Summary
Här presenterar vi en ekonomisk och effektiv metod för att isolera och generera benmärgsbaserade dendritiska celler med hög renhet från möss efter 7 dagars odling med 10 ng / ml GM-CSF / IL-4.
Abstract
Efterfrågan på dendritiska celler (DC) ökar gradvis när immunologiforskningen fortskrider. DC är dock sällsynta i alla vävnader. Den traditionella metoden för att isolera DC innebär främst att inducera benmärgsdifferentiering (BM) i DC genom att injicera stora doser (>10 ng / ml) av granulocyt-makrofagkolonistimulerande faktor / interleukin-4 (GM-CSF / IL-4), vilket gör proceduren komplex och dyr. I detta protokoll, med användning av alla BM-celler odlade i 10 ng / ml GM-CSF / IL-4-medium, efter 3-4 halvodlingsutbyten, skördades upp till2,7 x 10 7 CD11c + -celler (DC) per mus (två lårben) med en renhet av 80% -95%. Efter 10 dagar i odling ökade uttrycket av CD11c, CD80 och MHC II, medan antalet celler minskade. Antalet celler toppade efter 7 dagars odling. Dessutom tog denna metod bara 10 minuter att skörda alla benmärgsceller, och ett stort antal DC erhölls efter 1 veckas odling.
Introduction
Dendritiska celler (DC) är de mest kraftfulla antigenpresenterande cellerna (APC) för att aktivera naiva T-celler och inducera specifika cytotoxiska T-lymfocytsvar (CTL) mot infektionssjukdomar, allergisjukdomar och tumörceller 1,2,3. DC är den primära länken mellan medfödd immunitet och adaptiv immunitet och spelar en viktig roll i immunologiskt försvar och upprätthållandet av immuntolerans. Under de senaste 40 åren har många forskare försökt definiera delmängderna av DC och deras funktioner vid inflammation och immunitet. Enligt dessa studier utvecklas DC längs myeloida och lymfoida linjer från benmärgsceller. Tumörvacciner har fått betydande milstolpar de senaste åren och har en lovande framtid. Mekaniskt modulerar tumörvacciner immunsvaret och förhindrar tumörtillväxt genom att aktivera cytotoxiska T-lymfocyter med hjälp av tumörantigener. Vaccinet baserat på DC spelar en viktig roll i tumörimmunterapi och har identifierats som en av de mest lovande antitumörterapierna 1,4. Dessutom har DC använts i stor utsträckning vid testning av nya molekylära riktade läkemedel och immunkontrollpunktshämmare5.
Forskare behöver brådskande ett stort antal DC med hög renhet för att ytterligare studera DC: s roll. DC är dock sällsynta i olika vävnader och blod och står för endast 1% av blodkropparna hos människor och djur. In vitro-odling av benmärgsdendritiska celler (BMDC) är en viktig metod för att erhålla stora mängder LIKSTRÖMsceller. Under tiden har Lutz-protokollet för att generera DC från benmärg använts i stor utsträckning av forskare6. Även om protokollet är effektivt för att erhålla LIKSTRÖM-celler är det komplext och dyrt, vilket involverar tillsats av höga koncentrationer av cytokiner och lys av röda blodkroppar.
I denna studie rapporterar vi en metod för att isolera nästan alla benmärgsceller från musbenmärg (BM) och inducera differentiering till BMDC efter 7-9 dagars inkubation in vitro, med en lägre koncentration av GM-CSF och IL-4. Denna procedur tar bara 10 minuter att skörda nästan alla benmärgsceller och att suspendera dem i ett komplett medium. I korthet tillhandahåller vi en effektiv och kostnadseffektiv odlingsmetod för BMDC i denna forskning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer godkändes av Nanjing Medical University Animal Care and Use Committee.
1. Isolering av benmärg och beredning av BM-celler
- Offra C57BL/6 möss (18-22 g, 6-8 veckor gamla) via CO 2-kvävning. Fixa musen på musens operationsbord. Desinficera ytorna med 70% etanol.
- Skär benets hud för att exponera musklerna och lårbensartären. Kläm fast och riv av lårbensartären med två pincett och dra sedan den proximala änden mot buken.
OBS: Skär inte lårbensartären direkt. Annars kommer det att orsaka överdriven blödning och förorena synfältet. - Skär alla muskler runt lårbenet.
- Sträck långsamt musens nedre extremiteter utåt tills ljudet av höftledsförskjutning hörs och lårbenets prolaps är synligt.
- Separera underbenen från kroppen med sax längs insidan av lårbenet.
- Skär bakbenen från slutet av knäleden för att få ett fritt och komplett lårben.
- Ta bort musklerna som är fästa vid lårbenet med gasväv.
OBS: Riv inte musklerna direkt. Mössens lårben är känsligt, dess integritet måste bibehållas. - Sänk ner lårbenet i 75% alkohol i 2-5 min.
2. Induktionskultur av BMDC
- Skölj restalkoholen med PBS. Använd hemostatiska pincett för att klämma fast den mellersta och nedre delen av lårbenet och en annan uppsättning för att klämma fast lårbenets nedre ände. De hemostatiska pincetterna appliceras i sidled på lårbenet, och lårbenet separeras från epifyslinjen.
OBS: Epifyslinjen är inte lätt synlig förrän lårbenet spricker. Detta och nästa steg utförs alla i en steril miljö. - Använd en 1 ml spruta (nål: 0,6 mm x 25 mm) för att tränga in i benmärgshålan från epifyslinjebrottet och rotera nålen för att tränga in i lårbenshuvudet och genom benmärgshålan. Pulsera och spola benmärgshålan med 1 ml av det kompletta mediet innehållande GM-CSF/IL-4 tills benet blir vitt.
OBS: Komplett odlingsmedium: 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin, 55 μM β-merkaptoetanol, 10 ng / ml GM-CSF och 10 ng / ml IL-4. - Resuspend alla celler i 24 ml komplett odlingsmedium (~ 5 x 105 celler / ml). Efter blandning såddes allt medium på en 6-brunnsplatta med 4 ml/brunn och inkuberades sedan vid 37 °C med 5 % CO2 i 2 dagar.
OBS: Det är inte nödvändigt att lysa erytrocyter. - Byt ut allt medium efter 2 dagar mot medium som innehåller GM-CSF/IL-47. På den fjärde, sjätte och åttonde dagen, ersätt hälften av mediet med hela mediet som innehåller 10 ng / ml GM-CSF / IL-4.
OBS: I detta steg avlägsnas suspenderade celler såsom erytrocyter och lymfocyter. - Ta bilder varje dag för att registrera celltillväxt. Från och med dag sex, skörda en brunn av celler per dag för att räkna cellnumret och detektera CD11c, CD80 och MHC II-uttryck 6,7.
3. Flödescytometrisk detektion av uttrycket av CD11c, CD80 och MHC II
- Efter tvättning av DC: erna med PBS, återsuspendera 1 x 106 celler i 100 μL FACS-buffert, tillsätt 0,5 μg antimus-CD16/32-antikropp och inkubera i 10 minuter på is för att blockera icke-specifika antigenställen.
- Tillsätt 1 μg Percp/cy5,5-CD11c, 0,5 μg PE-CD80 och 0,04 μg APC-MHC II-antikroppar och inkubera på is i 30 minuter.
- Centrifug vid 1 000 x g i 3 min vid 4 °C, ta bort supernatanten, tillsätt 1 ml 4 % paraformaldehyd, fixera i 30 min vid 4 °C och suspendera igen i 300 μL FACS-buffert.
- Utför flödescytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De 1 x 10 7-1,7 x 107 cellerna extraherades från två lårben och suspenderades igen i 24 ml medium innan de planterades i en 6-brunnsplatta (figur 1A). Efter 2 dagar avlägsnades icke-vidhäftande celler genom att helt ändra odlingsmediet. Innan mediet byttes observerades ett signifikant antal suspenderade celler (figur 1B). Efter 3 dagars odling började småcellkolonier bildas. På den sjätte dagen ökade storleken och antalet kolonier avsevärt. På den sjunde dagen nådde antalet celler sin topp (22 x 10 6-27 x 106) och sjönk sedan gradvis (figur 2A). Dc-cellernas yta blev grov med längre pseudopodier och uppvisade typisk mogen DC-cellmorfologi (figur 2B). Flödescytometrisk analys visade att förhållandet mellan CD11c-positivt och totalt antal celler var 71% den sjätte dagen, medan förhållandet ökade till 96,1% den tionde dagen (Figur 2C,2D).
För att utvärdera uttrycket av samstimulerande molekyler samfärgades CD11c, CD80 och MHC II8. Som visas som figur 3A ökade uttrycket av CD11c, CD80 och MHC II gradvis med ökande odlingstid från dag 6 till dag 10. Dessutom visade flödescytometrisk analys en gradvis ökning av proportionerna av CD11c och CD80 dubbelpositiva, CD11c och MHCII dubbelpositiva (figur 3B,3D) och trippelpositiva celler (figur 3C,3D).
Figur 1: Representativa bilder av DC vid olika kulturtider. (A) Flödesschema för odling av BMDC. (B) Representativa bilder av DC vid olika kulturtider. Benmärgsceller suspenderades i 24 ml odlingsmedium med 10 ng / ml GM-CSF och IL-4 och såddes i en 6-brunnsplatta. BF, innan du byter kulturmedium; AF, efter att ha bytt kulturmedium. Röd pil, DC-koloni. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Antal och renhet hos DC vid olika odlingstider. (A) Totalt antal celler i alla odlingsmedier. (B) Representativa bilder av DCs. (C,D) Flödescytometrisk och grafisk representation av analysen av andelen DC. Positiva celler sorterades efter CD11c. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Uttrycket av samstimulerande molekyler i DC. (A) Uttrycket av CD11c, CD80 och MHC ΙΙ i DC. (B) Flödescytometrisk analys av andelen CD11c och CD80 dubbelpositiva, CD11c och MHC ΙΙ dubbelpositiva och trippelpositiva celler. (C, D) Flödescytometrisk analys från dag 6- dag 10 och grafisk representation för att visa den statistiska analysen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Människor och möss har olika DC-delmängder, inklusive klassiska DC (cDC, inklusive cDC1s och cDC2s) plasmacytoid DC (pDC) och monocyt-härledda DC (MoDC) 9,10,11. Det är allmänt accepterat att cDC1s reglerar cytotoxiska T-lymfocytsvar (CTL) på intracellulära patogener och cancer, och cDC2s reglerar immunsvar mot extracellulära patogener, parasiter och allergener12. Ett betydande antal DC kan framställas in vitro från BM-stamceller hos möss i närvaro av GM-CSF och IL-4 6,13,14. Renheten och kvantiteten av DC spelar nyckelroller i framgångsrik DC-immunterapi. Forskare har visat att två doser av 1 x 105 till 1 x 106 DC kan framkalla effektiva cytotoxiska T-lymfocytsvar (CTL) i en xenograftmodell 15,16,17,18. Detta innebär att ett stort antal DC med hög renhet måste odlas för att ytterligare undersöka DC: s roll i tumörimmunterapi.
Den traditionella metoden för att erhålla benmärgsceller är att skära lårbenets två ändar och skölja med mediet 6,7. I denna studie använde vi innovativt fysiologiska anatomiska strukturer för att skära lårbenet. Hemostatiska pincett användes för att klämma fast lårbenets nedre ände och flytta den i sidled. Epifyslinjen är fysiologiskt svag, vilket gör dem mottagliga för frakturer när de stressas19. Efter att lårbenet har separerats från epifyslinjen kvarstår en liten mängd ben i märghålan. Nålen kan lätt tränga in i benet i benmärgshålan. Metoden är enkel att använda, skyddar värdefulla benmärgsceller och ger en cellulär grund för odling av ett stort antal DC. Vi odlade DC: erna med en kombination av 10 ng / ml GM-CSF och 10 ng / ml IL-4, vilket bidrar mer till mognaden av DC än GM-CSF ensam. Labeur och Son rapporterade att den kombinerade användningen av GM-CSF och IL-4 i dc-mediet inducerade högre uttryck av mognadsmarkörer, såsom IFN-ɣ, TNF-α och IL-6, och förbättrad antigenpresenterande förmåga 7,20,21. Son et al. föreslog också att kombinationen av GM-CSF och IL-4 främjar mognaden av DCs 7,21.
I denna studie odlade vi direkt de uppsamlade benmärgscellerna utan att lysa erytrocyterna och separerade dem genom gradientcentrifugering, vilket kan leda till cellförlust och i slutändan till en minskning av skördade DC. Innan mediet ändrades fanns det flera suspenderande celler i odlingssystemet, inklusive erytrocyter, T-celler, B-celler och granulocyter. Under samodling kan dessa celler producera cytokiner för att främja mognad av DC.
När det gäller begränsningar använde detta protokoll endast två lårben i musen, exklusive de mindre tibierna, vilket resulterade i förlust av vissa mesenkymala stamceller. Kort sagt, vi utvecklade ett kostnadseffektivt och effektivt protokoll för isolering och generering av benmärgs-härledda dendritiska celler från möss, vilket bara tar 10 minuter att separera benmärgsceller. Ett stort antal DC med hög renhet skördades efter 6 dagar till 7 dagars inkubation med 10 ng/ml GM-CSF och IL-4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Alla författare förklarar att de inte har några intressekonflikter och att de inte har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Program of Tianjin Science and Technology Plan (20JCQNJC00550), Tianjin Health Science and Technology Project (TJWJ202021QN033 och TJWJ202021QN034).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| β-Mercaptoethanol | Solarbio | M8211 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 | |
| APC-MHC II | Biolegend | 116417 | |
| FBS | Gibco | 10100 | |
| PE-CD80 | Biolegend | 104707 | |
| Penicillin-Streptomycin | Solarbio | P1400 | |
| Percp/cy5.5-CD11c | Biolegend | 117327 | |
| PRMI-1640 | Thermo | 11875093 | |
| Recombinant Mouse GM-CSF | Solarbio | P00184 | |
| Recombinant Mouse IL-4 | Solarbio | P00196 | |
| TruStain Fc PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody | Biolegend | 156603 |
References
- Huang, M. N., et al. Antigen-loaded monocyte administration induces potent therapeutic antitumor T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 774-788 (2020).
- Wang, P., Dong, S., Zhao, P., He, X., Chen, M. Direct loading of CTL epitopes onto MHC class I complexes on dendritic cell surface in vivo. Biomaterials. 182, 92-103 (2018).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392 (6673), 245-252 (1998).
- Jiang, P. L., et al. Galactosylated liposome as a dendritic cell-targeted mucosal vaccine for inducing protective anti-tumor immunity. Acta Biomaterialia. 11, 356-367 (2015).
- Shi, Y., et al. Next-generation immunotherapies to improve anticancer immunity. Frontiers in Pharmacology. 11, 566401 (2020).
- Lutz, M. B., et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Journal of Immunological Methods. 223 (1), 77-92 (1999).
- Son, Y. I., et al. A novel bulk-culture method for generating mature dendritic cells from mouse bone marrow cells. Journal of Immunological Methods. 262 (1-2), 145-157 (2002).
- Guo, L., et al. Fusion protein vaccine based on Ag85B and STEAP1 induces a protective immune response against prostate cancer. Vaccines. 9 (7), 786 (2021).
- Olweus, J., et al. Dendritic cell ontogeny: A human dendritic cell lineage of myeloid origin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (23), 12551-12556 (1997).
- Martin, P., et al. Concept of lymphoid versus myeloid dendritic cell lineages revisited: both CD8alpha(-) and CD8alpha(+) dendritic cells are generated from CD4(low) lymphoid-committed precursors. Blood. 96 (-), 2511-2519 (2000).
- Anderson, D. A., Dutertre, C. A., Ginhoux, F., Murphy, K. M. Genetic models of human and mouse dendritic cell development and function. Nature Reviews: Immunology. 21 (2), 101-115 (2021).
- Vu Manh, T. P., Bertho, N., Hosmalin, A., Schwartz-Cornil, I., Dalod, M. Investigating evolutionary conservation of dendritic cell subset identity and functions. Frontiers in Immunology. 6, 260 (2015).
- Scheicher, C., Mehlig, M., Zecher, R., Reske, K. Dendritic cells from mouse bone marrow: in vitro differentiation using low doses of recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Journal of Immunological Methods. 154 (2), 253-264 (1992).
- Brasel, K., De Smedt, T., Smith, J. L., Maliszewski, C. R. Generation of murine dendritic cells from flt3-ligand-supplemented bone marrow cultures. Blood. 96 (9), 3029-3039 (2000).
- Mayordomo, J. I., et al. marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nature Medicine. 1 (12), 1297-1302 (1995).
- Condon, C., Watkins, S. C., Celluzzi, C. M., Thompson, K., Falo, L. D. DNA-based immunization by in vivo transfection of dendritic cells. Nature Medicine. 2 (10), 1122-1128 (1996).
- Brunner, G. A., et al. Post-prandial administration of the insulin analogue insulin aspart in patients with type 1 diabetes mellitus. Diabetic Medicine. 17 (5), 371-375 (2000).
- Koido, S., et al. Induction of antitumor immunity by vaccination of dendritic cells transfected with MUC1 RNA. Journal of Immunology. 165 (10), 5713-5719 (2000).
- Jonasson, P. S., et al. Strength of the porcine proximal femoral epiphyseal plate: The effect of different loading directions and the role of the perichondrial fibrocartilaginous complex and epiphyseal tubercle - An experimental biomechanical study. Journal of Experimental Orthopaedics. 1 (1), 4 (2014).
- Labeur, M. S., et al. Generation of tumor immunity by bone marrow-derived dendritic cells correlates with dendritic cell maturation stage. Journal of Immunology. 162 (1), 168-175 (1999).
- Hinkel, A., et al. Immunomodulatory dendritic cells generated from nonfractionated bulk peripheral blood mononuclear cell cultures induce growth of cytotoxic T cells against renal cell carcinoma. Journal of Immunotherapy. 23 (1), 83-93 (2000).
