Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Imaging dal vivo e quantificazione dell'infezione virale in topi transgenici K18 hACE2 utilizzando SARS-CoV-2 ricombinante che esprime reporter

Published: November 5, 2021 doi: 10.3791/63127
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Texas Biomedical Research Institute

Summary

Questo protocollo descrive la dinamica delle infezioni virali utilizzando la luciferasi e la fluorescenza che esprimono la ricombinante (r)SARS-CoV-2 e un sistema di imaging in vivo (IVIS) in topi transgenici K18 hACE2 per superare la necessità di approcci secondari necessari per studiare le infezioni da SARS-CoV-2 in vivo.

Abstract

La pandemia di coronavirus 2019 (COVID-19) è stata causata dalla sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Ad oggi, SARS-CoV-2 è stato responsabile di oltre 242 milioni di infezioni e più di 4,9 milioni di morti in tutto il mondo. Analogamente ad altri virus, lo studio del SARS-CoV-2 richiede l'uso di metodi sperimentali per rilevare la presenza di virus in cellule infette e/o in modelli animali. Per superare questa limitazione, abbiamo generato una ricombinante (r)SARS-CoV-2 competente per la replicazione che esprime proteine bioluminescenti (nanoluciferasi, Nluc) o fluorescenti (Venus). Questi rSARS-CoV-2 che esprimono reporter consentono di tracciare le infezioni virali in vitro e in vivo sulla base dell'espressione dei geni reporter Nluc e Venus. Qui lo studio descrive l'uso di rSARS-CoV-2 / Nluc e rSARS-CoV-2 / Venere per rilevare e tracciare l'infezione da SARS-CoV-2 nell'enzima murino transgenico K18 K18 umano di conversione dell'angiotensina 2 (hACE2) precedentemente descritto utilizzando sistemi di imaging in vivo (IVIS). Questo rSARS-CoV-2/Nluc e rSARS-CoV-2/Venus mostrano patogenicità rSARS-CoV-2/WT-like e replicazione virale in vivo. È importante sottolineare che l'espressione di Nluc e Venere ci consente di tracciare direttamente le infezioni virali in vivo ed ex vivo, nei topi infetti. Questi rSARS-CoV-2/Nluc e rSARS-CoV-2/Venus rappresentano un'opzione eccellente per studiare la biologia di SARS-CoV-2 in vivo, per comprendere l'infezione virale e la malattia COVID-19 associata e per identificare efficaci trattamenti profilattici e / o terapeutici per combattere l'infezione da SARS-CoV-2.

Introduction

La sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) è un virus a RNA avvolto, a senso positivo, a singolo filamento che appartiene al lignaggio Betacoronavirus della famiglia Coronaviridae 1. Questa famiglia virale è divisa in Alpha-, Beta-, Gamma-, e Delta-coronavirus1. Gli alfa e i betacoronavirus infettano principalmente i mammiferi, mentre il gamma e il deltacoronavirus infettano quasi esclusivamente gli uccelli2. Ad oggi, sette coronavirus (CoV) hanno attraversato le barriere delle specie ed sono emersi come coronavirus umani (HCoV): due alfa-CoV (HCoV-229E e HCoV-NL63) e cinque beta-CoV (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, coronavirus della sindrome respiratoria del Medio Oriente [MERS-CoV] e SARS-CoV-2)3,4,5,6. SARS-CoV, MERS-CoV e SARS-CoV-2 sono altamente patogeni, causando gravi infezioni del tratto respiratorio inferiore7. Prima dell'emergere di SARS-CoV-2, ci sono stati due focolai epidemici causati da CoV: SARS-CoV a Guangdong Providence, in Cina, dal 2002 al 2003, con un tasso di mortalità dei casi (CFR) di circa il 9,7%; e MERS-CoV in Medio Oriente dal 2012 ad oggi, con un CFR di circa il 34%7,8. SARS-CoV-2 ha un CFR complessivo tra il 3,4% e il 49%, con condizioni sottostanti che contribuiscono a un CFR 8,9 più elevato. Dalla sua scoperta nel dicembre 2019, a Wuhan, in Cina, SARS-CoV-2 è stato responsabile di oltre 242 milioni di infezioni umane e oltre 4,9 milioni di morti umane in tutto il mondo 7,10,11,12. In particolare, dalla fine del 2020, le nuove varianti di preoccupazione (VoC) e le varianti di interesse (VoI) di SARS-CoV-2 hanno avuto un impatto sulle caratteristiche del virus, tra cui la trasmissione e l'antigenicità 9,13, e sulla direzione generale della pandemia di COVID-19. Per il trattamento delle infezioni da SARS-CoV-2, attualmente esiste un solo Stati Uniti (USA) Food and Drug Administration (FDA) antivirale terapeutico (remdesivir) e un farmaco di autorizzazione all'uso di emergenza (EUA) (baricitinib, da somministrare in combinazione con remdesivir)14. Ci sono anche 6 anticorpi monoclonali EUA approvati: REGEN-COV (casirivimab e imdevimab, somministrati insieme), sotrovimab, tocilizumab e bamlanivimab ed etesevimab somministrati insieme 15,16,17,18,19. Attualmente esiste un solo vaccino profilattico approvato dalla FDA, Pfizer-BioNTech, e altri due vaccini profilattici (Moderna e Janssen) sono stati approvati dall'EUA 20,21,22,23,24. Tuttavia, con il tasso di infezione incontrollato e l'emergere di VoC e VoI, SARS-CoV-2 rappresenta ancora una minaccia per la salute umana. Pertanto, sono urgentemente necessari nuovi approcci per identificare profilattici e terapie efficienti per controllare l'infezione da SARS-CoV-2 e la pandemia di COVID-19 ancora in corso.

Lo studio di SARS-CoV-2 richiede tecniche laboriose e approcci secondari per identificare la presenza del virus in cellule infette e/o modelli animali di infezione convalidati. L'uso della genetica inversa ha permesso la generazione di virus ricombinanti per rispondere a domande importanti nella biologia delle infezioni virali. Ad esempio, le tecniche di genetica inversa hanno fornito mezzi per scoprire e comprendere i meccanismi di infezione virale, patogenesi e malattia. Allo stesso modo, gli approcci di genetica inversa hanno spianato la strada all'ingegnerizzazione di virus ricombinanti privi di proteine virali per comprendere il loro contributo nella patogenesi virale. Inoltre, sono state utilizzate tecniche di genetica inversa per generare virus ricombinanti che esprimono geni reporter per applicazioni in vitro e in vivo, compresa l'identificazione di approcci profilattici e/o terapeutici per il trattamento delle infezioni virali. Le proteine fluorescenti e bioluminescenti sono i geni reporter più comunemente usati grazie alla loro sensibilità, stabilità e facilità di rilevamento basata sul miglioramento delle nuove tecnologie25,26. In vitro, le proteine fluorescenti hanno dimostrato di servire come opzione migliore per la localizzazione dei virus nelle cellule infette, mentre le luciferasi sono più convenienti per gli studi di quantificazione 27,28,29. In vivo, le luciferasi sono preferite rispetto alle proteine fluorescenti per l'imaging di animali interi, mentre le proteine fluorescenti sono preferite per l'identificazione di cellule infette o l'imaging ex vivo 30,31,32. L'uso di virus ricombinanti che esprimono reporter è servito come un potente strumento per lo studio dei virus in molte famiglie, tra cui, tra gli altri, flavivirus, enterovirus, alfavirus, lentivirus, arenavirus e virus dell'influenza 28,33,34,35,36.

Per superare la necessità di approcci secondari per studiare SARS-CoV-2 e caratterizzare l'infezione da SARS-CoV-2 in tempo reale in vivo, abbiamo generato una riproduzione ricombinante (r)SARS-CoV-2 competente per la replicazione che esprime proteine bioluminescenti (nanoluciferasi, Nluc) o fluorescenti (Venere) utilizzando la nostra genetica inversa basata su cromosomi artificiali batterici (BAC) precedentemente descritta, che viene mantenuta come una singola copia in E. coli al fine di ridurre al minimo la tossicità delle sequenze virali durante la sua propagazione nei batteri37,38. In particolare, rSARS-CoV-2/Nluc e rSARS-CoV-2/Venus hanno mostrato patogenicità simile a rSARS-CoV-2/WT in vivo. L'alto livello di espressione di Venere da rSARS-CoV-2 /Venere ha permesso di rilevare l'infezione virale nei polmoni di topi transgenici K18 hACE2 infetti utilizzando un sistema di imaging in vivo (IVIS)39. I livelli di espressione di Venere si correlavano bene con i titoli virali rilevati nei polmoni, dimostrando la fattibilità dell'uso dell'espressione di Venere come valido surrogato dell'infezione da SARS-CoV-2. Utilizzando rSARS-CoV-2/Nluc, siamo stati in grado di tracciare la dinamica dell'infezione virale in tempo reale e valutare longitudinalmente l'infezione da SARS-CoV-2 in vivo utilizzando lo stesso approccio IVIS nei topi transgenici K18 hACE2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

I protocolli che coinvolgono topi transgenici K18 hACE2 sono stati approvati dal Texas Biomedical Research Institute (TBRI) Institutional Biosafety Committee (IBC) e dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Tutti gli esperimenti seguono le raccomandazioni contenute nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio del Consiglio Nazionale delleRicerche 40. Il dispositivo di protezione individuale (DPI) appropriato è necessario quando si lavora con i topi.

1. Uso di topi transgenici K18 hACE2

  1. Acquistare e mantenere topi femmina di 4-6 settimane B6.Cg-Tg (K18-ACE2) 2Prlmn / J (topi transgenici K18 hACE2) in una struttura di cura degli animali a livello di biosicurezza (BSL)-2 in condizioni specifiche prive di agenti patogeni.
    1. Dopo l'arrivo alle strutture BSL2, consentire agli animali di acclimatarsi per 7 giorni e trasferirli alla struttura per animali BSL-3 per infezioni e altre procedure sperimentali.
    2. Seguendo i protocolli IACUC, posizionare 4 topi per gabbia. Per garantire che l'animale sia deceduto, dopo l'infezione dei topi da rSARS-CoV-2 e imaging in vivo , eutanasizzare gli animali con una dose letale di Fatal-Plus (>100 mg/kg).

2. Biosicurezza

NOTA: In questo manoscritto, rSARS-CoV-2 viene generato utilizzando i sistemi genetici inversi basati su BAC per il ceppo SARS-CoV-2 USA-WA1/2020, come precedentemente descritto37. Tutte le procedure in vivo che coinvolgono infezioni da rSARS-CoV-2/Nluc o rSARS-CoV-2/Venere devono essere eseguite in un armadio di sicurezza biologica in condizioni BSL-3.

  1. Pulire l'armadio di biosicurezza con il 2% di wexicida e il 70% di etanolo disinfettante sequenzialmente prima e dopo aver eseguito tutte le procedure sperimentali descritte in questo articolo.
  2. Sterilizzare tutto il materiale di dissezione (forbici, pinze di dissezione, ecc.) e l'omogeneizzatore prima e dopo ogni utilizzo.
  3. Pulire la camera di isolamento e disinfettare utilizzando compresse MB10 prima e dopo ogni utilizzo secondo le istruzioni del produttore.
  4. Scartare tutto il materiale biologico prodotto durante le procedure secondo le linee guida IBC e IACUC.

3. Caratterizzazione in vivo di rSARS-CoV-2

  1. Infezioni da topi
    1. Metti topi transgenici K18 hACE2 di 4-6 settimane in gabbie etichettate, identifica i topi in ogni gabbia usando un codice di punzonatura auricolare e posiziona 4 topi per gabbia. Utilizzare un gruppo di topi per il peso corporeo e la sopravvivenza e un altro gruppo di animali per la titolazione virale e l'imaging.
    2. Prima dell'infezione, radere il torace dei topi sul lato ventrale dal capezzolo pettorale all'area del capezzolo inguinale per facilitare il segnale di bioluminescenza.
    3. Preparare l'inoculo rSARS-CoV-2 con 105 unità formanti placche (PFU)/topo in condizioni sterili in un volume totale di 50 μL utilizzando soluzione salina tampone fosfato sterile 1x (PBS).
      NOTA: Calcolare la quantità di rSARS-CoV-2 da utilizzare nella diluizione virale con la formula: virus necessario = (105 PFU per topo / 50 μL) x volume finale) / titolo virale di riserva.
    4. Mantenere l'inoculo del virus refrigerato sul ghiaccio.
    5. Utilizzare i topi infettati da simulazione (1x PBS) e rSARS-CoV-2 / WT-infetti come controlli interni. Metti i topi finti infetti in una gabbia separata rispetto ai topi infetti da rSARS-CoV-2.
    6. Anestetizzare i topi usando il 5% di sedazione gassosa isoflurano in una camera di anestesia e mantenere con il 3% di isoflurano.
    7. Una volta confermata la reazione posturale e il riflesso di raddrizzamento, posizionare il topo nella posizione di reclinazione dorsale.
    8. Scruffare il collo del topo tra l'indice e il pollice e tenere la coda contro il palmo della mano con il mignolo per tenere l'animale in posizione dorsale.
    9. Posizionare la punta della pipetta contenente 50 μL di inoculo virale nella narice ed espellere lentamente la soluzione. Assicurarsi che l'inoculo del virus venga inalato e che non vi sia reflusso osservando la scomparsa della goccia di inoculo.
  2. Monitoraggio della bioluminescenza K18 hACE2 topi transgenici infettati da rSARS-CoV-2/Nluc (Figura 1 e Figura 2)
    NOTA: questo esperimento segue la rappresentazione schematica e utilizza i virus visualizzati nella Figura 1. Per il sistema di imaging in vivo (IVIS) è necessario un attacco per anestesia isoflurano. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli degli strumenti e dei sistemi necessari.
    1. Avviare il software di imaging e impostare i parametri, fare clic sulla modalità immagine su Bioluminescenza, aprire il filtro e impostare il tempo di esposizione su auto.
    2. Dopo aver inizializzato la macchina IVIS, posizionare i mouse nella camera di isolamento mentre sono ancora all'interno dell'armadio di biosicurezza. Indurre topi con isoflurano a una concentrazione del 5%. Una volta confermata la perdita della reazione posturale e il riflesso di raddrizzamento, mantenere con il 3% di isoflurano.
    3. Una volta che i topi sono stati anestetizzati, rimuoverli dalla camera di isolamento e somministrare retro-orbitalmente il substrato della luciferasi diluito 1:10 in 1x PBS (volume finale 100 μL / topo) con un ago da 25 G.
    4. Dopo la somministrazione del substrato di luciferasi, riposizionare i topi nella camera di isolamento con il torace rivolto verso l'alto e la cavità nasale all'interno del multiplo per mantenere l'animale anestetizzato durante la procedura di imaging.
    5. Trasferire la camera di isolamento sulla macchina IVIS e, istantaneamente dopo aver chiuso lo sportello dell'imager IVIS, selezionare Acquisisci nel programma software da inizializzare (Figura 2A).
    6. Per analizzare le immagini di bioluminescenza acquisite, utilizzare lo strumento ROI (regione di interesse) nel software per designare il segnale preciso e misurare il flusso (Figura 2B).
    7. Clicca su Misura e consenti al sistema di iniziare a valutare la bioluminescenza nei fotoni per fornire l'emissione assoluta di fotoni paragonabile alle misure di uscita fornite dai vari parametri.
    8. Immagini di topi a 1, 2, 4 e 6 giorni dopo l'infezione.
    9. Dopo l'imaging, rimetti i topi in gabbia.
  3. Analisi di fluorescenza in topi transgenici K18 hACE2 infettati da rSARS-CoV-2/Venere (Figura 3 e Figura 4)
    NOTA: questo esperimento segue la rappresentazione schematica e rSARS-CoV-2 mostrati nella Figura 3. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli degli strumenti e dei sistemi necessari.
    1. Avviare il software di imaging e impostare i parametri, impostare l'eccitazione (500 nm) e i filtri di emissione (530 nm), fare clic sulla modalità immagine su Fluorescenza e impostare il tempo di esposizione su auto.
    2. Eutanasia intraperitoneale dei topi usando una dose letale di Fatal-Plus (>100 mg/kg). Dopo l'eutanasia, disinfettare il sito di incisione con etanolo al 70%.
    3. Usando una pinzetta, tirare la pelle, fare un'incisione dallo sterno all'addome e tagliare l'incisione dai lati con le forbici. Tagliare la vena epatica per ridurre al minimo la quantità di sangue nei polmoni ed evitare segnali di fondo elevati durante l'imaging.
    4. Usando le forbici, tagliare lo sterno e aprire la cassa toracica. Quindi, tagliare l'estremità della trachea con le forbici e rimuovere i polmoni con una pinzetta.
    5. Posizionare i polmoni asportati in una piastra a 6 pozzetti contenente 2 ml di PBS 1x e risciacquare per rimuovere il sangue in eccesso. Ridurre al minimo la possibilità di contaminazione tra i campioni disinfettando e pulendo gli strumenti chirurgici tra i campioni utilizzando il 70% di etanolo.
    6. Dopo aver inizializzato la macchina IVIS, posizionare i polmoni in un vassoio nero e separare i tessuti l'uno dall'altro.
    7. Posizionare il vassoio all'interno della camera di isolamento all'interno dell'armadio di biosicurezza, quindi trasferire la camera di isolamento all'IVIS. Chiudere la porta e fare clic su Acquisisci per avviare il sistema di imaging (Figura 4A).
    8. Per analizzare la fluorescenza, utilizzare lo strumento ROI e disegnare ROI attorno a ciascuno dei singoli polmoni. Misurare manualmente ogni ROI e quindi utilizzare i valori medi di efficienza radiante forniti e sottrarre da quelli dei topi finti infetti (Figura 4B).
    9. Una volta completata l'imaging, posizionare i tessuti sul ghiaccio per l'analisi dello stesso giorno o in un criotubo per il congelamento del ghiaccio secco da conservare a -80 °C per una successiva lavorazione.
  4. Imaging del campo luminoso polmonare e punteggio patologico di topi transgenici K18 hACE2 infettati da rSARS-CoV-2/Nluc (Figura 2A-C) e rSARS-CoV-2/Venere (Figura 4A-C)
    1. Dopo aver imaging la bioluminescenza di topi infetti da rSARS-CoV-2 / Nluc, rSARS-CoV-2 / WT e finto-infetti, riportare i topi nelle loro gabbie. Procedere con l'eutanasia e l'imaging a campo luminoso ex vivo dei polmoni dei topi (Figura 2A).
    2. Dopo aver imaging la fluorescenza ex vivo dei polmoni di topi infetti, acquisire immagini in campo luminoso dei polmoni (Figura 4A).
    3. Analizzare le lesioni grossolane sulla superficie del polmone utilizzando ImageJ (Figure 2C e 4C).
    4. Aprire l'immagine polmonare da analizzare in ImageJ.
    5. Calcola il rapporto tra pixel e cm, usa lo strumento Dritto e misura la lunghezza effettiva dell'immagine.
    6. Dopo aver selezionato, fare clic su Analizza > Misura per calcolare la lunghezza dei pixel per la lunghezza.
    7. Fare clic su Analisi > Imposta scala e immettere i numeri calcolati dal passaggio precedente.
    8. Utilizzate lo strumento Selezioni a mano libera e selezionate l'intera superficie polmonare. Fare clic su Analizza > misura per misurare l'area polmonare totale.
    9. Fare clic su Modifica > selezione > Crea inverso per selezionare il resto dell'area polmonare, quindi premere Canc o Backspace per rimuovere lo sfondo.
    10. Rimuovi l'area selezionata, quindi fai clic su Immagine > Regola > soglia colore.
    11. Per selezionare l'area della lesione patologica, regolare luminosità al minimo (tra 1 e 50) e un massimo (tra 50 e 200), a seconda dei livelli di congestione ed emorragie presenti.
    12. Una volta selezionate le lesioni patologiche, fare clic su Seleziona nella parte inferiore del pannello colore della soglia, quindi fare clic su Analizza > misura per misurare le aree patologiche.
    13. Calcolare la percentuale di lesioni grossolane con la formula: % di area patologica = (misurazione dell'area patologica/superficie polmonare totale) x 100.
  5. Titolazioni virali (Figura 2D e Figura 4D)
    1. Dopo l'imaging, completare l'eutanasia dei topi e raccogliere polmoni, cervello e mucosa nasale.
    2. Posizionare i polmoni, il cervello e la mucosa nasale in omogeneizzatori di tessuto sterili separati e aggiungere 1 mL di PBS freddo 1x.
    3. Omogeneizzare i campioni centrifugando a 21.500 x g per 10 minuti a pellet di detriti cellulari. Raccogliere e trasferire i supernatanti in un nuovo tubo sterile ed eliminare il pellet.
    4. Se le titolazioni virali vengono eseguite lo stesso giorno, conservare i supernatanti a 4 °C. In alternativa, congelare il surnatante dei campioni omogeneizzati a -80 °C fino a quando non viene valutato successivamente.
    5. Utilizzando i supernatanti ottenuti dagli omogeneizzati tissutali si ottengono diluizioni seriali 10 volte e si infettano monostrati confluenti di cellule Vero E6 con 1 mL di ogni diluizione del surnatante (formato a piastra a 6 pozzetti, 1,2 × 106 cellule/pozzetto, triplicati).
    6. Lasciare che il virus assorba per 1 ora a 37 °C in un incubatore umidificato al 5% di CO2 .
    7. Dopo l'adsorbimento virale, lavare le cellule con 1 mL di 1x PBS e incubare in 2 mL di terreno post-infezione contenente l'1% di Agar nell'incubatore umidificato al 5% di CO2 a 37 °C per 72 ore.
    8. Dopo l'incubazione, inattivare le piastre in formalina tamponata neutra al 10% per 24 ore a 4 °C, assicurarsi che l'intera piastra sia immersa.
    9. Estrarre le piastre da BSL3 e lavare le celle tre volte con 1 mL di 1x PBS e permeabilizzare con 1 mL di Triton X-100 allo 0,5% per 10 minuti a temperatura ambiente (RT).
    10. Bloccare le cellule con 1 mL di albumina sierica bovina al 2,5% (BSA) in 1x PBS per 1 ora a 37 °C, seguita da incubazione in 1 mL di 1 μg/mL dell'anticorpo monoclonale cross-reattivo della proteina SARS-CoV (N) (1C7C7), diluito in BSA al 2,5% per 1 ora a 37 °C.
    11. Lavare le celle tre volte con 1 mL di 1x PBS e sviluppare le placche utilizzando il kit ABC e il kit DAB Peroxidase Substrate secondo le istruzioni del produttore.
    12. Calcola i titoli virali come PFU / mL.
      NOTA: Calcolare con la formula PFU/mL = fattore di diluizione x numero di placche x (1 mL/volume dell'inoculo).
  6. Attività di Nluc nei tessuti di topi transgenici K18 hACE2 infettati da rSARS-CoV-2/Nluc (Figura 2E)
    1. Quantificare la presenza di Nluc negli omogeneizzati d'organo da topi transgenici K18 hACE2 infetti da finti, rSARS-CoV-2 / WT e rSARS-CoV-2 / Nluc utilizzando un test della luciferasi seguendo le istruzioni dei produttori.
  7. Valutazione della morbilità e della mortalità (Figura 2F, G e Figura 4E, F)
    1. Infettare per via intranasale topi transgenici K18 hACE2 femmina di 4-6 settimane con 105 PFU di rSARS-CoV-2/WT, rSARS-CoV-2/Venus, rSARS-CoV-2/Nluc o infettati finti come descritto al paragrafo 3.1.
    2. Monitorare e pesare i topi per 12 giorni contemporaneamente per ridurre al minimo la variazione di peso dovuta all'ingestione di cibo. Eutanasia i topi che perdono il 25% del loro peso corporeo iniziale da quando hanno raggiunto un endpoint umano e notano questi topi come soccombere all'infezione virale.
    3. Dopo 12 giorni, eutanasia dei topi che sopravvivono all'infezione virale e calcola la percentuale di variazione del peso corporeo e della sopravvivenza.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Infezione da rSARS-CoV-2/Nluc in topi transgenici K18 hACE2 (Figure 1 e 2)
La Figura 1A mostra una rappresentazione schematica di rSARS-CoV-2/WT (in alto) e rSARS-CoV-2/Nluc (in basso) utilizzati per valutare le infezioni in vivo. La Figura 1B mostra il diagramma di flusso schematico applicato per valutare la dinamica dell'infezione da rSARS-CoV-2/Nluc nei topi transgenici K18 hACE2. Topi transgenici K18 hACE2 di quattro-sei settimane (N = 4) sono stati infettati da 1x PBS o infettati da 105 PFU di rSARS-COV-2/WT o rSARS-CoV-2/Nluc per via intranasale. A 1, 2, 4 e 6 giorni dopo l'infezione, i topi sono stati sedati utilizzando la camera di isolamento e quindi iniettati con substrato Nluc retro-orbitalmente. La camera di isolamento è stata immediatamente posizionata nell'IVIS e il segnale Nluc è stato valutato in vivo utilizzando il software di imaging. L'espressione di Nluc è stata prontamente rilevata nei topi infetti da rSARS-CoV-2/Nluc, ma non in quelli infetti da rSARS-CoV-2/WT o infettati fintamente (Figura 2A). Le analisi quantitative hanno mostrato l'intensità di Nluc in diversi giorni dopo l'infezione (Figura 2B). Le lesioni grossolane sulla superficie polmonare di topi infetti da rSARS-CoV-2/Nluc erano paragonabili a quelle del gruppo infetto da rSARS-CoV-2/WT (Figure 2C). Infine, gli organi dei topi (polmoni, turbinato nasale e cervello) sono stati omogeneizzati e i titoli virali sono stati determinati mediante test della placca (PFU / mL) e l'attività di Nluc è stata determinata utilizzando il test della luciferasi seguendo le istruzioni del produttore. Le placche sono state valutate mediante immunocolorazione utilizzando l'anticorpo monoclonale cross-reattivo SARS-CoV N 1C7C7. I titoli virali rilevati nei topi infetti da rSARS-CoV-2/Nluc erano paragonabili a quelli infettati da rSARS-CoV-2/WT in tutti gli organi in diversi giorni dopo l'infezione (Figura 2D). L'attività di Nluc è stata rilevata solo negli organi di topi infetti da rSARS-CoV-2/Nluc (Figura 2E). Un gruppo separato di topi infetti da simulazione e da virus è stato monitorato per 12 giorni per i cambiamenti nel peso corporeo (Figura 2F) e nella sopravvivenza (Figura 2G). I topi infetti da rSARS-CoV-2/Nluc e rSARS-CoV-2/WT hanno perso fino al 25% del loro peso corporeo e tutti hanno ceduto all'infezione virale tra 7-8 giorni dopo l'infezione (Figura 2F-G).

Infezione da rSARS-CoV-2/Venere in topi transgenici K18 hACE2 (Figure 3 e 4)
La Figura 3A mostra una rappresentazione schematica di rSARS-CoV-2/WT (in alto) e rSARS-CoV-2/Nluc (in basso) utilizzati per valutare le infezioni ex vivo. La Figura 3B mostra il diagramma di flusso schematico applicato per valutare la dinamica rSARS-CoV-2/Venere nei topi transgenici K18 hACE2. Topi transgenici K18 hACE2 di età compresa tra quattro e sei settimane (N = 4 / gruppo) sono stati infettati da 1x PBS o infettati da 105 PFU di rSARS-COV-2 / WT o rSARS-CoV-2 / Venere per via intranasale. A 1, 2, 4 e 6 giorni dopo l'infezione, i topi sono stati sottoposti a eutanasia e i loro polmoni sono stati asportati e ripresi ex vivo utilizzando un IVIS. L'espressione di Venere è stata prontamente rilevata in tutti i polmoni da topi infetti da rSARS-CoV-2 / Venere, ma non in quelli infetti da rSARS-CoV-2 / WT o finto-infetti (Figura 4A). Le analisi quantitative hanno mostrato che l'intensità di Venere raggiunge il picco a 2 giorni dopo l'infezione e diminuisce nel corso dell'infezione nei polmoni dei topi infetti (Figura 4B). Le immagini della superficie polmonare hanno rivelato lesioni grossolane di topi infetti da rSARS-CoV-2 / Venere erano paragonabili a quelle di topi infetti da rSARS-CoV-2 / WT (Figura 4C). Infine, gli organi dei topi (polmoni, turbinato nasale e cervello) sono stati omogeneizzati e i titoli virali sono stati determinati mediante test della placca e valutati mediante immunocolorazione utilizzando l'anticorpo monoclonale cross-reattivo della proteina SARS-CoV N 1C7C7. L'infezione da rSARS-CoV-2/Venus ha determinato titoli virali comparabili a quelli osservati nei topi infetti da rSARS-CoV-2/WT in tutti gli organi (Figura 4D). Un gruppo separato di topi infetti da simulazione e da virus è stato monitorato per 12 giorni per i cambiamenti nel peso corporeo (Figura 4E) e nella sopravvivenza (Figura 4F). I topi infettati da rSARS-CoV-2 / Venus e rSARS-CoV-2 / WT hanno perso fino al 25% del loro peso corporeo e tutti hanno ceduto all'infezione virale entro il giorno 9 post-infezione senza sopravvivenza (Figure 4E-4F).

Figure 1
Figura 1: Valutazione dell'infezione da rSARS-CoV-2/Nluc in vivo utilizzando topi transgenici K18 hACE2. (A) Rappresentazione schematica di rSARS-CoV-2/WT (in alto) e rSARS-CoV-2/Nluc (in basso). (B) Diagramma di flusso schematico per la valutazione di rSARS-CoV-2/Nluc in vivo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Espressione di rSARS-CoV-2Nluc in topi transgenici K18 hACE2 infetti. (A-B) Topi transgenici K18 hACE2 femmina di quattro-sei settimane sono stati infettati fintamente (N = 4) o infettati da rSARS-CoV-2 / WT (N = 4) o rSARS-CoV-2 / Nluc (N = 4) usando 105 PFU per animale. I topi sono stati anestetizzati a 1, 2, 4 e 6 giorni dopo l'infezione, dopo essere stati iniettati retroorbitali con il substrato nluc. (A) L'espressione di Nluc è stata determinata in un sistema di imaging in vivo e i polmoni di topi finti infetti e infetti sono stati asportati e fotografati a 1, 2, 4 e 6 giorni dopo l'infezione. (B) L'intensità di Nluc è stata analizzata quantitativamente dal software di analisi delle immagini e (C) le lesioni grossolane sulla superficie polmonare sono state analizzate quantitativamente da ImageJ (C) **P < 0,01. (D) I titoli virali nel turbinato nasale (a sinistra), nei polmoni (al centro) e nel cervello (a destra) di topi infetti da rSARS-CoV-2/WT e rSARS-CoV-2/Nluc sono stati determinati mediante test della placca. (E) L'attività di Nluc nel turbinato nasale (a sinistra), nei polmoni (al centro) e nel cervello (a destra) è stata misurata sotto un lettore multi-piastra di luciferasi. ns, non significativo. I topi infetti da finti e virus sono stati monitorati per 12 giorni per i cambiamenti nel peso corporeo (F) e (G) nella sopravvivenza. Tutti i dati sono presentati come SD ± media per ciascun gruppo e analizzati da SPSS13.0 (IBM). Un valore P inferiore a 0,05 (P < 0,05) è stato considerato statisticamente significativo. Questa cifra è stata modificata da Ye C. et al.41. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Valutazione dell'infezione da rSARS-CoV-2/Venere in vivo utilizzando topi transgenici K18 hACE2. (A) Rappresentazione schematica di rSARS-CoV-2/WT (in alto) e rSARS-CoV-2/Venere (in basso). (B) Diagramma di flusso schematico per la valutazione di rSARS-CoV-2/Venere in vivo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: espressione di rSARS-CoV-2/Venus in topi transgenici K18 hACE2 infetti. (A-B) Topi transgenici K18 hACE2 di età compresa tra quattro e sei settimane erano fintamente infetti (N = 4) o infettati (105 PFU/topo) con rSARS-CoV-2/WT (N = 4) o rSARS-CoV-2/Venere (N = 4). I polmoni sono stati asportati a 1, 2, 4 e 6 giorni dopo l'infezione, le immagini dei polmoni sono state fotografate a 1, 2, 4 e 6 giorni dopo l'infezione. (A) L'espressione di Venere è stata valutata nell'ambito di un IVIS, (B) l'intensità della fluorescenza è stata analizzata quantitativamente dal software di analisi delle immagini e (C) le lesioni grossolane sulle superfici polmonari sono state analizzate quantitativamente da ImageJ. **P < 0,01. (D) I titoli virali nel turbinato nasale (a sinistra), nei polmoni (al centro) e nel cervello (a destra) di topi infetti da rSARS-CoV-2/WT e rSARS-CoV-2/Venere sono stati determinati mediante test della placca. ns, non significativo. I topi infetti da FINTO e SARS-CoV-2 sono stati monitorati per 12 giorni per (E) perdita di peso corporeo e (F) sopravvivenza. Tutti i dati sono presentati come SD ± media per ciascun gruppo e analizzati da SPSS13.0 (IBM). Un valore P inferiore a 0,05 (P < 0,05) è stato considerato statisticamente significativo. Questa cifra è stata modificata da Ye C. et al.41. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Questo protocollo dimostra la fattibilità dell'utilizzo di questi geni reporter che esprimono rSARS-CoV-2 per monitorare le infezioni virali in vivo. Entrambi i virus ricombinanti che esprimono reporter forniscono uno strumento eccellente per studiare le infezioni da SARS-CoV-2 in vivo. I sistemi di imaging ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) e in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) descritti rappresentano un'ottima opzione per comprendere le dinamiche dell'infezione da SARS-CoV-2, la patogenesi virale e per identificare cellule/organi infetti in momenti diversi dopo l'infezione virale. Al fine di condurre studi ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) e in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc), è eminente avere infezioni accurate e riproducibili e adeguate inoculazioni di rSARS-CoV-2/Nluc.

Quando si studiano infezioni in vivo utilizzando rSARS-CoV-2 / Nluc, i topi devono essere rasati per facilitare la visualizzazione di Nluc sotto l'IVIS. C'è anche la necessità di inoculare il substrato Nluc per la visualizzazione di Nluc. Ciò potrebbe richiedere alcuni test sperimentali per determinare le concentrazioni e il volume del substrato Nluc per garantire un segnale Nluc elevato. Quando si studiano infezioni ex vivo utilizzando rSARS-CoV-2 / Venere e a causa delle limitazioni di rilevare Venere direttamente da interi topi utilizzando IVIS, solo l'imaging ex vivo dei polmoni consente il rilevamento dell'espressione di Venere. Ciò richiede di avere un gruppo di topi da eutanasizzare in momenti diversi. Ciò è contrario alla situazione dei topi infettati da rSARS-CoV-2/Nluc poiché lo stesso gruppo di topi può essere ripreso in giorni diversi dopo l'infezione, senza richiedere l'eutanasia in ciascuno dei momenti post-infezione richiesti per rSARS-CoV-2 / Venere. Un vantaggio di rSARS-CoV-2 / Venus rispetto a rSARS-CoV-2 / Nluc è che può essere utilizzato con la citometria a flusso per identificare quale tipo di cellule sono infettate da SARS-CoV-2 semplicemente ordinando le cellule infettanti da cellule non infette accoppiate con l'uso di marcatori cellulari specifici come abbiamo precedentemente descritto con l'influenza (REF). Un aspetto importante del nostro rSARS-CoV-2/Venus e rSARS-CoV-2/Nluc è che entrambi hanno mostrato proprietà di crescita simili a WT in vitro e in vivo senza mostrare segni di attenuazione, permettendoci di monitorare l'infezione virale ex vivo nei polmoni dei topi infetti (rSARS-CoV-2/Venus) e la dinamica della replicazione virale nell'intero topo (rSARS-CoV-2/Nluc) utilizzando l'imaging longitudinale in vivo non invasivo .

È importante sottolineare che questi rSARS-CoV-2/Venus e rSARS-CoV-2/Nluc che esprimono reporter rappresentano un'opzione eccellente per l'identificazione di profilattici al piombo e / o terapeutici per il trattamento dell'infezione da SARS-CoV-241. L'uso di rSARS-CoV-2 che esprimono reporter che esprimono diverse proteine fluorescenti utilizzate (ad esempio, Venus e mCherry) ci consente di combinarle in saggi bifluorescenti per identificare se le terapie possono inibire efficacemente l'infezione di due virus contemporaneamente, in vitro e o in vivo, e per tracciare l'infezione virale e la patogenesi39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di qualsiasi conflitto di interessi commerciale, finanziario e non finanziario o personale in relazione al lavoro descritto.

Acknowledgments

Vorremmo ringraziare i membri del nostro istituto (Texas Biomedical Research Institute) per i loro sforzi nel mantenere le nostre strutture pienamente operative e sicure durante la pandemia di COVID-19. Vorremmo anche ringraziare il nostro Comitato istituzionale per la biosicurezza (IBC) e spell (IACUC) per aver rivisto i nostri protocolli in modo efficiente in termini di tempo. Ringraziamo il Dr. Thomas Moran della Icahn School of Medicine del Mount Sinai per aver fornito l'anticorpo monoclonale della proteina nucleocapsside (N) cross-reattivo 1C7C7 SARS-CoV. La ricerca SARS-CoV-2 nel laboratorio di Martinez-Sobrido è attualmente supportata dalle sovvenzioni NIAID / NIH RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 e R43AI165089-01; il Dipartimento della Difesa (DoD) concede W81XWH2110095 e W81XWH2110103; la San Antonio Partnership for Precision Therapeutic; il Texas Biomedical Research Institute Forum; l'Università del Texas Health Science Center di San Antonio; la San Antonio Medical Foundation; e dal Center for Research on Influenza Pathogenesis and Transmission (CRIPT), un Centro di eccellenza per la ricerca e la risposta all'influenza finanziato dal NIAID (CEIRR, contratto # 75N93021C00014).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% Triton X-100 J.T.Baker X198-07 Store at room temperature (RT)
1% DEAE-Dextran MP Biomedicals 195133
10% Formalin solution, neutral buffered Sigma-Aldrich HT501128
Agar Oxoid LP0028
24-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 662160
5% Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S-5761
6-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 657160
96-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 655-180
African green monkey kidney epithelial cells (Vero E6) ATCC CRL-1586
Ami HT Spectral Instruments Imaging
Aura Imaging Software 3.2.0 Spectral Instruments Imaging Image analysis software
Bovine Serum Albumin (BSA), 35% Sigma-Aldrich A9647 Store at 4 °C
Cell culture grade water Corning 25-055-CV
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Corning Cellgro 15-013-CV Store at 4 °C
Anesthesia gas machine Veterinary Anesthesia Systems, Inc. VAS 2001R
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1500-050 Store at -20 °C
Four- to six-week-old female K18-hACE2 transgenic mice The Jackson Laboratory 34860
Graphpad Prism Version 9.1.0 GraphPad
Isoflurane Baxter 1001936040 Store at RT
MARS Data Analysis Software BMG LABTECH
MB10 tablets QUIP Laboratories MBTAB1.5 Store at RT
Nano-Glo Luciferase Assay Reagent Promega N1110 This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C
Nunc MicroWell 96-Well Microplates ThermoFisher Scientific 269620
Nunc MicroWell 96-Well Microplates ThermoFisher Scientific 269620
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x Corning 30-009-CI Store at -20 °C
PHERAstar FSX BMG LABTECH PHERAstar FSX
Precelleys Evolution homogenizer Bertin Instruments P000062-PEVO0-A
Soft tissue homogenizing CK14 – 7 mL Bertin Instruments P000940-LYSK0-A
T75 EasYFlask ThermoFisher Scientific 156499
VECTASTAIN ABC-HRP Kit, Peroxidase Vector Laboratories PK-4002 ABC kit and DAB Peroxidase Substrate kit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. V'Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).
  2. Pal, M., Berhanu, G., Desalegn, C., Kandi, V. Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2): An update. Cureus. 12 (3), 7423 (2020).
  3. Su, S., et al. Epidemiology, genetic recombination, and pathogenesis of coronaviruses. Trends in Microbiology. 24 (6), 490-502 (2016).
  4. Cui, J., Li, F., Shi, Z. L. Origin and evolution of pathogenic coronaviruses. Nature Reviews Microbiology. 17 (3), 181-192 (2019).
  5. Lu, R., et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet. 395 (10224), 565-574 (2020).
  6. Evans, J. P., Liu, S. L. Role of host factors in SARS-CoV-2 entry. Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100847 (2021).
  7. Petersen, E., et al. Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics. Lancet Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).
  8. Alfaraj, S. H., et al. Clinical predictors of mortality of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) infection: A cohort study. Travel Medicine and Infectious Disease. 29, 48-50 (2019).
  9. Harvey, W. T., et al. SARS-CoV-2 variants, spike mutations and immune escape. Nature Reviews Microbiology. 19 (7), 409-424 (2021).
  10. Dong, E., Du, H., Gardner, L. An interactive web-based dashboard to track COVID-19 in real time. Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 533-534 (2020).
  11. Bar-On, Y. M., Flamholz, A., Phillips, R., Milo, R. ARS-CoV-2 (COVID-19) by the numbers. Elife. 9, 57309 (2020).
  12. Roussel, Y., et al. SARS-CoV-2: fear versus data. International Journal of Antimicrobial Agents. 55 (5), 105947 (2020).
  13. Scialo, F., et al. SARS-CoV-2: One year in the pandemic. What have we learned, the new vaccine era and the threat of SARS-CoV-2 variants. Biomedicines. 9 (6), 611 (2021).
  14. Coronavirus (COVID-19) update: FDA authorizes additional monoclonal antibody for treatment of COVID-19. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-additional-monoclonal-antibody-treatment-covid-19 (2021).
  15. Dougan, M., et al. Bamlanivimab plus Etesevimab in Mild or Moderate Covid-19. New England Journal of Medicine. 385 (15), 1382-1392 (2021).
  16. Ledford, H. COVID antibody treatments show promise for preventing severe disease. Nature. 591 (7851), 513-514 (2021).
  17. Tuccori, M., et al. An overview of the preclinical discovery and development of bamlanivimab for the treatment of novel coronavirus infection (COVID-19): reasons for limited clinical use and lessons for the future. Expert Opinion on Drug Discovery. , 1-12 (2021).
  18. Phan, A. T., Gukasyan, J., Arabian, S., Wang, S., Neeki, M. M. Emergent inpatient administration of casirivimab and imdevimab antibody cocktail for the treatment of COVID-19 pneumonia. Cureus. 13 (5), 15280 (2021).
  19. O'Brien, M. P., et al. Subcutaneous REGEN-COV antibody combination in early SARS-CoV-2 infection. medRxiv. , (2021).
  20. Beigel, J. H., et al. Remdesivir for the treatment of Covid-19 - Final report. New England Journal of Medicine. 383 (19), 1813-1826 (2020).
  21. Li, L., et al. Effect of convalescent plasma therapy on time to clinical improvement in patients with severe and life-threatening COVID-19: A randomized clinical trial. Journal of the American Medical Association. 324 (5), 460-470 (2020).
  22. Polack, F. P., et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).
  23. Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Pfizer-BioNTech COVID-19 vaccine - United States, December 2020. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (50), 1922-1924 (2020).
  24. Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Janssen COVID-19 vaccine - United States, February 2021. Morbidity and Mortality Weekly Report. 70 (9), 329-332 (2021).
  25. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210 (2005).
  26. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  27. Nogales, A., et al. A novel fluorescent and bioluminescent bireporter Influenza A Virus to evaluate viral infections. Journal of Virology. 93 (10), 00032 (2019).
  28. Nogales, A., et al. Replication-competent fluorescent-expressing influenza B virus. Virus Research. 213, 69-81 (2016).
  29. Welsh, D. K., Noguchi, T. Cellular bioluminescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).
  30. Tran, V., Moser, L. A., Poole, D. S., Mehle, A. Highly sensitive real-time in vivo imaging of an influenza reporter virus reveals dynamics of replication and spread. Journal of Virology. 87 (24), 13321-13329 (2013).
  31. Schoggins, J. W., et al. Dengue reporter viruses reveal viral dynamics in interferon receptor-deficient mice and sensitivity to interferon effectors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14610-14615 (2012).
  32. Luker, G. D., et al. Noninvasive bioluminescence imaging of herpes simplex virus type 1 infection and therapy in living mice. Journal of Virology. 76 (23), 12149-12161 (2002).
  33. Li, X., et al. Development of a rapid antiviral screening assay based on eGFP reporter virus of Mayaro virus. Antiviral Research. 168, 82-90 (2019).
  34. Kirui, J., Freed, E. O. Generation and validation of a highly sensitive bioluminescent HIV-1 reporter vector that simplifies measurement of virus release. Retrovirology. 17 (1), 12 (2020).
  35. Shang, B., et al. Development and characterization of a stable eGFP enterovirus 71 for antiviral screening. Antiviral Research. 97 (2), 198-205 (2013).
  36. Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening. Antiviral Research. 91 (1), 11-19 (2011).
  37. Ye, C., et al. Rescue of SARS-CoV-2 from a single bacterial artificial chromosome. mBio. 11 (5), 02168 (2020).
  38. Avila-Perez, G., Park, J. G., Nogales, A., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Zika virus from a bacterial artificial chromosome cDNA clone. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59537 (2019).
  39. Chiem, K., et al. A bifluorescent-based assay for the identification of neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 variants of concern in vitro and in vivo. Journal of Virology. , (2021).
  40. Committee for the update of the guide for the care and use of laboratory animals., Institute for laboratory animal research (U.S) & National Academies Press (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. 8th edn. National Research Council (US). , National Academies Press. (2011).
  41. Ye, C., et al. Analysis of SARS-CoV-2 infection dynamic in vivo using reporter-expressing viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), (2021).

Tags

Immunologia e infezione Numero 177 SARS-CoV-2 coronavirus fluorescenza bioluminescenza virus competenti per la replicazione virus reporter NanoLuc luciferasi venere proteina fluorescente infezione virale imaging in vivo IVIS Ami HT K18 hACE2 topi transgenici
Imaging dal vivo e quantificazione dell'infezione virale in topi transgenici K18 hACE2 utilizzando SARS-CoV-2 ricombinante che esprime reporter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morales Vasquez, D., Chiem, K.,… More

Morales Vasquez, D., Chiem, K., Silvas, J., Park, J. G., Ye, C., Martínez-Sobrido, L. Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2. J. Vis. Exp. (177), e63127, doi:10.3791/63127 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter