer les pinces Satinsky, administrer 300 U/kg d’héparine IV au porc receveur.
2. Placez une pince Satinsky sur l’IVC et créez une vénotomie longitudinale mesurant environ 1,5 cm à l’aide d’une lame à 11 lames et de ciseaux de Pott.
3. Anastomose le PA greffon à la CIV infra-rénale du receveur de bout en bout à l’aide d’une suture en polypropylène de taille courante: 4-0. Effectuez d’abord la partie interne de l’anastomose et renforcez si nécessaire avec des sutures interrompues avant de terminer la partie externe de l’anastomose.
   REMARQUE: L’anastomose PA à IVC est effectuée en premier, et l’anastomose de l’aorte à l’aorte est faite en dernier pour réduire la durée de l’occlusion aortique.
4. Placez une pince de Satinsky sur l’aorte et créez une aortotomie longitudinale mesurant environ 1,5 cm à l’aide d’une lame à 11 lames et de ciseaux de Pott.
   REMARQUE: Obtenez un ABG avant la mise en place de la pince. Revérifiez-le immédiatement après la libération de la pince et à nouveau 15-30 min plus tard pour évaluer tout changement dans l’hyperkaliémie, l’hyperlactatémie ou l’acidémie indiquant une lésion ischémique chez le receveur.
5. Anastomose l’aorte du greffon à l’aorte infra-rénale du receveur de bout en bout à l’aide d’une suture en polypropylène courante, taille: 4-0. Effectuez d’abord la partie interne de l’anastomose et renforcez si nécessaire avec des sutures interrompues avant de terminer la partie externe de l’anastomose.
6. Retirez les pinces Satinsky pour reperfumer le cœur; Tout d’abord, retirez la pince IVC suivie de la pince aortique.
7. Placez un angiocathe de 18 G dans l’apex LV du greffon pour désaérer. Lorsque vous avez terminé, retirez l’angiocathe et fermez le site avec une suture promise.
8. Vérifiez soigneusement les anastomoses pour tout saignement.
9. Placez soigneusement le cœur dans l’espace rétropéritonéal droit, de sorte qu’il n’y ait pas de tension sur les anastomoses et pas de pliage des vaisseaux. Remplacez l’intestin grêle.

12. Clôture de la laparotomie

1. Fermez le fascia avec une boucle, taille: 0, suture Maxon de manière courante en commençant par les deux extrémités de l’incision et en attachant au milieu. Prenez soin d’éviter toute blessure à l’intestin.
2. Fermez la couche dermique profonde avec la taille: 2-0, Vicryl en mode courant et la peau avec la taille: 4-0, Monocryl en mode course.
3. Nettoyez l’incision cutanée et appliquez de la colle pour la peau.

13. Traitement postchirurgical et euthanasie

1. Après la fin de la chirurgie, éteignez le flux d’isoflurane et surveillez le porc pour le retour du tonus musculaire et des réflexes neuromusculaires (réflexe cornéen, retrait aux stimuli douloureux, déglutition).
2. Après avoir confirmé la restauration de ces fonctions, désactivez la ventilation mécanique et observez la respiration spontanée. S’il y a une respiration spontanée, retirez le tube endotrachéal; si ce n’est pas le cas, reconnecter le tube endotrachéal à la ventilation mécanique.
3. Transférez le porc de la table d’opération dans un enclos isolé où ses signes vitaux (température rectale, pression artérielle, fréquence cardiaque) peuvent être étroitement surveillés. Utilisez une lampe chauffante pour réchauffer le cochon si nécessaire. Fournir un bolus de liquide IV de 250 mL de solution de Ringer lactée dans le cadre de l’hypotension (pression artérielle systolique < 100mmHg). Continuez à surveiller le porc jusqu’à ce qu’il puisse maintenir la position couchée du sternal et que les signes vitaux soient complètement normalisés.
   REMARQUE: L’animal n’est pas laissé sans surveillance jusqu’à ce qu’il ait retrouvé une conscience suffisante. De plus, l’animal n’est pas retourné à la compagnie d’autres animaux jusqu’à ce qu’il soit complètement rétabli.
4. Pour la gestion de la douleur, administrer une dose unique de buprénorphine (libération prolongée) injection sous-cutanée de 0,12 mg/ kg pendant 72 h d’analgésie.
5. À la fin de la période expérimentale, euthanasier le porc pour l’explantation du cœur natif (thoracique) et du cœur allogreffe (abdominal).
   1. Préparez le porc comme décrit aux rubriques 2 et 3 pour la procédure. Préparez deux sacs de del Nido et deux lignes de cardioplégie pour arrêter chaque cœur.
   2. Exposez le cœur thoracique comme décrit à la rubrique 4. Une fois terminé, procédez à une laparotomie comme décrit à la rubrique 9.
   3. Une fois que les anastomoses aorto-aortiques et PA-IVC sont exposées, placez une pince Satinsky sur l’aorte receveuse et une autre sur la CIV receveuse pour isoler l’allogreffe de la circulation systémique.
   4. Insérez une canule racinaire aortique 4-Fr pédiatrique dans la racine aortique de l’allogreffe et connectez une ligne de cardioplégie au cathéter. Administrer 500 mL de cardioplégie del Nido dans la racine à une pression de 100-150 mmHg à l’aide d’un sac sous pression. Après le début de la perfusion, utilisez des ciseaux Metzenbaum pour faire une incision de 2 cm au niveau de l’anastomose PA-IVC afin d’évacuer l’allogreffe.
   5. Une fois l’allogreffe arrêtée, procédez à l’explantation de l’allogreffe en utilisant des ciseaux Metzenbaum pour exciser au niveau de l’anastomose aorto-aortique et du reste de l’anastomose PA-IVC. Ne retirez aucune des pinces Satinsky.
   6. Procéder à l’ablation du cœur thoracique comme décrit à la rubrique 5.
      REMARQUE: La seule différence significative est que les veines pulmonaires n’ont pas besoin d’être soigneusement ligaturées et peuvent plutôt être disséquées grossièrement à l’aide de ciseaux Metzenbaum lors de la cardiectomie.

Representative Results

Ce groupe a survécu avec succès à 9 porcs entre 5 et 35 jours en suivant le protocole présenté ici, selon la conception de l’étude. Sur les 10 porcs qui ont subi ce protocole, seulement 1 est mort prématurément de complications chirurgicales, ce qui donne un taux de survie de 90%. La figure 2 illustre un diagramme de la configuration d’un cœur hétérotopique transplanté en position intraabdominale chez un porc. Lors de la détermination du site d’anastomose de l’allogreffe, sélectionnez un site qui minimise toute tension ou pliage sur l’anastomose. Cela garantit que les anastomoses guérissent correctement et que l’allogreffe reçoit une perfusion et un drainage optimaux du sang.

Une image représentative d’une allogreffe cardiaque perfusée sur un dispositif de perfusion ex vivo normotherme est illustrée à la figure 3. La figure 4 présente les paramètres de perfusion représentatifs acquis au cours d’une expérience réussie (débit circulatoire, pression aortique, fréquence cardiaque, température, saturation en oxygène veineux mixte et hématocrite). L’incapacité d’atteindre les valeurs de paramètres démontrées ici peut entraîner une altération de la fonction d’allogreffe après la transplantation. La figure 5 montre une image d’un cœur hétérotopique intraabdominal in situ 35 jours après une transplantation réussie. Des résultats représentatifs de l’efficacité de l’utilisation du protocole présenté ici pour l’administration thérapeutique ont déjà été démontrés par ce groupe¹⁵. Les allogreffes cardiaques (n = 3) ont été perfusées avec du perfusat traité avec un vecteur adénoviral porteur du transgène pour la luciférase. L’expression génique s’est avérée globale et robuste dans les allogreffes 5 jours après le traitement et la transplantation. La figure 6 montre un atlas de l’activité de la protéine luciférase mesurée et présentée comme un changement moyen d’activité de chaque région de l’allogreffe cardiaque explantée par rapport au cœur thoracique des receveurs.

Figure 1: Schéma de protocole pour l’administration thérapeutique d’une allogreffe cardiaque entière par perfusion sanguine ex vivo normotherme. (A) Le cœur et le sang sont obtenus du porc donneur. (B) Le sang est lavé à l’aide d’un dispositif d’économie de cellules pour éliminer tout composant neutralisant thérapeutique du sérum du donneur. (C) L’allogreffe cardiaque est montée sur le dispositif de perfusion ex vivo normotherme et perfusée pendant 2 h. (D) Peu de temps après le montage de l’allogreffe, le traitement d’intérêt est ajouté au perfusate. (E) Après la période de perfusion ex vivo allouée, l’allogreffe est transplantée dans le porc receveur en position intraabdominale et hétérotopique. Ce chiffre a été modifié par rapport à¹⁵. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Modèle cardiaque hétérotopique porcin en position intraabdominale. Diagramme du modèle cardiaque hétérotopique où l’allogreffe est transplantée en position intraabdominale tandis que le cœur natif du receveur reste à son emplacement naturel. L’artère pulmonaire de l’allogreffe est anastomisée à la veine cave inférieure infra-rénale, tandis que l’aorte de l’allogreffe est anastomosée à l’aorte infra-rénale du receveur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Allogreffe cardiaque sur dispositif de perfusion ex vivo. L’allogreffe cardiaque montée sur un dispositif de perfusion ex vivo normothermique où il est perfusé avec du perfusate perfusé thérapeutique pendant 2 h avant l’implantation dans le receveur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Paramètres représentatifs de perfusion ex vivo. (A) Débits circulatoires mesurés à partir de l’artère pulmonaire (bleu), de l’aorte (vert) et des artères coronaires (rouge). (B) Mesures représentatives de la pression aortique: pression moyenne (bleu), pression systolique (rouge), pression diastolique (vert). (C) Fréquence cardiaque d’une allogreffe cardiaque pendant la perfusion ex vivo. (D) Température enregistrée de l’allogreffe cardiaque pendant la perfusion ex vivo. (E) démontre les valeurs de SvO₂ mesurées à partir du perfusat pendant la période de perfusion. (F) Valeurs de l’hématocrite mesurées à partir du perfusat pendant la période de perfusion. Abréviations : hct = hématocrite ; _SvO2 = saturation veineuse mixte en oxygène. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Allogreffe cardiaque transplantée chez le receveur. Une allogreffe cardiaque au jour postopératoire 35 traité par thérapeutique au moment de l’implantation. Le donneur a été sélectionné pour correspondre parfaitement au SLA avec le receveur. Abréviation : SLA = Antigène leucocytaire porcin. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Activité de la luciférase après transduction d’allogreffes cardiaques. Sont présentés les résultats de trois allogreffes cardiaques qui ont été transduites avec des vecteurs adénoviraux porteurs d’un transgène luciférase. Démontré est le changement moyen de pli dans l’activité de la protéine luciférase dans chaque zone de l’allogreffe cardiaque. Ce chiffre a été modifié à partir de Bishawi et al. ¹⁵. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

L’administration de traitements pendant la perfusion ex vivo en transplantation cardiaque offre une stratégie pour modifier l’allogreffe et potentiellement améliorer les résultats de la transplantation. Le protocole présenté ici intègre le stockage de perfusion sanguin ex vivo normotherme de pointe et offre un potentiel prometteur pour tester l’administration isolée de cellules, de gènes ou d’immunothérapies à l’allogreffe 11,12,13. À ce jour, les techniques d’administration cardiaque pour ces thérapies putatives pour les maladies cardiovasculaires et l’insuffisance cardiaque terminale ont reposé sur l’administration systémique, la perfusion intracoronaire par cathétérisme et les injections intramyocardiques directes, qui ont toutes obtenu de mauvais résultats en termes d’administration myocardique ^5,16. Nous avions précédemment démontré l’expression robuste et globale d’un gène rapporteur à des allogreffes cardiaques entières lorsqu’un vecteur viral était administré dans le perfusat lors d’une perfusion ex vivo avant la transplantation¹⁵. Ceci est particulièrement important dans le contexte de la transplantation cardiaque, où l’expression globale et l’effet du thérapeutique doivent atteindre toutes les zones de l’allogreffe pour obtenir la « cardioprotection » souhaitée de l’ensemble de l’allogreffe. Ce protocole y parvient d’une manière qui n’a pas été réalisée auparavant en utilisant des voies d’administration traditionnellement décrites pour les thérapies.

Il y a plusieurs étapes critiques présentées dans ce protocole à souligner. (1) Toutes les précautions doivent être prises pour minimiser la perte de sang lors de l’approvisionnement du cœur du donneur. Au moins 1 L de sang doit être obtenu du donneur pour que le dispositif de perfusion atteigne des débits adéquats. (2) Pour l’administration thérapeutique par perfusion sanguin ex vivo normotherme, il est nécessaire de laver le sang du donneur avant de l’ajouter au perfusat afin d’éliminer tout composant neutralisant dans le sérum du donneur qui pourrait affecter négativement l’administration du médicament au cœur. (3) Minimiser la dissection du cœur chez le donneur jusqu’après l’arrêt cardioplégique pour éviter les arythmies mortelles. (4) Lors de l’introduction du produit thérapeutique dans le dispositif de perfusion, il est important de l’introduire par l’orifice le plus proche de la racine aortique et de toujours rincer l’orifice pour assurer la livraison complète de la suspension. Il s’agit de minimiser toute perte potentielle du produit thérapeutique pour l’oxygénateur ou le tube dans le circuit et de s’assurer que le greffon reçoit une concentration thérapeutique aussi élevée que possible. (5) Enfin, lors de la sélection du site d’implantation du greffon, il est essentiel que l’emplacement minimise le risque de tension sur l’anastomose et qu’il n’y ait pas de pliage des vaisseaux sanguins / anastomoses.

Il est également recommandé que les porcs soient de type antigène leucocytaire porcin (SLA) (c.-à-d. complexe majeur d’histocompatibilité porcin, CMH) afin de sélectionner au préalable le degré approprié d’appariement/d’inadéquation entre les haplotypes SLA comprenant les antigènes de surface cellulaire I (SLA-1, SLA-2 et SLA-3) et/ou de classe II (DR et DQ) en fonction des besoins de l’investigateur (typage SLA effectué par SH tel que décrit précédemment avec de légères modifications apportées aux panneaux d’amorce de typage)^{17, 18}. Par exemple, s’assurer que les porcs correspondent à tous les antigènes SLA minimise le risque de rejet d’allogreffe, tandis que l’utilisation de porcs incompatibles entre tous les antigènes SLA maximise l’incidence du rejet d’allogreffe.

Une limite de ce modèle est que, bien qu’il permette l’étude des effets immunologiques sur le greffon cardiaque, il ne permet pas une évaluation complète de la capacité du greffon à soutenir le système cardiovasculaire après une intervention. Pour ce faire, la greffe devrait être implantée orthotopiquement. Cependant, la transplantation orthotopique dans des modèles de gros animaux a une mortalité associée plus élevée et nécessite un pontage cardiopulmonaire³. Une autre limitation de ce modèle est l’accès limité à un dispositif de perfusion ex vivo pour effectuer une livraison efficace de gènes au greffon. À mesure que ces dispositifs deviennent plus disponibles dans le domaine de la transplantation d’organes, l’accès devrait s’améliorer. En outre, un dispositif non commercial peut être une option à des fins expérimentales.

La transplantation cardiaque offre un cadre unique où des thérapies peuvent être introduites dans l’allogreffe par perfusion ex vivo avant l’implantation dans le receveur. L’utilisation d’un dispositif de perfusion ex vivo permet aux greffons d’être en transit du donneur au receveur pendant des périodes beaucoup plus longues que ce qui est sûr en utilisant l’entreposage statique à froid traditionnel⁶. Cette période de perfusion prolongée permet une administration isolée efficace de produits thérapeutiques. Ce modèle sert d’étape translationnelle entre les tests précliniques sur les animaux de thérapies et les thérapies cliniques transformatrices.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0 Looped Maxon suture	Covidien	GMM-341L	Used to close fascia of the laparotomy incision
0 Silk ties	Medtronic, Inc	S346
18 G Angiocath	BD	381144	Used to de-air the left ventricle of the donor heart after implantation
20 Fr LV vent	Medtronic, Inc	12002
2-0 Silk sutures	Ethicon, Inc.	SA11G
2-0 Silk ties	Ethicon, Inc.	SA65H
2-0 Vicryl suture	Ethicon, Inc.	J259H
24 Fr venous cannula	Medtronic, Inc	68124
3-0 Prolene sutures	Ethicon, Inc.	8522
4-0 Monocryl suture	Ethicon, Inc.	Y469G
4-0 Prolene sutures	Ethicon, Inc.	8521
Animal hair cutting clipper	Wahl	8786-452
Aortic clamp	V. Mueller	CH6201
Army Navy retractor	V. Mueller	SU3660
ATF 40, Cell saver disposable set	Fresenius Kabi	9108494	Cell saver device insert
Balfour retractor	V. Mueller	SU3042	Used as an abdominal wall retractor
C.A.T.S cell saver	Fresenius Kabi	ES0019	Cell saver device used to wash donor blood
Cardiac defibrillator	Zoll	M Series	Cardiac defibrillator
Castro needle holder	V. Mueller	CH8589
CG4 iStat cartridges	Abbott	03P85-25	POC testing
CG8 iStat cartridges	Abbott	03P88-25	POC testing
DeBakey forceps	V. Mueller	CH5902
Electrocautery disposable pencil	Covidien	E2450H
Gerald forceps	V. Mueller	NL1451
Hemotherm 400CE Dual Reservoir Cooler/Heater	Cincinnati Sub-Zero	86022	Heater cooler used to regulate perfusion temperature on the ex vivo perfusion device
iSTAT 1	Abbott	04P75-03	POC testing device
Kocher clamp	V. Mueller	SU2790
Large clip applier	Sklar	50-4300
Large clips	Teleflex	4200
Large soft pledgets	Covidien	8886867901
Medium clip applier	Sklar	50-4335
Medium clips	Teleflex	2200
Metzenbaum scissor	V. Mueller	CH2006-001
No. 10 scalpel blade	Swann-Mortan	301	Used for skin incision
No. 11 scalpel blade	Kiato Plus	18111	Used for vascular incision
OCS device with base	TransMedics, Inc.		Ex vivo perfusion device
OCS disposable	TransMedics, Inc.		Ex vivo perfusion device insert with perfusion kits
Pacing cable	Remington Medical	FL-601-97
Pediatric cardioplegia catheter (4Fr)	Medtronic, Inc	10218	Used to deliver cardioplegia to the donor aortic root
Pediatric Foley catheter	Teleflex	RSH170003080	Placed pre-op to decompress the recipient's bladder
Potts scissors	V. Mueller	CH13038
Pressure bag x2 (1,000 mL)	Novaplus	V4010H	Used to deliver cardioplegia at a set pressure
Satinsky clamp	V. Mueller	CH7305	Vascular clamp used for creating anastomoses between donor heart and recipient vessels
Scissors	Felco	FELCO 200A-50	Used to perform sternotomy
Small hard pledgets	Covidien	8886867701
Sternal retractor	V. Mueller	CH6950-007
Temporary cardiac pacing wires	Ethicon, Inc.	TPW32
Temporary dual chamber pacemaker	Medtronic, Inc	5388	Cardiac pacing device
Tourniquet kit	Medtronic, Inc	79005	Rummel tourniquets
Umbilical tape	Covidien	8886861903
Vessel loops	Covidien	31145686