Summary
여기에서는 10 ng / mL GM-CSF / IL-4로 7 일 배양 한 후 마우스에서 고순도 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 생성하는 경제적이고 효율적인 방법을 제시합니다.
Abstract
수지상 세포 (DCs)에 대한 수요는 면역학 연구가 진행됨에 따라 점차 증가하고 있습니다. 그러나 DC는 모든 조직에서 드뭅니다. DC를 분리하는 전통적인 방법은 주로 과립구 - 대식세포 콜로니 자극 인자 / 인터루킨 -4 (GM-CSF / IL-4)의 다량 (>10 ng / mL)을 주입하여 골수 (BM) 분화를 유도하여 절차가 복잡하고 비용이 많이 듭니다. 이 프로토콜에서, 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 배지에서 배양된 모든 BM 세포를 사용하여, 3-4 반배양 교환 후, 마우스(2개의 대퇴골) 당 최대 2.7 x 107개의 CD11c+ 세포(DCs)를 80%-95%의 순도로 수확하였다. 배양 10일 후, CD11c, CD80, 및 MHC II의 발현은 증가한 반면, 세포의 수는 감소하였다. 세포의 수는 배양 7일 후에 최고조에 달했다. 더욱이, 이 방법은 모든 골수 세포를 수확하는 데 10분 밖에 걸리지 않았으며, 배양 1주일 후에 많은 수의 DC가 얻어졌다.
Introduction
Dendritic 세포 (DCs)는 나이브 T 세포를 활성화시키고 감염성 질환, 알레르기 질환 및 종양 세포 1,2,3에 대한 특이적 세포독성 T 림프구 (CTL) 반응을 유도하는 가장 강력한 항원 제시 세포 (APCs)입니다. DC는 선천적 면역과 적응 면역 사이의 주요 연결 고리이며 면역 방어 및 면역 관용의 유지에 필수적인 역할을합니다. 지난 40 년 동안 많은 연구자들은 DC의 하위 집합과 염증과 면역에서의 기능을 정의하려고 노력해 왔습니다. 이러한 연구에 따르면, DC는 골수 세포에서 골수성 및 림프계 혈통을 따라 발달합니다. 종양 백신은 최근 몇 년 동안 중요한 이정표를 얻었으며 유망한 미래를 가지고 있습니다. 기계적으로 종양 백신은 면역 반응을 조절하고 종양 항원을 사용하여 세포독성 T 림프구를 활성화시켜 종양 성장을 방지합니다. DC를 기반으로 한 백신은 종양 면역 요법에서 중요한 역할을하며 가장 유망한 항 종양 요법 1,4 중 하나로 확인되었습니다. 또한, DC는 새로운 분자 표적 약물 및 면역 체크포인트 억제제5의 시험에 널리 사용되어 왔다.
연구자들은 DC의 역할을 더 연구하기 위해 많은 수의 고순도 DC가 시급히 필요합니다. 그러나 DC는 다양한 조직과 혈액에서 드물며 인간과 동물의 혈액 세포의 1 % 만 차지합니다. 골수 수지상 세포 (BMDC)의 시험관내 배양은 다량의 DC 세포를 얻기 위한 중요한 방법이다. 한편, 골수에서 DC를 생성하기위한 Lutz 프로토콜은 연구자6에 의해 널리 사용되었습니다. 프로토콜은 DC 세포를 얻는 데 효과적이지만, 고농도의 사이토 카인의 첨가와 적혈구의 용해를 포함하는 복잡하고 비쌉니다.
본 연구에서, 우리는 마우스 골수(BM)로부터 거의 모든 골수 세포를 단리하고 GM-CSF 및 IL-4의 더 낮은 농도로 시험관 내에서 배양한 후 7-9일 후에 BMDC로의 분화를 유도하는 방법을 보고하였다. 이 절차는 거의 모든 골수 세포를 수확하고 완전한 배지에 현탁하는 데 10 분 밖에 걸리지 않습니다. 간단히 말해서, 우리는이 연구에서 BMDC에 대한 효율적이고 비용 효율적인 배양 방법을 제공합니다.
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Protocol
모든 절차는 난징 의과 대학 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다.
1. 골수의 분리 및 BM 세포의 준비
- CO2 질식을 통해 C57BL/6 마우스(18-22 g, 6-8주령)를 희생시킨다. 마우스 수술대에서 마우스를 고정합니다. 표면을 70 % 에탄올로 소독하십시오.
- 다리의 피부를 잘라 근육과 대퇴 동맥을 노출시킵니다. 두 개의 집게를 사용하여 대퇴 동맥을 클램프하고 찢어 낸 다음 근위 끝을 복부쪽으로 당깁니다.
참고 : 대퇴 동맥을 직접 자르지 마십시오. 그렇지 않으면 과도한 출혈을 일으키고 시야를 오염시킵니다. - 대퇴골 주변의 모든 근육을 자르십시오.
- 고관절 탈구 소리가 들리고 대퇴골 머리 탈출증이 보일 때까지 마우스의 하지를 바깥쪽으로 천천히 뻗습니다.
- 대퇴골 머리 안쪽을 따라 가위를 사용하여 하지를 몸에서 분리하십시오.
- 무릎 관절 끝에서 뒷다리를 잘라 자유롭고 완전한 대퇴골을 얻으십시오.
- 거즈를 사용하여 대퇴골에 붙어있는 근육을 제거하십시오.
참고: 근육을 직접 찢지 마십시오. 생쥐의 대퇴골은 섬세하며 무결성을 유지해야합니다. - 대퇴골을 75 % 알코올에 2-5 분 동안 담그십시오.
2. BMDC의 유도 배양
- 잔류 알코올을 PBS로 헹구십시오. 지혈 포셉을 사용하여 대퇴골의 중간 및 하단 부분을 고정하고 다른 세트는 대퇴골의 하단을 고정시킵니다. 지혈 포셉은 대퇴골에 옆으로 적용되고, 대퇴골은 epiphyseal 라인에서 분리됩니다.
참고 : epiphyseal 라인은 대퇴골 골절까지 쉽게 볼 수 없습니다. 이 단계와 다음 단계는 모두 멸균 환경에서 수행됩니다. - 1 mL 주사기 (바늘 : 0.6 mm x 25 mm)를 사용하여 epiphyseal 라인 브레이크에서 골수강을 관통하고 바늘을 회전시켜 대퇴골 머리와 골수강을 관통하십시오. 맥박을 내고 뼈가 하얗게 될 때까지 GM-CSF/IL-4가 들어있는 완전한 배지 1mL를 사용하여 골수강을 플러시합니다.
참고: 완전 배양 배지: 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 55 μM β-메르캅토에탄올, 10 ng/mL GM-CSF 및 10 ng/mL IL-4. - 모든 세포를 24 mL의 완전한 배양 배지 (~ 5 x 105 세포 / mL)에 재현탁하십시오. 혼합 후, 모든 배지를 4 mL/웰로 6-웰 플레이트 상에 시딩한 다음, 2일 동안 5%CO2 와 함께 37°C에서 인큐베이션하였다.
참고 : 적혈구를 용해시킬 필요는 없습니다. - 2 일 후에 모든 배지를 GM-CSF / IL-47을 함유 한 배지로 교체하십시오. 네 번째, 여섯 번째 및 여덟 번째 날에 배지의 절반을 10 ng / mL GM-CSF / IL-4를 포함하는 완전한 배지로 교체하십시오.
참고: 이 단계에서는 적혈구 및 림프구와 같은 부유 세포가 제거됩니다. - 세포 성장을 기록하기 위해 매일 사진을 찍으십시오. 여섯 번째 날부터 시작하여 하루에 한 웰의 세포를 수확하여 세포 수를 계수하고 CD11c, CD80 및 MHC II 발현 6,7을 검출한다.
3. CD11c, CD80, 및 MHC II의 발현의 유세포 검출
- DCs를 PBS로 세척한 후, 1 x 106 세포를 FACS 완충액 100 μL에 재현탁시키고, 0.5 μg의 항-마우스 CD16/32 항체를 첨가하고, 얼음 상에서 10분 동안 인큐베이션하여 비특이적 항원 부위를 차단한다.
- 1 μg의 Percp/cy5.5-CD11c, 0.5 μg의 PE-CD80 및 0.04 μg의 APC-MHC II 항체를 첨가하고, 30분 동안 얼음 상에서 인큐베이션한다.
- 4°C에서 3분 동안 1,000 x g에서 원심분리하고, 상층액을 제거하고, 4% 파라포름알데히드 1 mL를 첨가하고, 4°C에서 30분 동안 고정하고, FACS 완충액 300 μL에 재현탁시킨다.
- 유세포 분석기를 수행합니다.
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Representative Results
1 x 10 7-1.7 x 107 세포를 두 개의 대퇴골로부터 추출하고, 6-웰 플레이트에 심기 전에 24 mL의 배지에 재현탁시켰다 (도 1A). 2일 후, 비부착성 세포는 배양 배지를 완전히 변경하여 제거하였다. 배지를 변경하기 전에, 상당한 수의 현탁된 세포가 관찰되었다(도 1B). 배양 3일 후, 작은 세포 콜로니가 형성되기 시작했다. 여섯째 날, 식민지의 크기와 수가 크게 증가했다. 일곱째 날, 세포 수는 최고조에 달했고(22 x 10 6-27 x 106) 점차 떨어졌다(그림 2A). DC 세포의 표면은 더 긴 슈도포디아로 거칠어졌고, 전형적인 성숙한 DC 세포 형태를 나타내었다(도 2B). 유세포 분석 결과, 총 세포에 대한 CD11c 양성의 비율은 여섯째 날에 71%인 반면, 그 비율은 열째 날에 96.1%로 증가한 것으로 나타났다(도 2C,2D).
공동자극 분자의 발현을 평가하기 위해, CD11c, CD80, 및 MHC II를 공동-염색하였다8. 도 3A에 나타낸 바와 같이, CD11c, CD80, 및 MHC II의 발현은 6일째부터 10일째까지 배양 시간이 증가함에 따라 점차 증가하였다. 추가적으로, 유세포 분석 결과, CD11c 및 CD80 이중 양성, CD11c 및 MHCII 이중 양성 (도 3B, 3D) 및 삼중 양성 세포 (도 3C, 3D)의 비율이 점진적으로 증가한 것으로 나타났다.
그림 1: 서로 다른 배양 시간에서의 DC의 대표적인 이미지 . (A) BMDC를 배양하는 흐름도. (B) 서로 다른 배양 시간에 DC의 대표적인 이미지. 골수 세포를 10 ng/mL GM-CSF 및 IL-4와 함께 24 mL의 배지에 현탁시키고 6-웰 플레이트에 시딩하였다. BF, 배양 배지를 변경하기 전에; AF, 배양 배지를 변경한 후. 빨간색 화살표, DC 식민지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2: 상이한 배양 시간에서의 DCs의 수 및 순도. (A) 모든 배양 배지에서의 총 세포 수. (B) DCs의 대표적인 이미지. (C,D) DCs의 비율의 분석의 유세포 측정 및 그래픽 표현. 양성 세포는 CD11c에 의해 분류되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3: DCs에서의 공동자극 분자의 발현. (A) DCs에서 CD11c, CD80, 및 MHC ΙΙ의 발현. (B) CD11c 및 CD80 이중 양성, CD11c 및 MHC ΙΙ 이중 양성, 및 삼중 양성 세포의 비율에 대한 유세포 분석. (C, D) 6일째부터 10일째까지의 유세포 분석 및 통계적 분석을 보여주는 그래픽 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
인간과 마우스는 고전적 DC (cDC1 및 cDC2를 포함한 cDC) 혈장 세포질 세포 ID (pDCs) 및 단핵구 유래 DC (MoDCs) 9,10,11을 포함하여 서로 다른 DC 서브 세트를 갖는다. cDC1s는 세포내 병원체 및 암에 대한 세포독성 T 림프구 (CTL) 반응을 조절하고, cDC2는 세포외 병원체, 기생충 및 알레르겐12에 대한 면역 반응을 조절한다는 것이 일반적으로 인정된다. 상당한 수의 DC는 GM-CSF 및 IL-4 6,13,14의 존재하에 마우스에서 BM 전구 세포 로부터 시험관내에서 생산될 수 있다. DC의 순도와 양은 성공적인 DC 면역 요법에서 중요한 역할을합니다. 연구자들은 1 x 105 ~ 1 x 10 6 DC의 두 가지 용량이 이종이식 편 모델15,16,17,18에서 효율적인 세포독성 T 림프구 (CTL) 반응을 유도 할 수 있음을 보여주었습니다. 이는 종양 면역 요법에서 DC의 역할을 더 조사하기 위해 많은 수의 고순도 DC를 배양해야한다는 것을 의미합니다.
골수 세포를 얻는 전통적인 방법은 대퇴골의 두 끝을 자르고 배지 6,7로 헹구는 것입니다. 이 연구에서, 우리는 대퇴골을 절단하기 위해 생리적 해부학 적 구조를 혁신적으로 사용했습니다. 지혈 포셉은 대퇴골의 하단을 고정시키고 옆으로 이동시키는 데 사용되었습니다. epiphyseal 라인은 생리 학적으로 약하여 스트레스를받을 때 골절에 취약합니다19. 대퇴골이 epiphyseal 라인에서 분리 된 후, 소량의 뼈가 골수 구멍에 남아 있습니다. 바늘은 골수강으로 뼈를 쉽게 관통 할 수 있습니다. 이 방법은 조작이 간단하고, 귀중한 골수 세포를 보호하며, 많은 수의 DC를 배양하기위한 세포 기반을 제공합니다. 우리는 10 ng / mL GM-CSF 및 10 ng / mL IL-4의 조합을 사용하여 DC를 배양했으며, 이는 GM-CSF 단독보다 DC의 성숙에 더 많은 기여를합니다. Labeur 및 Son은 DCs의 배지에서 GM-CSF와 IL-4의 병용은 IFN-ɣ, TNF-α 및 IL-6과 같은 성숙 마커의 더 높은 발현을 유도하고, 향상된 항원 제시능 7,20,21을 유도한다고 보고하였다. Son et al.은 또한 GM-CSF와 IL-4의 조합이 DCs 7,21의 성숙을 촉진한다고 제안했다.
이 연구에서, 우리는 적혈구를 용해시키지 않고 수집 된 골수 세포를 직접 배양하고 구배 원심분리에 의해 분리하여 세포 손실을 초래할 수 있으며 궁극적으로 수확 된 DC의 감소를 초래할 수 있습니다. 배지가 변경되기 전에, 적혈구, T 세포, B 세포 및 과립구를 포함하는 배양 시스템에 몇몇 현탁 세포가 있었다. 공동 배양 동안, 이들 세포는 DCs의 성숙을 촉진하기 위해 사이토카인을 생산할 수 있다.
한계의 관점에서,이 프로토콜은 더 작은 tibias를 제외하고 마우스의 두 대퇴골 만 사용했기 때문에 일부 중간엽 줄기 세포가 손실되었습니다. 요컨대, 우리는 쥐로부터 골수 유래 수지상 세포를 분리하고 생성하기위한 비용 효율적이고 효율적인 프로토콜을 개발했으며, 골수 세포를 분리하는 데 10 분 밖에 걸리지 않습니다. 많은 수의 고순도 DC를 10 ng/mL의 GM-CSF 및 IL-4와 함께 6일 내지 7일간 인큐베이션 후에 수확하였다.
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Disclosures
모든 저자는 이해 상충이 없으며 공개 할 것이 없다고 선언합니다.
Acknowledgments
이 작업은 천진 과학 기술 계획 프로그램 (20JCQNJC00550), 천진 보건 과학 기술 프로젝트 (TJWJ202021QN033 및 TJWJ202021QN034)의 지원을 받았다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-Mercaptoethanol | Solarbio | M8211 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| APC-MHC II | Biolegend | 116417 | |
| FBS | Gibco | 10100 | |
| PE-CD80 | Biolegend | 104707 | |
| Penicillin-Streptomycin | Solarbio | P1400 | |
| Percp/cy5.5-CD11c | Biolegend | 117327 | |
| PRMI-1640 | Thermo | 11875093 | |
| Recombinant Mouse GM-CSF | Solarbio | P00184 | |
| Recombinant Mouse IL-4 | Solarbio | P00196 | |
| TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | 156603 |
References
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