Summary
Aquí, presentamos un método económico y eficiente para aislar y generar células dendríticas derivadas de la médula ósea de alta pureza a partir de ratones después de 7 días de cultivo con 10 ng / ml GM-CSF / IL-4.
Abstract
La demanda de células dendríticas (DC) está aumentando gradualmente a medida que avanza la investigación en inmunología. Sin embargo, los DC son raros en todos los tejidos. El método tradicional para aislar los DC consiste principalmente en inducir la diferenciación de la médula ósea (BM) en DC mediante la inyección de grandes dosis (>10 ng / ml) de factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos / interleucina-4 (GM-CSF / IL-4), lo que hace que el procedimiento sea complejo y costoso. En este protocolo, utilizando todas las células BM cultivadas en medio GM-CSF/IL-4 de 10 ng/mL, después de 3-4 intercambios de semicultivo, se cosecharon hasta2,7 x 10 7 células CD11c+ (DC) por ratón (dos fémures) con una pureza del 80%-95%. Después de 10 días en cultivo, la expresión de CD11c, CD80 y MHC II aumentó, mientras que el número de células disminuyó. El número de células alcanzó su punto máximo después de 7 días de cultivo. Además, este método solo tardó 10 minutos en cosechar todas las células de la médula ósea, y se obtuvo un alto número de DC después de 1 semana de cultivo.
Introduction
Las células dendríticas (CD) son las células presentadoras de antígenos (APC) más potentes para activar las células T naïve e inducir respuestas específicas de linfocitos T citotóxicos (CTL) contra enfermedades infecciosas, alergias y células tumorales 1,2,3. Los DC son el vínculo principal entre la inmunidad innata y la inmunidad adaptativa y desempeñan un papel esencial en la defensa inmunológica y el mantenimiento de la tolerancia inmune. En los últimos 40 años, muchos investigadores han tratado de definir los subconjuntos de DC y sus funciones en la inflamación y la inmunidad. Según esos estudios, los DC se desarrollan a lo largo de los linajes mieloides y linfoides de las células de la médula ósea. Las vacunas contra tumores han ganado hitos significativos en los últimos años y tienen un futuro prometedor. Mecánicamente, las vacunas tumorales modulan la respuesta inmune y previenen el crecimiento tumoral mediante la activación de linfocitos T citotóxicos utilizando antígenos tumorales. La vacuna basada en CD juega un papel importante en la inmunoterapia tumoral y ha sido identificada como una de las terapias antitumorales más prometedoras 1,4. Además, los DC se han utilizado ampliamente en las pruebas de nuevos fármacos dirigidos molecularmente e inhibidores del punto de control inmunitario5.
Los investigadores necesitan urgentemente un alto número de DC de alta pureza para estudiar más a fondo el papel de los DC. Sin embargo, los DC son raros en varios tejidos y sangre, representando solo el 1% de las células sanguíneas en humanos y animales. El cultivo in vitro de células dendríticas de la médula ósea (BMDC) es un método importante para obtener grandes cantidades de células DC. Mientras tanto, el protocolo Lutz para generar DC a partir de la médula ósea ha sido ampliamente utilizado por los investigadores6. Aunque el protocolo es efectivo en la obtención de células DC, es complejo y costoso, ya que implica la adición de altas concentraciones de citoquinas y la lisis de los glóbulos rojos.
En este estudio, informamos un método para aislar casi todas las células de la médula ósea de la médula ósea del ratón (BM) e inducir la diferenciación en BMDC después de 7-9 días de incubación in vitro, con una menor concentración de GM-CSF e IL-4. Este procedimiento solo toma 10 minutos para cosechar casi todas las células de la médula ósea y suspenderlas en un medio completo. En resumen, proporcionamos un método de cultivo eficiente y rentable para BMDC en esta investigación.
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Protocol
Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Nanjing.
1. Aislamiento de la médula ósea y preparación de células BM
- Sacrifice ratones C57BL/6 (18-22 g, 6-8 semanas de edad) a través de la asfixia por CO2 . Fije el ratón en la mesa de operaciones del ratón. Desinfectar las superficies con etanol al 70%.
- Cortar la piel de la pierna para exponer los músculos y la arteria femoral. Pinza y arranca la arteria femoral con dos fórceps, luego tira del extremo proximal hacia el abdomen.
NOTA: No corte la arteria femoral directamente. De lo contrario, causará sangrado excesivo y contaminará el campo de visión. - Corte todos los músculos alrededor del fémur.
- Estire lentamente las extremidades inferiores del ratón hacia afuera hasta que se escuche el sonido de la dislocación de la articulación de la cadera y el prolapso de la cabeza femoral sea visible.
- Separe las extremidades inferiores del cuerpo usando tijeras a lo largo del interior de la cabeza femoral.
- Cortar las patas traseras desde el extremo de la articulación de la rodilla para obtener un fémur libre y completo.
- Retire los músculos unidos al fémur con una gasa.
NOTA: No rasgue los músculos directamente. El fémur de los ratones es delicado, su integridad debe mantenerse. - Sumergir el fémur en alcohol al 75% durante 2-5 min.
2. Cultivo de inducción de BMDC
- Enjuague el alcohol residual con PBS. Use fórceps hemostáticos para sujetar la parte media e inferior del fémur y otro conjunto para sujetar el extremo inferior del fémur. Las pinzas hemostáticas se aplican lateralmente al fémur, y el fémur se separa de la línea epifisaria.
NOTA: La línea epifisaria no es fácilmente visible hasta que el fémur se fractura. Este y los siguientes pasos se realizan en un ambiente estéril. - Use una jeringa de 1 ml (aguja: 0,6 mm x 25 mm) para penetrar en la cavidad de la médula ósea desde la rotura de la línea epifisaria y gire la aguja para penetrar en la cabeza femoral y a través de la cavidad de la médula ósea. Pulse y enjuague la cavidad de la médula ósea utilizando 1 ml del medio completo que contiene GM-CSF/IL-4 hasta que el hueso se vuelva blanco.
NOTA: Medio de cultivo completo: 10% FBS, 1% penicilina-estreptomicina, 55 μM β-Mercaptoetanol, 10 ng/mL GM-CSF y 10 ng/mL IL-4. - Resuspendir todas las células en 24 mL de medio de cultivo completo (~5 x 105 células/mL). Después de la mezcla, todo el medio se sembró en una placa de 6 pocillos con 4 ml / pozo, luego se incubó a 37 ° C con 5% de CO2 durante 2 días.
NOTA: No es necesario lisar eritrocitos. - Reemplace todo el medio después de 2 días por un medio que contenga GM-CSF/IL-47. En el cuarto, sexto y octavo día, reemplace la mitad del medio con el medio completo que contiene 10 ng/ ml GM-CSF/IL-4.
NOTA: En este paso, se eliminan las células suspendidas como los eritrocitos y los linfocitos. - Tome fotografías todos los días para registrar el crecimiento celular. A partir del sexto día, recolecte un pocillo de células por día para contar el número de células y detectar la expresión de CD11c, CD80 y MHC II 6,7.
3. Detección citométrica de flujo de la expresión de CD11c, CD80 y MHC II
- Después de lavar los DC con PBS, resuspenda 1 x 106 células en 100 μL de tampón FACS, agregue 0.5 μg de anticuerpo CD16/32 anti-ratón e incube durante 10 minutos en hielo para bloquear los sitios de antígenos no específicos.
- Añadir 1 μg de Percp/cy5.5-CD11c, 0,5 μg de PE-CD80 y 0,04 μg de anticuerpos APC-MHC II, e incubar en hielo durante 30 min.
- Centrifugar a 1.000 x g durante 3 min a 4 °C, retirar el sobrenadante, añadir 1 ml de paraformaldehído al 4%, fijar durante 30 min a 4 °C y volver a suspender en 300 μL de tampón FACS.
- Realizar citometría de flujo.
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Representative Results
Las células 1 x 10 7-1.7 x 107 fueron extraídas de dos fémures y fueron re-suspendidas en 24 mL de medio antes de ser plantadas en una placa de 6 pocillos (Figura 1A). Después de 2 días, las células no adherentes se eliminaron cambiando completamente el medio de cultivo. Antes de cambiar el medio, se observó un número significativo de células suspendidas (Figura 1B). Después de 3 días de cultivo, comenzaron a formarse colonias de células pequeñas. En el sexto día, el tamaño y el número de colonias aumentaron significativamente. En el séptimo día, el número de células alcanzó su punto máximo (22 x 106-27 x 106) y luego disminuyó gradualmente (Figura 2A). La superficie de las células DC se volvió áspera con seudópodos más largos, exhibiendo la morfología típica de las células DC maduras (Figura 2B). El análisis citométrico de flujo mostró que la proporción de CD11c positivo a células totales fue del 71% en el sexto día, mientras que la relación aumentó al 96,1% en el décimo día (Figura 2C, 2D).
Para evaluar la expresión de moléculas coestimuladoras, cd11c, CD80 y MHC II fueron co-teñidos8. Como se muestra en la Figura 3A, la expresión de CD11c, CD80 y MHC II aumentó gradualmente con el aumento del tiempo de cultivo desde el día 6 hasta el día 10. Además, el análisis citométrico de flujo mostró un aumento gradual en las proporciones de células CD11c y CD80 doblemente positivas, CD11c y MHCII dobles positivas (Figura 3B, 3D) y triple positivas (Figura 3C, 3D).
Figura 1: Imágenes representativas de DC en diferentes momentos de cultivo. (A) Diagrama de flujo de cultivo de BMDC. B) Imágenes representativas de los países en desarrollo en diferentes momentos culturales. Las células de la médula ósea se suspendieron en 24 ml de medio de cultivo con 10 ng/ml de GM-CSF e IL-4 y se sembraron en una placa de 6 pocillos. BF, antes de cambiar el medio de cultivo; AF, después de cambiar el medio de cultivo. Flecha roja, colonia DC. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El número y la pureza de los DC en diferentes momentos de cultivo. (A) Número total de células en todos los medios de cultivo. (B) Imágenes representativas de los DC. (C,D) Representación citométrica y gráfica del flujo del análisis de la proporción de DC. Las células positivas se ordenaron por CD11c. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: La expresión de moléculas coestimuladoras en CD. (A) La expresión de CD11c, CD80 y MHC ΙΙ en DC. (B) Análisis citométrico de flujo de la proporción de células CD11c y CD80 doblemente positivas, CD11c y MHC ΙΙ doble positivas y triple positivas. (C, D) Análisis citométrico de flujo desde el Día 6- Día 10 y representación gráfica para mostrar el análisis estadístico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los seres humanos y los ratones tienen diferentes subconjuntos de DC, incluidos los DC clásicos (cDC, incluidos los cDC1 y cDC2), los DC plasmocitoides (pDC) y los DC derivados de monocitos (MoDC)9,10,11. En general, se acepta que los cDC1 regulan las respuestas de los linfocitos T citotóxicos (CTL) a los patógenos intracelulares y al cáncer, y los cDC2 regulan las respuestas inmunes a los patógenos, parásitos y alérgenos extracelulares12. Se puede producir un número significativo de DC in vitro a partir de células progenitoras de BM en ratones en presencia de GM-CSF e IL-4 6,13,14. La pureza y la cantidad de DC juegan un papel clave en el éxito de la inmunoterapia de DC. Los investigadores han demostrado que dos dosis de 1 x 105 a 1 x 106 DC podrían provocar respuestas eficientes de linfocitos T citotóxicos (CTL) en un modelo de xenoinjerto 15,16,17,18. Esto implica que es necesario cultivar un gran número de DC de alta pureza para investigar más a fondo el papel de los DC en la inmunoterapia tumoral.
El método tradicional de obtención de células de médula ósea es cortar los dos extremos del fémur y enjuagar con el medio 6,7. En este estudio, utilizamos de manera innovadora estructuras anatómicas fisiológicas para cortar el fémur. Se utilizaron pinzas hemostáticas para sujetar el extremo inferior del fémur y moverlo lateralmente. La línea epifisaria es fisiológicamente débil, lo que los hace susceptibles a fracturas cuando están estresados19. Después de que el fémur se separa de la línea epifisaria, una pequeña cantidad de hueso permanece en la cavidad de la médula. La aguja puede penetrar fácilmente el hueso en la cavidad de la médula ósea. El método es fácil de operar, protege las preciosas células de la médula ósea y proporciona una base celular para el cultivo de un gran número de DC. Cultivamos los DC utilizando una combinación de 10 ng/mL GM-CSF y 10 ng/mL IL-4, lo que contribuye más a la maduración de los DC que GM-CSF solo. Labeur y Son informaron que el uso combinado de GM-CSF e IL-4 en el medio de los DC indujo una mayor expresión de marcadores de maduración, como IFN-ɣ, TNF-α e IL-6, y mejoró la capacidad de presentación de antígenos 7,20,21. Son et al. también propusieron que la combinación de GM-CSF e IL-4 promueve la maduración de los DCs 7,21.
En este estudio, cultivamos directamente las células de médula ósea recolectadas sin lisar los eritrocitos y las separamos por centrifugación por gradiente, lo que puede resultar en la pérdida de células y, en última instancia, en una reducción de los DC cosechados. Antes de que se cambiara el medio, había varias células suspendidas en el sistema de cultivo, incluidos eritrocitos, células T, células B y granulocitos. Durante el cocultivo, estas células pueden producir citoquinas para promover la maduración de las DC.
En términos de limitaciones, este protocolo solo utilizó dos fémures del ratón, excluyendo las tibias más pequeñas, lo que resultó en la pérdida de algunas células madre mesenquimales. En resumen, desarrollamos un protocolo rentable y eficiente para el aislamiento y la generación de células dendríticas derivadas de la médula ósea a partir de ratones, que tarda solo 10 minutos en separar las células de la médula ósea. Se cosechó un gran número de DC de alta pureza después de 6 días a 7 días de incubación con 10 ng/mL de GM-CSF e IL-4.
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Disclosures
Todos los autores declaran que no tienen conflictos de intereses y que no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Programa del Plan de Ciencia y Tecnología de Tianjin (20JCQNJC00550), el Proyecto de Ciencia y Tecnología de la Salud de Tianjin (TJWJ202021QN033 y TJWJ202021QN034).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-Mercaptoethanol | Solarbio | M8211 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| APC-MHC II | Biolegend | 116417 | |
| FBS | Gibco | 10100 | |
| PE-CD80 | Biolegend | 104707 | |
| Penicillin-Streptomycin | Solarbio | P1400 | |
| Percp/cy5.5-CD11c | Biolegend | 117327 | |
| PRMI-1640 | Thermo | 11875093 | |
| Recombinant Mouse GM-CSF | Solarbio | P00184 | |
| Recombinant Mouse IL-4 | Solarbio | P00196 | |
| TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | 156603 |
References
- Huang, M. N., et al. Antigen-loaded monocyte administration induces potent therapeutic antitumor T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 774-788 (2020).
- Wang, P., Dong, S., Zhao, P., He, X., Chen, M. Direct loading of CTL epitopes onto MHC class I complexes on dendritic cell surface in vivo. Biomaterials. 182, 92-103 (2018).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Jiang, P. L., et al. Galactosylated liposome as a dendritic cell-targeted mucosal vaccine for inducing protective anti-tumor immunity. Acta Biomaterialia. 11, 356-367 (2015).
- Shi, Y., et al. Next-generation immunotherapies to improve anticancer immunity. Frontiers in Pharmacology. 11, 566401 (2020).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Son, Y. I., et al. A novel bulk-culture method for generating mature dendritic cells from mouse bone marrow cells. Journal of Immunological Methods. 262 (1-2), 145-157 (2002).
- Guo, L., et al. Fusion protein vaccine based on Ag85B and STEAP1 induces a protective immune response against prostate cancer. Vaccines. 9 (7), 786 (2021).
- Olweus, J., et al. Dendritic cell ontogeny: A human dendritic cell lineage of myeloid origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (23), 12551-12556 (1997).
- Martin, P., et al. Concept of lymphoid versus myeloid dendritic cell lineages revisited: both CD8alpha(-) and CD8alpha(+) dendritic cells are generated from CD4(low) lymphoid-committed precursors. Blood. 96 (-), 2511-2519 (2000).
- Anderson, D. A., Dutertre, C. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function. Nature Reviews: Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).
- Vu Manh, T. P., Bertho, N., Hosmalin, A., Schwartz-Cornil, I., Dalod, M. Investigating evolutionary conservation of dendritic cell subset identity and functions. Frontiers in Immunology. 6, 260 (2015).
- Scheicher, C., Mehlig, M., Zecher, R., Reske, K. Dendritic cells from mouse bone marrow: in vitro differentiation using low doses of recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Journal of Immunological Methods. 154 (2), 253-264 (1992).
- Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
- Mayordomo, J. I., et al. marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nature Medicine. 1 (12), 1297-1302 (1995).
- Condon, C., Watkins, S. C., Celluzzi, C. M., Thompson, K., Falo, L. D. DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells. Nature Medicine. 2 (10), 1122-1128 (1996).
- Brunner, G. A., et al. Post-prandial administration of the insulin analogue insulin aspart in patients with type 1 diabetes mellitus. Diabetic Medicine. 17 (5), 371-375 (2000).
- Koido, S., et al. Induction of antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1 RNA. Journal of Immunology. 165 (10), 5713-5719 (2000).
- Jonasson, P. S., et al. Strength of the porcine proximal femoral epiphyseal plate: The effect of different loading directions and the role of the perichondrial fibrocartilaginous complex and epiphyseal tubercle - An experimental biomechanical study. Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 4 (2014).
- Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. Journal of Immunology. 162 (1), 168-175 (1999).
- Hinkel, A., et al. Immunomodulatory dendritic cells generated from nonfractionated bulk peripheral blood mononuclear cell cultures induce growth of cytotoxic T cells against renal cell carcinoma. Journal of Immunotherapy. 23 (1), 83-93 (2000).
