Summary
在这里，我们提出了一种经济有效的方法，在用10 ng / mL GM-CSF / IL-4培养7天后从小鼠中分离和产生高纯度骨髓来源的树突状细胞。
Abstract
随着免疫学研究的进展，对树突状细胞（DC）的需求正在逐渐增加。然而，DC在所有组织中都很少见。分离DC的传统方法主要涉及通过注射大剂量（>10 ng / mL）的粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子/ 白细胞介素-4（GM-CSF / IL-4）来诱导骨髓（BM）分化为DC，使该过程复杂且昂贵。在该方案中，使用在10ng / mL GM-CSF / IL-4培养基中培养的所有BM细胞，经过3-4次半培养交换后，每只小鼠（两个股骨）收获高达2.7 x 107 CD11c + 细胞（DC），纯度为80%-95%。培养10天后，CD11c，CD80和MHC II的表达增加，而细胞数量减少。培养7天后细胞数量达到峰值。此外，该方法仅需10分钟即可收获所有骨髓细胞，并且在培养1周后获得大量DC。
Introduction
树突状细胞（DC）是最强大的抗原呈递细胞（APC），用于激活幼稚的T细胞并诱导针对传染病，过敏性疾病和肿瘤细胞的特定细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应1，2，3。DC是先天免疫和适应性免疫之间的主要纽带，在免疫防御和维持免疫耐受性方面起着至关重要的作用。在过去的40年中，许多研究人员试图定义DC的亚群及其在炎症和免疫中的功能。根据这些研究，DC从骨髓细胞沿着骨髓和淋巴系发展。近年来，肿瘤疫苗取得了重大的里程碑，并拥有光明的未来。在机械上，肿瘤疫苗通过使用肿瘤抗原激活细胞毒性T淋巴细胞来调节免疫反应并防止肿瘤生长。基于DC的疫苗在肿瘤免疫治疗中起着重要作用，已被确定为最有前途的抗肿瘤疗法之一1，4。此外，DC已广泛应用于新型分子靶向药物和免疫检查点抑制剂的检测5.
研究人员迫切需要大量的高纯度DC来进一步研究DC的作用。然而，DC在各种组织和血液中很少见，仅占人类和动物血细胞的1%。骨髓树突状细胞（BMDC）的 体外 培养是获得大量DC细胞的重要方法。同时，用于从骨髓中生成DC的Lutz协议已被研究人员广泛使用6。虽然该方案在获得DC细胞方面是有效的，但它是复杂和昂贵的，涉及添加高浓度的细胞因子和红细胞的裂解。
在这项研究中，我们报告了一种从小鼠骨髓（BM）中分离几乎所有骨髓细胞的方法，并在 体外孵育7-9天后诱导分化为BMDC，GM-CSF和IL-4的浓度较低。该过程只需10分钟即可收获几乎所有骨髓细胞并将其悬浮在完整的培养基中。简而言之，我们在本研究中为BMDC提供了一种高效且具有成本效益的养殖方法。
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Protocol
所有程序均经南京医科大学动物保育使用委员会批准。
1. 骨髓分离和BM细胞的制备
- 通过CO 2窒息处死C57BL / 6小鼠（18-22g ，6-8周龄）。将鼠标固定在鼠标操作台上。用70%乙醇消毒表面。
- 切开腿部皮肤以暴露肌肉和股动脉。用两个镊子夹住并撕下股动脉，然后将近端拉向腹部。
注意：不要直接切除股动脉。否则，会导致出血过多，污染视野。 - 切除股骨周围的所有肌肉。
- 慢慢地将小鼠的下肢向外伸展，直到听到髋关节脱位的声音并且可以看到股骨头脱垂。
- 用剪刀沿着股骨头内侧将下肢与身体分开。
- 从膝关节末端切开后腿，以获得自由和完整的股骨。
- 使用纱布去除附着在股骨上的肌肉。
注意：不要直接撕裂肌肉。小鼠的股骨是脆弱的，必须保持其完整性。 - 将股骨浸入75%酒精中2-5分钟。
2. BMDC的诱导培养
- 用PBS冲洗残留的酒精。使用止血镊子夹住股骨的中部和下部，另一套钳夹住股骨的下端。止血钳横向施加到股骨，股骨与骨骺线分离。
注意：骨骺线在股骨骨折之前不易看到。这一步和后续步骤都是在无菌环境中进行的。 - 使用 1 mL 注射器（针头：0.6 mm x 25 mm）从骨骺线断裂处穿透骨髓腔，并旋转针头以穿透股骨头并通过骨髓腔。使用 1 mL 含有 GM-CSF/IL-4 的完整培养基脉冲并冲洗骨髓腔，直到骨变白。
注意：完整的培养基：10%FBS，1%青霉素 - 链霉素，55μM β - 巯基乙醇，10ng / mL GM-CSF和10 ng / mL IL-4。 - 将所有细胞重悬于24mL完全培养基（〜5 x 105 细胞/ mL）中。混合后，将所有培养基以4mL / 孔接种在6孔板上，然后在37°C下用5%CO2 孵育2天。
注意：没有必要裂解红细胞。 - 2天后，用含有GM-CSF / IL-47的培养基替换所有培养基。在第四天、第六天和第八天，用含有 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 的完整培养基替换一半的培养基。
注意：在此步骤中，去除悬浮细胞，如红细胞和淋巴细胞。 - 每天拍照以记录细胞生长。从第六天开始，每天收获一孔细胞以计数细胞数量并检测CD11c，CD80和MHC II表达6，7。
3. 流式细胞术检测CD11c、CD80和MHC II的表达
- 用PBS洗涤DC后，在100μLFACS缓冲液中重悬1×106 个细胞，加入0.5μg抗小鼠CD16 / 32抗体，并在冰上孵育10分钟以阻断非特异性抗原位点。
- 加入1μgPercp / cy5.5-CD11c，0.5μgPE-CD80和0.04μgAPC-MHC II抗体，并在冰上孵育30分钟。
- 在4°C下以1，000×g离心3分钟，除去上清液，加入1mL4%多聚甲醛，在4°C下固定30分钟，并重新悬浮在300μLFACS缓冲液中。
- 进行流式细胞术。
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Representative Results
从两个股骨中提取1 x 10 7-1.7 x10 7个细胞，并在种植在6孔板中之前重新悬浮在24mL培养基中（图1A）。2天后，通过完全改变培养基去除非贴壁细胞。在更换培养基之前，观察到大量悬浮细胞（图1B）。培养3天后，小细胞集落开始形成。第六天，菌落的大小和数量显著增加。在第七天，细胞数量达到峰值（22 x 10 6-27 x 106），然后逐渐下降（图2A）。DC细胞的表面变得粗糙，具有较长的假足，表现出典型的成熟DC细胞形态（图2B）。流式细胞术分析显示，CD11c阳性与总细胞的比例在第六天为71%，而在第十天该比率增加到96.1%（图2C，2D）。
为了评价共刺激分子的表达，CD11c、CD80和MHC II共染色8.如图 3A所示，CD11c、CD80和MHC II的表达随着培养时间从第6天到第10天的增加而逐渐增加。此外，流式细胞术分析显示CD11c和CD80双阳性，CD11c和MHCII双阳性（图3B，3D）和三阳性细胞的比例逐渐增加（图3C，3D）。
图1：不同养殖时间DC的代表性图像。 （A）培养BMDC的流程图。（B）不同文化时期发展中国家具有代表性的形象。将骨髓细胞悬浮在24 mL培养基中，用10ng / mL GM-CSF和IL-4接种在6孔板中。BF，在更换培养基之前;AF，更换培养基后。红色箭头，DC殖民地。 请点击此处查看此图的大图。
图2：不同培养时间DC的数量和纯度。 （A）所有培养基中的细胞总数。（B）DC的代表性图像（C，D）流式细胞术和DC比例分析的图形表示。阳性细胞按CD11c排序 。请点击这里查看此图的大图。
图3：共刺激分子在DC中的表达。 （二）流式细胞术分析CD11c和CD80双阳性、CD11c和MHC ΙΙ双阳性、三阳性和三阳性细胞的比例。（C、 D）从第6天到第10天的流式细胞术分析和图形表示，以显示统计分析。请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
人类和小鼠具有不同的DC亚群，包括经典DC（cDC，包括cDC1和cDC2s），浆细胞样DC（pDC）和单核细胞衍生DC（MoDC）9，10，11。人们普遍认为，cDC1s调节细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对细胞内病原体和癌症的反应，cDC2调节对细胞外病原体，寄生虫和过敏原的免疫反应12。在GM-CSF和IL-46，13，14的存在下，可以在小鼠的BM祖细胞体外产生大量DC。DC的纯度和数量在DC免疫疗法的成功中起着关键作用。研究人员已经表明，两剂1 x 105至1 x 106 DC可以在异种移植模型15，16，17，18中引发有效的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）反应。这意味着需要培养大量的高纯度DC，以进一步研究DC在肿瘤免疫治疗中的作用。
获得骨髓细胞的传统方法是切开股骨的两端并用培养基6，7冲洗。在这项研究中，我们创新地使用生理解剖结构来切断股骨。止血镊子用于夹紧股骨的下端并横向移动。骨骺线生理上较弱，使其在受力时容易发生骨折19.股骨与骨骺线分离后，少量骨头残留在骨髓腔中。针头可以很容易地将骨头穿透到骨髓腔中。该方法操作简单，保护珍贵的骨髓细胞，并为大量DC的培养提供细胞基础。我们使用10 ng/mL GM-CSF和10 ng/mL IL-4的组合对DC进行培养，这比单独使用GM-CSF对DC的成熟贡献更大。Labeur和Son报道，在DC培养基中联合使用GM-CSF和IL-4诱导成熟标志物（如IFN-ɣ，TNF-α和IL-6）的更高表达，并增强抗原呈递能力7，20，21。Son等人还提出，GM-CSF和IL-4的组合促进了DCs7，21的成熟。
在这项研究中，我们直接培养收集的骨髓细胞而不裂解红细胞，并通过梯度离心分离它们，这可能导致细胞损失，并最终减少收获的DC。在更换培养基之前，培养系统中有几个悬浮细胞，包括红细胞，T细胞，B细胞和粒细胞。在共培养过程中，这些细胞可能产生细胞因子以促进DC的成熟。
在局限性方面，该方案仅使用小鼠的两个股骨，不包括较小的胫骨，导致一些间充质干细胞的损失。简而言之，我们开发了一种经济高效且高效的方案，用于从小鼠中分离和生成骨髓来源的树突状细胞，只需10分钟即可分离骨髓细胞。用10 ng/mL的GM-CSF和IL-4孵育6 d~7 d后收获大量高纯度DC。
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Disclosures
所有作者都声明他们没有利益冲突，也没有什么可披露的。
Acknowledgments
本研究由天津市科技计划（20JCQNJC00550）、天津市卫生科技计划（TJWJ202021QN033和TJWJ202021QN034）资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-Mercaptoethanol | Solarbio | M8211 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| APC-MHC II | Biolegend | 116417 | |
| FBS | Gibco | 10100 | |
| PE-CD80 | Biolegend | 104707 | |
| Penicillin-Streptomycin | Solarbio | P1400 | |
| Percp/cy5.5-CD11c | Biolegend | 117327 | |
| PRMI-1640 | Thermo | 11875093 | |
| Recombinant Mouse GM-CSF | Solarbio | P00184 | |
| Recombinant Mouse IL-4 | Solarbio | P00196 | |
| TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | 156603 |
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