Summary
Bu protokol, elektrofizyolojik çalışmalar için uygun, yetişkin, genç, larval ve embriyonik zebra balıklarından (Danio rerio) canlı kardiyak ve vasküler düz kas hücrelerinin akut izolasyonunu tanımlamaktadır.
Abstract
Zebra balığı uzun zamandır kardiyovasküler araştırmalarda model bir omurgalı organizma olarak kullanılmaktadır. Zebra balığı kardiyovasküler dokularından bireysel hücreleri izole etmenin teknik zorlukları, elektrofizyolojik özelliklerinin incelenmesinde sınırlayıcı olmuştur. Zebra balığı kalplerinin diseksiyonu ve ventriküler kardiyak miyositlerin izolasyonu için önceki yöntemler tanımlanmıştır. Bununla birlikte, zebra balığı atriyal ve vasküler miyositlerin elektrofizyolojik karakterizasyon için izolasyonu ayrıntılı olarak belirtilmemiştir. Bu çalışma, rutin olarak izole edilmiş genç ve yetişkin zebra balığı ventriküler ve atriyal kardiyomiyositlerin yanı sıra soğanlı arteriyozustan vasküler düz kas (VSM) hücreleri sağlayan, yama-kelepçe deneyleri için uygun olan yeni ve modifiye enzimatik protokolleri açıklamaktadır. Gelişimin embriyonik ve larva aşamalarında izole edilen zebra balığı kardiyovasküler dokuları üzerinde elektrofizyolojik çalışmalara dair edebi bir kanıt yoktur. Larva ve embriyonik kalplerden bireysel hücreler üzerinde yama-kelepçe deneylerine izin veren kısmi ayrışma teknikleri gösterilmiştir.
Introduction
Zebra balığı, uzun zamandır model omurgalı organizma1 olarak kullanılan ve son zamanlarda genlerin ve ilaçların yüksek verimli taranması için uygulanabilir bir omurgalı sistemi olarak öne çıkan küçük teleost balıklarıdır 2,3. Bununla birlikte, zebra balığı dokularının fizyolojik analizi iyi gelişmemiştir. Kardiyovasküler sistemde, zebra balığı kalplerinin diseksiyonu4 ve ventriküler kardiyak miyositlerin izolasyonu 5,6,7 için yöntemler tanımlanmıştır. Atriyal miyositlerin etkili izolasyonunun birkaç ayrıntılı açıklaması vardır ve yama-kelepçe çalışmaları için vasküler düz kas (VSM) preparatları bildirilmemiştir.
Mevcut çalışma, elektrofizyolojik ve fonksiyonel çalışmalar için uygun olan zebra balığı kardiyak ve vasküler miyositlerinin izolasyonu için metodolojiyi açıklamaktadır. Bu yaklaşım, zebra balığı ventriküler miyosit izolasyonu 5,6 için daha önce bildirilen protokollerin modifikasyonlarını içerir ve zebra balığı vasküler düz kas hücrelerinin soğanlı arteriyozustan (BA) izole edilmesine izin veren memeli VSM hücre izolasyonlarından8 yöntemleri uyarlar. Protokoller, zebra balığından izole atriyal, ventriküler ve VSM hücrelerinin verimli bir şekilde elde edilmesini sağlar ve bu da yama kelepçesi çalışmalarında 8 saate kadar9 saate kadar güvenilir bir şekilde kullanılabilir.
Tamamen ebeveyn organizmanın dışında gelişen neredeyse şeffaf larvalarına rağmen, kardiyovasküler gelişimi incelemede vaat edilen ontogenetik potansiyellerini keşfetmek, genç yaşta dokuların çıkarılması ve analiz edilmesindeki zorluklarla sınırlandırılmıştır. Mevcut makale, uyarlanmış, yayınlanmış bir ekstraksiyon yöntemi10 kullanarak, döllenmeden 3 gün sonra (dpf) izole edilen zebra balığı kalpleri üzerinde yama kelepçesi deneylerini göstererek bu sınırlamayı ele almaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm zebra balıkları (hem erkek hem de dişi vahşi tip AB suşu), Washington Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi'nin (IACUC) yönergelerini izleyerek deneyler için yetiştirildi, muhafaza edildi ve ele alındı.
1. Atriyum, ventrikül ve soğanlı arteriyozusun yetişkin, genç ve larva zebra balıklarından izolasyonu
- Balıkları soğuk şok kullanarak, yani ~ 10 s için 4 ° C suya batırarak ötenazileştirin.
- Kavisli forseps kullanarak, balıkları kısmen Perfüzyon Tamponu (PB) ile doldurulmuş büyük bir Petri kabına aktarın (Tablo 1) ve diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin.
- Bir çift makas kullanarak balığın gözlerinin hemen arkasından kafasını kesin.
- Kavisli forseps (larva balıkları için ince forseps) kullanarak, ventral tarafı diseksiyon kapsamına bakacak şekilde balığı baskın olmayan elinizde tutun. Baskın eldeki ikinci çift ince forseps (veya larva balıkları için süper ince) ile, kardiyovasküler (CV) dokuları (atriyum, ventrikül ve soğanlı arteriyozus, BA) ortaya çıkarmak için pektoral kasları ve yüzgeçleri yavaşça yırtın (Şekil 1).
- İnce forsepsleri baskın ele yerleştirerek, BA'yı BA ve ventral aortun kesişen ucuna yavaşça çekin.
NOT: BA ve kalp vücut boşluğundan çıkacaktır.- Forsepsleri sıkıştırarak ve birden fazla venöz dalın birleştiği atriyum ucunu (sinüs venozusu) bularak BA'yı aorttan dikkatlice ayırın. İnce forsepsleri kullanarak, atriyumun ucunu sinüs venozusundan 'koparın'. Bu, CV dokularını vücudun geri kalanından izole eder (Şekil 1).
2. Elektrofizyolojik çalışmalar için kardiyomiyositlerin yetişkin, genç ve larva zebra balıklarından ayrılması
- İnce forsepsleri kullanarak, atriyumu ve ventrikülü önceki adımda izole edilen CV dokusundan 'koparın'.
NOT: İşlem, her bir dokunun minimum çapraz kontaminasyonla temiz diseksiyonuna izin verir ve bir ağaçtan meyve koparmaya benzer hissettirir.- Fazla kanı boşaltmak için ince forseps kullanarak ventriküle nazik bir yırtılma yapın, bu da kalp dokusu soluk somon rengini parlak kırmızıdan çevirdiğinde sağlanabilir.
- İzole edilmiş atriyum ve ventrikülü Perfüzyon Tamponu (PB; 1.5 mL) içeren ayrı 1.5 mL santrifüj tüplerinde havuzlayın.
NOT: Yetişkin zebra balığı atriyal kardiyomiyositlerinin (ACM'ler) ve ventriküler kardiyomiyositlerin (VCM'ler) başarılı bir şekilde ayrışmasını garanti etmek için, tipik olarak dört atriyum ve üç ventrikül gereklidir. Genç zebra balığı durumunda (28-90 gün), bu sayı iki katına çıkar.- Larva zebra balığı durumunda (14-28 gün), ~ 30 larvadan mümkün olduğunca fazla doku toplayın.
- Tüplerdeki PB'yi her biri 750 μL Sindirim Tamponu (DB) (Tablo 1) ile değiştirin ve tüpleri 37 ° C ve 800 rpm'de bir termoshaker üzerine yerleştirin. Dokuların yarı saydam hale gelene kadar sindirimine izin verin (atriyum için ~ 30 dakika ve ventriküller için ~ 40 dakika).
- Masaüstü mini santrifüjdeki (ortam sıcaklığında 2.000 x g) dokuları 3-5 s boyunca hafifçe döndürerek sindirimi sonlandırın ve süpernatant DB'yi her biri 750 μL Durdurma Tamponu (SB) ile değiştirin (Tablo 1).
NOT: Bu santrifüjleme adımı, VCM yalıtımı için isteğe bağlıdır. - SB'deki pelet dokuları ortam sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
- SB'yi nazikçe her biri 500-750 μL PB ile değiştirin (son hücrelerin istenen yoğunluğuna bağlı olarak) ve hücreleri dağıtmak için alevle parlatılmış bir Pasteur pipet kullanarak dokuları (~ 30 kez) tritüre edin.
NOT: Kardiyomiyositler (CM'ler) artık elektrofizyolojik çalışmalara hazırdır ve oda sıcaklığında 8 saate kadar saklanmaktadır. - Tek tip örnekleme için, ilgili çalışmalar için bir damla eklemeden önce hücreleri birkaç kez yukarı ve aşağı doğru hafifçe pipetleyin.
3. Elektrofizyolojik çalışmalar için yetişkin ve genç zebra balıklarından vasküler düz kas (VSM) hücrelerinin ayrışması
- Soğanlı arteriyozusu (BA) CV dokularından adım 2.1 ile aynı yaklaşımı kullanarak kesin ve beş yetişkin BA'yı S1 tamponu (1.5 mL) içeren 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpünde bir havuza koyun (Tablo 2). Yavru zebra balığı durumunda, on BA'yı havuzlayın ve 2 haftadan eski larvalar için 30-40 BA'yı havuzlayın.
NOT: VSM hücrelerini 2 haftadan küçük zebra balığı larvalarından izole etmek pratik olarak mümkün değildir. - S1'i 400 μL S2 tamponu ile değiştirin (Tablo 2) ve BA'ların bir termoshaker üzerinde ~ 20 dakika boyunca 37 ° C ve 800 rpm'de papain ( Malzeme Tablosuna bakınız) sindirimine izin verin.
- Kısmen sindirilmiş BA'ların 1 dakika boyunca yerleşmesine izin verin ve süpernatant S2'yi kollajenaz içeren 500 μL S3 tamponu ile değiştirin (Tablo 2). Dokuları bir termoshaker üzerinde 37 ° C'de ve 800 rpm'de 3-5 dakika boyunca sindirin.
- Masaüstü mini santrifüjdeki dokuları 3-5 s boyunca hafifçe aşağı doğru döndürerek (ortam sıcaklığında 2.000 x g) ve süpernatant S3'ü 500 μL S1 ile değiştirerek sindirimi sonlandırın.
- VSM hücrelerini ve plakayı uygun boyuttaki cam kapaklara dağıtmak için peletlenmiş dokuları (~ 15 kez) nazikçe tritürleştirin.
NOT: Kapak kaydırma boyutu, yama kelepçeli kayıt odasının boyutuna göre belirlenir, bu durumda 5 x 5 mm kullanılmıştır).- Hücrelerin sonraki 6 saat içinde takılması ve kullanılması için kapak fişlerini 30 dakika oda sıcaklığında tutun.
4. Elektrofizyolojik çalışmalar için embriyonik zebra balıklarından kalplerin izolasyonu
- Kuluçka koşullarından toplanan ~300 embriyoya (2-5 dpf) trikain (150 mg / L; 100 mm x 20 mm Petri kabı başına 1 ml) ekleyin (Şekil 2A).
- Anestezi uygulanan embriyoları, bir transfer pipeti kullanarak 5 mL'lik bir santrifüj tüpüne transfer ederek, fazla medyayı (E3) santrifüj tüpünden çıkararak konsantre edin (Şekil 2B).
- Embriyoları 3 mL soğuk Perfüzyon Tamponu (PB) ile iki kez yıkayın ve 2 mL PB'de tekrar askıya alın (Şekil 2B).
- Embriyonik kalp izolasyon aparatını kullanarak (Şekil 2C), embriyoların ~ 1 mL'sini şırınga iğnesine çekin ve hemen tüpe geri atın. Bu işlemi şırınga hareketi başına 1 s oranında 30 kez tekrarlayın (Şekil 2C).
- Parçalanmış embriyoları bir huni içine yerleştirilmiş 100 μm hücre süzgeci eleğinden geçirin ve filtrelenmiş kalpleri başka bir 5 mL santrifüj tüpünde toplayın. Şırıngayı 1 mL PB ile durulayın ve bu durulamayı da elek yoluyla tüpe toplayın (Şekil 2C).
- İyice karıştırın ve 1,5 mL santrifüj tüplerine ayırın, her tüp 1 mL içerik içerir. Tüm tüpleri tezgah üstü mini santrifüjde 5 s (ortam sıcaklığında 2.000 x g) santrifüj yapın ve süpernatantları atın.
- 1 mL PB kullanarak tüplerdeki peletlerin seri olarak yeniden süspansiyonunu gerçekleştirin, yani 1 mL PB kullanarak peleti bir tüpte yeniden askıya alın ve bir sonraki tüpteki peleti yeniden askıya almak için bu yeniden askıya alınmış PB'yi kullanın.
- İlgili çalışmalar için bir damla eklemeden önce kalpleri iki kez yukarı ve aşağı doğru hafifçe pipetleyin.
5. İzole kardiyovasküler hücreler üzerinde yama-kelepçe çalışmaları
NOT: Zebra balığı kardiyovasküler9'daki KATP kanal akımları için daha önce bildirildiği gibi, izole hücrelerden içten dışa ve tüm hücre yama kelepçesi kayıtları elde edilebilir.
- Yetişkin ve genç kardiyomiyositler için, ayrışmış hücreleri (adım 2'den) doğrudan süspansiyondan kayıt odasına ekleyin. VSM hücreleri için, kaplanmış VSM hücrelerini içeren kapak fişini (adım 3'ten itibaren) kayıt odasına yerleştirin.
- İzole edilmiş bozulmamış embriyonik kalpleri (adım 4'ten itibaren) süspansiyondan odaya ekleyin ve epikardiyal miyositlerden yama kelepçeli kayıtlar yapın (Şekil 2D).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıdaki protokoller, vahşi tip ve mutant zebra balığı kardiyovaskülatür9'da ATP'ye duyarlı potasyum (KATP) kanallarının kapsamlı çalışmalarında yakın zamanda bildirildiği gibi, yama-kelepçe çalışmaları için uygun tutarlı kalitede yeterli kardiyak ve vasküler miyositleri güvenilir ve rutin olarak sağlar. İzole kardiyomiyositlerden bu tür KATP kanal aktivitesinin kayıtlarının temsili izleri Şekil 3A-C'de gösterilmiştir. Soğanlı arteriyozustan izole edilen hücrelerde, vasküler düz kas hücreleri Tg(tagln:egfp) ekspresyonu11,12 ile doğrulandı (Şekil 1). Embriyonik kalplerden eksize edilen yamalarda başarılı tek kanallı kayıtlar (n = N = 5 preparattan 8 kayıt) elde edildi (Şekil 3D). İzole yetişkin zebra balığı ventriküler ve atriyal miyositlerden aksiyon potansiyelleri, uyumlu bir sayısallaştırıcı ile birlikte bir yama kelepçeli amplifikatör kullanılarak tüm hücreli, akım kelepçesi modunda kaydedildi (bkz. Aksiyon potansiyeli (AP) ölçümleri için hücre dışı kayıt çözeltisi NaCl (140 mM), KCl (4 mM), CaCl 2 (1.8 mM), MgCl2 (1 mM), Glikoz (10 mM), HEPES (10 mM) ve Blebbistatin (0.01 mM, pH 7.4); hücre içi kayıt çözeltisi KCl (120 mM), EGTA (5 mM), K 2 ATP (5 mM), MgCl 2 (5 mM) ve HEPES (10 mM, pH7.2) içeriyordu. Patch pipetler soda-kireç camından çekildi ve hücre içi çözelti ile doldurulduğunda 3 - 5 MΩ dirençlere sahipti. Ventriküler miyositler stabil hiperpolarize membran potansiyelleri sergiler ve aksiyon potansiyelleri yama pipeti yoluyla akım enjeksiyonu yoluyla uyarılırken (Şekil 3E), atriyal miyositler spontan aksiyon potansiyeli ateşlemesi sergilemiştir (Şekil 3F). Eylem potansiyeli özellikleri Tablo 3'te özetlenmiştir.
Şekil 1: Atriyal, ventriküler ve soğanlı arteriyozus hücrelerinin izolasyonu. Atriyal (A), ventriküler (B) ve soğanlı arteriyozus (C) hücrelerinin izolasyonunu göstermek için şematik. Her izole hücre tipini (altta) gösteren resimler, her durumda ölçek çubuklarına = 50 μm'ye sahiptir. Düz kas hücresi transgenik muhabir zebra balığı çizgilerinden izole edilen BA hücreleri (Tg (tagln: egfp) 11,12) yeşil floresan için pozitiftir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Embriyonik kalplerin izolasyonunu göstermek için şematik. (A) Döllenmiş embriyolar üreme tankından çıkarılır ve E3 suyu içeren bir Petri kabına yerleştirilir ve 5 güne kadar 28 ° C'de tutulur. (B) İstenilen yaşta, embriyolar trikain kullanılarak in situ olarak uyuşturulur ve ayrışma için 5 mL santrifüj tüplerinde PB'ye transfer edilir. (C) Embriyonik kalp izolasyon aparatı, bir tezgah standındaki ayrışma tüpünün üzerine monte edilmiş 19 G'lik bir iğneye bağlı 10 mL'lik bir şırıngadan oluşur ve ellerin tritürasyonu gerçekleştirmesine izin verir. (D) Bir yama kelepçeli pipete bağlı izole kalbin görüntüsü (4. gün). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İzole zebra balığı kardiyovasküler dokularından temsili yama-kelepçe kayıtları. (A, B) yetişkin zebra balıklarından izole edilen atriyal (A) ve ventriküler (B) kardiyomiyositlerin içten dışa eksize edilmiş yama kelepçeli kayıtlarından ATP'ye duyarlı KATP kanalları. (C) KATP kanal iletkenliği, yetişkin zebra balığından izole edilen VSM hücrelerinin tüm hücre yama kelepçelenmesinden kaydedildi. (D) Zebra balığı embriyonik kalplerinden eksize edilen membran yamalarındaki tek K+ kanal aktivitesi (4 dpf). Tüm eksize edilmiş yama kayıtları, membranın her iki tarafında -50 mV membran potansiyelinde 140 mM KCl ile yapılmıştır. Tüm hücre akımları, membran potansiyeli -70 mV'ta kenetlenerek kaydedildi. (E) İzole ventriküler miyositten örnek akım-kelepçe kaydı. Aksiyon potansiyelleri aşağıda gösterildiği gibi akım enjeksiyonu ile uyarıldı. (F) İzole atriyal miyositten spontan aksiyon potansiyeli ateşlemeyi gösteren örnek akım-kelepçe kaydı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| PERFÜZYON TAMPONU (PB) | 10 mM HEPES, 30 mM Taurin, 5.5 mM Glikoz, 10 mM BDM. Çözeltiyi fosfat tamponlu salin (PBS) içinde yapın, pH'ı 7.4'e ayarlayın | ||
| SINDIRIM TAMPONU (DB) | PB + 12.5 μM CaCl2 + 5 mg/mL Kol II + 5 mg/mL Kol IV + 5 ng/mL İnsülin | ||
| DURDURMA ARABELLEĞI (SB) | PB + %10 FBS + 12.5 μM CaCl2 + 10 mg/ml BSA + 5 ng/mL İnsülin | ||
Tablo 1: Zebra balığı kardiyomiyositlerinin izolasyonu için çözümler.
| S1 ARABELLEK | %0,1 BSA (w/v), 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM Glikoz, 0,05 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, NaOH kullanılarak pH7,4'e ayarlanmıştır | ||
| S2 ARABELLEK | 2 mL S1, 4 mg Papain, 2 mg DTT | ||
| S3 ARABELLEK | 2 mL S1, 3 mg Kollajenaz Tip H, 2 mg Tripsin İnhibitörü, 1 mg Elastaz | ||
Tablo 2: Zebra balığı VSM hücrelerinin izolasyonu için çözümler.
| Ventriküler Miyositler (n = 3 Kayıt) | |||
| Vm (mV) | APA (mV) | APD50 (ms) | |
| -75.7 ± 3.9 | -119,6 ± 3,8 | 329 ± 163 | |
| Atriyal Miyositler (n = 3 Kayıt) | |||
| AP Hızı (min-1) | MDP (mV) | APA (mV) | APD50 (ms) |
| 107,3 ± 32,6 | -71.2 ± 5.1 | 98,4 ± 4,7 | 141 ± 12 |
Tablo 3: İzole zebra balığı kardiyomiyositlerinden kaynaklanan aksiyon potansiyeli özellikleri. Geçerli kelepçe modunda kaydedilir. Ortalama ± S.D. Vm = membran potansiyeli olarak gösterilen veriler; APA = aksiyon potansiyeli genliği; APD50 = %50 repolarizasyona kadar aksiyon potansiyeli süresi; MDP = maksimum diyastolik potansiyel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Zebra balığı ventrikülermiyositleri izole etmek için önceki yöntemler, kültür veya elektrofizyolojik çalışmalar için miyositler üretmeyi amaçlayan, daha düşük verime sahip hücreler sağladı ve hücre kalitesini ve canlılığını olumsuz yönde etkileyen çoklu santrifüjlemelerin uzun adımlarını içeriyordu. Burada açıklanan protokoller güvenilirdir, önemli kardiyovasküler dokuların (ventrikül, atriyum ve VSM) her birini kapsar ve daha da önemlisi canlı hücrelerin akut izolasyonu için oldukça pratiktir. Ventrikülün BA13 yoluyla kanülasyonunu içeren izolasyon yaklaşımları, ventriküler kardiyomiyositler için sofistike bir alternatif olabilir, ancak daha yüksek derecede el becerisi gerektirir ve atriyal izolasyonu olumsuz yönde etkileyebilir. Mevcut protokolde ayrıntılı olarak açıklanan yaklaşım, basit ve verimli bir alternatif sunmaktadır.
Larva kalp dokusu izolasyonu için ek hususlar şunlardır: (1) Adım 1.4'te, balığın yaşına ve mevcut büyütmeye bağlı olarak, dokular pektoral kasları çıkarmadan önce bile görülebilir, bu durumda dokular önceden ameliyat olmadan doğrudan balıktan "koparılabilir" ve daha sonra CV olmayan dokular süper ince forseps kullanılarak çıkarılabilir; (2) Adım 2.2'de, 14 günden küçük larvalar için, kalpler enzimatik ayrışmaya gerek kalmadan doğrudan elektrofizyolojik çalışmalar için kullanılabilir.
Yukarıda belirtildiği gibi ve tipik olarak enzimatik ayrışma yöntemleri için genel olarak geçerli olduğu gibi, her seferinde taze tamponlar ve enzimler kullanmanın önemli olduğu kanıtlanmıştır. Ancak Perfüzyon Tamponu (PB) ve S1 Tamponu önceden hazırlanarak 4-8 °C'de 1 ay saklanabilir.
Başarılı doku izolasyon süresi balık başına ~ 90 s'yi geçmemeli ve dokular havaya maruz bırakılmamalıdır. Ayrışma daha uzun sürdüğünde, hücre kalitesi (yani hayatta kalma) azalır. Dokuları tritüre ederken, hücre kalitesini de düşüren hava kabarcıkları oluşmasını önlemek için özen gösterilmelidir. VSM hücre izolasyonu, S3 tamponunda kollajenaz ile sindirime duyarlıdır. Sindirimin ilk 3 dakikasından sonra, tüp her dakika termoshaker'dan çıkarılmalı ve yüzen genişlemiş ve yarı saydam dokular için incelenmelidir. Doku parçalanması belirgin olduğunda, sindirim adımı durdurulmalıdır.
Bu protokollerin, kasılma çalışmaları için gerekli olduğu gibi, kalsiyuma toleranslı kardiyomiyositleri izole etmek için kapsamlı bir şekilde optimize edilmediğine dikkat etmek önemlidir. Bununla birlikte, gösterildiği gibi, kardiyomiyosit aksiyon potansiyellerinin güvenilir bir şekilde kaydedilmesi, fizyolojik hücre dışı kalsiyum konsantrasyonlarının varlığında elde edilebilir 7,14. Uyarılma ve kasılmayı ayırmak ve bu deneylerde giga-Ohm conta oluşumunu ve kayıt verimliliğini artırmak için dahil edilen blebbistatin'in, daha önce bozulmamış zebra balığı kalplerindeki AP parametrelerini önemli ölçüde etkilemediği gösterilmiştir14. Elektrofizyoloji için, hücrelerin mutlak verimi de rutin olarak hız sınırlayıcı değildir. Bu protokol, izole hücrelerin biyokimyasal çalışmaları için gerekli olabileceği gibi, verim için optimize edilmemiştir. Yine de, bu yöntemlerle elde edilen verim, elektrofizyolojik çalışmalar ve muhtemelen diğer birçok yaklaşım için çok uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar rakip finansal çıkarlar olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma, NIH'nin CGN'ye HL140024 ve CMC'ye HL150277 hibeleri ile desteklenmiştir. Şekil 1 ve Şekil 2, BioRender.com ile oluşturulmuştur.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| 10 mL Syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| 19 Guage Needle | BD | 305187 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 5 mL Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | EP0030119479 | For embryonic heart isolation |
| Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer | Molecular Devices | Used for action potential recordings | |
| Benchtop Mini Centrifuge | Southern Labware | MLX-106 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | 203390 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell-Strainer Sieve | Cole-Parmer | EW-06336-71 | 100 μm sieve for embryonic heart isolation |
| Collagenase Type H | Sigma-Aldrich | C8051 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | |
| Curved Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 324626 | |
| Elastase | Worthington | LS003118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fine Forceps | Dumont | Style #5 | Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two) |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| K2ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Large Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5981 | For dissociation |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Kimble Chase | 41A2502 | Soda lime glass for patch pipettes |
| Papain | Worthington | LS003118 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5606 | 100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | For adult and juvenile zebrafish decapitation |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Super Fine Forceps | Dumont | Style #SF | For isolating larval CV tissues (Need two) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13687711 | |
| Tricaine Methanesulfonate (MS222) | For anaesthetizing zebrafish larvae | ||
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 |
References
- Vascotto, S. G., Beckham, Y., Kelly, G. M. The zebrafish's swim to fame as an experimental model in biology. Biochemistry and Cell Biology. 75 (5), 479-485 (1997).
- Love, D. R., Pichler, F. B., Dodd, A., Copp, B. R., Greenwood, D. R. Technology for high-throughput screens: The present and future using zebrafish. Current Opinion in Biotechnology. 15 (6), 564-571 (2004).
- Keßler, M., Rottbauer, W., Just, S. Recent progress in the use of zebrafish for novel cardiac drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 10 (11), 1231-1241 (2015).
- Singleman, C., Holtzman, N. G. Heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (55), e3165 (2011).
- Brette, F., et al. Characterization of isolated ventricular myocytes from adult zebrafish (Danio rerio). Biochemical and Biophysical Research Communications. 374 (1), 143-146 (2008).
- Sander, V., Sune, G., Jopling, C., Morera, C., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and in vitro culture of primary cardiomyocytes from adult zebrafish hearts. Nature protocol. 8, 800-809 (2013).
- Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).
- Huang, Y., et al. Cardiovascular consequences of KATP overactivity in Cantu syndrome. JCI insight. 3 (15), 137799 (2018).
- Singareddy, S. S., et al. ATP-sensitive potassium channels in zebrafish cardiac and vascular smooth muscle. The Journal of Physiology. , (2021).
- Burns, C. G., MacRae, C. A. Purification of hearts from zebrafish embryos. BioTechniques. 40 (3), 274-282 (2006).
- Seiler, C., Abrams, J., Pack, M. Characterization of zebrafish intestinal smooth muscle development using a novel sm22α-b promoter. Developmental Dynamics. 239, 2806-2812 (2010).
- Yang, X. Y., et al. Whole amount in situ hybridization and transgene via microinjection in zebrafish. Shi Yan Sheng Wu Xue Bao. 36 (3), 243-247 (2003).
- Kompella, S. N., Brette, F., Hancox, J. C., Shiels, H. A. Phenanthrene impacts zebrafish cardiomyocyte excitability by inhibiting IKr and shortening action potential duration. The Journal of General Physiology. 153 (2), 202012733 (2021).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cellular Physiology and Biochemistry. 25 (4-5), 419-424 (2010).
