Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Live imaging og kvantificering af virusinfektion i K18 hACE2 transgene mus ved hjælp af reporter-udtrykkende rekombinant SARS-CoV-2

Published: November 5, 2021 doi: 10.3791/63127
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Texas Biomedical Research Institute

Summary

Denne protokol beskriver dynamikken i virusinfektioner ved hjælp af luciferase- og fluorescensekspressive rekombinante (r) SARS-CoV-2 og et in vivo-billeddannelsessystem (IVIS) i K18 hACE2 transgene mus for at overvinde behovet for sekundære tilgange, der kræves for at studere SARS-CoV-2-infektioner in vivo.

Abstract

Coronavirus sygdom 2019 (COVID-19) pandemi er forårsaget af alvorligt akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Til dato har SARS-CoV-2 været ansvarlig for over 242 millioner infektioner og mere end 4,9 millioner dødsfald på verdensplan. I lighed med andre vira kræver undersøgelse af SARS-CoV-2 anvendelse af eksperimentelle metoder til påvisning af tilstedeværelsen af virus i inficerede celler og / eller i dyremodeller. For at overvinde denne begrænsning genererede vi replikationskompetente rekombinante (r) SARS-CoV-2, der udtrykker bioluminescerende (nanoluciferase, Nluc) eller fluorescerende (Venus) proteiner. Disse reporter-udtrykkende rSARS-CoV-2 tillader sporing af virusinfektioner in vitro og in vivo baseret på ekspressionen af Nluc og Venus reportergener. Her beskriver undersøgelsen brugen af rSARS-CoV-2/Nluc og rSARS-CoV-2/Venus til at detektere og spore SARS-CoV-2-infektion i det tidligere beskrevne K18 humane angiotensin-konverterende enzym 2 (hACE2) transgene musemodel af infektion ved hjælp af in vivo imaging systems (IVIS). Denne rSARS-CoV-2/Nluc og rSARS-CoV-2/Venus viser rSARS-CoV-2/WT-lignende patogenicitet og viral replikation in vivo. Det er vigtigt, at Nluc og Venus udtryk giver os mulighed for direkte at spore virusinfektioner in vivo og ex vivo, i inficerede mus. Disse rSARS-CoV-2/Nluc og rSARS-CoV-2/Venus repræsenterer en glimrende mulighed for at studere biologien af SARS-CoV-2 in vivo, forstå virusinfektion og tilhørende COVID-19 sygdom og identificere effektive profylaktiske og / eller terapeutiske behandlinger til bekæmpelse af SARS-CoV-2-infektion.

Introduction

Alvorligt akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) er en indhyllet, positiv sans, enkeltstrenget RNA-virus, der tilhører Betacoronavirus-slægten i Coronaviridae-familien 1. Denne virale familie er opdelt i Alpha-, Beta-, Gamma- og Delta-coronavirus1. Alfa- og betacoronavirus inficerer hovedsageligt pattedyr, mens Gamma- og Deltacoronavirus næsten udelukkende inficerer fugle2. Til dato har syv coronavirus (CoV) krydset artsbarrierer og opstået som humane coronavirus (HCoV): to alfa-CoV'er (HCoV-229E og HCoV-NL63) og fem beta-CoV'er (HCoV-OC43, HCoV-HKU1, SARS-CoV, Mellemøsten respiratorisk syndrom coronavirus [MERS-CoV] og SARS-CoV-2)3,4,5,6. SARS-CoV, MERS-CoV og SARS-CoV-2 er højpatogene og forårsager alvorlig nedre luftvejsinfektion7. Før fremkomsten af SARS-CoV-2 var der to epidemiske udbrud forårsaget af CoV'er: SARS-CoV i Guangdong Providence, Kina, fra 2002-2003 med en dødelighed (CFR) på ca. 9,7%; og MERS-CoV i Mellemøsten fra 2012 til i dag med en CFR på ca. 34%7,8. SARS-CoV-2 har en samlet CFR mellem 3,4%-49%, hvor underliggende forhold bidrager til en højere CFR 8,9. Siden opdagelsen i december 2019 i Wuhan, Kina, har SARS-CoV-2 været ansvarlig for over 242 millioner menneskelige infektioner og mere end 4,9 millioner menneskelige dødsfald på verdensplan 7,10,11,12. Siden slutningen af 2020 har nye SARS-CoV-2-varianter af bekymring (VoC) og varianter af interesse (VoI) påvirket virusegenskaber, herunder transmission og antigenicitet 9,13, og den overordnede retning for COVID-19-pandemien. Til behandling af SARS-CoV-2-infektioner er der i øjeblikket kun et USA (USA) Food and Drug Administration (FDA) terapeutisk antiviral (remdesivir) og et lægemiddel til godkendelse af nødbrug (EUA) (baricitinib, der skal administreres i kombination med remdesivir)14. Der er også 6 godkendte MONOKLONALE ANTISTOFFER AF ERE: REGEN-COV (casirivimab og imdevimab, administreret sammen), sotrovimab, tocilizumab og bamlanivimab og etesevimab administreret sammen 15,16,17,18,19. Der er i øjeblikket kun en FDA-godkendt profylaktisk vaccine, Pfizer-BioNTech, og to andre profylaktiske vacciner (Moderna og Janssen) er blevet EUA godkendt 20,21,22,23,24. Men med den ukontrollerede infektionshastighed og fremkomsten af VoC og VoI udgør SARS-CoV-2 stadig en trussel mod menneskers sundhed. Der er derfor et presserende behov for nye tilgange til at identificere effektive profylaktiske midler og terapier til bekæmpelse af SARS-CoV-2-infektion og den stadig igangværende covid-19-pandemi.

At studere SARS-CoV-2 kræver besværlige teknikker og sekundære tilgange til at identificere tilstedeværelsen af virussen i inficerede celler og / eller validerede dyremodeller for infektion. Brugen af omvendt genetik har gjort det muligt for generering af rekombinante vira at besvare vigtige spørgsmål i biologien af virusinfektioner. For eksempel har omvendte genetikteknikker givet midler til at afdække og forstå mekanismerne for virusinfektion, patogenese og sygdom. Ligeledes har omvendte genetikmetoder banet vejen for at konstruere rekombinante vira, der mangler virale proteiner for at forstå deres bidrag til viral patogenese. Derudover er omvendte genetikteknikker blevet anvendt til at generere rekombinante vira, der udtrykker reportergener til in vitro- og in vivo-applikationer, herunder identifikation af profylaktiske og / eller terapeutiske tilgange til behandling af virusinfektioner. Fluorescerende og bioluminescerende proteiner er de mest almindeligt anvendte reportergener på grund af deres følsomhed, stabilitet og lette detektion baseret på forbedring af nye teknologier25,26. In vitro har fluorescerende proteiner vist sig at tjene som en bedre mulighed for lokalisering af vira i inficerede celler, mens luciferaser er mere bekvemme til kvantificeringsundersøgelser 27,28,29. In vivo foretrækkes luciferaser frem for fluorescerende proteiner til hel dyrebilleddannelse, mens fluorescerende proteiner foretrækkes til identifikation af inficerede celler eller ex vivo-billeddannelse 30,31,32. Brugen af indberettende rekombinante vira har fungeret som et kraftfuldt værktøj til undersøgelse af vira i mange familier, herunder blandt andet flavivirus, enterovirus, alphavirus, lentivirus, arenavirus og influenzavirus 28,33,34,35,36.

For at overvinde behovet for sekundære tilgange til at studere SARS-CoV-2 og karakterisere realtids SARS-CoV-2-infektion in vivo, har vi genereret replikationskompetente rekombinante (r) SARS-CoV-2, der udtrykker bioluminescerende (nanoluciferase, Nluc) eller fluorescerende (Venus) proteiner ved hjælp af vores tidligere beskrevne bakterielle kunstige kromosomer (BAC) -baserede omvendte genetik, som opretholdes som en enkelt kopi i E. coli for at minimere toksiciteten af virussekvenser under dens formering i bakterier 37,38. Navnlig viste rSARS-CoV-2/Nluc og rSARS-CoV-2/Venus rSARS-CoV-2/WT-lignende patogenicitet in vivo. Det høje niveau af Venus-ekspression fra rSARS-CoV-2/Venus gjorde det muligt at detektere virusinfektion i lungerne hos inficerede K18 hACE2 transgene mus ved hjælp af et in vivo-billeddannelsessystem (IVIS)39. Niveauerne af Venus-ekspression korrelerede godt med virale titere påvist i lungerne, hvilket demonstrerede muligheden for at bruge Venus-ekspression som en gyldig surrogat af SARS-CoV-2-infektion. Ved hjælp af rSARS-CoV-2 /Nluc var vi i stand til at spore dynamikken i virusinfektion i realtid og i længderetningen vurdere SARS-CoV-2-infektion in vivo ved hjælp af den samme IVIS-tilgang i K18 hACE2 transgene mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokoller, der involverer K18 hACE2 transgene mus, blev godkendt af Texas Biomedical Research Institute (TBRI) Institutional Biosafety Committee (IBC) og Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Alle forsøg følger anbefalingerne i Det Nationale Forskningsråds vejledning for pleje og brug af forsøgsdyr40. Det passende personlige beskyttelsesudstyr (PPE) er påkrævet, når du arbejder med mus.

1. Brug af K18 hACE2 transgene mus

  1. Køb og vedligehold 4-6 uger gamle hunmus B6.Cg-Tg(K18-ACE2)2Prlmn/J mus (K18 hACE2 transgene mus) i et biosikkerhedsniveau (BSL)-2 dyreplejeanlæg under specifikke patogenfrie forhold.
    1. Efter ankomsten til BSL2-faciliteterne skal dyrene akklimatisere sig i 7 dage og overføre dem til BSL-3-dyrefaciliteten for infektioner og andre eksperimentelle procedurer.
    2. Efter IACUC-protokoller skal du placere 4 mus pr. Bur. For at sikre, at dyret er død, skal dyrene aflives efter museinfektion med rSARS-CoV-2 og in vivo-billeddannelse med en dødelig dosis Fatal-Plus (>100 mg/kg).

2. Biosikkerhed

BEMÆRK: I dette manuskript genereres rSARS-CoV-2 ved hjælp af BAC-baserede omvendte genetiske systemer for SARS-CoV-2 USA-WA1/2020 stamme, som tidligere beskrevet37. Alle in vivo-procedurer , der involverer rSARS-CoV-2/Nluc- eller rSARS-CoV-2/Venus-infektioner, skal udføres i et biologisk sikkerhedsskab under BSL-3-betingelser.

  1. Rengør biosikkerhedsskabet med 2% Wexicide og 70% Ethanol desinfektionsmiddel sekventielt før og efter udførelse af alle de eksperimentelle procedurer, der er beskrevet i denne artikel.
  2. Steriliser alt dissektionsmateriale (saks, dissekeringstang osv.) og homogenisatoren før og efter hver brug.
  3. Rengør isolationskammeret og desinficer med MB10 tabletter før og efter hver brug i henhold til producentens anvisninger.
  4. Kassér alt biologisk materiale, der er produceret under procedurerne i henhold til IBC- og IACUC-retningslinjerne.

3. In vivo-karakterisering af rSARS-CoV-2

  1. Mus infektioner
    1. Placer 4-6 uger gamle K18 hACE2 transgene mus i mærkede bure, identificer musene i hvert bur ved hjælp af en øreslagskode og placer 4 mus pr. Bur. Brug en gruppe mus til kropsvægt og overlevelse og en anden gruppe dyr til viral titrering og billeddannelse.
    2. Før infektion barberer musens bryst på den ventrale side fra brystvorten til det inguinale brystvorteområde for at lette bioluminescenssignalet.
    3. rSARS-CoV-2-poden fremstilles med 105 plaquedannende enheder (PFU)/mus under sterile forhold i et samlet volumen på 50 μL ved hjælp af steril 1x phosphatbuffersalin (PBS).
      BEMÆRK: Beregn mængden af rSARS-CoV-2, der skal anvendes i viral fortynding med formlen: virus nødvendig = (105 PFU pr. Mus / 50 μL) x endeligt volumen) / lager viral titer.
    4. Hold virus inokulum kølet på is.
    5. Brug de mock-inficerede (1x PBS) og rSARS-CoV-2/WT-inficerede mus som interne kontroller. Placer de mock-inficerede mus i et separat bur end rSARS-CoV-2-inficerede mus.
    6. Bedøv musene ved hjælp af 5% isofluran gasformig sedation i et anæstesikammer og vedligehold med 3% isofluran.
    7. Når postural reaktion og højre refleks er bekræftet, skal du placere musen i dorsal recumbency position.
    8. Skru musens hals mellem pegefingeren og tommelfingeren, og hold halen mod håndfladen med pinkfingeren for at holde dyret i en dorsal position.
    9. Pipettespidsen indeholdende 50 μL virusinokulum anbringes i næseboret, og opløsningen skubbes langsomt ud. Sørg for, at virusinokulumhaleres, og at der ikke er tilbagesvaling ved at observere, at podefaldet forsvinder.
  2. Overvågning af bioluminescens K18 hACE2 transgene mus inficeret med rSARS-CoV-2/Nluc (figur 1 og figur 2)
    BEMÆRK: Dette eksperiment følger den skematiske repræsentation og bruger de vira, der vises i figur 1. En isofluranbedøvelsesfastgørelse er påkrævet til in vivo-billeddannelsessystemet (IVIS). Se materialetabel for detaljer instrumenter og systemer, der kræves.
    1. Start billedbehandlingssoftwaren, og konfigurer parametrene, klik på billedtilstand til Bioluminescens, åbn filter, og indstil eksponeringstiden til auto.
    2. Når du initialiserer IVIS-maskinen, skal du placere musene i isolationskammeret, mens de stadig er inde i biosikkerhedsskabet. Inducer mus med isofluran i en koncentration på 5%. Når tabet af den posturale reaktion og rejektionsrefleks er bekræftet, skal du opretholde med 3% isofluran.
    3. Når mus er bedøvet, skal du fjerne dem fra isolationskammeret og retro-orbitalt administrere luciferasesubstratet fortyndet 1:10 i 1x PBS (slutvolumen 100 μL / mus) med en 25 G nål.
    4. Efter administration af luciferasesubstrat skal musene placeres tilbage i isolationskammeret med brystet opad og næsehulen inde i manifoldkeglen for at holde dyret bedøvet under billeddannelsesproceduren.
    5. Overfør isolationskammeret til IVIS-maskinen, og vælg Hent i softwareprogrammet for at initialisere (figur 2A) øjeblikkeligt efter lukning af IVIS-billeddækslet.
    6. For at analysere de erhvervede bioluminescensbilleder skal du bruge ROI-værktøjet (region af interesse) i softwaren til at betegne det nøjagtige signal og måle fluxen (figur 2B).
    7. Klik på Mål og lad systemet begynde at vurdere bioluminescensen i fotoner for at give den absolutte fotonemission, der kan sammenlignes med outputmålingerne fra de forskellige parametre.
    8. Billede mus 1-, 2-, 4- og 6-dages post-infektion.
    9. Efter billeddannelse placeres mus tilbage i buret.
  3. Fluorescensanalyse i K18 hACE2 transgene mus inficeret med rSARS-CoV-2/Venus (figur 3 og figur 4)
    BEMÆRK: Dette eksperiment følger den skematiske repræsentation og rSARS-CoV-2 vist i figur 3. Se materialetabel for detaljer instrumenter og systemer, der kræves.
    1. Start billedbehandlingssoftwaren, og konfigurer parametrene, indstil excitering (500 nm) og emissionsfiltre (530 nm), klik på billedtilstand til Fluorescens , og indstil eksponeringstiden til auto.
    2. Intraperitonealt aflive musene ved hjælp af en dødelig dosis Fatal-Plus (>100 mg/kg). Efter eutanasi desinficeres snitstedet med 70% ethanol.
    3. Brug pincet til at trække huden, lave et snit fra brystbenet til maven og skære snittet fra siderne med en saks. Skær levervenen for at minimere mængden af blod i lungerne og undgå høje baggrundssignaler under billeddannelse.
    4. Brug en saks til at skære brystbenet og åbne brystkassen. Klip derefter enden af luftrøret med en saks og fjern lungerne med pincet.
    5. Anbring de udskårne lunger i en 6-brønds plade indeholdende 2 ml 1x PBS og skyl for at fjerne overskydende blod. Minimer muligheden for forurening mellem prøver ved at desinficere og rengøre kirurgiske værktøjer mellem prøver ved hjælp af 70% ethanol.
    6. Efter initialisering af IVIS-maskinen skal du placere lungerne i en sort bakke og adskille vævene fra hinanden.
    7. Placer bakken inde i isolationskammeret inde i biosikkerhedsskabet, og overfør derefter isolationskammeret til IVIS. Luk døren, og klik på Hent for at starte billedbehandlingssystemet (figur 4A).
    8. For at analysere fluorescens skal du bruge ROI-værktøjet og tegne ROI'er omkring hver af de enkelte lunger. Mål hvert investeringsafkast manuelt, og brug derefter de gennemsnitlige strålingseffektivitetsværdier, der er givet, og træk fra de mock-inficerede mus (figur 4B).
    9. Når billeddannelsen er afsluttet, skal du placere vævene på is til analyse samme dag eller i et kryorør til tørisfrysning for at opbevare ved -80 ° C til senere behandling.
  4. Lungelysfeltbilleddannelse og patologi scoring af K18 hACE2 transgene mus inficeret med rSARS-CoV-2 / Nluc (figur 2A-C) og rSARS-CoV-2 / Venus (figur 4A-C)
    1. Efter billeddannelse af bioluminescens af mus inficeret med rSARS-CoV-2/Nluc, rSARS-CoV-2/WT og mock-inficeret, returnere musene til deres bure. Fortsæt med eutanasi og ex vivo bright field imaging af musens lunger (figur 2A).
    2. Efter billeddannelse ex vivo fluorescens af lunger hos inficerede mus, tag lyse feltbilleder af lungerne (figur 4A).
    3. Analyser de grove læsioner på overfladen af lungen ved hjælp af ImageJ (figur 2C og 4C).
    4. Åbn lungebilledet, der skal analyseres i ImageJ.
    5. Beregn forholdet mellem pixel og cm, brug værktøjet Lige og mål billedets faktiske længde.
    6. Når du har valgt, skal du klikke på Analyser > Mål for at beregne længden af pixels for længden.
    7. Klik på Analyse > Indstil skala , og indtast de tal, der er beregnet ud fra det foregående trin.
    8. Brug værktøjet Frihåndsvalg , og vælg hele lungeoverfladen. Klik på Analyser > Mål for at måle det samlede lungeareal.
    9. Klik på Rediger > valg > Foretag omvendt for at vælge resten af lungeområdet, og tryk derefter på slet eller backspace for at fjerne baggrunden.
    10. Fjern det valgte område, og klik derefter på Billede > Juster > farvetærskel.
    11. For at vælge patologisk læsionsområde skal du justere lysstyrken til et minimum (mellem 1 og 50) og et maksimum (mellem 50 og 200) afhængigt af de tilstedeværende overbelastningsniveauer og blødninger.
    12. Når patologiske læsioner er valgt, skal du klikke på Vælg nederst i tærskelfarvepanelet og derefter klikke på Analyser > Mål for at måle patologiske områder.
    13. Procentdelen af bruttolæsioner beregnes med formlen: % af patologisk areal = (måling af patologisk areal/total lungeoverflade) x 100.
  5. Virale titreringer (figur 2D og figur 4D)
    1. Efter billeddannelse skal musene eutanasi og indsamle lunger, hjerne og næseslimhinde.
    2. Anbring lungerne, hjernen og næseslimhinden i separate sterile vævshomogenisatorer og tilsæt 1 ml kold 1x PBS.
    3. Homogeniser prøverne ved centrifugering ved 21.500 x g i 10 minutter til pelletcelleaffald. Saml og overfør supernatanterne til et nyt sterilt rør og kassér pelleten.
    4. Hvis der udføres virale titreringer samme dag, opbevares supernatanterne ved 4 °C. Alternativt fryses supernatanten af de homogeniserede prøver ved -80 °C, indtil den evalueres senere.
    5. Ved anvendelse af supernatanterne opnået fra vævshomogenaterne fremstilles 10 gange serielle fortyndinger og inficerer sammenflydende monolag af Vero E6-celler med 1 ml af hver fortynding af supernatanten (6-brønds pladeformat, 1,2 × 106 celler / brønd, triplikater).
    6. Virusadsorberes i 1 time ved 37 °C i en befugtet 5 % CO2 -inkubator.
    7. Efter viral adsorption vaskes cellerne med 1 ml 1x PBS og inkuberes i 2 ml post-infektionsmedier indeholdende 1% Agar i den befugtede 5% CO2-inkubator ved 37 ° C i 72 timer.
    8. Efter inkubationen inaktiveres pladerne i 10% neutralt bufferformin i 24 timer ved 4 °C, og det sikres, at hele pladen er nedsænket.
    9. Tag pladerne ud af BSL3 og vask cellerne tre gange med 1 ml 1x PBS og permeabiliser med 1 ml 0,5% Triton X-100 i 10 minutter ved stuetemperatur (RT).
    10. Cellerne blokeres med 1 ml 2,5 % bovint serumalbumin (BSA) i 1x PBS i 1 time ved 37 °C efterfulgt af inkubation i 1 ml 1 ml 1 μg/ml af SARS-CoV-nukleocapsid (N)-proteinets krydsreaktive monoklonale antistof (1C7C7), fortyndet i 2,5 % BSA i 1 time ved 37 °C.
    11. Vask cellerne tre gange med 1 ml 1x PBS, og udvikl plaques ved hjælp af ABC-kittet og DAB Peroxidase Substrate kit i henhold til producentens anvisninger.
    12. Beregn virustitrene som PFU / ml.
      BEMÆRK: Beregn med formlen PFU/ml = fortyndingsfaktor x antal plaques x (1 ml/podevolumen).
  6. Nluc-aktivitet i væv fra K18 hACE2 transgene mus inficeret med rSARS-CoV-2/Nluc (figur 2E)
    1. Kvantificer tilstedeværelsen af Nluc i organhomogenaterne fra mock-, rSARS-CoV-2/WT- og rSARS-CoV-2/Nluc-inficerede K18 hACE2-transgene mus ved hjælp af et luciferaseassay efter producentens anvisninger.
  7. Evaluering af sygelighed og dødelighed (figur 2F, G og figur 4E, F)
    1. Intranasalt inficere 4-6 uger gamle hun-K18 hACE2 transgene mus med 105 PFU rSARS-CoV-2/WT, rSARS-CoV-2/Venus, rSARS-CoV-2/Nluc eller mock-inficeret som beskrevet i pkt. 3.1.
    2. Overvåg og vej musene over 12 dage på samme tid for at minimere vægtvariationen på grund af fødeindtagelse. Afliv musene, der mister 25% af deres oprindelige kropsvægt, da de har nået et humant endepunkt, og bemærk disse mus som bukkende for virusinfektion.
    3. Efter 12 dage aflives de mus, der overlever virusinfektion, og beregnes procentdelen af kropsvægtsændring og overlevelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

rSARS-CoV-2/Nluc-infektion hos K18 hACE2 transgene mus (figur 1 og 2)
Figur 1A viser en skematisk repræsentation af rSARS-CoV-2/WT (øverst) og rSARS-CoV-2/Nluc (nederst), der anvendes til at vurdere infektioner in vivo. Figur 1B viser det skematiske rutediagram, der anvendes til at vurdere rSARS-CoV-2/Nluc-infektionsdynamikken hos K18 hACE2-transgene mus. Fire til seks uger gamle K18 hACE2-hunmus (N = 4) var enten mock-inficeret med 1x PBS eller inficeret med 105 PFU af rSARS-COV-2/WT eller rSARS-CoV-2/Nluc intranasalt. 1-, 2-, 4- og 6-dages post-infektion blev mus bedøvet ved hjælp af isolationskammeret og derefter injiceret med Nluc-substrat retro-orbitalt. Isolationskammeret blev straks placeret i IVIS, og Nluc-signalet blev vurderet in vivo ved hjælp af billedbehandlingssoftwaren. Nluc-ekspression blev let påvist hos mus inficeret med rSARS-CoV-2/Nluc, men ikke hos mus inficeret med rSARS-CoV-2/WT eller mock-inficeret (figur 2A). Kvantitative analyser viste Nluc-intensitet på forskellige dage efter infektion (figur 2B). Grove læsioner på lungeoverfladen hos mus inficeret med rSARS-CoV-2/Nluc var sammenlignelige med læsionerne i den rSARS-CoV-2/WT-inficerede gruppe (figur 2C). Endelig blev museorganer (lunger, nasal turbinat og hjerne) homogeniseret, og virale titere blev bestemt ved plaqueassay (PFU / ml), og Nluc-aktivitet blev bestemt ved hjælp af luciferaseassayet efter producentens anvisninger. Plaques blev vurderet ved immunostaining ved anvendelse af det krydsreaktive SARS-CoV N monoklonale antistof 1C7C7. Virustitre påvist i de rSARS-CoV-2/Nluc-inficerede mus var sammenlignelige med dem, der var inficeret med rSARS-CoV-2/WT i alle organer på forskellige dage efter infektion (figur 2D). Nluc-aktivitet blev kun påvist i organerne fra rSARS-CoV-2/Nluc-inficerede mus (figur 2E). En separat gruppe af mock-inficerede og virusinficerede mus blev overvåget i 12 dage for ændringer i kropsvægt (figur 2F) og overlevelse (figur 2G). Mus inficeret med rSARS-CoV-2/Nluc og rSARS-CoV-2/WT tabte op til 25 % af deres kropsvægt, og alle bukkede under for virusinfektion mellem 7-8 dage efter infektion (figur 2F-G).

rSARS-CoV-2/Venus-infektion hos K18 hACE2 transgene mus (figur 3 og 4)
Figur 3A viser en skematisk repræsentation af rSARS-CoV-2/WT (øverst) og rSARS-CoV-2/Nluc (nederst), der anvendes til at vurdere infektioner ex vivo. Figur 3B viser det skematiske rutediagram, der anvendes til at vurdere rSARS-CoV-2/Venus-dynamikken i K18 hACE2 transgene mus. Fire til seks uger gamle hun-K18 hACE2 transgene mus (N= 4/gruppe) var enten mock-inficeret med 1x PBS eller inficeret med 105 PFU af rSARS-COV-2/WT eller rSARS-CoV-2/Venus intranasalt. 1-, 2-, 4- og 6-dages efter infektion blev mus aflivet, og deres lunger blev udskåret og afbildet ex vivo ved hjælp af en IVIS. Venusekspression blev let påvist i alle lunger fra mus inficeret med rSARS-CoV-2/Venus, men ikke dem, der var inficeret med rSARS-CoV-2/WT eller mock-inficeret (figur 4A). Kvantitative analyser viste, at Venus-intensiteten topper 2 dage efter infektion og falder i løbet af infektionsforløbet i lungerne hos inficerede mus (figur 4B). Billeder af lungeoverfladen afslørede grove læsioner af mus inficeret med rSARS-CoV-2/Venus var sammenlignelige med dem hos rSARS-CoV-2/WT-inficerede mus (figur 4C). Endelig blev museorganer (lunger, nasal turbinat og hjerne) homogeniseret, og virale titere blev bestemt ved plaqueassay og vurderet ved immunostaining ved anvendelse af SARS-CoV N-proteinet krydsreaktivt monoklonalt antistof 1C7C7. Infektion med rSARS-CoV-2/Venus resulterede i sammenlignelige virale titere som dem, der blev observeret hos mus inficeret med rSARS-CoV-2/WT i alle organer (figur 4D). En separat gruppe af mock-inficerede og virusinficerede mus blev overvåget i 12 dage for ændringer i kropsvægt (figur 4E) og overlevelse (figur 4F). Mus inficeret med rSARS-CoV-2/Venus og rSARS-CoV-2/WT mistede op til 25 % af deres kropsvægt, og alle bukkede under for virusinfektion på dag 9 efter infektion uden overlevelse (figur 4E-4F).

Figure 1
Figur 1: Vurdering af rSARS-CoV-2/Nluc-infektion in vivo ved anvendelse af K18 hACE2 transgene mus. A) Skematisk gengivelse af rSARS-CoV-2/WT (øverst) og rSARS-CoV-2/Nluc (nederst). (B) Skematisk rutediagram til vurdering af rSARS-CoV-2/Nluc in vivo. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: rSARS-CoV-2Nluc ekspression i inficerede K18 hACE2 transgene mus. (A-B) Fire til seks uger gamle K18 hACE2-hunmus var mock-inficeret (N = 4) eller inficeret med rSARS-CoV-2/WT (N = 4) eller rSARS-CoV-2/Nluc (N = 4) med 105 PFU pr. dyr. Musene blev bedøvet 1-, 2-, 4- og 6-dages post-infektion efter retroorbital injiceret med Nluc-substratet. (A) Nluc-ekspression blev bestemt under et in vivo-billeddannelsessystem, og lunger fra mock-inficerede og inficerede mus blev udskåret og fotograferet 1-, 2-, 4- og 6-dages post-infektion. (B) Nluc-intensitet blev kvantitativt analyseret af billedanalysesoftwaren, og (C) bruttolæsioner på lungeoverfladen blev kvantitativt analyseret af ImageJ (C) ** P < 0,01. (D) Virale titere i næseturbinat (venstre), lunger (i midten) og hjerne (højre) fra mus inficeret med rSARS-CoV-2/WT og rSARS-CoV-2/Nluc blev bestemt ved plaqueassay. (E) Nluc-aktivitet i nasal turbinat (venstre), lunger (midten) og hjernen (højre) blev målt under en luciferase multi-plate reader. ns, ikke signifikant. Mock- og virusinficerede mus blev overvåget i 12 dage for ændringer i (F) kropsvægt og (G) overlevelse. Alle data præsenteres som middel ± SD for hver gruppe og analyseres af SPSS13.0 (IBM). En P-værdi på mindre end 0,05 (P < 0,05) blev betragtet som statistisk signifikant. Dette tal er blevet ændret fra Ye C. et al.41. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Vurdering af rSARS-CoV-2/Venus-infektion in vivo ved hjælp af K18 hACE2 transgene mus. (A) Skematisk repræsentation af rSARS-CoV-2/WT (øverst) og rSARS-CoV-2/Venus (nederst). (B) Skematisk rutediagram til vurdering af rSARS-CoV-2/Venus in vivo. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: rSARS-CoV-2/Venus ekspression i inficerede K18 hACE2 transgene mus. (A-B) Fire til seks uger gamle hunmus med K18 hACE2 var mock-inficeret (N = 4) eller inficeret (105 PFU/mus) med rSARS-CoV-2/WT (N = 4) eller rSARS-CoV-2/Venus (N = 4). Lunger blev udskåret 1-, 2-, 4- og 6-dages efter infektion, billeder af lunger blev fotograferet 1-, 2-, 4- og 6-dages post-infektion. (A) Venusekspression blev vurderet under en IVIS, (B) fluorescensintensitet blev kvantitativt analyseret af billedanalysesoftwaren, og (C) bruttolæsionerne på lungeoverfladerne blev kvantitativt analyseret af ImageJ. **P < 0,01. (D) Virale titere i næseturbinat (venstre), lunger (i midten) og hjerne (højre) fra mus inficeret med rSARS-CoV-2/WT og rSARS-CoV-2/Venus blev bestemt ved plaqueassay. ns, ikke signifikant. Mock- og SARS-CoV-2-inficerede mus blev overvåget i 12 dage for (E) vægttab og (F) overlevelse. Alle data præsenteres som middel ± SD for hver gruppe og analyseres af SPSS13.0 (IBM). En P-værdi på mindre end 0,05 (P < 0,05) blev betragtet som statistisk signifikant. Dette tal er blevet ændret fra Ye C. et al.41. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol demonstrerer muligheden for at bruge disse rSARS-CoV-2-ekspressive reportergener til at overvåge virusinfektioner in vivo. Begge reporter-udtrykkende rekombinante vira giver et glimrende værktøj til at studere SARS-CoV-2-infektioner in vivo. De beskrevne ex vivo (rSARS-CoV-2/Venus) og in vivo (rSARS-CoV-2/Nluc) billeddannelsessystemer repræsenterer en glimrende mulighed for at forstå dynamikken i SARS-CoV-2-infektion, viral patogenese og identificere inficerede celler/organer på forskellige tidspunkter efter virusinfektion. For at udføre ex vivo-undersøgelser (rSARS-CoV-2/Venus) og in vivo-undersøgelser (rSARS-CoV-2/Nluc) er det eminent at have nøjagtige og reproducerbare infektioner samt passende vaccinationer af rSARS-CoV-2/Nluc.

Når man studerer in vivo-infektioner ved hjælp af rSARS-CoV-2/Nluc, skal mus barberes for at lette Nluc-visualisering under IVIS. Der er også behov for at inokulere Nluc-substratet til visualisering af Nluc. Dette kan kræve nogle eksperimentelle test for at bestemme koncentrationerne og volumenet af Nluc-substratet for at sikre et højt Nluc-signal. Når man studerer ex vivo-infektioner ved hjælp af rSARS-CoV-2/Venus, og på grund af begrænsninger ved at detektere Venus direkte fra hele musene ved hjælp af IVIS, er det kun ex vivo-billeddannelse af lungerne, der muliggør påvisning af Venus-ekspression. Dette kræver, at en gruppe mus skal aflives på forskellige tidspunkter. Dette er i modstrid med situationen for mus inficeret med rSARS-CoV-2/Nluc, da den samme gruppe mus kan afbildes på forskellige dage efter infektion uden at kræve eutanasi på hvert af de tidspunkter efter infektion, der kræves for rSARS-CoV-2/Venus. En fordel ved rSARS-CoV-2/Venus i forhold til rSARS-CoV-2/Nluc er, at det kan bruges sammen med flowcytometri til at identificere, hvilken type celler der er inficeret med SARS-CoV-2 ved blot at sortere inficerende celler fra ikke-inficerede celler kombineret med brugen af specifikke cellulære markører, som vi tidligere har beskrevet med influenza (REF). Et vigtigt aspekt af vores rSARS-CoV-2/Venus og rSARS-CoV-2/Nluc er, at begge udviste WT-lignende vækstegenskaber in vitro og in vivo uden at vise tegn på dæmpning, hvilket giver os mulighed for at overvåge virusinfektion ex vivo i lungerne på inficerede mus (rSARS-CoV-2/Venus) og dynamikken i viral replikation i hele musen (rSARS-CoV-2/Nluc) ved hjælp af ikke-invasiv langsgående in vivo-billeddannelse .

Det er vigtigt, at disse indberettende rSARS-CoV-2/Venus og rSARS-CoV-2/Nluc udgør en glimrende mulighed for identifikation af blyprofylaktiske og/eller terapeutiske midler til behandling af SARS-CoV-2-infektion41. Brugen af reporter-udtrykkende rSARS-CoV-2, der udtrykker forskellige fluorescerende proteiner, der anvendes (f.eks. Venus og mCherry), giver os mulighed for at kombinere dem i bifluorescerende assays for at identificere, om terapi effektivt kan hæmme infektion af to vira på samme tid, in vitro og eller in vivo, og til at spore virusinfektion og patogenese39.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at forskningen blev udført i mangel af kommerciel, økonomisk og ikke-finansiel eller personlig interessekonflikt i forhold til det beskrevne arbejde.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke medlemmer på vores institut (Texas Biomedical Research Institute) for deres indsats for at holde vores faciliteter fuldt operationelle og sikre under COVID-19-pandemien. Vi vil også gerne takke vores Institutional Biosafety Committee (IBC) og spell (IACUC) for at gennemgå vores protokoller på en tidseffektiv måde. Vi takker Dr. Thomas Moran ved Icahn School of Medicine på Mount Sinai for at levere SARS-CoV krydsreaktivt 1C7C7 nucleocapsid (N) protein monoklonalt antistof. SARS-CoV-2-forskning i Martinez-Sobridos laboratorium støttes i øjeblikket af NIAID / NIH-tilskud RO1AI161363-01, RO1AI161175-01A1 og R43AI165089-01; Forsvarsministeriet (DoD) giver W81XWH2110095 og W81XWH2110103; San Antonio-partnerskabet for præcisionsterapi; Texas Biomedical Research Institute Forum; University of Texas Health Science Center i San Antonio; San Antonio Medical Foundation; og af Center for Forskning i Influenza Patogenese og Transmission (CRIPT), et NIAID-finansieret Center of Excellence for Influenza Research and Response (CEIRR, kontrakt nr. 75N93021C00014).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% Triton X-100 J.T.Baker X198-07 Store at room temperature (RT)
1% DEAE-Dextran MP Biomedicals 195133
10% Formalin solution, neutral buffered Sigma-Aldrich HT501128
Agar Oxoid LP0028
24-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 662160
5% Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S-5761
6-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 657160
96-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 655-180
African green monkey kidney epithelial cells (Vero E6) ATCC CRL-1586
Ami HT Spectral Instruments Imaging
Aura Imaging Software 3.2.0 Spectral Instruments Imaging Image analysis software
Bovine Serum Albumin (BSA), 35% Sigma-Aldrich A9647 Store at 4 °C
Cell culture grade water Corning 25-055-CV
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Corning Cellgro 15-013-CV Store at 4 °C
Anesthesia gas machine Veterinary Anesthesia Systems, Inc. VAS 2001R
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1500-050 Store at -20 °C
Four- to six-week-old female K18-hACE2 transgenic mice The Jackson Laboratory 34860
Graphpad Prism Version 9.1.0 GraphPad
Isoflurane Baxter 1001936040 Store at RT
MARS Data Analysis Software BMG LABTECH
MB10 tablets QUIP Laboratories MBTAB1.5 Store at RT
Nano-Glo Luciferase Assay Reagent Promega N1110 This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C
Nunc MicroWell 96-Well Microplates ThermoFisher Scientific 269620
Nunc MicroWell 96-Well Microplates ThermoFisher Scientific 269620
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x Corning 30-009-CI Store at -20 °C
PHERAstar FSX BMG LABTECH PHERAstar FSX
Precelleys Evolution homogenizer Bertin Instruments P000062-PEVO0-A
Soft tissue homogenizing CK14 – 7 mL Bertin Instruments P000940-LYSK0-A
T75 EasYFlask ThermoFisher Scientific 156499
VECTASTAIN ABC-HRP Kit, Peroxidase Vector Laboratories PK-4002 ABC kit and DAB Peroxidase Substrate kit

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. V'Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).
  2. Pal, M., Berhanu, G., Desalegn, C., Kandi, V. Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2): An update. Cureus. 12 (3), 7423 (2020).
  3. Su, S., et al. Epidemiology, genetic recombination, and pathogenesis of coronaviruses. Trends in Microbiology. 24 (6), 490-502 (2016).
  4. Cui, J., Li, F., Shi, Z. L. Origin and evolution of pathogenic coronaviruses. Nature Reviews Microbiology. 17 (3), 181-192 (2019).
  5. Lu, R., et al. Genomic characterisation and epidemiology of 2019 novel coronavirus: implications for virus origins and receptor binding. Lancet. 395 (10224), 565-574 (2020).
  6. Evans, J. P., Liu, S. L. Role of host factors in SARS-CoV-2 entry. Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100847 (2021).
  7. Petersen, E., et al. Comparing SARS-CoV-2 with SARS-CoV and influenza pandemics. Lancet Infectious Diseases. 20 (9), 238-244 (2020).
  8. Alfaraj, S. H., et al. Clinical predictors of mortality of Middle East Respiratory Syndrome Coronavirus (MERS-CoV) infection: A cohort study. Travel Medicine and Infectious Disease. 29, 48-50 (2019).
  9. Harvey, W. T., et al. SARS-CoV-2 variants, spike mutations and immune escape. Nature Reviews Microbiology. 19 (7), 409-424 (2021).
  10. Dong, E., Du, H., Gardner, L. An interactive web-based dashboard to track COVID-19 in real time. Lancet Infectious Diseases. 20 (5), 533-534 (2020).
  11. Bar-On, Y. M., Flamholz, A., Phillips, R., Milo, R. ARS-CoV-2 (COVID-19) by the numbers. Elife. 9, 57309 (2020).
  12. Roussel, Y., et al. SARS-CoV-2: fear versus data. International Journal of Antimicrobial Agents. 55 (5), 105947 (2020).
  13. Scialo, F., et al. SARS-CoV-2: One year in the pandemic. What have we learned, the new vaccine era and the threat of SARS-CoV-2 variants. Biomedicines. 9 (6), 611 (2021).
  14. Coronavirus (COVID-19) update: FDA authorizes additional monoclonal antibody for treatment of COVID-19. , Available from: https://www.fda.gov/news-events/press-announcements/coronavirus-covid-19-update-fda-authorizes-additional-monoclonal-antibody-treatment-covid-19 (2021).
  15. Dougan, M., et al. Bamlanivimab plus Etesevimab in Mild or Moderate Covid-19. New England Journal of Medicine. 385 (15), 1382-1392 (2021).
  16. Ledford, H. COVID antibody treatments show promise for preventing severe disease. Nature. 591 (7851), 513-514 (2021).
  17. Tuccori, M., et al. An overview of the preclinical discovery and development of bamlanivimab for the treatment of novel coronavirus infection (COVID-19): reasons for limited clinical use and lessons for the future. Expert Opinion on Drug Discovery. , 1-12 (2021).
  18. Phan, A. T., Gukasyan, J., Arabian, S., Wang, S., Neeki, M. M. Emergent inpatient administration of casirivimab and imdevimab antibody cocktail for the treatment of COVID-19 pneumonia. Cureus. 13 (5), 15280 (2021).
  19. O'Brien, M. P., et al. Subcutaneous REGEN-COV antibody combination in early SARS-CoV-2 infection. medRxiv. , (2021).
  20. Beigel, J. H., et al. Remdesivir for the treatment of Covid-19 - Final report. New England Journal of Medicine. 383 (19), 1813-1826 (2020).
  21. Li, L., et al. Effect of convalescent plasma therapy on time to clinical improvement in patients with severe and life-threatening COVID-19: A randomized clinical trial. Journal of the American Medical Association. 324 (5), 460-470 (2020).
  22. Polack, F. P., et al. Safety and efficacy of the BNT162b2 mRNA Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 383 (27), 2603-2615 (2020).
  23. Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Pfizer-BioNTech COVID-19 vaccine - United States, December 2020. Morbidity and Mortality Weekly Report. 69 (50), 1922-1924 (2020).
  24. Oliver, S. E., et al. The advisory committee on immunization practices' interim recommendation for use of Janssen COVID-19 vaccine - United States, February 2021. Morbidity and Mortality Weekly Report. 70 (9), 329-332 (2021).
  25. Zhao, H., et al. Emission spectra of bioluminescent reporters and interaction with mammalian tissue determine the sensitivity of detection in vivo. Journal of Biomedical Optics. 10 (4), 41210 (2005).
  26. Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. A guide to choosing fluorescent proteins. Nature Methods. 2 (12), 905-909 (2005).
  27. Nogales, A., et al. A novel fluorescent and bioluminescent bireporter Influenza A Virus to evaluate viral infections. Journal of Virology. 93 (10), 00032 (2019).
  28. Nogales, A., et al. Replication-competent fluorescent-expressing influenza B virus. Virus Research. 213, 69-81 (2016).
  29. Welsh, D. K., Noguchi, T. Cellular bioluminescence imaging. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (8), (2012).
  30. Tran, V., Moser, L. A., Poole, D. S., Mehle, A. Highly sensitive real-time in vivo imaging of an influenza reporter virus reveals dynamics of replication and spread. Journal of Virology. 87 (24), 13321-13329 (2013).
  31. Schoggins, J. W., et al. Dengue reporter viruses reveal viral dynamics in interferon receptor-deficient mice and sensitivity to interferon effectors in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (36), 14610-14615 (2012).
  32. Luker, G. D., et al. Noninvasive bioluminescence imaging of herpes simplex virus type 1 infection and therapy in living mice. Journal of Virology. 76 (23), 12149-12161 (2002).
  33. Li, X., et al. Development of a rapid antiviral screening assay based on eGFP reporter virus of Mayaro virus. Antiviral Research. 168, 82-90 (2019).
  34. Kirui, J., Freed, E. O. Generation and validation of a highly sensitive bioluminescent HIV-1 reporter vector that simplifies measurement of virus release. Retrovirology. 17 (1), 12 (2020).
  35. Shang, B., et al. Development and characterization of a stable eGFP enterovirus 71 for antiviral screening. Antiviral Research. 97 (2), 198-205 (2013).
  36. Zou, G., Xu, H. Y., Qing, M., Wang, Q. Y., Shi, P. Y. Development and characterization of a stable luciferase dengue virus for high-throughput screening. Antiviral Research. 91 (1), 11-19 (2011).
  37. Ye, C., et al. Rescue of SARS-CoV-2 from a single bacterial artificial chromosome. mBio. 11 (5), 02168 (2020).
  38. Avila-Perez, G., Park, J. G., Nogales, A., Almazan, F., Martinez-Sobrido, L. Rescue of recombinant Zika virus from a bacterial artificial chromosome cDNA clone. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (148), e59537 (2019).
  39. Chiem, K., et al. A bifluorescent-based assay for the identification of neutralizing antibodies against SARS-CoV-2 variants of concern in vitro and in vivo. Journal of Virology. , (2021).
  40. Committee for the update of the guide for the care and use of laboratory animals., Institute for laboratory animal research (U.S) & National Academies Press (U.S.). Guide for the care and use of laboratory animals. 8th edn. National Research Council (US). , National Academies Press. (2011).
  41. Ye, C., et al. Analysis of SARS-CoV-2 infection dynamic in vivo using reporter-expressing viruses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (41), (2021).

Tags

Immunologi og infektion udgave 177 SARS-CoV-2 coronavirus fluorescens bioluminescens replikationskompetente vira reportervirus NanoLuc luciferase venus fluorescerende protein virusinfektion in vivo-billeddannelse IVIS Ami HT K18 hACE2 transgene mus
Live imaging og kvantificering af virusinfektion i K18 hACE2 transgene mus ved hjælp af reporter-udtrykkende rekombinant SARS-CoV-2
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Morales Vasquez, D., Chiem, K.,… More

Morales Vasquez, D., Chiem, K., Silvas, J., Park, J. G., Ye, C., Martínez-Sobrido, L. Live Imaging and Quantification of Viral Infection in K18 hACE2 Transgenic Mice Using Reporter-Expressing Recombinant SARS-CoV-2. J. Vis. Exp. (177), e63127, doi:10.3791/63127 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter