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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

रिपोर्टर-एक्सप्रेसिंग पुनः संयोजक सार्स-सीओवी-2 का उपयोग करते हुए के 18 एचएसीई 2 ट्रांसजेनिक चूहों में वायरल संक्रमण की लाइव इमेजिंग और मात्रा का ठहराव

Published: November 5, 2021 doi: 10.3791/63127
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Texas Biomedical Research Institute

Summary

यह प्रोटोकॉल विवो में सार्स-सीओवी-2 संक्रमणों का अध्ययन करने के लिए आवश्यक माध्यमिक दृष्टिकोण की आवश्यकता को दूर करने के लिए लूसिफेरेज़- और प्रतिदीप्ति-व्यक्त पुनः संयोजक (आर) सार्स-सीओवी-2 और के 18 एचएसीई 2 ट्रांसजेनिक चूहों में इन विवो इमेजिंग सिस्टम (आईवीआईएस) का उपयोग करके वायरल संक्रमण की गतिशीलता का वर्णन करता है।

Abstract

कोरोना वायरस बीमारी 2019 (कोविड-19) महामारी गंभीर तीव्र श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 (सार्स-सीओवी-2) के कारण हुई है। अब तक, सार्स-सीओवी-2 दुनिया भर में 242 मिलियन से अधिक संक्रमणों और 4.9 मिलियन से अधिक मौतों के लिए जिम्मेदार है। अन्य वायरस की तरह, सार्स-सीओवी-2 के अध्ययन के लिए संक्रमित कोशिकाओं और/या पशु मॉडल में वायरस की उपस्थिति का पता लगाने के लिए प्रयोगात्मक तरीकों के उपयोग की आवश्यकता होती है। इस सीमा को दूर करने के लिए, हमने प्रतिकृति-सक्षम पुनः संयोजक (आर) सार्स-सीओवी-2 उत्पन्न किया जो बायोल्यूमिनेसेंट (नैनोलुसिफेरेस, एनएलयूसी) या फ्लोरोसेंट (वीनस) प्रोटीन को व्यक्त करता है। ये रिपोर्टर-एक्सप्रेसिंग आरएसएआरएस-सीओवी-2 एनएलयूसी और वीनस रिपोर्टर जीन की अभिव्यक्ति के आधार पर इन विट्रो और इन विवो में वायरल संक्रमण को ट्रैक करने की अनुमति देते हैं। यहां अध्ययन में विवो इमेजिंग सिस्टम (आईवीआईएस) में उपयोग किए जाने वाले संक्रमण के पहले वर्णित के 18 मानव एंजियोटेंसिन-परिवर्तित एंजाइम 2 (एचएसीई 2) ट्रांसजेनिक माउस मॉडल में सार्स-सीओवी-2 संक्रमण का पता लगाने और ट्रैक करने के लिए आरएसएआरएस-सीओवी-2/एनएलयूसी और आरएसएआरएस-सीओवी-2/वीनस के उपयोग का वर्णन किया गया है। यह आरएसएआरएस-सीओवी-2/एनएलयूसी और आरएसएआरएस-सीओवी-2/वीनस विवो में आरएसएआरएस-सीओवी-2/डब्ल्यूटी जैसी रोगजनकता और वायरल प्रतिकृति दिखाता है। महत्वपूर्ण बात यह है कि एनएलयूसी और वीनस अभिव्यक्ति हमें संक्रमित चूहों में विवो और पूर्व विवो में वायरल संक्रमण को सीधे ट्रैक करने की अनुमति देती है। ये आरएसएआरएस-सीओवी-2/एनएलयूसी और आरएसएआरएस-सीओवी-2/वीनस विवो में सार्स-सीओवी-2 के जीव विज्ञान का अध्ययन करने, वायरल संक्रमण और संबंधित कोविड-19 बीमारी को समझने और सार्स-सीओवी-2 संक्रमण से निपटने के लिए प्रभावी रोगनिरोधी और/या चिकित्सीय उपचारों की पहचान करने के लिए एक उत्कृष्ट विकल्प का प्रतिनिधित्व करते हैं।

Introduction

सीवियर एक्यूट रेस्पिरेटरी सिंड्रोम कोरोनावायरस 2 (सार्स-सीओवी-2) एक लिफाफा, सकारात्मक-भावना, एकल-फंसे आरएनए वायरस है जो कोरोनाविरिडे परिवार में बीटाकोरोनावायरस वंश से संबंधितहै। इस वायरल परिवार को अल्फा-, बीटा-, गामा-, और डेल्टा-कोरोनावायरस1 में विभाजित किया गया है। अल्फा- और बीटाकोरोनावायरस मुख्य रूप से स्तनधारियों को संक्रमित करते हैं, जबकि गामा- और डेल्टाकोरोनावायरस लगभग विशेष रूप से पक्षियों को संक्रमित करतेहैं 2. अब तक, सात कोरोनावायरस (सीओवी) प्रजातियों की बाधाओं को पार कर चुके हैं और मानव कोरोनावायरस (एचसीओवी) के रूप में उभरे हैं: दो अल्फा-सीओवी (एचसीओवी -229 ई और एचसीओवी-एनएल 63) और पांच बीटा-सीओवी (एचसीओवी-ओसी 43, एचसीओवी-एचकेयू 1, सार्स-सीओवी, मध्य पूर्व श्वसन सिंड्रोम कोरोनावायरस [एमईआरएस-सीओवी], और सार्स-सीओवी -2)3,4,5,6। सार्स-सीओवी, एमईआरएस-सीओवी और सार्स-सीओवी-2 अत्यधिक रोगजनक हैं, जिससे श्वसन पथ के गंभीर निचले हिस्से में संक्रमणहोता है। सार्स-सीओवी-2 के उद्भव से पहले, सीओवी के कारण दो महामारी के प्रकोप थे: 2002-2003 तक चीन के गुआंग्डोंग प्रोविडेंस में सार्स-सीओवी, लगभग 9.7% की मृत्यु दर (सीएफआर) के साथ; और 2012 से वर्तमान तक मध्य पूर्व में एमईआरएस-सीओवी, लगभग 34% 7,8 के सीएफआर के साथ। सार्स-सीओवी-2 का समग्र सीएफआर 3.4% -49% के बीच है, जिसमें अंतर्निहित स्थितियों ने उच्च सीएफआर 8,9 में योगदान दिया है। दिसंबर 2019 में चीन के वुहान में अपनी खोज के बाद से, सार्स-सीओवी-2 दुनिया भर में 242 मिलियन से अधिक मानव संक्रमणों और 4.9 मिलियन से अधिक मानवमौतों के लिए जिम्मेदार रहा है, 7,10,11,12. उल्लेखनीय है कि 2020 के अंत से, नए सार्स-सीओवी-2 वेरिएंट ऑफ कंसर्न (वीओसी) और वेरिएंट ऑफ इंटरेस्ट (वीओआई) ने वायरस की विशेषताओं को प्रभावित किया है, जिसमें संचरण और एंटीजेनेसिटी 9,13 और कोविड-19 महामारी की समग्र दिशा शामिल है। सार्स-सीओवी-2 संक्रमण के उपचार के लिए, वर्तमान में केवल एक संयुक्त राज्य अमेरिका (यू.एस.) है फूड एंड ड्रग एडमिनिस्ट्रेशन (एफडीए) चिकित्सीय एंटीवायरल (रेमडेसिविर) और एक आपातकालीन उपयोग प्राधिकरण (ईयूए) दवा (बैरिसिटिनिब, रेमडेसिविर के साथ संयोजन में प्रशासित किया जाना है) 14. 6 अनुमोदित ईयूए मोनोक्लोनल एंटीबॉडी भी हैं: आरईजीईएन-सीओवी (कैसिरिविमैब और इमडेविमैब, एक साथ प्रशासित), सोट्रोविमैब, टोसिलिज़ुमाब, और बामलानिविमैब और एटेसेविमैब को एक साथ प्रशासित किया जाता है 15,16,17,18,19। वर्तमान में केवल एक एफडीए-अनुमोदित रोगनिरोधी टीका, फाइजर-बायोएनटेक है, और दो अन्य रोगनिरोधी टीके (मॉडर्ना और जानसेन) को ईयूए अनुमोदित20,21,22,23,24 किया गया है। हालांकि, अनियंत्रित संक्रमण दर और वीओसी और वीओआई के उद्भव के साथ, सार्स-सीओवी-2 अभी भी मानव स्वास्थ्य के लिए खतरा है। इसलिए, सार्स-सीओवी-2 संक्रमण और अभी भी जारी कोविड-19 महामारी को नियंत्रित करने के लिए कुशल रोगनिरोधी और चिकित्सीय की पहचान करने के लिए नए दृष्टिकोणों की तत्काल आवश्यकता है।

सार्स-सीओवी-2 के अध्ययन के लिए संक्रमित कोशिकाओं और/या संक्रमण के मान्य पशु मॉडल में वायरस की उपस्थिति की पहचान करने के लिए श्रमसाध्य तकनीकों और द्वितीयक दृष्टिकोण की आवश्यकता होती है। रिवर्स जेनेटिक्स के उपयोग ने पुनः संयोजक वायरस की पीढ़ी को वायरल संक्रमण के जीव विज्ञान में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने की अनुमति दी है। उदाहरण के लिए, रिवर्स जेनेटिक्स तकनीकों ने वायरल संक्रमण, रोगजनन और बीमारी के तंत्र को उजागर करने और समझने के साधन प्रदान किए हैं। इसी तरह, रिवर्स जेनेटिक्स दृष्टिकोण ने वायरल रोगजनन में उनके योगदान को समझने के लिए वायरल प्रोटीन की कमी वाले पुनः संयोजक वायरस को इंजीनियर करने का मार्ग प्रशस्त किया है। इसके अलावा, रिवर्स जेनेटिक्स तकनीकों का उपयोग इन विट्रो और इन विवो अनुप्रयोगों के लिए रिपोर्टर जीन व्यक्त करने वाले पुनः संयोजक वायरस उत्पन्न करने के लिए किया गया है, जिसमें वायरल संक्रमण के उपचार के लिए रोगनिरोधी और / फ्लोरोसेंट और बायोल्यूमिनेसेंट प्रोटीन नई प्रौद्योगिकियों25,26 के सुधार के आधार पर उनकी संवेदनशीलता, स्थिरता और आसान पहचान के कारण सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले रिपोर्टर जीन हैं। इन विट्रो में, फ्लोरोसेंट प्रोटीन को संक्रमित कोशिकाओं में वायरस के स्थानीयकरण के लिए एक बेहतर विकल्प के रूप में काम करने के लिए दिखाया गया है, जबकि ल्यूसिफेरेज़ परिमाणीकरण अध्ययन 27,28,29 के लिए अधिक सुविधाजनक हैं। विवो में, पूरे पशु इमेजिंग के लिए फ्लोरोसेंट प्रोटीन पर ल्यूसिफेरेज़ को प्राथमिकता दी जाती है, जबकि फ्लोरोसेंट प्रोटीन को संक्रमित कोशिकाओं या पूर्व विवो इमेजिंग30,31,32 की पहचान के लिए पसंद किया जाता है। रिपोर्टर-व्यक्त पुनः संयोजक वायरस के उपयोग ने कई परिवारों में वायरस के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में कार्य किया है, जिसमें दूसरों के बीच, फ्लेविवायरस, एंटरोवायरस, अल्फावायरस, लेंटिवायरस, एरिनावायरस और इन्फ्लूएंजा वायरस 28,33,34,35,36 शामिल हैं।

सार्स-सीओवी-2 का अध्ययन करने के लिए माध्यमिक दृष्टिकोण की आवश्यकता को दूर करने और विवो में वास्तविक समय सार्स-सीओवी-2 संक्रमण को चिह्नित करने के लिए, हमने प्रतिकृति-सक्षम पुनः संयोजक (आर) सार्स-सीओवी-2 उत्पन्न किया है जो हमारे पहले वर्णित जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्रों (बीएसी) आधारित रिवर्स जेनेटिक्स का उपयोग करके बायोल्यूमिनेसेंट (नैनोल्यूमिसिफेरेज़, एनएलयूसी) या फ्लोरोसेंट (वीनस) प्रोटीन व्यक्त करता है। बैक्टीरिया37,38 में इसके प्रसार के दौरान वायरस अनुक्रमों की विषाक्तता को कम करने के लिए। उल्लेखनीय है कि आरएसएआरएस-सीओवी-2/एनएलयूसी और आरएसएआरएस-सीओवी-2/वीनस ने विवो में आरएसएआरएस-सीओवी-2/डब्ल्यूटी जैसी रोगजनकता दिखाई। आरएसएआरएस-सीओवी-2/शुक्र से शुक्र की अभिव्यक्ति के उच्च स्तर ने इन विवो इमेजिंग सिस्टम (आईवीआईएस)39 का उपयोग करके संक्रमित के 18 एचएसीई 2 ट्रांसजेनिक चूहों के फेफड़ों में वायरल संक्रमण का पता लगाने की अनुमति दी। शुक्र अभिव्यक्ति का स्तर फेफड़ों में पाए गए वायरल टाइटर्स के साथ अच्छी तरह से सहसंबद्ध है, जो सार्स-सीओवी-2 संक्रमण के वैध सरोगेट के रूप में शुक्र अभिव्यक्ति का उपयोग करने की व्यवहार्यता का प्रदर्शन करता है। आरएसएआरएस-सीओवी-2/एनएलयूसी का उपयोग करते हुए, हम वास्तविक समय में वायरल संक्रमण की गतिशीलता को ट्रैक करने में सक्षम थे और के 18 एचएसीई 2 ट्रांसजेनिक चूहों में एक ही आईवीआईएस दृष्टिकोण का उपयोग करके विवो में सार्स-सीओवी-2 संक्रमण का अनुदैर्ध्य रूप से आकलन करने में सक्षम थे।

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Protocol

के 18 एचएसीई 2 ट्रांसजेनिक चूहों से जुड़े प्रोटोकॉल टेक्सास बायोमेडिकल रिसर्च इंस्टीट्यूट (टीबीआरआई) संस्थागत जैव सुरक्षा समिति (आईबीसी) और संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किए गए थे। सभी प्रयोग राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद40 के प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड में सिफारिशों का पालन करते हैं। चूहों के साथ काम करते समय उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) की आवश्यकता होती है।

1. के 18 एचएसीई 2 ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग

  1. विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त स्थितियों के तहत जैव सुरक्षा स्तर (बीएसएल) -2 पशु देखभाल सुविधा में 4-6 सप्ताह की मादा B6.Cg-टीजी (के 18-एसीई 2) 2 पीआरएलएमएन / जे चूहों (के 18 एचएसीई 2 ट्रांसजेनिक चूहों) की खरीद और रखरखाव करें।
    1. बीएसएल 2 सुविधाओं में आने के बाद, जानवरों को 7 दिनों के लिए अनुकूलित करने की अनुमति दें और उन्हें संक्रमण और अन्य प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के लिए बीएसएल -3 पशु सुविधा में स्थानांतरित करें।
    2. आईएसीयूसी प्रोटोकॉल के बाद, पिंजरे प्रति 4 चूहों को रखें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि जानवर मर चुका है, चूहों के आरएसएआरएस-सीओवी-2 के साथ संक्रमण के बाद और विवो इमेजिंग में , जानवरों को घातक-प्लस (>100 मिलीग्राम /

2. जैव सुरक्षा

नोट: इस पांडुलिपि में, सार्स-सीओवी-2 यूएसए-डब्ल्यूए 1/2020 स्ट्रेन के लिए बीएसी-आधारित रिवर्स जेनेटिक सिस्टम का उपयोग करके आरएसएआरएस-सीओवी-2 उत्पन्न किया गया है, जैसा कि पहलेवर्णित है। आरएसएआरएस-सीओवी-2/एनएलयूसी या आरएसएआरएस-सीओवी-2/वीनस संक्रमण से जुड़ी सभी विवो प्रक्रियाओं को बीएसएल-3 स्थितियों के तहत जैविक सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना चाहिए।

  1. इस लेख में वर्णित सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को करने से पहले और बाद में क्रमिक रूप से 2% वेक्सिसाइड और 70% इथेनॉल कीटाणुनाशक के साथ जैव सुरक्षा कैबिनेट को साफ करें।
  2. प्रत्येक उपयोग से पहले और बाद में सभी विच्छेदन सामग्री (कैंची, विदारक संदंश, आदि) और होमोजेनाइज़र को निष्फल करें।
  3. अलगाव कक्ष को साफ करें और निर्माता के निर्देश के अनुसार प्रत्येक उपयोग से पहले और बाद में एमबी 10 गोलियों का उपयोग करके कीटाणुरहित करें।
  4. आईबीसी और आईएसीयूसी दिशानिर्देशों का पालन करने वाली प्रक्रियाओं के दौरान उत्पादित सभी जैविक सामग्री को त्याग दें।

3. आरएसएआरएस-सीओवी-2 के विवो लक्षण वर्णन में

  1. माउस संक्रमण
    1. लेबल वाले पिंजरों में मादा 4-6 सप्ताह पुराने के 18 एचएसीई 2 ट्रांसजेनिक चूहों को रखें, कान पंच कोड का उपयोग करके प्रत्येक पिंजरे में चूहों की पहचान करें और पिंजरे प्रति 4 चूहों को रखें। वायरल अनुमापन और इमेजिंग के लिए शरीर के वजन और अस्तित्व और जानवरों के एक अन्य समूह के लिए चूहों के एक समूह का उपयोग करें।
    2. संक्रमण से पहले, बायोल्यूमिनेसेंस सिग्नल की सुविधा के लिए वंक्षण निप्पल क्षेत्र में पेक्टोरल निप्पल से उदर पक्ष पर चूहों की छाती दाढ़ी।
    3. बाँझ 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) का उपयोग कर50 μL की कुल मात्रा में बाँझ परिस्थितियों मेंबाँझ परिस्थितियों में 10 5 पट्टिका बनाने वाली इकाइयों (पीएफयू)/माउस के साथ आरएसएआरएस-सीओवी-2 इनोकुलम तैयार करें।
      नोट: सूत्र के साथ वायरल कमजोर पड़ने में उपयोग किए जाने वाले आरएसएआरएस-सीओवी-2 की मात्रा की गणना करें: वायरस की आवश्यकता = (105 पीएफयू प्रति माउस / 50 μL) एक्स अंतिम मात्रा) / स्टॉक वायरल टिटर।
    4. वायरस इनोकुलम को बर्फ पर ठंडा रखें।
    5. मॉक-संक्रमित (1x पीबीएस) और आरएसएआरएस-सीओवी-2/डब्ल्यूटी-संक्रमित चूहों को आंतरिक नियंत्रण के रूप में उपयोग करें। आरएसएआरएस-सीओवी-2-संक्रमित चूहों की तुलना में नकली संक्रमित चूहों को एक अलग पिंजरे में रखें।
    6. एक संज्ञाहरण कक्ष में 5% आइसोफ्लूरेन गैसीय बेहोश करने की क्रिया का उपयोग करके चूहों को संवेदनाहारी करें और 3% आइसोफ्लूरेन के साथ बनाए रखें।
    7. एक बार पोस्टुरल प्रतिक्रिया और राइटिंग रिफ्लेक्स की पुष्टि हो जाने के बाद, माउस को पृष्ठीय रिकंबेंसी स्थिति में रखें।
    8. तर्जनी और अंगूठे के बीच माउस की गर्दन को स्क्रफ करें और जानवर को पृष्ठीय स्थिति में पकड़ने के लिए पिंकी उंगली के साथ हाथ की हथेली के खिलाफ पूंछ को पकड़ें।
    9. नाक में वायरस इनोकुलम के 50 μL युक्त विंदुक टिप रखें और धीरे-धीरे समाधान को बाहर निकालें। सुनिश्चित करें कि वायरस इनोकुलम साँस ले रहा है और इनोकुलम ड्रॉप गायब होने का अवलोकन करके कोई भाटा नहीं है।
  2. बायोल्यूमिनेसेंस मॉनिटरिंग के 18 एचएसीई 2 ट्रांसजेनिक चूहों को आरएसएआरएस-सीओवी-2/एनएलयूसी से संक्रमित (चित्रा 1 और चित्रा 2)
    नोट: यह प्रयोग योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व का अनुसरण करता है और चित्रा 1 में प्रदर्शित वायरस का उपयोग करता है। इन विवो इमेजिंग सिस्टम (आईवीआईएस) के लिए एक आइसोफ्लूरेन संज्ञाहरण लगाव की आवश्यकता होती है। विवरण उपकरणों और आवश्यक प्रणालियों के लिए सामग्री की तालिका देखें।
    1. इमेजिंग सॉफ़्टवेयर शुरू करें और पैरामीटर सेट करें, बायोल्यूमिनेसेंस के लिए छवि मोड पर क्लिक करें, फ़िल्टर खोलें, और एक्सपोज़र समय को ऑटो पर सेट करें।
    2. आईवीआईएस मशीन को शुरू करने पर, चूहों को अलगाव कक्ष में रखें, जबकि अभी भी जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर। 5% एकाग्रता पर आइसोफ्लूरेन के साथ चूहों को प्रेरित करें। एक बार पोस्टुरल प्रतिक्रिया और राइटिंग रिफ्लेक्स के नुकसान की पुष्टि हो जाने के बाद, 3% आइसोफ्लूरेन के साथ बनाए रखें।
    3. एक बार चूहों को संवेदनाहारी करने के बाद, उन्हें अलगाव कक्ष से हटा दें और रेट्रो-ऑर्बिटली 25 जी सुई के साथ 1 एक्स पीबीएस (अंतिम मात्रा 100 μL / माउस) में 1:10 पतला लूसिफेरेज़ सब्सट्रेट का प्रशासन करें।
    4. ल्यूसिफेरेज़ सब्सट्रेट प्रशासन के बाद, चूहों को उनकी छाती का सामना करना पड़ रहा है और इमेजिंग प्रक्रिया के दौरान जानवर को संवेदनाहारी रखने के लिए कई गुना शंकु के अंदर नाक गुहा के साथ अलगाव कक्ष में वापस रखें।
    5. आईवीआईएस मशीन के लिए अलगाव कक्ष स्थानांतरण, और तुरंत आईवीआईएस इमेजर दरवाजा बंद करने के बाद, प्रारंभ करने के लिए सॉफ्टवेयर प्रोग्राम में अधिग्रहण का चयन करें (चित्रा 2 ए)।
    6. अधिग्रहित बायोल्यूमिनेसेंस छवियों का विश्लेषण करने के लिए, सटीक संकेत को नामित करने और प्रवाह (चित्रा 2 बी) को मापने के लिए सॉफ्टवेयर में आरओआई (ब्याज का क्षेत्र) उपकरण का उपयोग करें।
    7. माप पर क्लिक करें और सिस्टम को विभिन्न मापदंडों द्वारा प्रदान किए गए आउटपुट माप की तुलना में पूर्ण फोटॉन उत्सर्जन प्रदान करने के लिए फोटॉनों में बायोल्यूमिनेसेंस का आकलन शुरू करने की अनुमति दें।
    8. 1-, 2-, 4- और 6-दिनों के बाद संक्रमण पर छवि चूहों।
    9. इमेजिंग के बाद चूहों पिंजरे में वापस जगह.
  3. शुक्र से संक्रमित के 18 एचएसीई 2 ट्रांसजेनिक चूहों में प्रतिदीप्ति विश्लेषण (चित्रा 3 और चित्रा 4)
    नोट: यह प्रयोग योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व और चित्रा 3 में दिखाए गए आरएसएआरएस-सीओवी-2 का अनुसरण करता है। विवरण उपकरणों और आवश्यक प्रणालियों के लिए सामग्री की तालिका देखें।
    1. इमेजिंग सॉफ्टवेयर शुरू करें और पैरामीटर सेट करें, उत्तेजना (500 एनएम) और उत्सर्जन फिल्टर (530 एनएम) सेट करें, प्रतिदीप्ति के लिए छवि मोड पर क्लिक करें और ऑटो के लिए एक्सपोजर समय सेट करें।
    2. इंट्रापेरिटोनियल रूप से घातक-प्लस (>100 मिलीग्राम / किग्रा) की घातक खुराक का उपयोग करके चूहों को इच्छामृत्यु दें। इच्छामृत्यु के बाद, 70% इथेनॉल के साथ चीरा साइट कीटाणुरहित करें।
    3. चिमटी का उपयोग करके, त्वचा को खींचें, उरोस्थि से पेट तक चीरा लगाएं और कैंची के साथ किनारों से चीरा काटें। फेफड़ों में रक्त की मात्रा को कम करने और इमेजिंग के दौरान उच्च पृष्ठभूमि संकेतों से बचने के लिए यकृत शिरा को काटें।
    4. कैंची का उपयोग करके, उरोस्थि को काटें और रिबकेज खोलें। अगला, कैंची के साथ श्वासनली के अंत को स्निप करें और चिमटी के साथ फेफड़ों को हटा दें।
    5. एक्साइज्ड फेफड़ों को 1 एक्स पीबीएस के 2 एमएल युक्त 6-अच्छी तरह से प्लेट में रखें और अतिरिक्त रक्त को हटाने के लिए कुल्ला करें। 70% इथेनॉल का उपयोग कर नमूनों के बीच कीटाणुशोधन और सफाई सर्जरी उपकरण द्वारा नमूनों के बीच संदूषण की संभावना को कम करें।
    6. आईवीआईएस मशीन को शुरू करने के बाद, फेफड़ों को एक काली ट्रे में रखें और ऊतकों को एक दूसरे से अलग करें।
    7. जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर अलगाव कक्ष के अंदर ट्रे रखें, और फिर अलगाव कक्ष को आईवीआईएस में स्थानांतरित करें। दरवाजा बंद करें और इमेजिंग सिस्टम (चित्रा 4 ए) शुरू करने के लिए अधिग्रहण पर क्लिक करें।
    8. प्रतिदीप्ति का विश्लेषण करने के लिए, आरओआई उपकरण का उपयोग करें और प्रत्येक व्यक्तिगत फेफड़ों के चारों ओर आरओआई खींचें। प्रत्येक आरओआई को मैन्युअल रूप से मापें और फिर दिए गए औसत उज्ज्वल दक्षता मूल्यों का उपयोग करें और नकली संक्रमित चूहों (चित्रा 4 बी) से घटाएं।
    9. एक बार इमेजिंग पूरा हो जाने के बाद, ऊतकों को उसी दिन के विश्लेषण के लिए बर्फ पर रखें या बाद में प्रसंस्करण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए सूखी बर्फ ठंड के लिए क्रायोट्यूब में रखें।
  4. आरएसएआरएस-सीओवी-2/एनएलयूसी (चित्रा 2ए-सी) और आरएसएआरएस-सीओवी-2/वीनस (चित्रा 4ए-सी) से संक्रमित के18 एचएसीई2 ट्रांसजेनिक चूहों के फेफड़ों के उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग और पैथोलॉजी स्कोरिंग
    1. आरएसएआरएस-सीओवी-2/एनएलयूसी, आरएसएआरएस-सीओवी-2/डब्ल्यूटी से संक्रमित और नकली संक्रमित चूहों की बायोल्यूमिनेसेंस की इमेजिंग के बाद चूहों को उनके पिंजरों में लौटा दें। इच्छामृत्यु और चूहों के फेफड़ों के पूर्व विवो उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग (चित्रा 2 ए) के साथ आगे बढ़ें।
    2. संक्रमित चूहों के फेफड़ों के पूर्व विवो प्रतिदीप्ति इमेजिंग के बाद, फेफड़ों (चित्रा 4 ए) की उज्ज्वल क्षेत्र छवियों ले लो।
    3. इमेजजे (आंकड़े 2 सी और 4 सी) का उपयोग करके फेफड़ों की सतह पर सकल घावों का विश्लेषण करें।
    4. इमेजजे में विश्लेषण करने के लिए फेफड़ों की छवि खोलें।
    5. पिक्सेल से सेमी के अनुपात की गणना करें, सीधे उपकरण का उपयोग करें और छवि की वास्तविक लंबाई को मापें।
    6. चयन करने के बाद, लंबाई के लिए पिक्सेल की लंबाई की गणना करने के लिए विश्लेषण > माप पर क्लिक करें।
    7. विश्लेषण > सेट स्केल पर क्लिक करें और पिछले चरण से गणना की गई संख्याओं को इनपुट करें।
    8. फ्रीहैंड चयन उपकरण का उपयोग करें और पूरे फेफड़ों की सतह का चयन करें। कुल फेफड़ों के क्षेत्र को मापने के लिए विश्लेषण > उपाय पर क्लिक करें।
    9. फेफड़ों के बाकी क्षेत्र का चयन करने के लिए > चयन संपादित करें > उलटा करें पर क्लिक करें, फिर पृष्ठभूमि को हटाने के लिए हटाएं या बैकस्पेस दबाएं।
    10. चयनित क्षेत्र निकालें, फिर छवि पर क्लिक करें > रंग थ्रेशोल्ड > समायोजित करें।
    11. पैथोलॉजिकल घाव क्षेत्र का चयन करने के लिए, चमक को न्यूनतम (1 से 50 के बीच) और अधिकतम (50 से 200 के बीच) समायोजित करें, जो भीड़ और रक्तस्राव के स्तर पर निर्भर करता है।
    12. एक बार पैथोलॉजिकल घावों का चयन हो जाने के बाद, थ्रेशोल्ड रंग पैनल के निचले भाग में चयन करें पर क्लिक करें, फिर पैथोलॉजिकल क्षेत्रों को मापने के लिए विश्लेषण > माप पर क्लिक करें।
    13. सूत्र के साथ सकल घावों के प्रतिशत की गणना करें: पैथोलॉजिकल क्षेत्र का % = (पैथोलॉजिकल क्षेत्र / कुल फेफड़ों की सतह का माप) x 100।
  5. वायरल अनुमापन (चित्रा 2 डी और चित्रा 4 डी)
    1. इमेजिंग पर, चूहों की इच्छामृत्यु को पूरा करें और फेफड़े, मस्तिष्क और नाक के श्लेष्म को इकट्ठा करें।
    2. फेफड़े, मस्तिष्क और नाक के श्लेष्म को अलग-अलग बाँझ ऊतक होमोजेनाइज़र में रखें और 1 मिलीलीटर ठंडा 1 एक्स पीबीएस जोड़ें।
    3. गोली सेल मलबे के लिए 10 मिनट के लिए 21,500 एक्स जी पर सेंट्रीफ्यूजिंग द्वारा नमूनों को समरूप करें। इकट्ठा और एक नई बाँझ ट्यूब में सतह पर तैरनेवालों हस्तांतरण और गोली त्यागें।
    4. यदि वायरल अनुमापन उसी दिन किया जाता है, तो सतह पर तैरनेवालों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। वैकल्पिक रूप से, बाद में मूल्यांकन किए जाने तक -80 डिग्री सेल्सियस पर होमोजेनाइज्ड नमूनों के सतह पर तैरनेवाला फ्रीज करें।
    5. ऊतक होमोजेनेट्स से प्राप्त सतह पर तैरनेवालों का उपयोग 10 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने बनाते हैं और सतह पर तैरनेवाला के प्रत्येक कमजोर पड़ने के 1 एमएल के साथ वेरो ई 6 कोशिकाओं के संगम मोनोलेयर को संक्रमित करते हैं (6-अच्छी तरह से प्लेट प्रारूप, 1.2 × 106 कोशिकाएं /
    6. एक आर्द्र 5% सीओ2 इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए वायरस सोखना चलो।
    7. वायरल सोखना के बाद, 1x पीबीएस के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो लें और 72 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्र 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में 1% अगर युक्त पोस्ट-संक्रमण मीडिया के2 एमएल में सेते हैं।
    8. इनक्यूबेशन के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए 10% तटस्थ बफर फॉर्मलिन में प्लेटों को निष्क्रिय करें, सुनिश्चित करें कि पूरी प्लेट जलमग्न है।
    9. बीएसएल 3 से प्लेटें लें और 1 एक्स पीबीएस के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को तीन बार धोएं और कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 मिनट के लिए 0.5% ट्राइटन एक्स -100 के 1 एमएल के साथ पारगम्य करें।
    10. 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 1 एक्स पीबीएस में 2.5% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को ब्लॉक करें, इसके बाद सार्स-सीओवी न्यूक्लियोकैप्सिड (एन) प्रोटीन क्रॉस-रिएक्टिव मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (1 सी 7 सी 7) के 1 एमएल में इनक्यूबेशन, 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए 2.5% बीएसए में पतला।
    11. 1x पीबीएस के 1 एमएल के साथ कोशिकाओं को तीन बार धोएं और निर्माताओं के निर्देशों के अनुसार एबीसी किट और डीएबी पेरोक्सीडेज सब्सट्रेट किट का उपयोग करके सजीले टुकड़े विकसित करें।
    12. पीएफयू /एमएल के रूप में वायरल टाइटर्स की गणना करें।
      नोट: सूत्र पीएफयू/एमएल = कमजोर पड़ने कारक एक्स सजीले टुकड़े की संख्या एक्स (1 एमएल /
  6. आरएसएआरएस-सीओवी-2/एनएलयूसी से संक्रमित के18 एचएसीई2 ट्रांसजेनिक चूहों के ऊतकों में एनएलयूसी गतिविधि (चित्रा 2ई)
    1. निर्माताओं के निर्देशों का पालन करते हुए लूसिफेरेज़ परख का उपयोग करके मॉक, आरएसएआरएस-सीओवी-2/डब्ल्यूटी, और आरएसएआरएस-सीओवी-2/एनएलयूसी संक्रमित के18 एचएसीई2 ट्रांसजेनिक चूहों से अंग होमोजेनेट्स में एनएलयूसी की उपस्थिति की मात्रा निर्धारित करें।
  7. रुग्णता और मृत्यु दर का मूल्यांकन (चित्रा 2 एफ, जी और चित्रा 4 ई, एफ)
    1. धारा 3.1 में वर्णित 4-6 सप्ताह की मादा के18 एचएसीई2 ट्रांसजेनिक चूहों को आरएसएआरएस-सीओवी-2/डब्ल्यूटी, आरएसएआरएस-सीओवी-2/वीनस, आरएसएआरएस-सीओवी-2/एनएलयूसी के 105 पीएफयू के साथ संक्रमित करती है।
    2. भोजन के अंतर्ग्रहण के कारण वजन भिन्नता को कम करने के लिए एक ही समय में 12 दिनों में चूहों की निगरानी और वजन करें। चूहों को इच्छामृत्यु दें जो अपने प्रारंभिक शरीर के वजन का 25% खो देते हैं क्योंकि वे एक मानवीय समापन बिंदु तक पहुंच गए हैं और इन चूहों को वायरल संक्रमण के शिकार होने के रूप में नोट करते हैं।
    3. 12 दिनों के बाद, वायरल संक्रमण से बचने वाले चूहों को इच्छामृत्यु दें और शरीर के वजन में परिवर्तन और अस्तित्व के% की गणना करें।

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Representative Results

के 18 एचएसीई 2 ट्रांसजेनिक चूहों में आरएसएआरएस-सीओवी-2/ एनएलयूसी संक्रमण (चित्र 1 और 2)
चित्रा 1ए विवो में संक्रमण का आकलन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले आरएसएआरएस-सीओवी-2/डब्ल्यूटी (शीर्ष) और आरएसएआरएस-सीओवी-2/एनएलयूसी (नीचे) का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दिखाता है। चित्रा 1 बी के 18 एचएसीई 2 ट्रांसजेनिक चूहों में आरएसएआरएस-सीओवी-2 / एनएलयूसी संक्रमण गतिशीलता का आकलन करने के लिए लागू योजनाबद्ध प्रवाह चार्ट दिखाता है। चार से छह सप्ताह की मादा के18 एचएसीई2 ट्रांसजेनिक चूहे (एन = 4) या तो 1एक्स पीबीएस से नकली संक्रमित थीं या आरएसएआरएस-सीओवी-2/डब्ल्यूटी या आरएसएआरएस-सीओवी-2/एनएलयूसी के 105 पीएफयू से संक्रमित थीं। 1-, 2-, 4- और 6-दिनों के बाद संक्रमण, चूहों को अलगाव कक्ष का उपयोग करके बेहोश किया गया था और फिर एनलुक सब्सट्रेट रेट्रो-ऑर्बिटली के साथ इंजेक्शन दिया गया था। आइसोलेशन चैंबर को तुरंत आईवीआईएस में रखा गया था और इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करके विवो में एनएलयूसी सिग्नल का मूल्यांकन किया गया था। एनएलयूसी से संक्रमित चूहों में आसानी से एनएलयूसी अभिव्यक्ति का पता लगाया गया था, लेकिन आरएसएआरएस-सीओवी-2/डब्ल्यूटी, या नकली संक्रमित (चित्रा 2ए) से संक्रमित चूहों में नहीं। मात्रात्मक विश्लेषण संक्रमण के बाद विभिन्न दिनों में एनएलयूसी तीव्रता से पता चला (चित्रा 2 बी)। आरएसएआरएस-सीओवी-2/एनएलयूसी से संक्रमित चूहों के फेफड़ों की सतह पर सकल घाव आरएसएआरएस-सीओवी-2/डब्ल्यूटी संक्रमित समूह (आंकड़े 2सी) के बराबर थे। अंत में, चूहों के अंगों (फेफड़े, नाक टरबाइनेट और मस्तिष्क) को समरूप किया गया था, और वायरल टाइटर्स को पट्टिका परख (पीएफयू / एमएल) द्वारा निर्धारित किया गया था और निर्माता के निर्देशों के बाद लूसिफेरेज़ परख का उपयोग करके एनलुक गतिविधि निर्धारित की गई थी। क्रॉस-रिएक्टिव सार्स-सीओवी एन मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 1सी7सी7 का उपयोग करके इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा सजीले टुकड़े का आकलन किया गया था। आरएसएआरएस-सीओवी-2/एनएलयूसी संक्रमित चूहों में पाए गए वायरल टाइटर्स संक्रमण के बाद अलग-अलग दिनों में सभी अंगों में आरएसएआरएस-सीओवी-2/डब्ल्यूटी से संक्रमित लोगों के बराबर थे (चित्रा 2डी)। एनएलयूसी गतिविधि केवल आरएसएआरएस-सीओवी-2/एनएलयूसी-संक्रमित चूहों (चित्रा 2ई) के अंगों में पाई गई थी। नकली संक्रमित और वायरस संक्रमित चूहों के एक अलग समूह शरीर के वजन (चित्रा 2 एफ) और अस्तित्व (चित्रा 2 जी) में परिवर्तन के लिए 12 दिनों के लिए निगरानी की गई थी। आरएसएआरएस-सीओवी-2/एनएलयूसी और आरएसएआरएस-सीओवी-2/डब्ल्यूटी से संक्रमित चूहों ने अपने शरीर के वजन का 25% तक खो दिया और संक्रमण के बाद 7-8 दिनों के बीच वायरल संक्रमण के कारण सभी की मृत्यु हो गई (चित्र 2एफ-जी)।

के18 एचएसीई2 ट्रांसजेनिक चूहों में आरएसएआरएस-सीओवी-2/शुक्र संक्रमण (चित्र 3 और 4)
चित्रा 3ए आरएसएआरएस-सीओवी-2/डब्ल्यूटी (शीर्ष) और आरएसएआरएस-सीओवी-2/एनएलयूसी (नीचे) का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व दिखाता है जिसका उपयोग पूर्व विवो में संक्रमण का आकलन करने के लिए किया जाता है। चित्रा 3 बी के 18 एचएसीई 2 ट्रांसजेनिक चूहों में आरएसएआरएस-सीओवी-2 / शुक्र गतिशीलता का आकलन करने के लिए लागू योजनाबद्ध प्रवाह चार्ट दिखाता है। चार से छह सप्ताह की मादा के18 एचएसीई2 ट्रांसजेनिक चूहों (एन = 4/समूह) या तो 1एक्स पीबीएस से संक्रमित थीं या आरएसएआरएस-सीओवी-2/डब्ल्यूटी या आरएसएआरएस-सीओवी-2/वीनस के 105 पीएफयू से संक्रमित थीं। 1-, 2-, 4- और 6-दिनों के बाद संक्रमण, चूहों को इच्छामृत्यु दी गई थी, और उनके फेफड़ों को आईवीआईएस का उपयोग करके पूर्व विवो को एक्साइज और इमेज किया गया था। शुक्र से संक्रमित चूहों से सभी फेफड़ों में शुक्र अभिव्यक्ति आसानी से पता चला था, लेकिन आरएसएआरएस-सीओवी-2/डब्ल्यूटी, या नकली संक्रमित (चित्रा 4 ए) से संक्रमित चूहों से नहीं। मात्रात्मक विश्लेषण से पता चला है कि शुक्र तीव्रता संक्रमण के बाद 2 दिनों में चोटियों और संक्रमित चूहों (चित्रा 4 बी) के फेफड़ों में संक्रमण के दौरान कम हो जाती है। फेफड़ों की सतह की छवियों से पता चला कि आरएसएआरएस-सीओवी-2/शुक्र से संक्रमित चूहों के सकल घाव आरएसएआरएस-सीओवी-2/डब्ल्यूटी संक्रमित चूहों (चित्रा 4सी) के बराबर थे। अंत में, चूहों के अंगों (फेफड़े, नाक टरबाइनेट और मस्तिष्क) को समरूप किया गया था, और वायरल टाइटर्स को पट्टिका परख द्वारा निर्धारित किया गया था और सार्स-सीओवी एन प्रोटीन क्रॉस-रिएक्टिव मोनोक्लोनल एंटीबॉडी 1 सी 7 सी 7 का उपयोग करके इम्यूनोस्टेनिंग द्वारा मूल्यांकन किया गया था। शुक्र के संक्रमण के परिणामस्वरूप सभी अंगों में आरएसएआरएस-सीओवी-2/डब्ल्यूटी से संक्रमित चूहों में देखे गए लोगों के लिए तुलनीय वायरल टाइटर्स थे (चित्रा 4 डी)। नकली संक्रमित और वायरस संक्रमित चूहों के एक अलग समूह शरीर के वजन (चित्रा 4 ई) और अस्तित्व (चित्रा 4 एफ) में परिवर्तन के लिए 12 दिनों के लिए निगरानी की गई थी। आरएसएआरएस-सीओवी-2/वीनस और आरएसएआरएस-सीओवी-2/डब्ल्यूटी से संक्रमित चूहों ने अपने शरीर के वजन का 25% तक खो दिया और संक्रमण के बाद 9 वें दिन तक सभी ने वायरल संक्रमण के कारण दम तोड़ दिया, जिसमें कोई जीवित नहीं था (आंकड़े 4ई-4एफ)।

Figure 1
चित्र 1: के18 एचएसीई2 ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करके विवो में आरएसएआरएस-सीओवी-2/एनएलयूसी संक्रमण का आकलन। (ए) आरएसएआरएस-सीओवी-2/डब्ल्यूटी (शीर्ष) और आरएसएआरएस-सीओवी-2/एनएलयूसी (नीचे) का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (बी) विवो में आरएसएआरएस-सीओवी-2/एनएलयूसी के मूल्यांकन के लिए योजनाबद्ध प्रवाह चार्ट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: संक्रमित के 18 एचएसीई 2 ट्रांसजेनिक चूहों में आरएसएआरएस-सीओवी -2 एन ल्यूक अभिव्यक्ति। (ए-बी) चार से छह सप्ताह की मादा के18 एचएसीई2 ट्रांसजेनिक चूहों को मॉक-संक्रमित (एन = 4) या आरएसएआरएस-सीओवी-2/डब्ल्यूटी (एन = 4) या आरएसएआरएस-सीओवी-2/एनएलयूसी (एन = 4) से संक्रमित किया गया था। चूहों को 1-, 2-, 4- और 6-दिनों के बाद संक्रमण पर संवेदनाहारी किया गया था, एनलुक सब्सट्रेट के साथ रेट्रोऑर्बिटल इंजेक्शन के बाद। (ए) एनएलयूसी अभिव्यक्ति को इन विवो इमेजिंग सिस्टम के तहत निर्धारित किया गया था, और नकली संक्रमित और संक्रमित चूहों के फेफड़ों को एक्साइज किया गया था और 1-, 2-, 4- और 6-दिनों के बाद संक्रमण पर फोटो खिंचवाया गया था। (बी) छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा एनएलयूसी तीव्रता का मात्रात्मक रूप से विश्लेषण किया गया था और (सी) फेफड़ों की सतह पर सकल घावों का मात्रात्मक रूप से इमेजजे (सी) ** पी < 0.01 द्वारा विश्लेषण किया गया था। (डी) आरएसएआरएस-सीओवी-2/डब्ल्यूटी और आरएसएआरएस-सीओवी-2/एनएलयूसी से संक्रमित चूहों से नाक टरबाइनेट (बाएं), फेफड़े (मध्य), और मस्तिष्क (दाएं) में वायरल टाइटर्स पट्टिका परख द्वारा निर्धारित किए गए थे। (ई) नाक टरबाइनेट (बाएं), फेफड़े (मध्य) और मस्तिष्क (दाएं) में एनलुक गतिविधि को लूसिफेरेज़ मल्टी-प्लेट रीडर के तहत मापा गया था। एनएस, महत्वपूर्ण नहीं है। मॉक- और वायरस संक्रमित चूहों को (एफ) शरीर के वजन और (जी) अस्तित्व में परिवर्तन के लिए 12 दिनों तक निगरानी की गई थी। सभी डेटा प्रत्येक समूह के लिए औसत ± एसडी के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं और एसपीएसएस 13.0 (आईबीएम) द्वारा विश्लेषण किया जाता है। 0.05 से कम का पी मान (पी < 0.05) को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। इस आंकड़े को ये सी एट अल 41 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: के18 एचएसीई2 ट्रांसजेनिक चूहों का उपयोग करके विवो में आरएसएआरएस-सीओवी-2/शुक्र संक्रमण का आकलन. (ए) आरएसएआरएस-सीओवी-2/डब्ल्यूटी (शीर्ष) और आरएसएआरएस-सीओवी-2/शुक्र (नीचे) का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व. (बी) विवो में आरएसएआरएस-सीओवी-2/शुक्र के मूल्यांकन के लिए योजनाबद्ध प्रवाह चार्ट। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: संक्रमित के 18 एचएसीई 2 ट्रांसजेनिक चूहों में आरएसएआरएस-सीओवी -2 / (ए-बी) चार से छह सप्ताह की मादा के18 एचएसीई2 ट्रांसजेनिक चूहे आरएसएआरएस-सीओवी-2/डब्ल्यूटी (एन = 4) या आरएसएआरएस-सीओवी-2/वीनस (एन = 4) के साथ नकली संक्रमित (एन = 4) या संक्रमित (105 पीएफयू/माउस) थीं। फेफड़ों को संक्रमण के बाद 1-, 2-, 4-, और 6-दिनों में एक्साइज किया गया था, फेफड़ों की छवियों को संक्रमण के बाद 1-, 2-, 4- और 6-दिनों में फोटो खिंचवाया गया था। (ए) शुक्र अभिव्यक्ति का मूल्यांकन आईवीआईएस के तहत किया गया था, (बी) प्रतिदीप्ति तीव्रता का विश्लेषण छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर द्वारा मात्रात्मक रूप से किया गया था और (सी) फेफड़ों की सतहों पर सकल घावों का इमेजजे द्वारा मात्रात्मक रूप से विश्लेषण किया गया था। ** पी 0.01 <। (डी) आरएसएआरएस-सीओवी-2/डब्ल्यूटी और आरएसएआरएस-सीओवी-2/शुक्र से संक्रमित चूहों से नाक टरबाइनेट (बाएं), फेफड़े (मध्य) और मस्तिष्क (दाएं) में वायरल टाइटर्स पट्टिका परख द्वारा निर्धारित किए गए थे। एनएस, महत्वपूर्ण नहीं है। मॉक- और सार्स-सीओवी-2 संक्रमित चूहों की (ई) शरीर के वजन घटाने और (एफ) जीवित रहने के लिए 12 दिनों तक निगरानी की गई। सभी डेटा प्रत्येक समूह के लिए औसत ± एसडी के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं और एसपीएसएस 13.0 (आईबीएम) द्वारा विश्लेषण किया जाता है। 0.05 से कम का पी मान (पी < 0.05) को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता था। इस आंकड़े को ये सी एट अल 41 से संशोधित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल विवो में वायरल संक्रमण की निगरानी के लिए रिपोर्टर जीन व्यक्त करने वाले इन आरएसएआरएस-सीओवी-2 का उपयोग करने की व्यवहार्यता को दर्शाता है। दोनों रिपोर्टर-व्यक्त पुनः संयोजक वायरस विवो में सार्स-सीओवी-2 संक्रमण का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट उपकरण प्रदान करते हैं। वर्णित एक्स विवो (आरएसएआरएस-सीओवी-2/वीनस) और इन विवो (आरएसएआरएस-सीओवी-2/एनएलयूसी) इमेजिंग सिस्टम सार्स-सीओवी-2 संक्रमण, वायरल रोगजनन की गतिशीलता को समझने और वायरल संक्रमण के बाद अलग-अलग समय पर संक्रमित कोशिकाओं/अंगों की पहचान करने के लिए एक उत्कृष्ट विकल्प का प्रतिनिधित्व करते हैं। एक्स विवो (आरएसएआरएस-सीओवी-2/वीनस) और इन विवो (आरएसएआरएस-सीओवी-2/एनएलयूसी) अध्ययन करने के लिए, सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य संक्रमण के साथ-साथ आरएसएआरएस-सीओवी-2/एनएलयूसी के पर्याप्त टीकाकरण होना प्रख्यात है।

आरएसएआरएस-सीओवी-2/एनएलयूसी का उपयोग करके विवो संक्रमण में अध्ययन करते समय, आईवीआईएस के तहत एनएलयूसी विज़ुअलाइज़ेशन की सुविधा के लिए चूहों को मुंडाया जाना चाहिए। एनलुक के विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एनलुक सब्सट्रेट को टीका लगाने की भी आवश्यकता है। यह एक उच्च एनएलयूसी संकेत सुनिश्चित करने के लिए एनलक सब्सट्रेट की सांद्रता और मात्रा निर्धारित करने के लिए कुछ प्रयोगात्मक परीक्षण की आवश्यकता हो सकती है। शुक्र का उपयोग करके पूर्व विवो संक्रमणों का अध्ययन करते समय, और आईवीआईएस का उपयोग करके पूरे चूहों से सीधे शुक्र का पता लगाने की सीमाओं के कारण, फेफड़ों की केवल पूर्व विवो इमेजिंग शुक्र अभिव्यक्ति का पता लगाने की अनुमति देती है। इसके लिए चूहों के एक समूह को अलग-अलग समय बिंदुओं पर इच्छामृत्यु की आवश्यकता होती है। यह आरएसएआरएस-सीओवी-2/एनएलयूसी से संक्रमित चूहों की स्थिति के विपरीत है क्योंकि चूहों के एक ही समूह को संक्रमण के बाद अलग-अलग दिनों में इमेज किया जा सकता है, बिना आरएसएआरएस-सीओवी-2/वीनस के लिए आवश्यक संक्रमण के बाद प्रत्येक समय इच्छामृत्यु की आवश्यकता के बिना। आरएसएआरएस-सीओवी-2/एनएलयूसी पर आरएसएआरएस-सीओवी-2/वीनस का एक फायदा यह है कि इसका उपयोग प्रवाह साइटोमेट्री के साथ किया जा सकता है ताकि यह पता लगाया जा सके कि सार्स-सीओवी-2 से किस प्रकार की कोशिकाएं संक्रमित हैं, केवल विशिष्ट सेलुलर मार्करों के उपयोग के साथ युग्मित गैर-संक्रमित कोशिकाओं से संक्रमित कोशिकाओं को छांटकर जैसा कि हमने पहले इन्फ्लूएंजा (आरईएफ) के साथ वर्णित किया था। हमारे आरएसएआरएस-सीओवी-2/वीनस और आरएसएआरएस-सीओवी-2/एनएलयूसी का एक महत्वपूर्ण पहलू यह है कि दोनों ने क्षीणन के संकेत प्रदर्शित किए बिना इन विट्रो और विवो में डब्ल्यूटी जैसे विकास गुणों का प्रदर्शन किया, जिससे हमें संक्रमित चूहों (आरएसएआरएस-सीओवी-2/वीनस) के फेफड़ों में वायरस संक्रमण पूर्व विवो की निगरानी करने और पूरे माउस (आरएसएआरएस-सीओवी-2/

महत्वपूर्ण बात यह है कि ये रिपोर्टर-एक्सप्रेसिंग आरएसएआरएस-सीओवी-2/वीनस और आरएसएआरएस-सीओवी-2/एनएलयूसी सार्स-सीओवी-2 संक्रमणके उपचार के लिए लीड रोगनिरोधी और/या चिकित्सीय की पहचान के लिए एक उत्कृष्ट विकल्प का प्रतिनिधित्व करते हैं। उपयोग किए जाने वाले विभिन्न फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे, शुक्र और एमचेरी) को व्यक्त करने वाले रिपोर्टर-एक्सप्रेसिंग आरएसएआरएस-सीओवी-2 का उपयोग हमें यह पहचानने के लिए उन्हें द्विसूत्री परख में संयोजित करने की अनुमति देता है कि क्या चिकित्सीय कुशलतापूर्वक एक ही समय में दो वायरस के संक्रमण को रोक सकते हैं, इन विट्रो और या विवो में, और वायरल संक्रमण, और रोगजनन39 को ट्रैक करने के लिए।

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Disclosures

लेखकों ने घोषणा की कि अनुसंधान किसी भी वाणिज्यिक, वित्तीय और गैर-वित्तीय, या वर्णित कार्य के संबंध में हितों के व्यक्तिगत संघर्ष की अनुपस्थिति में आयोजित किया गया था।

Acknowledgments

हम अपने संस्थान (टेक्सास बायोमेडिकल रिसर्च इंस्टीट्यूट) के सदस्यों को कोविड-19 महामारी के दौरान हमारी सुविधाओं को पूरी तरह से चालू और सुरक्षित रखने के प्रयासों के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। हम समय-कुशल तरीके से हमारे प्रोटोकॉल की समीक्षा करने के लिए अपनी संस्थागत जैव सुरक्षा समिति (आईबीसी) और स्पेल (आईएसीयूसी) को भी धन्यवाद देना चाहते हैं। हम सार्स-सीओवी क्रॉस-रिएक्टिव 1सी7सी7 न्यूक्लियोकैप्सिड (एन) प्रोटीन मोनोक्लोनल एंटीबॉडी प्रदान करने के लिए माउंट सिनाई में इकान स्कूल ऑफ मेडिसिन में डॉ थॉमस मोरन को धन्यवाद देते हैं। मार्टिनेज-सोब्रिडो की प्रयोगशाला में सार्स-सीओवी-2 अनुसंधान वर्तमान में एनआईएआईडी/एनआईएच अनुदान आरओ1एआई161363-01, आरओ1एआई161175-01ए1 और आर43एआई165089-01 द्वारा समर्थित है; रक्षा विभाग (डीओडी) डब्ल्यू 81 एक्सडब्ल्यूएच 2110095 और डब्ल्यू 81 एक्सडब्ल्यूएच 2110103 अनुदान देता है; प्रेसिजन चिकित्सीय के लिए सैन एंटोनियो साझेदारी; टेक्सास बायोमेडिकल रिसर्च इंस्टीट्यूट फोरम; सैन एंटोनियो में टेक्सास स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र विश्वविद्यालय; सैन एंटोनियो मेडिकल फाउंडेशन; और इन्फ्लूएंजा रोगजनन और संचरण (सीआरआईपीटी) पर अनुसंधान केंद्र द्वारा, इन्फ्लूएंजा अनुसंधान और प्रतिक्रिया के लिए एनआईएआईडी-वित्त पोषित उत्कृष्टता केंद्र (सीईआईआरआर, अनुबंध # 75 एन 9 3021 सी00014)।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5% Triton X-100 J.T.Baker X198-07 Store at room temperature (RT)
1% DEAE-Dextran MP Biomedicals 195133
10% Formalin solution, neutral buffered Sigma-Aldrich HT501128
Agar Oxoid LP0028
24-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 662160
5% Sodium bicarbonate Sigma Aldrich S-5761
6-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 657160
96-well Cell Culture Plate Greiner Bio-one 655-180
African green monkey kidney epithelial cells (Vero E6) ATCC CRL-1586
Ami HT Spectral Instruments Imaging
Aura Imaging Software 3.2.0 Spectral Instruments Imaging Image analysis software
Bovine Serum Albumin (BSA), 35% Sigma-Aldrich A9647 Store at 4 °C
Cell culture grade water Corning 25-055-CV
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Corning Cellgro 15-013-CV Store at 4 °C
Anesthesia gas machine Veterinary Anesthesia Systems, Inc. VAS 2001R
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1500-050 Store at -20 °C
Four- to six-week-old female K18-hACE2 transgenic mice The Jackson Laboratory 34860
Graphpad Prism Version 9.1.0 GraphPad
Isoflurane Baxter 1001936040 Store at RT
MARS Data Analysis Software BMG LABTECH
MB10 tablets QUIP Laboratories MBTAB1.5 Store at RT
Nano-Glo Luciferase Assay Reagent Promega N1110 This reagent is used to measure Nluc activity. Store at -20 °C
Nunc MicroWell 96-Well Microplates ThermoFisher Scientific 269620
Nunc MicroWell 96-Well Microplates ThermoFisher Scientific 269620
Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100x Corning 30-009-CI Store at -20 °C
PHERAstar FSX BMG LABTECH PHERAstar FSX
Precelleys Evolution homogenizer Bertin Instruments P000062-PEVO0-A
Soft tissue homogenizing CK14 – 7 mL Bertin Instruments P000940-LYSK0-A
T75 EasYFlask ThermoFisher Scientific 156499
VECTASTAIN ABC-HRP Kit, Peroxidase Vector Laboratories PK-4002 ABC kit and DAB Peroxidase Substrate kit

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References

  1. V'Kovski, P., Kratzel, A., Steiner, S., Stalder, H., Thiel, V. Coronavirus biology and replication: implications for SARS-CoV-2. Nature Reviews Microbiology. 19 (3), 155-170 (2021).
  2. Pal, M., Berhanu, G., Desalegn, C., Kandi, V. Severe acute respiratory syndrome coronavirus-2 (SARS-CoV-2): An update. Cureus. 12 (3), 7423 (2020).
  3. Su, S., et al. Epidemiology, genetic recombination, and pathogenesis of coronaviruses. Trends in Microbiology. 24 (6), 490-502 (2016).
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