Summary
Protokollen beskriver en metode til undersøgelse af ekstracellulær matrixviskoselasticitet og dens afhængighed af proteinsammensætning eller miljøfaktorer. Det målrettede matrixsystem er musezonulen. Metodens ydeevne demonstreres ved at sammenligne den viskoelastiske opførsel af vildtype zonulære fibre med dem, der mangler mikrofibril-associeret glycoprotein-1.
Abstract
Elasticitet er afgørende for funktionen af væv som blodkar, muskler og lunger. Denne egenskab er hovedsagelig afledt af den ekstracellulære matrix (ECM), proteinnetværket, der binder celler og væv sammen. Hvordan et ECM-netværks elastiske egenskaber relaterer til dets sammensætning, og om ECM's afslapningsegenskaber spiller en fysiologisk rolle, er spørgsmål, der endnu ikke er behandlet fuldt ud. En del af udfordringen ligger i den komplekse arkitektur i de fleste ECM-systemer og vanskeligheden ved at isolere ECM-komponenter uden at gå på kompromis med deres struktur. En undtagelse er zonule, et ECM-system, der findes i hvirveldyrs øje. Zonule består af fibre hundreder til tusinder af mikrometer i længden, der spænder over det cellefrie rum mellem linsen og øjenvæggen. I denne rapport beskriver vi en mekanisk teknik, der udnytter zonulens højt organiserede struktur til at kvantificere dens viskoelastiske egenskaber og bestemme bidraget fra individuelle proteinkomponenter. Metoden involverer dissektion af et fast øje for at eksponere linsen og zonulen og anvender en pull-up-teknik, der strækker de zoneulære fibre ligeligt, mens deres spænding overvåges. Teknikken er relativt billig, men alligevel følsom nok til at detektere ændringer i viskoelastiske egenskaber af zoneulære fibre hos mus, der mangler specifikke zoneindiske proteiner eller med aldring. Selvom metoden, der præsenteres her, primært er designet til at studere okulær udvikling og sygdom, kan den også tjene som en eksperimentel model til at udforske bredere spørgsmål vedrørende de elastiske ECM's viskoelastiske egenskaber og rollen som eksterne faktorer såsom ionisk koncentration, temperatur og interaktioner med signalmolekyler.
Introduction
Et hvirveldyrs øje indeholder en levende optisk linse, der hjælper med at fokusere billeder på nethinden1. Linsen er ophængt på den optiske akse af et system af sarte, radialt orienterede fibre, som illustreret i figur 1A. I den ene ende fastgøres fibrene til linseækvator og i den anden til overfladen af ciliarylegemet. Deres længder spænder over afstande fra 150 μm hos mus til 1 mm hos mennesker. Samlet set er disse fibre kendt som zonule af Zinn2, ciliary zonule eller simpelthen zonule. Okulært traume, sygdom og visse genetiske lidelser kan påvirke integriteten af de zoneulære fibre3, hvilket resulterer i deres eventuelle fiasko og ledsagende tab af syn. I mus har fibrene en kerne, der hovedsagelig består af proteinet fibrillin-2, omgivet af en kappe rig på fibrillin-14. Selvom zonefibre er unikke for øjet, har de mange ligheder med elastinbaserede ECM-fibre, der findes andre steder i kroppen. Sidstnævnte er dækket af en fibrillin-1 mantel5 og har lignende dimensioner som zoneulære fibre6. Andre proteiner, såsom latent transformerende vækstfaktor β(LTBP'er) og mikrofibril-associeret glycoprotein-1 (MAGP-1), findes i forbindelse med begge typer fibre7,8,9,10,11. Det elastiske modul af zonende fibre ligger i området 0,18-1,50 MPa12,13,14,15,16, der kan sammenlignes med elastinbaserede fibre (0,3-1,2 MPa)17. Disse arkitektoniske og mekaniske ligheder får os til at tro, at enhver indsigt i rollerne af zonule-associerede proteiner kan hjælpe med at belyse deres roller i andre ECM elastiske fibre.
Hovedformålet med at udvikle den metode, der er beskrevet her, er at få indsigt i specifikke zonebaserede proteiners rolle i udviklingen af arvelig øjensygdom. Den generelle tilgang er at sammenligne de viskoelastiske egenskaber af zoneulære fibre i vildtypemus med mus, der bærer målrettede mutationer i gener, der koder for zoneulære proteiner. Mens flere metoder tidligere er blevet brugt til at måle de elasto-mekaniske egenskaber af zoneulære fibre, blev alle designet til øjnene på meget større dyr12,13,14,15,16. Som sådanne modeller er ikke genetisk trækbare; vi søgte at udvikle en eksperimentel metode, der var bedre egnet til musens små og sarte øjne.
Den metode, vi udviklede til vurdering af musens zonefibres viskoelasticitet, er en teknik, vi kalder pull-up-analysen4,18, som opsummeres visuelt i figur 1. En detaljeret beskrivelse af pull-up-metoden og analysen af resultaterne findes nedenfor. Vi begynder med at beskrive apparatets konstruktion, herunder de tredimensionelle (3D)-printede dele, der anvendes i projektet. Dernæst beskriver vi den protokol, der bruges til at opnå og forberede øjnene til eksperimentet. Endelig giver vi trinvise instruktioner om, hvordan man får data til bestemmelse af de viskoelastiske egenskaber af zonelære fibre. I afsnittet Repræsentative resultater deler vi tidligere upublicerede data opnået med vores metode om de viskoelastiske egenskaber af zonefibre fra mus, der mangler MAGP-119, samt et kontrolsæt opnået fra aldersmatchede vildtypedyr. Endelig slutter vi med generelle bemærkninger om fordelene og begrænsningerne ved metoden og forslag til potentielle eksperimenter, der kan belyse, hvordan miljømæssige og biokemiske faktorer påvirker ECM-fibrenes viskoelastiske egenskaber.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev godkendt af Washington University Animal Studies Committee og overholdt ARVO Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research.
1. Fremstilling af specialiserede dele og konstruktion af apparater
- Fremstilling af specialiserede dele
- Sonde fabrikation. Hold en glaskapillær i en vinkel som vist i venstre panel i figur 2A. Anbring en flamme fra en cigarettænder ca. 2 cm fra den ene ende, og hold den der, indtil enden bøjer med 90°, som vist i højre panel i figur 2A.
- Prøve platform fabrikation. Brug 3D-tegnesoftware til at designe en platform, der måler 30 x 30 x 5 mm og indeholder halvkugleformede fordybninger på 2,0, 2,5 og 3,0 mm i diameter, som vist i figur 2B.
- Fremstilling af sondeholder. Brug 3D-tegnesoftwaren til at designe et beslag, der holder kapillærsonden, og fastgør den til en mikromanipulator (se figur 2C).
BEMÆRK: En prøve 3D-fil til platformfabrikation og sondeholderfabrikation i STL-format er tilgængelig på anmodning fra den tilsvarende forfatter. - Negativ linse samling. Anbring et negativt cylindrisk objektiv (-75 mm i brændvidde og ca. 50 mm i højde og længde) som vist i figur 1C og figur 1D for at korrigere forvrængningen forårsaget af tilsætning af væske til petriskålen (tilsætning af væske forvrænger synet af det dissekerede øje, når det afbildes fra siden).
- Lim det negative objektiv på en af de 2-slidsede baser (se figur 2D for placering af objektivet på bunden).
- Saml de resterende dele som vist i figur 2D.
- Juster stolpens højde, så linsen næsten ikke svæver over vægten, og stram skruen i stolpeholderen.
- Konstruktion af apparater
- Installer på en computer det logningsprogram, der følger med skalaen, mikroskopkamerasoftwaren og den motoriserede mikrometercontrollerapplikation.
- Tilslut det motoriserede mikrometer til servomotorcontrolleren og sidstnævnte til computeren. Start motorstyringsprogrammet, og rediger motorindstillingerne.
BEMÆRK: Motorindstillingerne, som er anført nedenfor, blev valgt efter indledende eksperimenter, der afslørede, at spændingerne slappede af på en tidsskala på 10-20 s. Baseret på denne bestemmelse valgte vi en hastighed og acceleration, der gjorde det muligt for motoren at gennemføre en 50 μm forskydning i en tid, der var mindre end afslapningstiden, men ikke for kort til at undgå at ryste prøven. Her valgte vi en forskydningstid på ca. 5-10 s. - Indstil den maksimale hastighed til 0,01 mm/s og accelerationen til 0,005 mm/s2.
- Installer kameraet i inspektionsmikroskopet, og test kameraets billedbehandlingssoftware.
- Placer skalaen på bænkpladsen, der er afsat til apparatet.
- Lim en 3D-printet platform (fra trin 1.1.2) på en petriskål og tilsæt en 2-3 mm glasperle til en af brøndene. Placer petriskålen på skalaen, så adlen er placeret nær midten af gryden.
- Udskift det manuelle mikrometer fra mikromanipulatoren med det motoriserede.
- Skru de to 4-40 skruer ind i sondeholderen. Fastgør sondeholderen til manipulatoren som vist i figur 1C.
- Forbered en sonde som illustreret i figur 2A, placer den inde i sondeholderen med den bøjede del nedad, og stram skruerne.
- Placer mikromanipulatoren på bordet, så spidsen af sonden er over perlen på platformen. Anbring mikromanipulatoren på bordet for at forhindre utilsigtet bevægelse under eksperimentet.
- Placer sidemikroskopet på bordet, så pællen er i midten af sit synsfelt og i fokus.
2. Prøveforberedelse og dataindsamling
- Øjenfiksering og dissektion
- Oprethold vildtypemus og Magp1-null dyr på en identisk C57 / BL6J baggrund. Afliv 1 måned gamle eller 1-årige mus ved CO2-indånding .
- Fjern øjnene med fine tang og fastgør de enukleerede kloder ved 4 °C natten over i 4 % paraformaldehyd/fosfatbufret saltvand (PBS, pH 7,4). Oprethold et positivt tryk på 15-20 mmHg i øjet under fikseringsprocessen som beskrevet6.
BEMÆRK: Eksperimenter udføres på hanmus for at kontrollere for mulige kønsrelaterede forskelle i størrelsen af den okulære klode. Det positive tryk sikrer, at kloden forbliver oppustet, hvilket bevarer afstanden mellem linsen og øjets væg, der spænder over de zoneulære fibre. - Vask øjnene i 10 min i PBS. Brug oftalmisk kirurgisk saks og arbejde under et stereomikroskop, lav et snit i fuld tykkelse i øjets væg nær det optiske nervehoved.
- Forlæng snittet fremad til ækvator og derefter omkring øjets ækvatoriale omkreds. Pas på at skåne de delikate ciliære processer og tilhørende zonefibre.
- Fjern bagsiden af kloden, og udsæt objektivets bageste overflade.
- Brug tangen til at fjerne et dissekeret øje fra bufferopløsningen og læg det på en tør opgave, der tørres af med hornhinden nedad. Træk forsigtigt hornhinden over overfladen af aftørringen for at tørre den.
- Tilsæt 3 μL instant lim til platformsbrøndene, der passer til øjet i petriskålen.
- Placer fadet på stereomikroskopets sceneplade, så brønden med limen er i syne.
- Overfør øjet fra aftørringen til kanten af brønden, der indeholder lim. Træk derefter forsigtigt øjet ind i brønden og juster hurtigt dets retning, så bagsiden af linsen er øverst.
- Tør den udsatte side af linsen ved forsigtigt at blotte den med hjørnet af en tørserviet.
- Påfør en klat instant lim på bunden af en 50 mm petriskål og cementer platformen på den.
- Måling af zonulær viskoelastisk respons
- Tænd for skalaen, start skalalogningsprogrammet og kamerasoftwaren. Sørg for, at logningsprogrammet kan hente data i 30 minutter, da nogle forsøg kan vare så længe.
- Tænd for servomotorstyringen, og start controllerprogrammet på computeren. Sørg for, at controlleren er indstillet til at bevæge sig i trin på 50 μm ved hjælp af bevægelsesparametre svarende til dem, der er beskrevet i NOTE i trin 1.2.2.
- Opret en 90° bøjning i en kapillærstang som beskrevet i trin 1.1.1.
- Skub den bøjede kapillær ind i kapillærsondeholderen, og stram fastgørelsesskruerne.
BEMÆRK: For at minimere prøvedehydrering anbefaler vi, at trin 1-4 gennemføres før eller under øjendissektion. - Tilsæt en lille (~ 1 mm) perle af UV-hærdende lim til spidsen af kapillæren.
- Brug de manuelle justeringer på manipulatoren til at flytte spidsen af kapillærsonden, så den er direkte over midten af linsen. Kontroller, om den nederste del af UV-limen ser ud til at være centreret over toppen af objektivet, når den ses forfra (ved visuel inspektion) og siden (gennem mikroskopkameraet).
- Mens du kigger gennem kameraet, skal du sænke sondespidsen, indtil UV-limen kommer i kontakt med linsen og dækker en tredjedel til halvdelen af dens øvre overflade.
- Brug en lavintensitets (~ 1 mW), retningsbestemt, næsten synlig UV (380-400 nm) lyskilde til at hærde limen.
BEMÆRK: Disse specifikationer er tilstrækkelige til at hærde limen på få sekunder og samtidig minimere potentialet for at fremkalde proteintværbinding. UV-lyskilderne, der leveres med kommercielle UV-limpenne, opfylder disse specifikationer. - Tilsæt PBS-opløsning til fadet, indtil øjet er dækket af væske til en dybde på mindst 2 mm.
- Placer den cylindriske linse foran inspektionsmikroskopet og så tæt som muligt på petriskålen uden at røre ved den.
- Start samtidig logningsprogrammet og et timerprogram. Tag et billede af øjet/sonden ved hjælp af kameraet.
- Efter 60 s skal du starte yderligere 50 μm forskydning og derefter hver 60 s, indtil eksperimentet er afsluttet, dvs. indtil alle fibrene er brudt. Bemærk, at signalet ikke vender tilbage til basislinjeniveauer på grund af bufferfordampning under eksperimentet. Korrigere den efterfølgende drift i aflæsningerne under dataanalysen, som eksemplificeret i trin 2.2.14.
- Når en kørsel er afsluttet, skal du gemme skaleringslogningsdataene og eksportere dem til et format, der er kompatibelt med regnearket, f.eks. et .csv format. Gem de objektivbilleder, der blev indsamlet under løbet.
- Importer data til et regneark. Brug den første og den sidste skalaaflæsning til at interpolere afdriften i baggrundsaflæsningen over tid på grund af fordampning (se figur 3). Træk den interpolerede aflæsning fra aflæsningen på hvert tidspunkt.
BEMÆRK: Hvis du bruger et regneark, kan interpolationen udføres automatisk ved at indtaste formlen = B2 - $B $ 2 + ($B $ 2 - @INDIRECT ("B"&COUNTA (B: B)))/(COUNTA (B: B) -2) * A2 i cellen til højre for den første skalalæsning, derefter flytte markøren til højre nederste hjørne af cellen og trække den ned til den sidste dataværdi. Formlen forudsætter, at dataene er organiseret i en kolonne, hvor det første datapunkt vises i celle B2. Hvis det ønskes, kan de data, der behandles i trin 2.2.14, analyseres med den kvasi-elastiske viskoelastiske model udviklet af en af medforfatterne, Dr. Matthew Riley4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Pull-up-teknikken, der er beskrevet her, giver en ligetil tilgang til bestemmelse af viskoelastiske egenskaber af zoneformede fibre i mus. Kort fortalt bevares museøjet først ved injektion af et fikseringsmiddel ved fysiologisk intraokulært tryk. Denne tilgang opretholder den naturlige inflation i øjet og holder fibrene korrekt forspændte (fiksering blev anset for acceptabel efter foreløbige forsøg viste, at det ikke ændrede fibrenes elasticitet eller styrke væsentligt). Bagsiden af museøjet fjernes derefter ved dissektion for at udsætte linsen og de zoneulære fibre, der suspenderer den. Forsiden af øjet er fastgjort til en platform og placeret inde i en petriskål, der hviler på en digital skala. Dernæst cementeres en glaskapillær fastgjort til en mikromanipulator til linsens bageste overflade. Linsen hæves derefter i trin på 50 μm, mens kraften på skalaen registreres. En reduktion i præparatets tilsyneladende vægt giver information om de kræfter, der strækker fibrene. Hver forskydning efterfølges af en ligevægtsperiode, der varer ca. 1 minut for at observere enhver afslapning af stresset forårsaget af forskydningen. Endelig analyseres resultaterne ved hjælp af en kvasi-lineær viskoelastisk model designet specielt til geometrien af musens zoneulære fibre og retningen af trækket ind for assayet4.
Typiske viskoelastiske data opnået med vores metode er vist i figur 3. Kurven fremstår omvendt (negativ), da løftekraften på linsen reducerer vægten af skålen/platformen/øjenenheden på vægten med en tilsvarende mængde. Responsen omfatter øjeblikkelige kraftspidser under hver af objektivets lodrette forskydninger på 50 μm efterfulgt af en afslapningsfase med en levetid i størrelsesordenen 10 s. En lignende stressafslapning er blevet observeret for kvægzonulære fibre12. Størrelsen af de øjeblikkelige og afslappede kræfter stiger med hvert trin op til ca. 1000 s (~ 800 μm total forskydning) og begynder derefter at falde, når fibre begynder at svigte. Zonule-fejl er afsluttet med 1.500 s-punktet (~ 1,25 mm total forskydning). Bemærk, at kurven på grund af fordampningen af bufferen i løbet af eksperimentet ikke vender tilbage til den indledende aflæsning, efter at linsen er befriet fra øjet.
Figur 4 kontrasterer svarene opnået for en Magp-1 knockout-mus (rød kurve) og et aldersmatchet vildtypedyr (blå kurve). Disse kurver er korrigeret for fordampning, inverteret, og de rå massemålinger (se figur 3) udtrykkes nu som kraft (med enheder af mN). Den oprindelige viskoelastiske respons af den Magp-1-udtømte zonule (tid 0-600 s) ligner meget vildtypens, hvilket tyder på, at zonules viskoelastiske egenskaber ikke blev signifikant ændret ved fraværet af Magp-1. Fibrene ser imidlertid ud til at briste ved en meget lavere spænding sammenlignet med deres vildtype-modstykker.
For at illustrere metodens pålidelighed indsamlede vi data fra flere dyr om den maksimale øjeblikkelige kraft, der blev påført øjnene, før deres fibre bristede. Resultaterne er vist i figur 5. Dataene for 1 måned gamle mus udviser meget små værdier for standardfejlen i gennemsnittet (SEM) på trods af det relativt lave antal anvendte prøver (n = 5 eller 6), hvilket tyder på høj reproducerbarhed. Resultaterne indikerer, at fibrenes styrke adskiller sig signifikant mellem de to genotyper (p-værdi = 2,4 x 10-6). Resultater, der ikke er vist i tallene, tyder også på, at der er en subtil, men statistisk signifikant stigning i brudkraftstyrken med alderen for vildtypedyr (p-værdi = 0,024).
Pull-up-metoden kan også generere kvantitative estimater af de viskoelastiske parametre, der tager højde for de observerede variationer i tidsmæssige reaktioner. Tabel 1 opsummerer de bedst egnede parametre til vores MAGP-1-data, opnået med en kvasi-lineær viskoelastisk model, der er beskrevet tidligere4. Resultaterne viser, at både MAGP-1-deletion og aldring kan have meget betydelige konsekvenser for nogle af de mekaniske egenskaber ved zonebaserede fibre.
Figur 1: Et visuelt resumé af pull-up-metoden. (A) Tværsnitsbillede af et hvirveldyrøje, der viser linsen og de zoneulære fibre, der suspenderer den. (B) En generel tilgang til bestemmelse af viskoelastisk adfærd i zoneulære fibre ved at forskyde linsen opad (væk fra hornhinden). (C) Faktisk visning af et dissekeret øje limet på en platform, hvor linsen trækkes opad af en glassonde, der er fastgjort til en mikromanipulator. D) Skematisk oversigt over hele apparatet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Fremstilling af forskellige dele. (A) Fremstilling af glassonden. En glaskapillær holdes i en vinkel, og en flamme påføres på et sted ca. 2 cm fra den ene ende. Inden for få sekunder begynder enden af kapillæren at falde. Flammen fjernes, når enden af kapillæren er bøjet ved ca. 90°. (B) Fremstilling af øjenplatformen. Delen er fremstillet med en 3D stereolitografi (SLA) printer. Den måler 30 x 30 x 5 mm og indeholder tre halvkugleformede fordybninger med 2,0, 2,5 og 3,0 mm diametre, hvori dissekerede øjne i forskellige størrelser limes. (C) Fremstilling af sondeholder. Denne del blev også fremstillet med en 3D SLA-printer. Den består af to ortogonale stænger med en diameter på 7,3 mm. Den nederste stang indeholder en 1,5 mm boring og to 2,5 mm gennemgående huller på den ydre overflade for at rumme metalskruer, der fastgør kapillærsonden på plads. (D) Negativ linsesamling. Billeder taget af sidemikroskopet indeholder en astigmatisk forvrængning på grund af krumningen af petriskålen og bufferopløsningen. Objektivenheden er designet til at kompensere for forvrængningen, så sidemikroskopet kan tage billeder i skarpt fokus. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Typiske rådata opnået med assayet. Den viste graf blev registreret med logningssoftware, der registrerer data fra en digital skala med en nøjagtighed på 0,01 g. Grafens venstre kant (tid 0) afspejler prøvens vægt uden løftekraft. Y-aksen viser masse i g. Linsen løftes derefter i trin på 50 μm, indtil alle zonefibre er brudt, og petriskålen igen hviler helt på skalaen. Bemærk, at slutlæsningen er forskudt fra den oprindelige læsning. Forskydningen skyldes gradvis fordampning af bufferopløsningen i løbet af forsøget og kan redegøres for under dataanalysen som beskrevet i trin 2.2.14. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative zonulære kraftforskydningskurver for vildtype- og MAGP-1-mangelfulde mus. Grafen sammenligner den viskoelastiske respons opnået efter diskrete forskydninger af linsen væk fra dens ligevægtsposition. Reaktionen fra et øje fra en MAGP-1 knockout (KO) mus sporer et aldersmatchet vildtypedyr op til det punkt, hvor fibrene i knockoutmusen går i stykker for tidligt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Zonulære fiberbrudskræfter opnået med pull-up-metoden til MAGP-1 KO versus vildtypemus og i to aldre. Alle viste målinger er baseret på n = 5 eller 6 øjne, med fejlbjælker, der repræsenterer standardfejlen i gennemsnittet (SEM). Forkortelser: WT = vildtype; KO = MAGP-1 knockout. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Genotype/alder | G0 (Pa) | G∞ (Pa) | Ʈ (sek) | σ f (Pa) | |
| WT 1-måned | BETYDE | 2.34E+05 | 9.33E+04 | 16.3 | 9.61E+05 |
| SD | 2,83E+04 | 2.94E+04 | 3.4 | 1.25E+05 | |
| 95% Cl | 5,55E+04 | 5,76E+04 | 6.7 | 2,45E+05 | |
| KO 1 måned | BETYDE | 2.73E+05 | 6,74E+04 | 17.6 | 4.44E+05 |
| SD | 6.30E+04 | 2.06E+04 | 3.8 | 7,85E+04 | |
| 95% Cl | 1.23E+05 | 4.03E+04 | 7.5 | 1.54E+05 | |
| p-værdier | 0.25 | 0.12 | 0.58 | 0.000022 | |
| WT 1-årig | BETYDE | 1.98E+05 | 7.42E+04 | 17 | 1.41E+06 |
| SD | 1.17E+05 | 2.39E+04 | 9.1 | 2.44E+05 | |
| 95% Cl | 2.29E+05 | 4.69E+04 | 17.9 | 4.79E+05 | |
| KO 1-årig | BETYDE | 1.70E+04 | 2.46E+04 | 12.9 | 5.05E+05 |
| SD | 9.06E+03 | 8.04E+03 | 7.4 | 1.48E+05 | |
| 95% Cl | 1.78E+04 | 1.58E+04 | 14.4 | 2.91E+05 | |
| p-værdier | 0.0063 | 0.001 | 0.41 | 0.000014 | |
| p værdier, alder | WT | 0.46 | 0.23 | 0.85 | 0.002 |
| KO | 0.0007 | 0.0068 | 0.26 | 0.44 | |
Tabel 1: Viskoelastiske egenskaber opnået med en kvasi-lineær viskoelastisk (QLV) model. Datascanninger som dem, der er vist i figur 4 , blev analyseret med en QLV-model udviklet specielt til pull-up-assayet og musezonule. De bedst egnede parametre for de øjeblikkelige (G0) og ligevægtsstivheder (G∞), afslapningstidskonstanten (τ) og den ultimative trækstyrke (σ f) vises. Forkortelser: SD = standardafvigelse; CI = konfidensinterval.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zonule er et usædvanligt ECM-system, hvor fibre er arrangeret symmetrisk og kan manipuleres identisk ved at forskyde øjenlinsen langs den optiske akse. Rummet kan også let tilgås uden cellulær forstyrrelse, hvilket gør det muligt at studere fibrene i et miljø tæt på deres oprindelige tilstand. Pull-up-teknikken udnytter denne ECM-præsentation til at manipulere de sarte fibre fra mus, et genetisk trækbart system og nøjagtigt kvantificere deres mekaniske egenskaber. Dette har gjort det muligt for os at undersøge bidraget fra vigtige ECM-proteiner (fibrillin-118, LTBP-24 og MAGP-1 rapporteret her) til de biomekaniske egenskaber af de zoneformede fibre. Vores analyse af fibrillin-1-mangelfulde mus afslørede, at zoneulære fibre, der mangler fibrillin-1, svækkes med alderen og til sidst brister, hvilket fører til forskydning af linsen i øjet (hos mennesker, en tilstand kendt som ektopi lentis). Signifikant er linseforskydning også en almindelig forekomst hos patienter med Marfan syndrom, en sygdom forårsaget af mutationer i FBN1-genet20. Således giver pull-up-analysen mulighed for at modellere aspekter af human bindevævssygdom hos mus. Hos mus, der manglede LTPB-2 (et protein, der menes at være involveret i tilblivelsen af mikrofibriller), var vi i stand til at påvise, at zonefibre blev produceret i fravær af dette protein, men bristede ved signifikant lavere belastninger og til sidst gik i opløsning med alderen4. Disse resultater tyder på, at LTBP-2 bidrager til fibrenes levetid snarere end deres syntese. I den aktuelle undersøgelse fastslog vi, at MAGP-1-mangelfulde fibre havde lignende viskoelastiske egenskaber som vildtypefibre, men bristede ved lavere belastninger uden tegn på yderligere aldersrelateret nedbrydning. Dette ville være i overensstemmelse med en model, hvor fibre, der mangler MAGP-1, i sig selv er svagere, så snart de udvikler sig.
Vi bemærker, at de ultimative trækstyrker, der er anført i tabel 1 , estimeres under antagelse af, at fibrene bryder et sted midt i spændvidden. Vi kan dog ikke udelukke muligheden for, at fibersvigt skyldes løsrivelse fra forankringspunkter på linseoverfladen eller ciliarylegemet. Hvis dette var tilfældet, kunne fiberens brudtrækstyrke være højere end de værdier, der er anført i tabel 1. Mikroskopisk analyse vil være nødvendig for at skelne mellem disse muligheder. En sådan analyse er langt fra triviel, da de involverede fibre er meget tynde (~ 0,5-0,6 μm i bredden) og næsten indeksmatchet med vand, hvilket gør dem i det væsentlige usynlige. I mangel af disse yderligere oplysninger kan vi kun fastslå, at de ultimative trækstyrker, der er anført i tabel 1, repræsenterer deres nedre grænser. Det ville også i princippet være interessant at kontrollere, om kraftmålingerne varierer afhængigt af hvilken retning linsen trækkes. I praksis ville det imidlertid kræve fjernelse af iris at trække linsen fra den forreste side uden at beskadige de zoneulære fibre, der ligger umiddelbart nedenunder. En sådan præcis dissektion er ud over, hvad vi i øjeblikket kan opnå med museøjet.
Metodens relative enkelhed og den høje reproducerbarhed af dens resultater er ønskelige kvaliteter til komparative undersøgelser af ECM mekaniske egenskaber. Derudover, som vist her, er det også muligt at anvende pull-up-analysen til at opnå absolutte værdier af viskoelastiske parametre ved at antage en viskoelastisk model og tilpasse tidskurverne til den. For eksempel var vi ved hjælp af en standard kvasi-lineær viskoelastisk (QLV) model i stand til at udtrække værdier for øjeblikkelige (G0) og ligevægtsstivheder (G∞), afslapningstidskonstanten (τ) og den ultimative trækstyrke (σ f) af zoneformede fibre fra vildtypemus såvel som dem, der mangler LTBP-24 eller MAGP-1. G0- og G∞værdierne for vildtypedyr i begge undersøgelser varierer fra 6,7 x 104 Pa til 2,3 x 105 Pa, et interval, der stort set kan sammenlignes med dem, der findes i meget større fibre afledt af humane, kvæg og svinezonuler (1,8 x 105-1,5 x 106 Pa)12,13 14,15,16. Denne enighed mellem arter tyder på, at disse er universelle træk ved disse fibre, og giver os tillid til, at meningsfulde viskoelastiske parametre kan ekstraheres med vores metode.
Et kritisk trin for at opnå viskoelastiske reaktioner af høj kvalitet er orienteringen af det dissekerede øje limet til platformen (trin 2.1.9). Mindre hældning (mindre end 10°) synes ikke at påvirke resultaterne væsentligt. Eksperimenter udført uden for denne grænse kan generere kurver med former, der afviger fra dem, der er vist i figur 4. For eksempel kan nogle af disse kurver have to brede toppe i stedet for en.
Ideelt set ville proceduren, der er skitseret i dette papir, være blevet udført uden fiksering af øjnene, hvilket begrænser vores evne til at vurdere de sande viskoelastiske parametre for friske zoneindrette fibre. Men efter at vores indledende eksperimenter ikke viste nogen signifikant forskel mellem de paraformaldehydfikserede og friske prøver, besluttede vi at vedtage fiksering, da det gav flere fordele. Som antydet i protokollen hjælper brugen af faste væv med at bevare den oprindelige strækning af fibrene til pull-up-eksperimenterne. Derudover fandt vi, at fiksering fremmede større vedhæftning af UV-limen til øjenkapslen, hvilket reducerede chancerne for, at sonden løsnede sig fra linsen under pull-up-handlingen, som det almindeligvis opleves med friske prøver (sondeafmontering kan let genkendes som en pludselig tilbagevenden af kraften til et basisniveau). Fikseringen forhindrede også spændning af øjenvæggen i retning af trækket. På trods af denne begrænsning giver vores metode en robust tilgang til bestemmelse af proteinkomponenternes relative bidrag til de zoneformede fibres viskoelastiske egenskaber.
Selvom vores arbejde til dato har fokuseret på bidraget fra specifikke proteiner, kunne metoden let tilpasses til at studere effekten af faktorer uden for fibrene på deres mekaniske egenskaber. Sådanne faktorer indbefatter temperatur, pH, calciumkoncentration og tilstedeværelsen eller fraværet af tværbindende enzymer. Højpræcisionsmålinger kunne opnås ved hjælp af vores metode i differentiel tilstand, dvs. ved at forspænde de zoneformede fibre med en indledende spænding / belastning og derefter aflæse forskellen i spænding, der følger, når eksterne forhold ændres. Nogle af disse indgreb kan tænkes at påvirke elasticiteten af vævene, der omgiver zonen og dermed producere ændringer i spænding, der konkurrerer med dem, der genereres i zonule. Kontrolmålinger med isoleret væv vil være nødvendige for at vurdere deres relevans for de foreslåede forsøg. Vi forventer, at sådanne virkninger kan være ubetydelige, baseret på observationer med sidekameraet, der viser, at sammenhængende væv opfører sig som meget stive materialer, der i det væsentlige ikke gennemgår nogen deformation, selv når de zoneulære fibre er fuldt strakt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH R01 EY029130 (S.B.) og P30 EY002687 (S.B.), R01 HL53325 og Ines Mandl Research Foundation (R.P.M.), Marfan Foundation og et ubegrænset tilskud til Institut for Oftalmologi og Visuel Videnskab ved Washington University fra Research to Prevent Blindness. J.R. modtog også en bevilling fra University of Health Sciences and Pharmacy til støtte for dette projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1/4-20 hex screws 3/4 inch long | Thorlabs | SH25S075 | |
| 1/4-20 nut | Hardware store | ||
| 3D SLA printer | Anycubic | Photon | |
| 4-40 screws 3/8 inch long, 2 | Hardware store | ||
| Capillaries, OD 1.2 mm and 3 inches long, no filament | WPI | 1B120-3 | |
| Cyanoacrylate (super) glue | Loctite | ||
| Digital Scale accurate to 0.01 g | Vernier | OHAUS Scout 220 | |
| Excel | Microsoft | Spreadsheet | |
| Gas cigarette lighter | |||
| Inspection/dissection microscope | Amscope | SKU: SM-4NTP | Working distance ~ 15 cm |
| Micromanipulator, Economy 4-axis | WPI | Kite-L | |
| Motorized micrometer | Thorlabs | Z812B | |
| Negative cylindrical lens | Thorlabs | LK1431L1 | -75 mm focal length |
| Petri dishes, 50 mm | |||
| Post holder, 3 inches | Thorlabs | PH3 | |
| Post, 4 inches | Thorlabs | TR4 | |
| Scale logging software | Vernier | LoggePro | |
| Servo motor controller | Thorlabs | KDC101 | |
| Servo motor controller software | Thorlabs | APT | |
| Slotted base, 1 | Thorlabs | BA1S | |
| Slotted bases, 2 | Thorlabs | BA2 | |
| Stand for micromanipular | WPI | M-10 | |
| USB-camera for microscope | Amscope | SKU: MD500 | |
| UV activated glue with UV source | Amazon |
References
- Bassnett, S., Shi, Y., Vrensen, G. F. Biological glass: structural determinants of eye lens transparency. Philosophical Transactions of the Royal Society B Biological Sciences. 366 (1568), 1250-1264 (2011).
- Bassnett, S.
- Dureau, P.
- Shi, Y., et al. Latent-transforming growth factor beta-binding protein-2 (LTBP-2) is required for longevity but not for development of zonular fibers. Matrix Biology. 95, 15-31 (2021).
- Ushiki, T. Collagen fibers, reticular fibers and elastic fibers. A comprehensive understanding from a morphological viewpoint. Archives of Histology and Cytology. 65 (2), 109-126 (2002).
- Bassnett, S. A method for preserving and visualizing the three-dimensional structure of the mouse zonule. Experimental Eye Research. 185, 107685 (2019).
- Todorovic, V., Rifkin, D. B. LTBPs, more than just an escort service. Journal of Cellular Biochemistry. 113 (2), 410-418 (2012).
- Mecham, R. P., Gibson, M. A. The microfibril-associated glycoproteins (MAGPs) and the microfibrillar niche. Matrix Biology. 47, 13-33 (2015).
- Hubmacher, D., Reinhardt, D. P., Plesec, T., Schenke-Layland, K., Apte, S. S. Human eye development is characterized by coordinated expression of fibrillin isoforms. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (12), 7934-7944 (2014).
- Inoue, T., et al. Latent TGF-β binding protein-2 is essential for the development of ciliary zonule microfibrils. Human Molecular Genetics. 23 (21), 5672-5682 (2014).
- De Maria, A., Wilmarth, P. A., David, L. L., Bassnett, S. Proteomic analysis of the bovine and human ciliary zonule. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (1), 573-585 (2017).
- Wright, D. M., Duance, V. C., Wess, T. J., Kielty, C. M., Purslow, P. P. The supramolecular organization of fibrillin-rich microfibrils determines the mechanical properties of bovine zonular filaments. Journal of Experimental Biology. 202 (21), 3011-3020 (1999).
- Bocskai, Z. I., Sandor, G. L., Kiss, Z., Bojtar, I., Nagy, Z. Z. Evaluation of the mechanical behaviour and estimation of the elastic properties of porcine zonular fibres. Journal of Biomechanics. 47 (13), 3264-3271 (2014).
- Fisher, R. F.
- Michael, R., et al. Elastic properties of human lens zonules as a function of age in presbyopes. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (10), 6109-6114 (2012).
- van Alphen, G. W., Graebel, W. P.
- Green, E. M., Mansfield, J. C., Bell, J. S., Winlove, C. P. The structure and micromechanics of elastic tissue. Interface Focus. 4 (2), 20130058 (2014).
- Jones, W., Rodriguez, J., Bassnett, S. Targeted deletion of fibrillin-1 in the mouse eye results in ectopia lentis and other ocular phenotypes associated with Marfan syndrome. Disease Models & Mechanisms. 12 (1), 037283 (2019).
- Weinbaum, J. S., et al. Deficiency in microfibril-associated glycoprotein-1 leads to complex phenotypes in multiple organ systems. Journal of Biological Chemistry. 283 (37), 25533-25543 (2008).
- Comeglio, P., Evans, A. L., Brice, G., Cooling, R. J., Child, A. H. Identification of FBN1 gene mutations in patients with ectopia lentis and marfanoid habitus. British Journal of Ophthalmology. 86 (12), 1359-1362 (2002).
