Summary
O presente protocolo descreve o isolamento agudo de células musculares lisas cardíacas e vasculares viáveis de zebrafish adulto, juvenil, larval e embrionário (Danio rerio), adequados para estudos eletrofisiológicos.
Abstract
Os zebrafish têm sido usados há muito tempo como um modelo de organismo vertebrado em pesquisas cardiovasculares. As dificuldades técnicas de isolar células individuais dos tecidos cardiovasculares dos zebrafish têm sido limitantes no estudo de suas propriedades eletrofisiológicas. Métodos anteriores foram descritos para dissecção de corações de zebrafish e isolamento de miócitos cardíacos ventriculares. No entanto, o isolamento dos mócitos atrial e vascular de zebrafish para caracterização eletrofisiológica não foi detalhado. Este trabalho descreve protocolos enzimáticos novos e modificados que fornecem rotineiramente cardiomiocócitos ventriculares e atrials isolados, bem como células de músculo liso vascular (VSM) do arteriosus bulboso, adequados para experimentos de grampo de remendo. Não houve evidência literária de estudos eletrofisiológicos sobre tecidos cardiovasculares de zebrafish isolados em estágios embrionários e larvais de desenvolvimento. Técnicas parciais de dissociação que permitem experimentos de grampo de remendo em células individuais de corações larvais e embrionários são demonstradas.
Introduction
Zebrafish são pequenos peixes teleost que têm sido usados há muito tempo como um modelo de organismo vertebrado1 e recentemente ganharam destaque como um sistema viável de vertebrados para rastreamento de alto rendimento de genes e drogas 2,3. No entanto, a análise fisiológica dos tecidos de zebrafish não é bem desenvolvida. No sistema cardiovascular, foram descritos métodos para dissecção de corações de zebrafish4 e isolamento de miócitos cardíacos ventriculares 5,6,7. Há poucas descrições detalhadas do isolamento efetivo de miócitos atrial e nenhum relato de preparações vasculares de músculo liso (VSM) para estudos de grampo de remendo.
O trabalho atual descreve metodologia para o isolamento de mócitos cardíacos e vasculares de zebrafish, viáveis para estudos eletrofisiológicos e funcionais. Esta abordagem inclui modificações de protocolos previamente relatados para o isolamento ventricular do mócito ventricular de zebrafish 5,6 e adapta métodos de isolamento de células VSM8, permitindo o isolamento de zebrafish vascular smooth muscle cell do arteriosus bulboso (BA). Os protocolos resultam em rendimentos eficientes de células atrial, ventricular e VSM isoladas de zebrafish que podem ser usados de forma confiável em estudos de grampo de remendo por até 8 h9.
Apesar de suas larvas quase transparentes que se desenvolvem inteiramente fora do organismo parental, explorar seu potencial ongenético prometido no estudo do desenvolvimento cardiovascular tem sido limitado por desafios na extração e análise de tecidos em uma idade jovem. O artigo atual aborda essa limitação demonstrando experimentos de grampo de remendo em corações de zebrafish isolados já em 3 dias após a fertilização (dpf), utilizando um método de extração adaptado e publicado10.
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Protocol
Todos os zebrafish (cepa tipo selvagem AB, tanto masculino quanto feminino) foram criados, mantidos e tratados para os experimentos seguindo as diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Washington (IACUC).
1. Isolamento do átrio, ventrículo e arterioso bulboso de zebrafish adulto, juvenil e larval
- Eutanize peixes usando choque frio, ou seja, imergindo em água de 4 °C, por ~10 s.
- Usando fórceps curvos, transfira peixes para uma grande placa de Petri parcialmente preenchida com Tampão de Perfusão (PB) (Tabela 1) e coloque sob um microscópio dissecando.
- Decapitar o peixe apenas posterior aos olhos, usando um par de tesouras.
- Utilizando fórceps curvos (fórceps finos para peixes larvais), segure o peixe na mão não dominante com o lado ventral voltado para o escopo de dissecção. Com o segundo par de fórceps finos (ou superfinos para peixes larvais) na mão dominante, rasgue suavemente os músculos peitorais e as barbatanas para revelar os tecidos cardiovasculares (CV) (átrio, ventrículo e arterioso bulboso, BA) (Figura 1).
- Colocando os fórceps finos na mão dominante, puxe suavemente a BA na ponta interseccionar da BA e na aorta ventral.
NOTA: O BA e o coração sairão da cavidade corporal.- Separe cuidadosamente a BA da aorta beliscando as fórceps e localizando a ponta do átrio em que múltiplos ramos venosos convergem (sinus venosus). Usando os fórceps finos, 'arrancar' a ponta do átrio do ânseio do ânseio sinuso. Isso isola os tecidos CV do resto do corpo (Figura 1).
2. Dissociação de cardiomiócitos de zebrafish adulto, juvenil e larval para estudos eletrofisiológicos
- Usando as fórceps finas, 'arrancar' o átrio e o ventrículo do tecido CV isolados na etapa anterior.
NOTA: O processo permite a dissecação limpa de cada tecido com contaminação cruzada mínima e se sente semelhante a arrancar frutas de uma árvore.- Faça uma ruptura suave no ventrículo usando fórceps finos para drenar o excesso de sangue, o que pode ser assegurado quando o tecido cardíaco torna a cor de salmão pálido de vermelho brilhante.
- Acumule o átrio isolado e o ventrículo em tubos de centrífugas separados de 1,5 mL contendo tampão de perfusão (PB; 1,5 mL).
NOTA: Para garantir a dissociação bem sucedida de cardiomiócitos atrial de zebrafish adultos (ACMs) e cardiomiócitos ventriculares (VCMs), normalmente são necessários quatro átrios e três ventrículos. No caso do zebrafish juvenil (28-90 dias), esse número é dobrado.- No caso do zebrafish larval (14-28 dias), colete o máximo de tecido possível de ~30 larvas.
- Substitua o PB nos tubos por 750 μL de Tampão de Digestão (DB) (Tabela 1) cada um e coloque os tubos em um termoshaker a 37 °C e 800 rpm. Permita a digestão dos tecidos até que se tornem translúcidos (~30 min para a atria e ~40 min para os ventrículos).
- Acabe com a digestão girando suavemente os tecidos em uma mini centrífuga de bancada (2.000 x g a temperatura ambiente) por 3-5 s e substitua o DB sobrenante por 750 μL de Stop Buffer (SB) cada um (Tabela 1).
NOTA: Esta etapa de centrifugação é opcional para o isolamento VCM. - Incubar os tecidos pelleted na SB a temperatura ambiente por 15 minutos.
- Substitua suavemente a SB por 500-750 μL de PB cada (dependendo da densidade desejada das células finais) e tritura os tecidos (~30 vezes) usando uma pipeta Pasteur polida em chamas para dispersar as células.
NOTA: Os cardiomiócitos (CMs) estão agora prontos para estudos eletrofisiológicos e armazenados à temperatura ambiente por até 8h. - Para amostragem uniforme, pipeta suavemente as células para cima e para baixo algumas vezes para resuspend antes de adicionar uma gota delas para estudos correspondentes.
3. Dissociação de células do músculo liso vascular (VSM) de zebrafish adulto e juvenil para estudos eletrofisiológicos
- Retire arteriosus bulboso bulboso (BA) dos tecidos CV usando a mesma abordagem da etapa 2.1 e poça cinco BAs adultos em um tubo de centrífuga de 1,5 mL contendo tampão S1 (1,5 mL) (Tabela 2). No caso do zebrafish juvenil, piscina dez BAs e, para larvas com mais de 2 semanas, piscina 30-40 BAs.
NOTA: Não é praticamente viável isolar células VSM de larvas de zebrafish com menos de 2 semanas. - Substitua o S1 por 400 μL de tampão S2 (Tabela 2) e permita a digestão do papan (ver Tabela de Materiais) dos BAs em um termoshaker a 37 °C e 800 rpm por ~20 min.
- Deixe que os BAs parcialmente digeridos se acalmem por 1 min e substitua o S2 supernante por 500 μL de tampão S3 (Tabela 2) contendo colagemnase. Digerir os tecidos em um termoshaker a 37 °C e 800 rpm por 3-5 min.
- Acabe com a digestão girando suavemente os tecidos em uma mini centrífuga de bancada (2.000 x g a temperatura ambiente) por 3-5 s e substituindo s3 supernaca por 500 μL de S1.
- Triturar suavemente os tecidos pelleted (~15 vezes) para dispersar células VSM e placas em tampas de vidro de tamanho apropriado.
NOTA: O tamanho do deslizamento de tampa é determinado pelo tamanho da câmara de gravação de grampo de remendo, neste caso, foi utilizado 5 x 5 mm).- Mantenha as tampas à temperatura ambiente por 30 minutos para que as células se conectem e use-as dentro das próximas 6 horas.
4. Isolamento de corações de zebrafish embrionário para estudos eletrofisiológicos
- Adicione tricaine (150 mg/L; 1 ml por placa de Petri de 100 mm x 20 mm) a ~300 embriões (2-5 dpf), coletados de suas condições de incubação (Figura 2A).
- Concentre os embriões anestesiados transferindo-os para um tubo de centrífuga de 5 mL usando uma pipeta de transferência, removendo o excesso de mídia (E3) do tubo centrífuga (Figura 2B).
- Lave os embriões com 3 mL de tampão de perfusão frio (PB) duas vezes e resuspende em 2 mL de PB (Figura 2B).
- Usando o aparelho de isolamento cardíaco embrionário (Figura 2C), desenhe ~1 mL dos embriões na agulha da seringa e expulse-os imediatamente de volta para o tubo. Repita este processo 30 vezes, a uma taxa de 1 s por movimento de seringa (Figura 2C).
- Passe os embriões fragmentados através de uma peneira de 100 μm de células colocada em um funil e colete os corações filtrados em outro tubo de centrífuga de 5 mL. Enxágüe a seringa com 1 mL de PB e colete esta enxágue bem no tubo através da peneira (Figura 2C).
- Misture bem e separe em tubos de centrífuga de 1,5 mL, com cada tubo contendo 1 mL do conteúdo. Centrifugar todos os tubos em uma mini centrífuga de bancada por 5 s (2.000 x g a temperatura ambiente) e descartar os sobrenantes.
- Realizar a ressuspensão serial das pelotas nos tubos usando 1 mL de PB, ou seja, resuspensar a pelota em um tubo usando 1 mL de PB e usar que resuspended PB para resuspend a pelota no próximo tubo.
- Pipeta suavemente os corações duas vezes antes de adicionar uma gota deles para estudos correspondentes.
5. Estudos de grampos de correção em células cardiovasculares isoladas
NOTA: Gravações de grampo de remendo de dentro para fora e células inteiras das células isoladas podem ser obtidas como relatado anteriormente para as correntes do canalK ATP na cardiovasculatura de zebrafish9.
- Para cardiomiócitos adultos e juvenis, adicione as células dissociadas (a partir da etapa 2) diretamente à câmara de gravação da suspensão. Para células VSM, coloque o deslizamento contendo as células VSM banhadas (a partir da etapa 3) na câmara de gravação.
- Adicione corações embrionários intactos isolados (da etapa 4) à câmara da suspensão, e faça gravações de grampo de remendo dos miócitos epicáridos (Figura 2D).
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Representative Results
Os protocolos acima fornecem de forma confiável e rotineiramente miócitos cardíacos e vasculares suficientes de qualidade consistente para estudos de grampo de remendo, como recentemente relatado em estudos extensivos de canais de potássio sensíveis a ATP (KATP) em cardiovasculatura de zebrafish de tipo selvagem e mutante9. Traços representativos de gravações de tais atividades do canalK ATP de cardiomiócitos isolados são mostrados na Figura 3A-C. No caso de células isoladas de arterioso bulboso, as células musculares lisas vasculares foram confirmadas pela expressão Tg (tagln:egfp) 11,12 (Figura 1). Foram obtidas gravações de um único canal bem-sucedidas (n = 8 gravações de N = 5 preparações) em patches excisados dos corações embrionários (Figura 3D). Os potenciais de ação foram registrados a partir de miócitos ventriculares e atrial adultos isolados em células inteiras, modo de fixação atual, usando um amplificador de grampo de remendo junto com um digitalizador compatível (ver Tabela de Materiais). A solução de gravação extracelular para as medidas de potencial de ação (AP) continha NaCl (140 mM), KCl (4 mM), CaCl2 (1,8 mM), MgCl2 (1 mM), Glicose (10 mM), HEPES (10 mM) e Blebbistatin (0,01 mM, pH 7.4); a solução de gravação intracelular continha KCl (120 mM), EGTA (5 mM), K2ATP (5 mM), MgCl2 (5 mM) e HEPES (10 mM, pH 7.2). As pipetas de remendo foram retiradas do vidro soda-limão e tinham resistências de 3 a 5 MΩ quando preenchidas com solução intracelular. Os miócitos ventriculares apresentam potenciais estáveis de membrana hiperpolarizada, e os potenciais de ação foram estimulados através da injeção atual através da pipeta de remendo (Figura 3E), enquanto os miócitos atrial apresentaram potencial de disparo de ação espontânea (Figura 3F). As propriedades potenciais de ação estão resumidas na Tabela 3.
Figura 1: Isolamento das células arteriossas atrial, ventricular e bulbosa. Esquema para ilustrar o isolamento das células atrial (A), ventricular (B) e arterioso bulboso (C). As imagens que retratam cada tipo de célula isolada (inferior) têm barras de escala = 50 μm em cada caso. As células BA isoladas das linhas de zebrafish de células musculares lisas (Tg(tagln:egfp)11,12) são positivas para fluorescência verde. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Esquema para ilustrar o isolamento de corações embrionários. (A) Os embriões fertilizados são removidos do tanque de reprodução e colocados em uma placa de Petri contendo água E3 e mantidos a 28 °C por até 5 dias. (B) Na idade desejada, os embriões são anestesiados in situ usando tricaine e transferidos para PB em tubos de centrífugas de 5 mL para dissociação. (C) O aparelho de isolamento cardíaco embrionário consiste em uma seringa de 10 mL presa a uma agulha de 19 G montada acima do tubo de dissociação em um suporte de banco, permitindo que as mãos realizem a trituração. (D) Imagem do coração isolado (dia 4) anexada a uma pipeta de grampo de remendo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Gravações representativas de grampos de remendo de tecidos cardiovasculares de zebrafish isolados. (A, B) Canais KATP sensíveis a ATP de gravações de grampo de remendo excisado de dentro para fora excisados de cardiomiocócitos atrial (A) e ventricular (B) isolados de zebrafish adulto. (C) A condução do canalK ATP foi registrada a partir de fixação de células inteiras de células VSM isoladas de zebrafish adultos. (D) Atividade do canal K+ único em manchas de membrana excisadas de corações embrionários de zebrafish (4 dpf). Todas as gravações de remendo excisadas foram feitas com 140 mM KCl em ambos os lados da membrana, com potencial de membrana de -50 mV. Correntes de células inteiras foram registradas com o potencial de membrana fixado em -70 mV. (E) Exemplo de gravação de grampo atual a partir de miócito ventricular isolado. Os potenciais de ação foram estimulados pela injeção atual, como mostrado abaixo. (F) Exemplo de gravação atual do grampo de miócito atrial isolado mostrando potencial de ação espontânea de disparo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| TAMPÃO DE PERFUSÃO (PB) | 10 mM HEPES, 30 mM Taurina, 5,5 mM de glicose, 10 mM BDM. Faça a solução em soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS), ajuste o pH para 7,4 | ||
| TAMPÃO DE DIGESTÃO (DB) | PB + 12,5 μM CaCl2 + 5 mg/mL Col II + 5 mg/mL Col IV + 5 ng/mL Insulina | ||
| STOP BUFFER (SB) | PB + 10% FBS + 12,5 μM CaCl2 + 10 mg/ml BSA + 5 ng/mL Insulina | ||
Tabela 1: Soluções para isolamento de cardiomiócitos de zebrafish.
| TAMPÃO S1 | 0,1% BSA (w/v), 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM de glicose, 0,05 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, ajustado para pH 7.4 usando NaOH | ||
| TAMPÃO S2 | 2 mL S1, 4 mg Papain, 2 mg DTT | ||
| TAMPÃO S3 | 2 mL S1, 3 mg Collagenase Tipo H, 2 mg Inibidor de Trippsina, 1 mg Destaço | ||
Tabela 2: Soluções para isolamento de células VSM de zebrafish.
| Miócitos Ventriculares (n = 3 Gravações) | |||
| Vm (mV) | APA (mV) | APD50 (ms) | |
| -75,7 ± 3,9 | -119,6 ± 3,8 | 329 ± 163 | |
| Miócitos atrial (n = 3 Gravações) | |||
| Taxa AP (min-1) | MDP (mV) | APA (mV) | APD50 (ms) |
| 107,3 ± 32,6 | -71,2 ± 5.1 | 98,4 ± 4,7 | 141 ± 12 |
Tabela 3: Propriedades potenciais de ação de cardiomiócitos isolados de zebrafish. Gravado no modo de fixação atual. Dados apresentados como média ± S.D. Vm = potencial de membrana; APA = amplitude potencial de ação; APD50 = duração do potencial de ação para repolarização de 50%; MDP = potencial diastólico máximo.
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Discussion
Métodos anteriores para isolar mócitos ventricularesde zebrafish 5,6, destinados a gerar miócitos para cultura ou estudos eletrofisiológicos, forneceram células de menor rendimento e envolveram longas etapas de múltiplas centrífugas que afetaram negativamente a qualidade e a viabilidade da célula. Os protocolos descritos aqui são confiáveis, abrangem cada um dos tecidos cardiovasculares significativos (ventrículo, atria e VSM), e, principalmente, são bastante práticos para o isolamento agudo das células vivas. Abordagens de isolamento envolvendo cannulação do ventrículo através da BA13 podem ser uma alternativa sofisticada para cardiomiócitos ventriculares, mas requerem um maior grau de destreza e podem afetar negativamente o isolamento atrial. A abordagem detalhada no protocolo atual fornece uma alternativa simples e eficiente.
Considerações adicionais para o isolamento do tecido cardíaco larval são: (1) Na etapa 1.4, dependendo da idade do peixe e da ampliação disponível, os tecidos podem ser visíveis mesmo antes de remover os músculos peitorais, caso em que os tecidos podem ser diretamente "arrancados" do peixe sem cirurgia prévia, e então os tecidos não-CV podem ser removidos usando fórceps superfinais; (2) Na etapa 2.2, para larvas menores de 14 dias, os corações podem ser utilizados diretamente para estudos eletrofisiológicos sem necessidade de dissociação enzimática.
Como observado acima, e tipicamente verdadeiro dos métodos de dissociação enzimática em geral, tem se mostrado importante usar tampões frescos e enzimas todas as vezes. No entanto, o Buffer de Perfusão (PB) e o Buffer S1 podem ser preparados com antecedência e armazenados a 4-8 °C por 1 mês.
O tempo de isolamento do tecido bem sucedido não deve exceder ~90 s por peixe, e os tecidos não devem ser expostos ao ar. Quando a dissociação demora mais, a qualidade da célula (ou seja, sobrevivência) é reduzida. Ao triturar tecidos, deve-se tomar cuidado para evitar a geração de bolhas de ar, o que também reduz a qualidade celular. O isolamento celular VSM é sensível à digestão por colagem no buffer S3. Após os primeiros 3 minutos de digestão, o tubo deve ser retirado do termoshaker a cada minuto e examinado para tecidos dilatados e translúcidos flutuantes. Uma vez que a fragmentação do tecido é aparente, o passo de digestão deve ser cessado.
É importante notar que esses protocolos não são extensivamente otimizados para isolar cardiomiócitos tolerantes ao cálcio, como seria necessário para estudos de contrativismo. No entanto, como mostrado, o registro confiável de potenciais de ação cardiomiócito pode ser alcançado na presença de concentrações fisiológicas extracelulares de cálcio 7,14. Blebbistatin, incluído para desacoplar excitação e contração, e melhorar a formação de selos giga-Ohm e a eficiência de registro nesses experimentos, foi anteriormente mostrado para não afetar significativamente os parâmetros AP em corações de zebrafish intactos14. Para a eletrofisiologia, o rendimento absoluto das células também não é rotineiramente limitador de taxas. Este protocolo não foi otimizado para rendimento, como pode ser necessário para estudos bioquímicos de células isoladas. Ainda assim, o rendimento alcançado com esses métodos é bem adequado para estudos eletrofisiológicos e provavelmente múltiplas outras abordagens.
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Disclosures
Os autores não declaram interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo NIH concede HL140024 à CGN e HL150277 à CMC. As figuras 1 e figura 2 foram criadas com BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| 10 mL Syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| 19 Guage Needle | BD | 305187 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 5 mL Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | EP0030119479 | For embryonic heart isolation |
| Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer | Molecular Devices | Used for action potential recordings | |
| Benchtop Mini Centrifuge | Southern Labware | MLX-106 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | 203390 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell-Strainer Sieve | Cole-Parmer | EW-06336-71 | 100 μm sieve for embryonic heart isolation |
| Collagenase Type H | Sigma-Aldrich | C8051 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | |
| Curved Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 324626 | |
| Elastase | Worthington | LS003118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fine Forceps | Dumont | Style #5 | Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two) |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| K2ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Large Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5981 | For dissociation |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Kimble Chase | 41A2502 | Soda lime glass for patch pipettes |
| Papain | Worthington | LS003118 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5606 | 100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | For adult and juvenile zebrafish decapitation |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Super Fine Forceps | Dumont | Style #SF | For isolating larval CV tissues (Need two) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13687711 | |
| Tricaine Methanesulfonate (MS222) | For anaesthetizing zebrafish larvae | ||
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 |
References
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