Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die akute Isolierung lebensfähiger kardialer und vaskulärer glatter Muskelzellen aus adulten, juvenilen, larven und embryonalen Zebrafischen (Danio rerio), die für elektrophysiologische Untersuchungen geeignet sind.
Abstract
Zebrafische werden seit langem als Modell-Wirbeltierorganismus in der Herz-Kreislauf-Forschung eingesetzt. Die technischen Schwierigkeiten, einzelne Zellen aus dem kardiovaskulären Gewebe des Zebrafischs zu isolieren, schränkten die Untersuchung ihrer elektrophysiologischen Eigenschaften ein. Frühere Methoden wurden für die Dissektion von Zebrafischherzen und die Isolierung von ventrikulären Herzmyozyten beschrieben. Die Isolierung von Zebrafisch-Vorhof- und Gefäßmyozyten zur elektrophysiologischen Charakterisierung war jedoch nicht detailliert. Diese Arbeit beschreibt neue und modifizierte enzymatische Protokolle, die routinemäßig isolierte juvenile und adulte Zebrafisch-Ventrikel- und Vorhof-Kardiomyozyten sowie vaskuläre glatte Muskelzellen (VSM) aus dem bauchigen Arteriosus bereitstellen, die für Patch-Clamp-Experimente geeignet sind. Es gibt keine literarischen Beweise für elektrophysiologische Studien an kardiovaskulärem Gewebe von Zebrafischen, die in embryonalen und larven Entwicklungsstadien isoliert wurden. Partielle Dissoziationstechniken, die Patch-Clamp-Experimente an einzelnen Zellen aus Larven- und embryonalen Herzen ermöglichen, werden demonstriert.
Introduction
Zebrafische sind kleine Teleostfische, die seit langem als Modell-Wirbeltierorganismus1 verwendet werden und in jüngster Zeit als lebensfähiges Wirbeltiersystem für das Hochdurchsatz-Screening von Genen und Medikamenten bekannt gewordensind 2,3. Die physiologische Analyse von Zebrafischgeweben ist jedoch nicht gut entwickelt. Im kardiovaskulären System wurden Methoden zur Dissektion von Zebrafischherzen4 und zur Isolierung von ventrikulären kardialen Myozyten 5,6,7 beschrieben. Es gibt nur wenige detaillierte Beschreibungen der effektiven Isolierung von Vorhofmyozyten und keine Berichte über Präparate der glatten Vaskulärmuskulatur (VSM) für Patch-Clamp-Studien.
Die aktuelle Arbeit beschreibt Methoden zur Isolierung von Herz- und Gefäßmyozyten von Zebrafischen, die für elektrophysiologische und funktionelle Studien geeignet sind. Dieser Ansatz umfasst Modifikationen der zuvor berichteten Protokolle für die ventrikuläre Myozytenisolierung von Zebrafischen5,6 und adaptiert Methoden aus VSM-Zellisolierungen von Säugetieren8, wodurch die Isolierung von glatten Zebrafisch-Gefäßmuskelzellen aus dem bauchigen Arteriosus (BA) ermöglicht wird. Die Protokolle führen zu effizienten Ausbeuten von isolierten atrialen, ventrikulären und VSM-Zellen aus Zebrafischen, die zuverlässig in Patch-Clamp-Studien für bis zu 8 h9 verwendet werden können.
Trotz ihrer nahezu transparenten Larven, die sich vollständig außerhalb des elterlichen Organismus entwickeln, war die Erforschung ihres versprochenen ontogenetischen Potenzials bei der Untersuchung der kardiovaskulären Entwicklung durch Herausforderungen bei der Extraktion und Analyse von Geweben in jungen Jahren begrenzt. Der aktuelle Artikel befasst sich mit dieser Einschränkung, indem er Patch-Clamp-Experimente an Zebrafischherzen demonstriert, die bereits 3 Tage nach der Befruchtung (dpf) unter Verwendung einer angepassten, veröffentlichten Extraktionsmethode isoliert wurden10.
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Protocol
Alle Zebrafische (Wildtypstamm AB, sowohl männlich als auch weiblich) wurden gemäß den Richtlinien des Washington University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aufgezogen, gepflegt und für die Experimente behandelt.
1. Isolierung von Vorhof, Ventrikel und knolligem Arteriosus aus adulten, juvenilen und larven Zebrafischen
- Euthanasieren Sie Fische mit Kälteschock, d.h. durch Eintauchen in 4 °C warmes Wasser, für ~10 s.
- Mit einer gebogenen Pinzette Fische in eine große Petrischale geben, die teilweise mit Perfusionspuffer (PB) gefüllt ist (Tabelle 1) und unter ein Seziermikroskop legen.
- Enthaupten Sie den Fisch nur hinter den Augen mit einer Schere.
- Halten Sie den Fisch mit gebogenen Pinzetten (feine Pinzetten für Larvenfische) in der nicht dominanten Hand, wobei die ventrale Seite dem Sezierbereich zugewandt ist. Mit der zweiten feinen Pinzette (oder superfein für Larvenfische) in der dominanten Hand die Brustmuskeln und Flossen vorsichtig aufreißen, um das kardiovaskuläre (CV) Gewebe (Atrium, Ventrikel und knolliger Arteriosus, BA) freizulegen (Abbildung 1).
- Legen Sie die feine Pinzette in die dominante Hand und ziehen Sie die BA vorsichtig an der sich kreuzenden Spitze der BA und der ventralen Aorta.
HINWEIS: Der BA und das Herz kommen aus der Körperhöhle.- Trennen Sie die BA vorsichtig von der Aorta, indem Sie die Pinzette kneifen und die Spitze des Vorhofs lokalisieren, in die mehrere Venenäste zusammenlaufen (Sinus venosus). Mit der feinen Pinzette "zupfen" Sie die Spitze des Vorhofs vom Sinus venosus. Dadurch werden die CV-Gewebe vom Rest des Körpers isoliert (Abbildung 1).
2. Dissoziation von Kardiomyozyten aus adulten, juvenilen und larven Zebrafischen für elektrophysiologische Studien
- Mit der feinen Pinzette "zupfen" Sie den Vorhof und den Ventrikel aus dem CV-Gewebe, das im vorherigen Schritt isoliert wurde.
HINWEIS: Der Prozess ermöglicht eine saubere Dissektion jedes Gewebes mit minimaler Kreuzkontamination und fühlt sich an wie das Pflücken von Früchten von einem Baum.- Machen Sie einen sanften Riss in den Ventrikel mit feiner Pinzette, um überschüssiges Blut abzulassen, was sichergestellt werden kann, wenn das Herzgewebe blasse Lachsfarbe von leuchtend rot wird.
- Poolen Sie den isolierten Vorhof und den Ventrikel in separate 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen mit Perfusionspuffer (PB; 1,5 ml).
HINWEIS: Um eine erfolgreiche Dissoziation von adulten Zebrafisch-Vorhof-Kardiomyozyten (ACMs) und ventrikulären Kardiomyozyten (VCMs) zu gewährleisten, werden typischerweise vier Vorhöfe und drei Ventrikel benötigt. Bei jungen Zebrafischen (28-90 Tage) verdoppelt sich diese Zahl.- Im Falle von Larven Zebrafische (14-28 Tage), sammeln Sie so viel Gewebe wie möglich von ~ 30 Larven.
- Ersetzen Sie die PB in den Röhrchen durch je 750 μL Aufschlusspuffer (DB) (Tabelle 1) und legen Sie die Röhrchen bei 37 °C und 800 U/min auf einen Thermoshaker. Lassen Sie die Verdauung der Gewebe zu, bis sie durchscheinend werden (~ 30 min für die Vorhöfe und ~ 40 min für die Ventrikel).
- Beenden Sie die Verdauung, indem Sie das Gewebe in einer Minizentrifuge (2.000 x g bei Umgebungstemperatur) für 3-5 s vorsichtig herunterdrehen und den überstehenden DB durch jeweils 750 μL Stopping Buffer (SB) ersetzen (Tabelle 1).
HINWEIS: Dieser Zentrifugationsschritt ist optional für die VCM-Isolierung. - Inkubieren Sie das pelletierte Gewebe im SB bei Umgebungstemperatur für 15 min.
- Ersetzen Sie den SB vorsichtig durch jeweils 500-750 μL PB (abhängig von der gewünschten Dichte der fertigen Zellen) und trituieren Sie das Gewebe (~30 mal) mit einer flammpolierten Pasteur-Pipette, um die Zellen zu dispergieren.
HINWEIS: Die Kardiomyozyten (CMs) sind nun bereit für elektrophysiologische Untersuchungen und werden bis zu 8 h bei Raumtemperatur gelagert. - Für eine gleichmäßige Probenahme pipetten Sie die Zellen einige Male vorsichtig auf und ab, um sie zu resuspendieren, bevor Sie einen Tropfen von ihnen für entsprechende Studien hinzufügen.
3. Dissoziation von Zellen der glatten vaskulären Muskulatur (VSM) aus adulten und juvenilen Zebrafischen für elektrophysiologische Studien
- Zupfen Sie den knolligen Arteriosus (BA) aus dem CV-Gewebe mit dem gleichen Ansatz wie Schritt 2.1 und poolen Sie fünf adulte BAs in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen mit S1-Puffer (1,5 ml) (Tabelle 2). Bei jungen Zebrafischen Pool zehn BAs und bei Larven, die älter als 2 Wochen sind, Pool 30-40 BAs.
HINWEIS: Es ist praktisch nicht möglich, VSM-Zellen aus Zebrafischlarven zu isolieren, die jünger als 2 Wochen sind. - Ersetzen Sie S1 durch 400 μL S2-Puffer (Tabelle 2) und lassen Sie Papain (siehe Materialtabelle) die BAs auf einem Thermoshaker bei 37 °C und 800 U/min für ~20 min aufschlussen.
- Lassen Sie die teilweise verdauten BAs für 1 min absetzen und ersetzen Sie den Überstand S2 durch 500 μL S3-Puffer (Tabelle 2), der Kollagenase enthält. Verdauen Sie die Tücher auf einem Thermoshaker bei 37 °C und 800 U/min für 3-5 min.
- Beenden Sie die Verdauung, indem Sie das Gewebe in einer Minizentrifuge (2.000 x g bei Umgebungstemperatur) für 3-5 s vorsichtig herunterdrehen und den Überstand S3 durch 500 μL S1 ersetzen.
- Trituieren Sie die pelletierten Gewebe vorsichtig (~ 15 mal), um VSM-Zellen zu dispergieren und auf Glasdeckgläser geeigneter Größe zu legen.
HINWEIS: Die Deckglasgröße wird durch die Größe der Patch-Clamp-Aufnahmekammer bestimmt, in diesem Fall wurden 5 x 5 mm verwendet).- Bewahren Sie die Deckgläser 30 Minuten bei Raumtemperatur auf, damit die Zellen sie anbringen können, und verwenden Sie sie innerhalb der nächsten 6 Stunden.
4. Isolierung von Herzen aus embryonalen Zebrafischen für elektrophysiologische Untersuchungen
- Fügen Sie Tricain (150 mg/L; 1 ml pro 100 mm x 20 mm Petrischale) zu ~300 Embryonen (2-5 dpf) hinzu, die aus ihren Inkubationsbedingungen gewonnen wurden (Abbildung 2A).
- Die anästhesierten Embryonen werden konzentriert, indem Sie sie mit einer Transferpipette in ein 5-ml-Zentrifugenröhrchen überführen und überschüssiges Medium (E3) aus dem Zentrifugenröhrchen entfernen (Abbildung 2B).
- Die Embryonen werden zweimal mit 3 ml kaltem Perfusionspuffer (PB) gewaschen und in 2 ml PB resuspendiert (Abbildung 2B).
- Mit dem embryonalen Herzisolierungsapparat (Abbildung 2C) ~1 ml der Embryonen in die Spritzennadel ziehen und sofort wieder in das Röhrchen ausstoßen. Wiederholen Sie diesen Vorgang 30 Mal mit einer Rate von 1 s pro Spritzenbewegung (Abbildung 2C).
- Führen Sie die fragmentierten Embryonen durch ein 100-μm-Zellsieb in einem Trichter und sammeln Sie die gefilterten Herzen in einem weiteren 5-ml-Zentrifugenröhrchen. Spülen Sie die Spritze mit 1 ml PB aus, und sammeln Sie diese Spülung ebenfalls durch das Sieb in das Röhrchen (Abbildung 2C).
- Gut mischen und in 1,5 ml Zentrifugenröhrchen trennen, wobei jedes Röhrchen 1 ml des Inhalts enthält. Zentrifugieren Sie alle Röhrchen auf einer Minizentrifuge auf einem Tischgerät für 5 s (2.000 x g bei Umgebungstemperatur) und entsorgen Sie die Überstände.
- Führen Sie eine serielle Resuspension der Pellets in den Röhrchen mit 1 ml PB durch, d. h. resuspendieren Sie das Pellet in einem Röhrchen mit 1 ml PB und verwenden Sie dieses resuspendierte PB, um das Pellet im nächsten Röhrchen zu resuspendieren.
- Pipetten Sie die Herzen zweimal vorsichtig auf und ab, bevor Sie einen Tropfen davon für entsprechende Studien hinzufügen.
5. Patch-Clamp-Studien an isolierten kardiovaskulären Zellen
HINWEIS: Inside-Out- und Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen aus den isolierten Zellen können wie zuvor fürK-ATP-Kanalströme im Zebrafisch-Karovaskulatur9 berichtet werden.
- Bei adulten und juvenilen Kardiomyozyten werden die dissoziierten Zellen (aus Schritt 2) aus der Suspension direkt in die Aufnahmekammer gegeben. Bei VSM-Zellen legen Sie das Deckglas mit den plattierten VSM-Zellen (aus Schritt 3) in die Aufnahmekammer.
- Fügen Sie isolierte intakte embryonale Herzen (aus Schritt 4) aus der Suspension in die Kammer hinzu und machen Sie Patch-Clamp-Aufnahmen von den Epikardialmyozyten (Abbildung 2D).
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Representative Results
Die oben genannten Protokolle liefern zuverlässig und routinemäßig ausreichend kardiale und vaskuläre Myozyten von gleichbleibender Qualität, die für Patch-Clamp-Studien geeignet sind, wie kürzlich in umfangreichen Studien von ATP-sensitiven Kaliumkanälen (KATP) in Wildtyp- und mutierten Zebrafisch-Kardiovaskulatur berichtetwurde 9. Repräsentative Spuren von Aufzeichnungen einer solchenK-ATP-Kanalaktivität von isolierten Kardiomyozyten sind in Abbildung 3A-C dargestellt. Im Fall von Zellen, die aus knolligen Arteriosus isoliert wurden, wurden die vaskulären glatten Muskelzellen durch Tg(tagln:egfp)-Expression11,12 bestätigt (Abbildung 1). Erfolgreiche Einkanalaufnahmen wurden erhalten (n = 8 Aufnahmen von N = 5 Präparaten) in Pflastern, die aus den embryonalen Herzen herausgeschnitten wurden (Abbildung 3D). Aktionspotentiale wurden von isolierten adulten Zebrafisch-Ventrikel- und Vorhofmyozyten im Ganzzell-Stromklemmmodus unter Verwendung eines Patch-Clamp-Verstärkers zusammen mit einem kompatiblen Digitizer aufgezeichnet (siehe Materialtabelle). Die extrazelluläre Aufzeichnungslösung für die Aktionspotentialmessungen (AP) enthielt NaCl (140 mM), KCl (4 mM), CaCl 2 (1,8 mM), MgCl2 (1 mM), Glucose (10 mM), HEPES (10 mM) und Blebbistatin (0,01 mM, pH 7,4); die intrazelluläre Aufzeichnungslösung enthielt KCl (120 mM), EGTA (5 mM), K2 ATP (5 mM),MgCl2(5 mM) und HEPES (10 mM, pH 7,2). Patchpipetten wurden aus Kalknatronglas gezogen und wiesen Widerstände von 3 - 5 MΩ auf, wenn sie mit intrazellulärer Lösung gefüllt wurden. Ventrikuläre Myozyten weisen stabile hyperpolarisierte Membranpotentiale auf, und Aktionspotentiale wurden durch Strominjektion durch die Pflasterpipette stimuliert (Abbildung 3E), während atriale Myozyten spontane Aktionspotentialfeuer aufwiesen (Abbildung 3F). Aktionspotentialeigenschaften sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
Abbildung 1: Isolierung von atrialen, ventrikulären und bauchigen Arteriosuszellen. Schematische Darstellung der Isolierung von atrialen (A), ventrikulären (B) und bauchigen Arteriosuszellen (C). Die Bilder, die jeden isolierten Zelltyp (unten) darstellen, haben Maßstabsbalken = jeweils 50 μm. BA-Zellen, die aus transgenen Reporter-Zebrafischlinien (Tg(tagln:egfp)11,12) isoliert wurden, sind positiv für grüne Fluoreszenz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Isolierung embryonaler Herzen. (A) Befruchtete Embryonen werden aus dem Aufzuchtbecken entnommen und in eine Petrischale mit E3-Wasser gegeben und bis zu 5 Tage bei 28 °C gehalten. (B) Im gewünschten Alter werden die Embryonen in situ mit Tricain betäubt und zur Dissoziation in 5-ml-Zentrifugenröhrchen in PB überführt. (C) Der embryonale Herzisolationsapparat besteht aus einer 10-ml-Spritze, die an einer 19-G-Nadel befestigt ist, die über dem Dissoziationsschlauch auf einem Bankständer angebracht ist, so dass die Hände die Verreibung durchführen können. (D) Bild des isolierten Herzens (Tag 4), das an einer Patch-Clamp-Pipette befestigt ist. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Repräsentative Patch-Clamp-Aufnahmen aus isolierten kardiovaskulären Geweben von Zebrafischen. (A, B) ATP-sensitiveK-ATP-Kanäle aus herausgeschnittenen Patch-Clamp-Aufnahmen von atrialen (A) und ventrikulären (B) Kardiomyozyten, die aus erwachsenen Zebrafischen isoliert wurden. (C) Die Leitfähigkeit desK-ATP-Kanals wurde durch Ganzzell-Patch-Klemmung von VSM-Zellen aufgezeichnet, die aus adulten Zebrafischen isoliert wurden. (D) Einzel-K+ -Kanalaktivität in Membranpflastern, die aus embryonalen Herzen von Zebrafischen herausgeschnitten wurden (4 dpf). Alle ausgeschnittenen Patchaufnahmen wurden mit 140 mM KCl auf beiden Seiten der Membran bei -50 mV Membranpotential gemacht. Ganzzellströme wurden aufgezeichnet, wobei das Membranpotential bei -70 mV eingespannt war. (E) Beispiel für Stromklemmenaufzeichnung aus isolierten ventrikulären Myozyten. Die Aktionspotentiale wurden durch Strominjektion stimuliert, wie unten gezeigt. (F) Beispiel für Stromzangenaufzeichnung von isolierten Vorhofmyozyten, die spontanes Aktionspotentialfeuern zeigen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
| PERFUSIONSPUFFER (PB) | 10 mM HEPES, 30 mM Taurin, 5,5 mM Glukose, 10 mM BDM. Machen Sie die Lösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), stellen Sie den pH-Wert auf 7,4 ein | ||
| AUFSCHLUSSPUFFER (DB) | PB + 12,5 μM CaCl2 + 5 mg/ml Col II + 5 mg/ml Col IV + 5 ng/ml Insulin | ||
| STOPPPUFFER (SB) | PB + 10% FBS + 12,5 μM CaCl2 + 10 mg/ml BSA + 5 ng/ml Insulin | ||
Tabelle 1: Lösungen zur Isolierung von Zebrafisch-Kardiomyozyten.
| S1 PUFFER | 0,1% BSA (w/v), 145 mM NaCl, 4 mM KCl, 10 mM HEPES, 10 mM Glucose, 0,05 mM CaCl 2, 1 mM MgCl2, eingestellt auf pH7,4 mit NaOH | ||
| S2-PUFFER | 2 ml S1, 4 mg Papain, 2 mg DTT | ||
| S3-PUFFER | 2 ml S1, 3 mg Kollagenase Typ H, 2 mg Trypsin-Inhibitor, 1 mg Elastase | ||
Tabelle 2: Lösungen zur Isolierung von VSM-Zellen im Zebrafisch.
| Ventrikuläre Myozyten (n = 3 Aufnahmen) | |||
| Vm (mV) | APA (mV) | APD50 (ms) | |
| -75,7 ± 3,9 | -119,6 ± 3,8 | 329 ± 163 | |
| Vorhofmyozyten (n = 3 Aufnahmen) | |||
| AP-Rate (min-1) | MDP (mV) | APA (mV) | APD50 (ms) |
| 107,3 ± 32,6 | -71,2 ± 5,1 | 98,4 ± 4,7 | 141 ± 12 |
Tabelle 3: Aktionspotentialeigenschaften von isolierten Zebrafisch-Kardiomyozyten. Aufgezeichnet im Stromzangenmodus. Daten als Mittelwert ± S.D. Vm = Membranpotential; APA = Aktionspotentialamplitude; APD50 = Dauer des Aktionspotentials bis 50% Repolarisation; MDP = maximales diastolisches Potential.
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Discussion
Frühere Methoden zur Isolierung ventrikulärer Myozyten5,6 von Zebrafischen, die darauf abzielten, Myozyten für Kultur- oder elektrophysiologische Studien zu erzeugen, lieferten Zellen mit geringerer Ausbeute und beinhalteten langwierige Schritte mehrerer Zentrifugationen, die die Zellqualität und Lebensfähigkeit beeinträchtigten. Die hier beschriebenen Protokolle sind zuverlässig, decken jedes der signifikanten kardiovaskulären Gewebe (Ventrikel, Vorhöfe und VSM) ab und sind vor allem für die akute Isolierung lebender Zellen sehr praktisch. Isolationsansätze, bei denen der Ventrikel über den BA13 kanüliert wird, können eine anspruchsvolle Alternative für ventrikuläre Kardiomyozyten sein, erfordern jedoch ein höheres Maß an Geschicklichkeit und können sich negativ auf die Vorhofisolation auswirken. Der im aktuellen Protokoll beschriebene Ansatz bietet eine einfache und effiziente Alternative.
Zusätzliche Überlegungen zur Isolierung des Larvenherzgewebes sind: (1) In Schritt 1.4 können die Gewebe je nach Alter der Fische und verfügbarer Vergrößerung bereits vor dem Entfernen der Brustmuskeln sichtbar sein, in diesem Fall können die Gewebe ohne vorherige Operation direkt aus dem Fisch "gezupft" werden, und dann können die Nicht-CV-Gewebe mit einer superfeinen Pinzette entfernt werden; (2) In Schritt 2.2 können bei Larven, die jünger als 14 Tage sind, die Herzen direkt für elektrophysiologische Studien verwendet werden, ohne dass eine enzymatische Dissoziation erforderlich ist.
Wie oben erwähnt und typischerweise bei enzymatischen Dissoziationsmethoden im Allgemeinen, hat es sich als wichtig erwiesen, jedes Mal frische Puffer und Enzyme zu verwenden. Perfusion Buffer (PB) und S1 Buffer können jedoch im Voraus vorbereitet und bei 4-8 °C für 1 Monat gelagert werden.
Eine erfolgreiche Gewebeisolierungszeit sollte ~ 90 s pro Fisch nicht überschreiten, und das Gewebe sollte nicht der Luft ausgesetzt werden. Wenn die Dissoziation länger dauert, ist die Zellqualität (d.h. das Überleben) reduziert. Beim Verreiben von Geweben sollte darauf geachtet werden, dass keine Luftblasen entstehen, was auch die Zellqualität beeinträchtigt. Die VSM-Zellisolierung reagiert empfindlich auf die Verdauung durch Kollagenase im S3-Puffer. Nach den ersten 3 Minuten Verdauung sollte der Schlauch jede Minute aus dem Thermoshaker genommen und auf schwimmendes erweitertes und durchscheinendes Gewebe untersucht werden. Sobald eine Gewebefragmentierung erkennbar ist, sollte der Verdauungsschritt beendet werden.
Es ist wichtig zu beachten, dass diese Protokolle nicht umfassend für die Isolierung von kalziumtoleranten Kardiomyozyten optimiert sind, wie dies für Kontraktilitätsstudien erforderlich wäre. Wie jedoch gezeigt, kann eine zuverlässige Aufzeichnung von Kardiomyozyten-Aktionspotentialen in Gegenwart physiologischer extrazellulärer Kalziumkonzentrationen 7,14 erreicht werden. Es wurde bisher gezeigt, dass Blebbistatin, das in diesen Experimenten zur Entkopplung von Anregung und Kontraktion und zur Verbesserung der Giga-Ohm-Siegelbildung und der Aufnahmeeffizienz einbezogen wurde, die AP-Parameter in intakten Zebrafischherzen nicht signifikant beeinflusst14. Für die Elektrophysiologie ist die absolute Ausbeute von Zellen auch nicht routinemäßig ratenlimitierend. Dieses Protokoll wurde nicht für die Ausbeute optimiert, wie es für biochemische Untersuchungen isolierter Zellen erforderlich sein könnte. Dennoch eignet sich die mit diesen Methoden erzielte Ausbeute gut für elektrophysiologische Studien und wahrscheinlich mehrere andere Ansätze.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch die NIH-Zuschüsse HL140024 an CGN und HL150277 an CMC unterstützt. Abbildung 1 und Abbildung 2 wurden mit BioRender.com erstellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| 10 mL Syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| 19 Guage Needle | BD | 305187 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 5 mL Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | EP0030119479 | For embryonic heart isolation |
| Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer | Molecular Devices | Used for action potential recordings | |
| Benchtop Mini Centrifuge | Southern Labware | MLX-106 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | 203390 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell-Strainer Sieve | Cole-Parmer | EW-06336-71 | 100 μm sieve for embryonic heart isolation |
| Collagenase Type H | Sigma-Aldrich | C8051 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | |
| Curved Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 324626 | |
| Elastase | Worthington | LS003118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fine Forceps | Dumont | Style #5 | Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two) |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| K2ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Large Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5981 | For dissociation |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Kimble Chase | 41A2502 | Soda lime glass for patch pipettes |
| Papain | Worthington | LS003118 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5606 | 100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | For adult and juvenile zebrafish decapitation |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Super Fine Forceps | Dumont | Style #SF | For isolating larval CV tissues (Need two) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13687711 | |
| Tricaine Methanesulfonate (MS222) | For anaesthetizing zebrafish larvae | ||
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 |
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