Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Levande avbildning och kvantifiering av virusinfektion i K18 hACE2 transgena möss med reporteruttryckande rekombinant SARS-CoV-2

Published: November 5, 2021 doi: 10.3791/63127
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Texas Biomedical Research Institute

Summary

Detta protokoll beskriver dynamiken hos virusinfektioner med användning av luciferas- och fluorescensuttryckande rekombinant (r) SARS-CoV-2 och ett in vivo-bildsystem (IVIS) i K18 hACE2 transgena möss för att övervinna behovet av sekundära metoder som krävs för att studera SARS-CoV-2-infektioner in vivo.

Abstract

Coronavirussjukdomen 2019 (COVID-19) pandemi har orsakats av allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Hittills har SARS-CoV-2 varit ansvarig för över 242 miljoner infektioner och mer än 4,9 miljoner dödsfall över hela världen. I likhet med andra virus kräver studier av SARS-CoV-2 användning av experimentella metoder för att detektera förekomsten av virus i infekterade celler och / eller i djurmodeller. För att övervinna denna begränsning genererade vi replikationskompetenta rekombinanta (r) SARS-CoV-2 som uttrycker bioluminescerande (nanoluciferas, Nluc) eller fluorescerande (Venus) proteiner. Dessa reporteruttryckande rSARS-CoV-2 gör det möjligt att spåra virusinfektioner in vitro och in vivo baserat på uttrycket av Nluc- och Venus-reportergener. Här beskriver studien användningen av rSARS-CoV-2/Nluc och rSARS-CoV-2/Venus för att detektera och spåra SARS-CoV-2-infektion i den tidigare beskrivna K18 humana angiotensinkonverterande enzym 2 (hACE2) transgena musmodellen för infektion med hjälp av in vivo-avbildningssystem (IVIS). Denna rSARS-CoV-2 / Nluc och rSARS-CoV-2 / Venus visar rSARS-CoV-2 / WT-liknande patogenicitet och viral replikation in vivo. Viktigt är att Nluc och Venus uttryck tillåter oss att direkt spåra virusinfektioner in vivo och ex vivo, hos infekterade möss. Dessa rSARS-CoV-2 / Nluc och rSARS-CoV-2 / Venus representerar ett utmärkt alternativ för att studera biologin hos SARS-CoV-2 in vivo, för att förstå virusinfektion och tillhörande COVID-19-sjukdom och för att identifiera effektiva profylaktiska och / eller terapeutiska behandlingar för att bekämpa SARS-CoV-2-infektion.

Introduction

Allvarligt akut respiratoriskt syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) är ett omslutet, positivt, enkelsträngat RNA-virus som tillhör Betacoronavirus-härstamningen i Coronaviridae-familjen 1. Denna virala familj är uppdelad i Alpha-, Beta-, Gamma- och Delta-coronavirus1. Alfa- och betacoronavirus infekterar främst däggdjur, medan Gamma- och Deltacoronavirus nästan uteslutande infekterar fåglar2. Hittills har sju coronavirus (CoV) korsat artbarriärer och dykt upp som mänskliga coronavirus (HCoV): två alfa-CoV (HCoV-229E och HCoV-NL63) och fem beta-CoV (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, Mellanöstern respiratoriskt syndrom coronavirus [MERS-CoV] och SARS-CoV-2) 3,4,5,6. SARS-CoV, MERS-CoV och SARS-CoV-2 är högpatogena och orsakar allvarlig infektion i nedre luftvägarna7. Före uppkomsten av SARS-CoV-2 fanns det två epidemiska utbrott orsakade av CoVs: SARS-CoV i Guangdong Providence, Kina, från 2002-2003, med en falldödlighet (CFR) på cirka 9,7%; och MERS-CoV i Mellanöstern från 2012 till idag, med en CFR på cirka 34% 7,8. SARS-CoV-2 har en övergripande CFR mellan 3,4% -49%, med underliggande tillstånd som bidrar till en högre CFR 8,9. Sedan upptäckten i december 2019, i Wuhan, Kina, har SARS-CoV-2 varit ansvarig för över 242 miljoner mänskliga infektioner och mer än 4,9 miljoner mänskliga dödsfall över hela världen 7,10,11,12. Sedan slutet av 2020 har nya SARS-CoV-2-varianter av oro (VoC) och varianter av intresse (VoI) påverkat virusegenskaperna, inklusive överföring och antigenicitet 9,13, och den övergripande riktningen för COVID-19-pandemin. För behandling av SARS-CoV-2-infektioner finns det för närvarande bara ett USA (USA) Food and Drug Administration (FDA) terapeutiskt antiviralt (remdesivir) och ett emergency use authorization (EUA) läkemedel (baricitinib, som ska administreras i kombination med remdesivir)14. Det finns också 6 godkända EUA monoklonala antikroppar: REGEN-COV (casirivimab och imdevimab, administreras tillsammans), sotrovimab, tocilizumab och bamlanivimab och etesevimab administreras tillsammans 15,16,17,18,19. Det finns för närvarande endast ett FDA-godkänt profylaktiskt vaccin, Pfizer-BioNTech, och två andra profylaktiska vacciner (Moderna och Janssen) har godkänts av EUA 20,21,22,23,24. Men med den okontrollerade infektionshastigheten och uppkomsten av VoC och VoI utgör SARS-CoV-2 fortfarande ett hot mot människors hälsa. Därför behövs det omgående nya tillvägagångssätt för att identifiera effektiva profylaktiska medel och terapier för att kontrollera SARS-CoV-2-infektion och den fortfarande pågående COVID-19-pandemin.

Att studera SARS-CoV-2 kräver mödosamma tekniker och sekundära metoder för att identifiera förekomsten av viruset i infekterade celler och / eller validerade djurmodeller av infektion. Användningen av omvänd genetik har gjort det möjligt för generering av rekombinanta virus att svara på viktiga frågor i biologin för virusinfektioner. Till exempel har omvänd genetikteknik gett medel för att avslöja och förstå mekanismerna för virusinfektion, patogenes och sjukdom. På samma sätt har omvänd genetik tillvägagångssätt banat väg för att konstruera rekombinanta virus som saknar virala proteiner för att förstå deras bidrag i viral patogenes. Dessutom har omvänd genetik använts för att generera rekombinanta virus som uttrycker reportergener för in vitro- och in vivo-applikationer, inklusive identifiering av profylaktiska och/eller terapeutiska metoder för behandling av virusinfektioner. Fluorescerande och bioluminescerande proteiner är de vanligaste reportergenerna på grund av deras känslighet, stabilitet och enkla detektion baserat på förbättring av ny teknik25,26. In vitro har fluorescerande proteiner visat sig fungera som ett bättre alternativ för lokalisering av virus i infekterade celler, medan luciferaser är mer praktiska för kvantifieringsstudier 27,28,29. In vivo föredras luciferaser framför fluorescerande proteiner för avbildning av hela djur, medan fluorescerande proteiner föredras för identifiering av infekterade celler eller ex vivo-avbildning 30,31,32. Användningen av reporteruttryckande rekombinanta virus har fungerat som ett kraftfullt verktyg för studier av virus i många familjer, inklusive bland annat flavivirus, enterovirus, alfavirus, lentivirus, arenavirus och influensavirus 28,33,34,35,36.

För att övervinna behovet av sekundära metoder för att studera SARS-CoV-2 och karakterisera SARS-CoV-2-infektion i realtid in vivo har vi genererat replikationskompetenta rekombinanta (r) SARS-CoV-2 som uttrycker bioluminescerande (nanoluciferas, Nluc) eller fluorescerande (Venus) proteiner med hjälp av våra tidigare beskrivna bakteriella artificiella kromosomer (BAC) -baserade omvänd genetik, som upprätthålls som en enda kopia i E. coli för att minimera toxiciteten hos virussekvenser under dess förökning i bakterier 37,38. I synnerhet visade rSARS-CoV-2 / Nluc och rSARS-CoV-2 / Venus rSARS-CoV-2 / WT-liknande patogenicitet in vivo. Den höga nivån av Venus-uttryck från rSARS-CoV-2 / Venus gjorde det möjligt att upptäcka virusinfektion i lungorna hos infekterade K18 hACE2-transgena möss med hjälp av ett in vivo-bildsystem (IVIS)39. Nivåerna av Venus-uttryck korrelerade väl med virala titrar som detekterades i lungorna, vilket visar möjligheten att använda Venus-uttryck som ett giltigt surrogat av SARS-CoV-2-infektion. Med hjälp av rSARS-CoV-2 / Nluc kunde vi spåra dynamiken i virusinfektion i realtid och longitudinellt bedöma SARS-CoV-2-infektion in vivo med samma IVIS-tillvägagångssätt i K18 hACE2 transgena möss.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokoll som involverar K18 hACE2 transgena möss godkändes av Texas Biomedical Research Institute (TBRI) Institutional Biosafety Committee (IBC) och Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Alla försök följer rekommendationerna i Forskningsrådets vägledning för vård och användning av försöksdjur40. Lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) krävs vid arbete med möss.

1. Användning av K18 hACE2 transgena möss

  1. Köp och underhåll 4-6 veckor gamla kvinnliga B6.Cg-Tg (K18-ACE2) 2Prlmn / J-möss (K18 hACE2 transgena möss) i en biosäkerhetsnivå (BSL) -2 djurvårdsanläggning under specifika patogenfria förhållanden.
    1. Efter ankomsten till BSL2-anläggningarna, låt djuren acklimatisera sig i 7 dagar och överföra dem till BSL-3-djuranläggningen för infektioner och andra experimentella förfaranden.
    2. Efter IACUC-protokoll, placera 4 möss per bur. För att säkerställa att djuret avlider, efter mössinfektion med rSARS-CoV-2 och in vivo-avbildning , avliva djuren med en dödlig dos fatal-plus (>100 mg/kg).

2. Biosäkerhet

OBS: I detta manuskript genereras rSARS-CoV-2 med hjälp av BAC-baserade omvända genetiska system för SARS-CoV-2 USA-WA1/2020-stam, som tidigarebeskrivits 37. Alla in vivo-procedurer som involverar rSARS-CoV-2 / Nluc- eller rSARS-CoV-2 / Venus-infektioner måste utföras i ett biologiskt säkerhetsskåp under BSL-3-förhållanden.

  1. Rengör biosäkerhetsskåpet med 2% Wexicid och 70% Etanol desinfektionsmedel sekventiellt före och efter att ha utfört alla experimentella procedurer som beskrivs i den här artikeln.
  2. Sterilisera allt dissektionsmaterial (sax, dissekerande pincett etc.) och homogenisatorn före och efter varje användning.
  3. Rengör isoleringskammaren och desinficera med MB10-tabletter före och efter varje användning enligt tillverkarens instruktioner.
  4. Kassera allt biologiskt material som producerats under förfarandena enligt IBC: s och IACUC: s riktlinjer.

3. In vivo-karakterisering av rSARS-CoV-2

  1. Mus infektioner
    1. Placera kvinnliga 4-6 veckor gamla K18 hACE2 transgena möss i märkta burar, identifiera mössen i varje bur med hjälp av en öronstanskod och placera 4 möss per bur. Använd en grupp möss för kroppsvikt och överlevnad och en annan grupp djur för viral titrering och avbildning.
    2. Före infektion, raka mössens bröstkorg på den ventrala sidan från bröstvårtan till inguinalnippelområdet för att underlätta bioluminescenssignalen.
    3. Förbered rSARS-CoV-2-inokulatet med 105 plackbildande enheter (PFU)/mus under sterila förhållanden i en total volym på 50 μL med steril 1x fosfatbuffertsaltlösning (PBS).
      OBS: Beräkna mängden rSARS-CoV-2 som ska användas i virusutspädningen med formeln: virus behövs = (105 PFU per mus / 50 μL) x slutlig volym) / lagervirustiter.
    4. Håll virusinokulum kyld på is.
    5. Använd de mock-infekterade (1x PBS) och rSARS-CoV-2/WT-infekterade mössen som interna kontroller. Placera de mock-infekterade mössen i en separat bur än rSARS-CoV-2-infekterade möss.
    6. Bedöva mössen med 5% isofluran gasformig sedering i en anestesikammare och behåll med 3% isofluran.
    7. När postural reaktion och rätningsreflex har bekräftats, placera musen i dorsal recumbency position.
    8. Scruff musens hals mellan pekfingret och tummen och håll svansen mot handflatan med det rosa fingret för att hålla djuret i ryggläge.
    9. Placera pipettspetsen som innehåller 50 μL av virusinokulum i näsborren och mata långsamt ut lösningen. Se till att virusinokulumet inhaleras och att det inte finns någon återflöde genom att observera att inokulumfallet försvinner.
  2. Bioluminescensövervakning av K18 hACE2 transgena möss infekterade med rSARS-CoV-2/Nluc (figur 1 och figur 2)
    Det här experimentet följer den schematiska representationen och använder de virus som visas i figur 1. En isoflurananestesifästning krävs för in vivo-avbildningssystemet (IVIS). Se materialtabell för detaljer om instrument och system som krävs.
    1. Starta bildprogramvaran och ställ in parametrarna, klicka på bildläget till Bioluminescence, öppna filtret och ställ in exponeringstiden till auto.
    2. När du initierar IVIS-maskinen, placera mössen i isoleringskammaren medan du fortfarande är inne i biosäkerhetsskåpet. Inducera möss med isofluran i en koncentration på 5 %. När förlusten av den posturala reaktionen och rätningsreflexen har bekräftats, behåll med 3% isofluran.
    3. När möss har sövts, ta bort dem från isoleringskammaren och administrera retro-orbitalt luciferassubstratet utspätt 1:10 i 1x PBS (slutlig volym 100 μL / mus) med en 25 G nål.
    4. Efter administrering av luciferassubstrat, placera mössen tillbaka i isoleringskammaren med kistorna uppåt och näshålan inuti grenrörskonen för att hålla djuret sövt under avbildningsproceduren.
    5. Överför isoleringskammaren till IVIS-maskinen och välj Hämta i programmet för att initiera omedelbart efter att du har stängt IVIS-bilddörren (bild 2A).
    6. För att analysera förvärvade bioluminescensbilder, använd ROI-verktyget (region av intresse) i programvaran för att ange den exakta signalen och mäta flödet (figur 2B).
    7. Klicka på Mät och låt systemet börja bedöma bioluminescensen i fotoner för att ge den absoluta fotonemissionen som är jämförbar med utgångsmätningarna som tillhandahålls av de olika parametrarna.
    8. Bildmöss vid 1-, 2-, 4- och 6-dagar efter infektion.
    9. Efter avbildning placera möss tillbaka i bur.
  3. Fluorescensanalys hos K18 hACE2 transgena möss infekterade med rSARS-CoV-2/Venus (figur 3 och figur 4)
    Det här experimentet följer den schematiska representationen och rSARS-CoV-2 som visas i figur 3. Se materialtabell för detaljer om instrument och system som krävs.
    1. Starta bildprogramvaran och ställ in parametrarna, ställ in excitation (500 nm) och emissionsfilter (530 nm), klicka på bildläget till Fluorescens och ställ in exponeringstiden till auto.
    2. Avliva mössen intraperitonealt med en dödlig dos fatal-plus (>100 mg/kg). Efter eutanasi desinficerar du snittstället med 70% etanol.
    3. Dra i huden med pincett, gör ett snitt från bröstbenet till buken och skär snittet från sidorna med sax. Skär levervenen för att minimera mängden blod i lungorna och undvik höga bakgrundssignaler under avbildning.
    4. Skär bröstbenet med sax och öppna bröstkorgen. Klipp sedan änden av luftstrupen med sax och ta bort lungorna med pincett.
    5. Placera de utskurna lungorna i en 6-brunnsplatta som innehåller 2 ml 1x PBS och skölj för att ta bort överflödigt blod. Minimera risken för kontaminering mellan prover genom att desinficera och rengöra kirurgiska verktyg mellan prover med 70% etanol.
    6. Efter att ha initierat IVIS-maskinen, placera lungorna i en svart bricka och separera vävnaderna från varandra.
    7. Placera brickan inuti isoleringskammaren inuti biosäkerhetsskåpet och överför sedan isoleringskammaren till IVIS. Stäng dörren och klicka på Hämta för att starta bildsystemet (figur 4A).
    8. För att analysera fluorescens, använd ROI-verktyget och rita ROI runt var och en av de enskilda lungorna. Mät varje ROI manuellt och använd sedan de genomsnittliga strålningseffektivitetsvärdena som ges och subtrahera från de mock-infekterade mössen (figur 4B).
    9. När avbildning är klar, placera vävnaderna på is för analys samma dag eller i en kryotube för torrisfrysning för att lagra vid -80 °C för senare bearbetning.
  4. Lungljusfältsavbildning och patologipoäng för K18 hACE2 transgena möss infekterade med rSARS-CoV-2 / Nluc (figur 2A-C) och rSARS-CoV-2 / Venus (figur 4A-C)
    1. Efter avbildning av bioluminescens hos möss infekterade med rSARS-CoV-2 / Nluc, rSARS-CoV-2 / WT och mock-infekterade, återför mössen till sina burar. Fortsätt med eutanasi och ex vivo ljusfältsavbildning av möss lungor (figur 2A).
    2. Efter avbildning ex vivo fluorescens av lungor hos infekterade möss, ta ljusa fältbilder av lungorna (figur 4A).
    3. Analysera de grova lesionerna på lungans yta med Hjälp av ImageJ (figur 2C och 4C).
    4. Öppna lungbilden som ska analyseras i ImageJ.
    5. Beräkna förhållandet mellan pixel och cm, använd verktyget Rak och mät bildens faktiska längd.
    6. När du har valt klickar du på Analysera > mät för att beräkna längden på pixlar för längden.
    7. Klicka på Analys > Ställ in skala och mata in siffrorna beräknade från föregående steg.
    8. Använd verktyget Frihandsmarkeringar och markera hela lungytan. Klicka på Analysera > Mät för att mäta total lungarea.
    9. Klicka på Redigera > Markering > Gör invers för att välja resten av lungområdet och tryck sedan på delete eller backspace för att ta bort bakgrunden.
    10. Ta bort det valda området och klicka sedan på Bild > Justera > färgtröskel.
    11. För att välja patologiskt lesionsområde, justera Ljusstyrka till ett minimum (mellan 1 och 50) och ett maximum (mellan 50 och 200), beroende på nivåerna av trängsel och blödningar som finns.
    12. När patologiska lesioner har valts klickar du på Välj längst ner på tröskelfärgpanelen och klickar sedan på Analysera > Mät för att mäta patologiska områden.
    13. Beräkna procentandelen bruttoskador med formeln: % av patologisk yta = (mätning av patologisk yta/total lungyta) x 100.
  5. Virala titreringar (figur 2D och figur 4D)
    1. Vid avbildning, slutför mössens eutanasi och samla lungor, hjärna och nässlemhinna.
    2. Placera lungorna, hjärnan och nässlemhinnan i separata sterila vävnadshomogenisatorer och tillsätt 1 ml kall 1x PBS.
    3. Homogenisera proverna genom centrifugering vid 21 500 x g i 10 min till pelletscellsskräp. Samla och överför supernatanterna till ett nytt sterilt rör och kassera pelleten.
    4. Om virala titreringar utförs samma dag, förvara supernatanterna vid 4 °C. Alternativt kan du frysa supernatanten i de homogeniserade proverna vid -80 °C tills den utvärderas senare.
    5. Genom att använda supernatanterna erhållna från vävnadshomogenaten görs 10-faldiga seriella utspädningar och infekterar sammanflytande monolager av Vero E6-celler med 1 ml av varje utspädning av supernatanten (6-brunnsplattformat, 1,2 × 106 celler / brunn, tredubblar).
    6. Låt viruset adsorberas i 1 timme vid 37 °C i en fuktad 5% CO2-inkubator .
    7. Tvätta cellerna efter viral adsorption med 1 ml 1x PBS och inkubera i 2 ml postinfektionsmedier innehållande 1% Agar i den fuktade 5%CO2-inkubatorn vid 37 °C i 72 timmar.
    8. Efter inkubationen, inaktivera plattorna i 10% neutralt buffrat formalin i 24 timmar vid 4 °C, se till att hela plattan är nedsänkt.
    9. Ta plattor ur BSL3 och tvätta cellerna tre gånger med 1 ml 1x PBS och permeabilisera med 1 ml 0,5% Triton X-100 i 10 minuter vid rumstemperatur (RT).
    10. Blockera cellerna med 1 ml 2,5 % bovint serumalbumin (BSA) i 1x PBS i 1 timme vid 37 °C, följt av inkubation i 1 ml 1 μg/ml av SARS-CoV-nukleokapsid (N) proteinet korsreaktiv monoklonal antikropp (1C7C7), utspätt i 2,5 % BSA i 1 timme vid 37 °C.
    11. Tvätta cellerna tre gånger med 1 ml 1x PBS och utveckla placken med ABC-satsen och DAB-peroxidassubstratsatsen enligt tillverkarens instruktioner.
    12. Beräkna virustitrarna som PFU/ml.
      OBS: Beräkna med formeln PFU/ml = utspädningsfaktor x antal plack x (1 ml/ympvolym).
  6. Nluc-aktivitet i vävnader från K18 hACE2 transgena möss infekterade med rSARS-CoV-2/Nluc (figur 2E)
    1. Kvantifiera närvaron av Nluc i organhomogenaten från mock, rSARS-CoV-2/WT och rSARS-CoV-2/Nluc infekterade K18 hACE2 transgena möss med hjälp av en luciferasanalys enligt tillverkarens instruktioner.
  7. Utvärdering av sjuklighet och dödlighet (figur 2F, G och figur 4E, F)
    1. Intranasalt infektera 4-6 veckor gamla kvinnliga K18 hACE2 transgena möss med 105 PFU rSARS-CoV-2 / WT, rSARS-CoV-2 / Venus, rSARS-CoV-2 / Nluc eller mock-infekterade enligt beskrivningen i avsnitt 3.1.
    2. Övervaka och väg mössen över 12 dagar samtidigt för att minimera viktvariationen på grund av matintag. Avliva mössen som förlorar 25% av sin ursprungliga kroppsvikt eftersom de har nått en human slutpunkt och notera att dessa möss ger efter för virusinfektion.
    3. Efter 12 dagar, avliva mössen som överlever virusinfektion och beräkna % av kroppsviktsförändring och överlevnad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

rSARS-CoV-2/Nluc-infektion hos K18 hACE2 transgena möss (figur 1 och 2)
Figur 1A visar en schematisk representation av rSARS-CoV-2/WT (överst) och rSARS-CoV-2/Nluc (nederst) som används för att bedöma infektioner in vivo. Figur 1B visar det schematiska flödesschemat som används för att bedöma rSARS-CoV-2/Nluc-infektionsdynamiken hos K18 hACE2 transgena möss. Fyra till sex veckor gamla kvinnliga K18 hACE2 transgena möss (N = 4) var antingen mock-infekterade med 1x PBS eller infekterade med 105 PFU rSARS-COV-2 / WT eller rSARS-CoV-2 / Nluc intranasalt. Vid 1-, 2-, 4- och 6-dagar efter infektion sederades möss med hjälp av isoleringskammaren och injicerades sedan med Nluc-substrat retro-orbitalt. Isoleringskammaren placerades omedelbart i IVIS och Nluc-signalen bedömdes in vivo med hjälp av bildprogramvaran. Nluc-uttryck upptäcktes lätt hos möss infekterade med rSARS-CoV-2/Nluc men inte de som var infekterade med rSARS-CoV-2/WT eller mock-infekterade (figur 2A). Kvantitativa analyser visade Nluc-intensitet vid olika dagar efter infektion (figur 2B). Bruttoskador på lungytan hos möss infekterade med rSARS-CoV-2/Nluc var jämförbara med dem i den rSARS-CoV-2/WT-infekterade gruppen (figur 2C). Slutligen homogeniserades mössorgan (lungor, nasalt turbinat och hjärna) och virala titrar bestämdes genom plackanalys (PFU / ml) och Nluc-aktiviteten bestämdes med hjälp av luciferasanalysen enligt tillverkarens instruktioner. Plack bedömdes genom immunfärgning med användning av den korsreaktiva SARS-CoV N monoklonala antikroppen 1C7C7. Virala titrar som detekterades hos de rSARS-CoV-2/Nluc-infekterade mössen var jämförbara med dem som infekterades med rSARS-CoV-2/WT i alla organ vid olika dagar efter infektion (figur 2D). Nluc-aktivitet påvisades endast i organen från rSARS-CoV-2/Nluc-infekterade möss (figur 2E). En separat grupp mock-infekterade och virusinfekterade möss övervakades i 12 dagar för förändringar i kroppsvikt (figur 2F) och överlevnad (figur 2G). Möss infekterade med rSARS-CoV-2 / Nluc och rSARS-CoV-2 / WT förlorade upp till 25% av sin kroppsvikt och alla gav efter för virusinfektion mellan 7-8 dagar efter infektion (figur 2F-G).

rSARS-CoV-2/Venus-infektion hos K18 hACE2 transgena möss (figur 3 och 4)
Figur 3A visar en schematisk representation av rSARS-CoV-2/WT (överst) och rSARS-CoV-2/Nluc (nederst) som används för att bedöma infektioner ex vivo. Figur 3B visar det schematiska flödesschemat som används för att bedöma rSARS-CoV-2 / Venus-dynamiken hos K18 hACE2 transgena möss. Fyra till sex veckor gamla kvinnliga K18 hACE2 transgena möss (N = 4 / grupp) var antingen mock-infekterade med 1x PBS eller infekterade med 105 PFU rSARS-COV-2 / WT eller rSARS-CoV-2 / Venus intranasalt. Vid 1-, 2-, 4- och 6-dagar efter infektion avlivades möss och deras lungor skars ut och avbildades ex vivo med hjälp av en IVIS. Venusuttryck upptäcktes lätt i alla lungor från möss infekterade med rSARS-CoV-2 / Venus men inte de som var infekterade med rSARS-CoV-2 / WT eller mock-infekterade (figur 4A). Kvantitativa analyser visade att Venus intensitet toppar vid 2 dagar efter infektion och minskar under infektionsförloppet i lungorna hos infekterade möss (figur 4B). Bilder av lungytan avslöjade att grova lesioner hos möss infekterade med rSARS-CoV-2/Venus var jämförbara med rSARS-CoV-2/WT-infekterade möss (figur 4C). Slutligen homogeniserades mössorgan (lungor, nasalt turbinat och hjärna) och virala titrar bestämdes genom plackanalys och bedömdes genom immunfärgning med användning av SARS-CoV N-proteinet korsreaktiv monoklonal antikropp 1C7C7. Infektion med rSARS-CoV-2/Venus resulterade i jämförbara virustiter med de som observerades hos möss infekterade med rSARS-CoV-2/WT i alla organ (figur 4D). En separat grupp mock-infekterade och virusinfekterade möss övervakades i 12 dagar för förändringar i kroppsvikt (figur 4E) och överlevnad (figur 4F). Möss infekterade med rSARS-CoV-2 / Venus och rSARS-CoV-2 / WT förlorade upp till 25% av sin kroppsvikt och alla gav efter för virusinfektion vid dag 9 efter infektion utan överlevnad (figur 4E-4F).

Figure 1
Figur 1: Bedömning av rSARS-CoV-2/Nluc-infektion in vivo med K18 hACE2 transgena möss. (A) Schematisk representation av rSARS-CoV-2 / WT (överst) och rSARS-CoV-2 / Nluc (botten). B) Schematiskt flödesschema för bedömning av rSARS-CoV-2/Nluc in vivo. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: rSARS-CoV-2Nluc-uttryck i infekterade K18 hACE2 transgena möss. (A-B) Fyra till sex veckor gamla kvinnliga K18 hACE2 transgena möss var mock-infekterade (N = 4) eller infekterade med rSARS-CoV-2 / WT (N = 4) eller rSARS-CoV-2 / Nluc (N = 4) med 105 PFU per djur. Mössen bedövades vid 1-, 2-, 4- och 6-dagar efter infektion, efter att ha retroorbital injicerats med Nluc-substratet. (A) Nluc-uttrycket bestämdes enligt ett in vivo-avbildningssystem, och lungor från mock-infekterade och infekterade möss skars ut och fotograferades vid 1-, 2-, 4- och 6-dagar efter infektion . (B) Nluc-intensiteten analyserades kvantitativt av bildanalysprogramvaran och (C) bruttoskador på lungytan analyserades kvantitivt av ImageJ (C) **P < 0,01. (D) Virala titrar i nästurbinatet (vänster), lungorna (mitten) och hjärnan (höger) från möss infekterade med rSARS-CoV-2 / WT och rSARS-CoV-2 / Nluc bestämdes genom plackanalys. (E) Nluc-aktiviteten i nasalt turbinat (vänster), lungor (mitten) och hjärna (höger) mättes under en luciferas flerplattläsare. ns, inte signifikant. Mock- och virusinfekterade möss övervakades i 12 dagar för förändringar i (F) kroppsvikt och (G) överlevnad. Alla data presenteras som medelvärde ± SD för varje grupp och analyseras av SPSS13.0 (IBM). Ett P-värde på mindre än 0,05 (P < 0,05) ansågs statistiskt signifikant. Denna siffra har modifierats från Ye C. et al.41. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Bedömning av rSARS-CoV-2/Venus-infektion in vivo med hjälp av K18 hACE2 transgena möss. B) Schematiskt flödesschema för bedömning av rSARS-CoV-2/Venus in vivo. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: rSARS-CoV-2/Venus-uttryck hos infekterade K18 hACE2 transgena möss. (A-B) Fyra till sex veckor gamla kvinnliga K18 hACE2 transgena möss var mock-infekterade (N = 4) eller infekterade (105 PFU / mus) med rSARS-CoV-2 / WT (N = 4) eller rSARS-CoV-2 / Venus (N = 4). Lungorna skars ut vid 1-, 2-, 4- och 6- dagar efter infektion, bilder av lungor fotograferades vid 1-, 2-, 4- och 6-dagar efter infektion. (A) Venus uttryck bedömdes under en IVIS, (B) fluorescensintensiteten analyserades kvantitivt av bildanalysprogramvaran och (C) de grova lesionerna på lungytorna analyserades kvantitativt av ImageJ. **P < 0,01. (D) Virala titrar i nästurbinatet (vänster), lungorna (mitten) och hjärnan (höger) från möss infekterade med rSARS-CoV-2 / WT och rSARS-CoV-2 / Venus bestämdes genom plackanalys. ns, inte signifikant. Mock- och SARS-CoV-2-infekterade möss övervakades i 12 dagar för (E) viktminskning och (F) överlevnad. Alla data presenteras som medelvärde ± SD för varje grupp och analyseras av SPSS13.0 (IBM). Ett P-värde på mindre än 0,05 (P < 0,05) ansågs statistiskt signifikant. Denna siffra har modifierats från Ye C. et al.41. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Detta protokoll visar möjligheten att använda dessa rSARS-CoV-2 som uttrycker reportergener för att övervaka virusinfektioner in vivo. Båda reporteruttryckande rekombinanta virus ger ett utmärkt verktyg för att studera SARS-CoV-2-infektioner in vivo. De beskrivna bildsystemen ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) och in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) utgör ett utmärkt alternativ för att förstå dynamiken i SARS-CoV-2-infektion, viral patogenes och för att identifiera infekterade celler/organ vid olika tidpunkter efter virusinfektion. För att kunna genomföra ex vivo-studier (rSARS-CoV-2/Venus) och in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) är det viktigt att ha exakta och reproducerbara infektioner samt adekvata inokuleringar av rSARS-CoV-2/Nluc.

Vid studier av in vivo-infektioner med rSARS-CoV-2/Nluc bör möss rakas för att underlätta Nluc-visualisering under IVIS. Det finns också ett behov av att inokulera Nluc-substratet för visualisering av Nluc. Detta kan kräva vissa experimentella tester för att bestämma koncentrationerna och volymen av Nluc-substratet för att säkerställa en hög Nluc-signal. När man studerar ex vivo-infektioner med rSARS-CoV-2/Venus, och på grund av begränsningar för att detektera Venus direkt från hela mössen med IVIS, tillåter endast ex vivo-avbildning av lungorna detektion av Venus-uttryck. Detta kräver att en grupp möss avlivas vid olika tidpunkter. Detta strider mot situationen för möss infekterade med rSARS-CoV-2 / Nluc eftersom samma grupp möss kan avbildas vid olika dagar efter infektion, utan att kräva eutanasi vid var och en av de tidpunkter efter infektion som krävs för rSARS-CoV-2 / Venus. En fördel med rSARS-CoV-2/Venus jämfört med rSARS-CoV-2/Nluc är att den kan användas med flödescytometri för att identifiera vilken typ av celler som är infekterade av SARS-CoV-2 genom att helt enkelt sortera infekterande celler från icke-infekterade celler i kombination med användning av specifika cellulära markörer som vi tidigare beskrivit med influensa (REF). En viktig aspekt av våra rSARS-CoV-2/Venus och rSARS-CoV-2/Nluc är att båda uppvisade WT-liknande tillväxtegenskaper in vitro och in vivo utan att visa tecken på dämpning, vilket gör att vi kan övervaka virusinfektion ex vivo i lungorna hos infekterade möss (rSARS-CoV-2/Venus) och dynamiken i viral replikation i hela musen (rSARS-CoV-2/Nluc) med hjälp av icke-invasiv longitudinell in vivo-avbildning .

Viktigt är att dessa reporteruttryckande rSARS-CoV-2 / Venus och rSARS-CoV-2 / Nluc representerar ett utmärkt alternativ för identifiering av blyprofylaktal och / eller terapi för behandling av SARS-CoV-2-infektion41. Användningen av reporteruttryckande rSARS-CoV-2 som uttrycker olika fluorescerande proteiner som används (t.ex. Venus och mCherry) gör att vi kan kombinera dem i bifluorescerande analyser för att identifiera om terapier effektivt kan hämma infektion av två virus samtidigt, in vitro och eller in vivo, och för att spåra virusinfektion och patogenes39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av kommersiell, finansiell och icke-finansiell eller personlig intressekonflikt i förhållande till det beskrivna arbetet.

Acknowledgments

Vi vill tacka medlemmarna vid vårt institut (Texas Biomedical Research Institute) för deras ansträngningar för att hålla våra anläggningar fullt fungerande och säkra under COVID-19-pandemin. Vi vill också tacka vår institutionella biosäkerhetskommitté (IBC) och stavning (IACUC) för att ha granskat våra protokoll på ett tidseffektivt sätt. Vi tackar Dr. Thomas Moran vid Icahn School of Medicine vid Mount Sinai för att ha tillhandahållit SARS-CoV korsreaktiv 1C7C7 nukleokapsid (N) protein monoklonal antikropp. SARS-CoV-2-forskning i Martinez-Sobridos laboratorium stöds för närvarande av NIAID / NIH-bidrag RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 och R43AI165089-01; Försvarsdepartementet (DoD) beviljar W81XWH2110095 och W81XWH2110103; San Antonio-partnerskapet för Precision Therapeutic; Texas Biomedical Research Institute Forum; University of Texas Health Science Center i San Antonio; San Antonio Medical Foundation; och av Center for Research on Influenza Pathogenesis and Transmission (CRIPT), ett NIAID-finansierat Center of Excellence for Influenza Research and Response (CEIRR, kontrakt # 75N93021C00014).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% Triton X-100 J.T.Baker X198-07 Store at room temperature (RT)
1% DEAE-Dextran MP Biomedicals 195133
10% Formalin solution, neutral buffered Sigma-Aldrich HT501128
Agar Oxoid LP0028
24-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 662160
5% Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S-5761
6-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 657160
96-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 655-180
African green monkey kidney epithelial cells (Vero E6) ATCC CRL-1586
Ami HT Spectral Instruments Imaging
Aura Imaging Software 3.2.0 Spectral Instruments Imaging Image analysis software
Bovine Serum Albumin (BSA), 35% Sigma-Aldrich A9647 Store at 4 °C
Cell culture grade water Corning 25-055-CV
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Corning Cellgro 15-013-CV Store at 4 °C
Anesthesia gas machine Veterinary Anesthesia Systems, Inc. VAS 2001R
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1500-050 Store at -20 °C
Four- to six-week-old female K18-hACE2 transgenic mice The Jackson Laboratory 34860
Graphpad Prism Version 9.1.0 GraphPad
Isoflurane Baxter 1001936040 Store at RT
MARS Data Analysis Software BMG LABTECH
MB10 tablets QUIP Laboratories MBTAB1.5 Store at RT
Nano-Glo Luciferase Assay Reagent Promega N1110 This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C
Nunc MicroWell 96-Well Microplates ThermoFisher Scientific 269620
Nunc MicroWell 96-Well Microplates ThermoFisher Scientific 269620
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x Corning 30-009-CI Store at -20 °C
PHERAstar FSX BMG LABTECH PHERAstar FSX
Precelleys Evolution homogenizer Bertin Instruments P000062-PEVO0-A
Soft tissue homogenizing CK14 – 7 mL Bertin Instruments P000940-LYSK0-A
T75 EasYFlask ThermoFisher Scientific 156499
VECTASTAIN ABC-HRP Kit, Peroxidase Vector Laboratories PK-4002 ABC kit and DAB Peroxidase Substrate kit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. V'Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).
  2. Pal, M., Berhanu, G., Desalegn, C., Kandi, V. Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2): An update. Cureus. 12 (3), 7423 (2020).
  3. Su, S., et al. Epidemiology, genetic recombination, and pathogenesis of coronaviruses. Trends in Microbiology. 24 (6), 490-502 (2016).
  4. Cui, J., Li, F., Shi, Z. L. Origin and evolution of pathogenic coronaviruses. Nature Reviews Microbiology. 17 (3), 181-192 (2019).
  5. Lu, R., et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet. 395 (10224), 565-574 (2020).
  6. Evans, J. P., Liu, S. L. Role of host factors in SARS-CoV-2 entry. Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100847 (2021).
  7. Petersen, E., et al. Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics. Lancet Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).
  8. Alfaraj, S. H., et al. Clinical predictors of mortality of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) infection: A cohort study. Travel Medicine and Infectious Disease. 29, 48-50 (2019).
  9. Harvey, W. T., et al. SARS-CoV-2 variants, spike mutations and immune escape. Nature Reviews Microbiology. 19 (7), 409-424 (2021).
  10. Dong, E., Du, H., Gardner, L. An interactive web-based dashboard to track COVID-19 in real time. Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 533-534 (2020).
  11. Bar-On, Y. M., Flamholz, A., Phillips, R., Milo, R. ARS-CoV-2 (COVID-19) by the numbers. Elife. 9, 57309 (2020).
  12. Roussel, Y., et al. SARS-CoV-2: fear versus data. International Journal of Antimicrobial Agents. 55 (5), 105947 (2020).
  13. Scialo, F., et al. SARS-CoV-2: One year in the pandemic. What have we learned, the new vaccine era and the threat of SARS-CoV-2 variants. Biomedicines. 9 (6), 611 (2021).
  14. Coronavirus (COVID-19) update: FDA authorizes additional monoclonal antibody for treatment of COVID-19. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-additional-monoclonal-antibody-treatment-covid-19 (2021).
  15. Dougan, M., et al. Bamlanivimab plus Etesevimab in Mild or Moderate Covid-19. New England Journal of Medicine. 385 (15), 1382-1392 (2021).
  16. Ledford, H. COVID antibody treatments show promise for preventing severe disease. Nature. 591 (7851), 513-514 (2021).
  17. Tuccori, M., et al. An overview of the preclinical discovery and development of bamlanivimab for the treatment of novel coronavirus infection (COVID-19): reasons for limited clinical use and lessons for the future. Expert Opinion on Drug Discovery. , 1-12 (2021).
  18. Phan, A. T., Gukasyan, J., Arabian, S., Wang, S., Neeki, M. M. Emergent inpatient administration of casirivimab and imdevimab antibody cocktail for the treatment of COVID-19 pneumonia. Cureus. 13 (5), 15280 (2021).
  19. O'Brien, M. P., et al. Subcutaneous REGEN-COV antibody combination in early SARS-CoV-2 infection. medRxiv. , (2021).
  20. Beigel, J. H., et al. Remdesivir for the treatment of Covid-19 - Final report. New England Journal of Medicine. 383 (19), 1813-1826 (2020).
  21. Li, L., et al. Effect of convalescent plasma therapy on time to clinical improvement in patients with severe and life-threatening COVID-19: A randomized clinical trial. Journal of the American Medical Association. 324 (5), 460-470 (2020).
  22. Polack, F. P., et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).
  23. Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Pfizer-BioNTech COVID-19 vaccine - United States, December 2020. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (50), 1922-1924 (2020).
  24. Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Janssen COVID-19 vaccine - United States, February 2021. Morbidity and Mortality Weekly Report. 70 (9), 329-332 (2021).
  25. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210 (2005).
  26. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  27. Nogales, A., et al. A novel fluorescent and bioluminescent bireporter Influenza A Virus to evaluate viral infections. Journal of Virology. 93 (10), 00032 (2019).
  28. Nogales, A., et al. Replication-competent fluorescent-expressing influenza B virus. Virus Research. 213, 69-81 (2016).
  29. Welsh, D. K., Noguchi, T. Cellular bioluminescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).
  30. Tran, V., Moser, L. A., Poole, D. S., Mehle, A. Highly sensitive real-time in vivo imaging of an influenza reporter virus reveals dynamics of replication and spread. Journal of Virology. 87 (24), 13321-13329 (2013).
  31. Schoggins, J. W., et al. Dengue reporter viruses reveal viral dynamics in interferon receptor-deficient mice and sensitivity to interferon effectors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14610-14615 (2012).
  32. Luker, G. D., et al. Noninvasive bioluminescence imaging of herpes simplex virus type 1 infection and therapy in living mice. Journal of Virology. 76 (23), 12149-12161 (2002).
  33. Li, X., et al. Development of a rapid antiviral screening assay based on eGFP reporter virus of Mayaro virus. Antiviral Research. 168, 82-90 (2019).
  34. Kirui, J., Freed, E. O. Generation and validation of a highly sensitive bioluminescent HIV-1 reporter vector that simplifies measurement of virus release. Retrovirology. 17 (1), 12 (2020).
  35. Shang, B., et al. Development and characterization of a stable eGFP enterovirus 71 for antiviral screening. Antiviral Research. 97 (2), 198-205 (2013).
  36. Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening. Antiviral Research. 91 (1), 11-19 (2011).
  37. Ye, C., et al. Rescue of SARS-CoV-2 from a single bacterial artificial chromosome. mBio. 11 (5), 02168 (2020).
  38. Avila-Perez, G., Park, J. G., Nogales, A., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Zika virus from a bacterial artificial chromosome cDNA clone. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59537 (2019).
  39. Chiem, K., et al. A bifluorescent-based assay for the identification of neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 variants of concern in vitro and in vivo. Journal of Virology. , (2021).
  40. Committee for the update of the guide for the care and use of laboratory animals., Institute for laboratory animal research (U.S) & National Academies Press (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. 8th edn. National Research Council (US). , National Academies Press. (2011).
  41. Ye, C., et al. Analysis of SARS-CoV-2 infection dynamic in vivo using reporter-expressing viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), (2021).

Tags

Immunologi och infektion utgåva 177 SARS-CoV-2 coronavirus fluorescens bioluminescens replikationskompetenta virus reportervirus NanoLuc luciferas venus fluorescerande protein virusinfektion in vivo-avbildning IVIS Ami HT K18 hACE2 transgena möss
Levande avbildning och kvantifiering av virusinfektion i K18 hACE2 transgena möss med reporteruttryckande rekombinant SARS-CoV-2
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morales Vasquez, D., Chiem, K.,… More

Morales Vasquez, D., Chiem, K., Silvas, J., Park, J. G., Ye, C., Martínez-Sobrido, L. Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2. J. Vis. Exp. (177), e63127, doi:10.3791/63127 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter