Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल वयस्क, किशोर, लार्वा, और भ्रूण ज़ेब्राफिश (डेनियो रेरियो) से व्यवहार्य हृदय और संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के तीव्र अलगाव का वर्णन करता है, जो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययन के लिए उपयुक्त है।
Abstract
जेब्राफिश का उपयोग लंबे समय से कार्डियोवैस्कुलर अनुसंधान में एक मॉडल कशेरुक जीव के रूप में किया जाता है। जेब्राफिश कार्डियोवैस्कुलर ऊतकों से व्यक्तिगत कोशिकाओं को अलग करने की तकनीकी कठिनाइयां उनके इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल गुणों का अध्ययन करने में सीमित रही हैं। जेब्राफिश दिलों के विच्छेदन और वेंट्रिकुलर कार्डियक मायोसाइट्स के अलगाव के लिए पिछले तरीकों का वर्णन किया गया है। हालांकि, इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल लक्षण वर्णन के लिए ज़ेब्राफिश एट्रियल और संवहनी मायोसाइट्स का अलगाव विस्तृत नहीं था। यह काम नए और संशोधित एंजाइमेटिक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो नियमित रूप से पैच-क्लैंप प्रयोगों के लिए उपयुक्त बल्बनुमा धमनी से पृथक किशोर और वयस्क जेब्राफिश वेंट्रिकुलर और एट्रियल कार्डियोमायोसाइट्स, साथ ही संवहनी चिकनी मांसपेशी (वीएसएम) कोशिकाओं को प्रदान करते हैं। विकास के भ्रूण और लार्वा चरणों में पृथक ज़ेब्राफिश कार्डियोवैस्कुलर ऊतकों पर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययन का कोई साहित्यिक प्रमाण नहीं मिला है। आंशिक पृथक्करण तकनीक जो लार्वा और भ्रूण के दिल से व्यक्तिगत कोशिकाओं पर पैच-क्लैंप प्रयोगों की अनुमति देती है, का प्रदर्शन किया जाता है।
Introduction
ज़ेब्राफिश छोटी टेलीओस्ट मछली हैं जिन्हें लंबे समय से एक मॉडल कशेरुक जीव1 के रूप में उपयोग किया जाता है और हाल ही में जीन और ड्रग्स 2,3 की उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए एक व्यवहार्य कशेरुक प्रणाली के रूप में प्रमुखता से आया है। हालांकि, जेब्राफिश ऊतकों का शारीरिक विश्लेषण अच्छी तरह से विकसित नहीं हुआ है। कार्डियोवैस्कुलर सिस्टम में, जेब्राफिश दिल4 के विच्छेदन और वेंट्रिकुलर कार्डियक मायोसाइट्स 5,6,7 के अलगाव के लिए तरीकों का वर्णन किया गया है। एट्रियल मायोसाइट्स के प्रभावी अलगाव के कुछ विस्तृत विवरण हैं और पैच-क्लैंप अध्ययन के लिए संवहनी चिकनी मांसपेशियों (वीएसएम) की तैयारी की कोई रिपोर्ट नहीं है।
वर्तमान कार्य जेब्राफिश कार्डियक और संवहनी मायोसाइट्स के अलगाव के लिए पद्धति का वर्णन करता है, जो इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल और कार्यात्मक अध्ययनों के लिए व्यवहार्य है। इस दृष्टिकोण में जेब्राफिश वेंट्रिकुलर मायोसाइट अलगाव 5,6 के लिए पहले से रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉलके संशोधन शामिल हैं और स्तनधारी वीएसएम सेल अलगाव8 से तरीकों को अनुकूलित करता है, जिससे बल्बनुमा धमनी (बीए) से ज़ेब्राफिश संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं के अलगाव की अनुमति मिलती है। प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप जेब्राफिश से पृथक आलिंद, वेंट्रिकुलर और वीएसएम कोशिकाओं की कुशल पैदावार होती है जिसे 8 घंटे9 तक पैच-क्लैंप अध्ययन में मज़बूती से उपयोग किया जा सकता है।
उनके लगभग पारदर्शी लार्वा के बावजूद जो माता-पिता के जीव के बाहर पूरी तरह से विकसित होते हैं, कार्डियोवैस्कुलर विकास का अध्ययन करने में उनकी वादा की गई ऑन्टोजेनेटिक क्षमता की खोज कम उम्र में ऊतकों को निकालने और विश्लेषण करने में चुनौतियों से सीमित हो गई है। वर्तमान लेख एक अनुकूलित, प्रकाशित निष्कर्षण विधि 10 का उपयोग करके 3 दिनों के बाद निषेचन (डीपीएफ) के रूप में पृथक ज़ेब्राफिश दिलों पर पैच-क्लैंपप्रयोगों का प्रदर्शन करके इस सीमा को संबोधित करता है।
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Protocol
वाशिंगटन विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) के दिशानिर्देशों का पालन करते हुए प्रयोगों के लिए सभी जेब्राफिश (जंगली प्रकार के तनाव एबी, नर और मादा दोनों) को उठाया, बनाए रखा गया और संभाला गया।
1. वयस्क, किशोर और लार्वा ज़ेब्राफिश से आलिंद, वेंट्रिकल और बल्बनुमा धमनी का अलगाव
- ठंडे सदमे का उपयोग करके मछली को इच्छामृत्यु दें, यानी, ~ 10 एस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पानी में डूबकर।
- घुमावदार संदंश का उपयोग करके, आंशिक रूप से छिड़काव बफर (पीबी) (तालिका 1) से भरा एक बड़े पेट्री डिश में मछली हस्तांतरण और एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत जगह है।
- कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करके मछली को आंखों के पीछे हटा दें।
- घुमावदार संदंश (लार्वा मछली के लिए ठीक संदंश) का उपयोग करके, विच्छेदन गुंजाइश का सामना करना पड़ उदर पक्ष के साथ गैर-प्रमुख हाथ में मछली पकड़ो। प्रमुख हाथ में ठीक संदंश (या लार्वा मछली के लिए सुपरफाइन) की दूसरी जोड़ी के साथ, धीरे-धीरे कार्डियोवैस्कुलर (सीवी) ऊतकों (आलिंद, वेंट्रिकल, और बल्बनुमा धमनी, बीए) (चित्रा 1) को प्रकट करने के लिए पेक्टोरल मांसपेशियों और पंखों को खोलें।
- प्रमुख हाथ में ठीक संदंश रखकर, धीरे बीए और उदर महाधमनी की प्रतिच्छेदन नोक पर बीए खींचें।
नोट: बीए और दिल शरीर गुहा से बाहर आ जाएगा।- ध्यान से संदंश चुटकी और आलिंद की नोक जिसमें कई शिरापरक शाखाओं अभिसरण (साइनस वेनोसस) का पता लगाने से महाधमनी से बीए को अलग करें। ठीक संदंश का उपयोग करके, साइनस वेनोसस से आलिंद की नोक को 'प्लक' करें। यह शरीर के बाकी हिस्सों से सीवी ऊतकों को अलग करता है (चित्रा 1)।
2. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययन के लिए वयस्क, किशोर और लार्वा ज़ेब्राफिश से कार्डियोमायोसाइट्स का पृथक्करण
- ठीक संदंश का उपयोग करते हुए, पहले चरण में पृथक सीवी ऊतक से आलिंद और वेंट्रिकल को 'प्लक' करें।
नोट: प्रक्रिया न्यूनतम क्रॉस-संदूषण के साथ प्रत्येक ऊतक के साफ विच्छेदन की अनुमति देती है और एक पेड़ से फल तोड़ने के समान महसूस करती है।- अतिरिक्त रक्त निकालने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करके वेंट्रिकल में एक कोमल आंसू बनाएं, जिसे सुनिश्चित किया जा सकता है जब हृदय ऊतक उज्ज्वल लाल से पीला सामन रंग बदल जाता है।
- छिड़काव बफर (पीबी; 1.5 एमएल) युक्त अलग 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में पृथक आलिंद और वेंट्रिकल पूल।
नोट: वयस्क जेब्राफिश एट्रियल कार्डियोमायोसाइट्स (एसीएम) और वेंट्रिकुलर कार्डियोमायोसाइट्स (वीसीएम) के सफल पृथक्करण की गारंटी देने के लिए, आमतौर पर चार अटरिया और तीन वेंट्रिकल्स की आवश्यकता होती है। किशोर जेब्राफिश (28-90 दिन) के मामले में, यह संख्या दोगुनी हो जाती है।- लार्वा ज़ेब्राफिश (14-28 दिन) के मामले में, ~ 30 लार्वा से जितना संभव हो उतना ऊतक इकट्ठा करें।
- पाचन बफर (डीबी) (तालिका 1) प्रत्येक के 750 μL के साथ ट्यूबों में पीबी को बदलें और ट्यूबों को 37 डिग्री सेल्सियस और 800 आरपीएम पर थर्मोशेकर पर रखें। ऊतकों के पाचन की अनुमति दें जब तक कि वे पारदर्शी न हो जाएं (एट्रिया के लिए ~ 30 मिनट और वेंट्रिकल्स के लिए ~ 40 मिनट)।
- 3-5 एस के लिए एक बेंचटॉप मिनी अपकेंद्रित्र (परिवेश के तापमान पर 2,000 एक्स जी ) में ऊतकों को धीरे-धीरे कताई करके पाचन समाप्त करें और सतह पर तैरनेवाला डीबी को स्टॉपिंग बफर (एसबी) प्रत्येक (तालिका 1) के 750 μL के साथ प्रतिस्थापित करें।
नोट: यह सेंट्रीफ्यूजेशन चरण वीसीएम अलगाव के लिए वैकल्पिक है। - 15 मिनट के लिए परिवेश के तापमान पर एसबी में गोली ऊतकों सेते हैं।
- धीरे पीबी के 500-750 μL प्रत्येक (अंतिम कोशिकाओं के वांछित घनत्व के आधार पर) के साथ एसबी को प्रतिस्थापित करें और कोशिकाओं को फैलाने के लिए लौ पॉलिश पाश्चर विंदुक का उपयोग करके ऊतकों (~ 30 बार) को ट्राइट्यूरेट करें।
नोट: कार्डियोमायोसाइट्स (सीएम) अब इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययन के लिए तैयार हैं और 8 घंटे तक कमरे के तापमान पर संग्रहीत हैं। - वर्दी नमूनाकरण के लिए, धीरे से ऊपर और नीचे कोशिकाओं को इसी अध्ययन के लिए उनमें से एक बूंद जोड़ने से पहले पुन: निलंबित करने के लिए एक दो बार पिपेट।
3. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययन के लिए वयस्क और किशोर जेब्राफिश से संवहनी चिकनी मांसपेशियों (वीएसएम) कोशिकाओं का पृथक्करण
- चरण 2.1 के समान दृष्टिकोण का उपयोग करके सीवी ऊतकों से बल्बनुमा धमनी (बीए) को तोड़ें और एस 1 बफर (1.5 एमएल) युक्त 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में पांच वयस्क बीए पूल करें (तालिका 2)। किशोर जेब्राफिश के मामले में, पूल दस बीए और, 2 सप्ताह से अधिक पुराने लार्वा के लिए, पूल 30-40 बीए।
नोट: 2 सप्ताह से कम उम्र के ज़ेब्राफिश लार्वा से वीएसएम कोशिकाओं को अलग करना व्यावहारिक रूप से संभव नहीं है। - एस 2 बफर (तालिका 2) के 400 μL के साथ एस 1 को बदलें और ~ 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 800 आरपीएम पर थर्मोशेकर पर बीए के पपैन ( सामग्री की तालिका देखें) पाचन की अनुमति दें।
- आंशिक रूप से पचने वाले बीए को 1 मिनट के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें और सतह पर तैरनेवाला एस 2 को एस 3 बफर (तालिका 2) के 500 μL के साथ प्रतिस्थापित करें जिसमें कोलेजनेज होता है। 3-5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 800 आरपीएम पर थर्मोशेकर पर ऊतकों को पचाएं।
- 3-5 एस के लिए एक बेंचटॉप मिनी अपकेंद्रित्र (परिवेश के तापमान पर 2,000 एक्स जी ) में ऊतकों को धीरे-धीरे कताई करके पाचन समाप्त करें और सतह पर तैरनेवाला एस 3 को एस 1 के 500 μL के साथ प्रतिस्थापित करें।
- उचित आकार के ग्लास कवरलिप्स पर वीएसएम कोशिकाओं और प्लेट को फैलाने के लिए धीरे-धीरे गोली वाले ऊतकों (~ 15 बार) को ट्रिट्यूरेट करें।
नोट: कवरस्लिप आकार पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग कक्ष के आकार से निर्धारित होता है, इस मामले में, 5 x 5 मिमी का उपयोग किया गया था)।- कोशिकाओं को संलग्न करने और अगले 6 घंटे के भीतर उनका उपयोग करने के लिए 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर कवरलिप्स रखें।
4. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययन के लिए भ्रूण ज़ेब्राफिश से दिल का अलगाव
- एल; 1 मिलीलीटर प्रति 100 मिमी x 20 मिमी पेट्री डिश) ~ 300 भ्रूण (2-5 डीपीएफ) में जोड़ें, उनके इनक्यूबेशन स्थितियों (चित्रा 2 ए) से एकत्र किया गया।
- अपकेंद्रित्र ट्यूब (चित्रा 2 बी) से अतिरिक्त मीडिया (ई 3) को हटाने, एक हस्तांतरण विंदुक का उपयोग कर उन्हें एक 5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करके संवेदनाहारी भ्रूण ध्यान केंद्रित करें।
- दो बार ठंड छिड़काव बफर (पीबी) के 3 मिलीलीटर के साथ भ्रूण धो लें और पीबी (चित्रा 2 बी) के 2 मिलीलीटर में फिर से निलंबित।
- भ्रूण हृदय अलगाव उपकरण (चित्रा 2 सी) का उपयोग करके, सिरिंज सुई में भ्रूण के ~ 1 एमएल आकर्षित करें और तुरंत उन्हें ट्यूब में वापस निष्कासित करें। सिरिंज गति (चित्रा 2 सी) प्रति 1 एस की दर से, इस प्रक्रिया को 30 बार दोहराएं।
- एक कीप में रखा एक 100 μm सेल छलनी छलनी के माध्यम से खंडित भ्रूण पास और एक और 5 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में फ़िल्टर किए गए दिल इकट्ठा। पीबी के 1 एमएल के साथ सिरिंज कुल्ला और छलनी (चित्रा 2 सी) के माध्यम से ट्यूब में इस कुल्ला के रूप में अच्छी तरह से इकट्ठा।
- अच्छी तरह से मिलाएं और 1.5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में अलग करें, प्रत्येक ट्यूब में सामग्री के 1 एमएल होते हैं। 5 एस (परिवेश के तापमान पर 2,000 एक्स जी ) के लिए एक बेंचटॉप मिनी अपकेंद्रित्र पर सभी ट्यूबों को अपकेंद्रित्र करें और सतह पर तैरनेवालों को त्याग दें।
- पीबी के 1 एमएल का उपयोग करके ट्यूबों में छर्रों के सीरियल पुन: निलंबन को पूरा करें, यानी, पीबी के 1 एमएल का उपयोग करके एक ट्यूब में गोली को फिर से निलंबित करें और अगली ट्यूब में गोली को फिर से निलंबित करने के लिए उस निलंबित पीबी का उपयोग करें।
- धीरे इसी अध्ययन के लिए उनमें से एक बूंद जोड़ने से पहले दो बार दिल ऊपर और नीचे पिपेट।
5. पृथक कार्डियोवैस्कुलर कोशिकाओं पर पैच-क्लैंप अध्ययन
नोट: पृथक कोशिकाओं से इनसाइड-आउट और पूरे सेल पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग को जेब्राफिश कार्डियोवास्कुलचर9 में केएटीपी चैनल धाराओं के लिए पहले की रिपोर्ट के रूप में प्राप्त किया जा सकता है।
- वयस्क और किशोर कार्डियोमायोसाइट्स के लिए, निलंबन से सीधे रिकॉर्डिंग कक्ष में पृथक कोशिकाओं (चरण 2 से) जोड़ें। वीएसएम कोशिकाओं के लिए, रिकॉर्डिंग कक्ष में मढ़वाया वीएसएम कोशिकाओं (चरण 3 से) युक्त कवरस्लिप रखें।
- निलंबन से कक्ष के लिए पृथक बरकरार भ्रूण दिल (चरण 4 से) जोड़ें, और एपिकार्डियल मायोसाइट्स (चित्रा 2 डी) से पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग करें।
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Representative Results
उपरोक्त प्रोटोकॉल मज़बूती से और नियमित रूप से पैच-क्लैंप अध्ययन के लिए उत्तरदायी लगातार गुणवत्ता के पर्याप्त हृदय और संवहनी मायोसाइट्स प्रदान करते हैं जैसा कि हाल ही में जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती ज़ेब्राफिश कार्डियोवास्कुलचर 9 मेंएटीपी-संवेदनशील पोटेशियम (के एटीपी)चैनलों के व्यापक अध्ययन में बताया गया है। पृथक कार्डियोमायोसाइट्स से इस तरह केके एटीपी चैनल गतिविधि की रिकॉर्डिंग के प्रतिनिधि निशान चित्रा 3 ए-सी में दिखाए गए हैं। बल्बनुमा धमनी से पृथक कोशिकाओं के मामले में, संवहनी चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं की पुष्टि टीजी (टैगलन: ईजीएफपी) अभिव्यक्ति11,12 (चित्रा 1) द्वारा की गई थी। सफल एकल चैनल रिकॉर्डिंग (एन = एन = 5 तैयारी से 8 रिकॉर्डिंग) भ्रूण दिल (चित्रा 3 डी) से उत्सर्जित पैच में प्राप्त किए गए थे। एक्शन पोटेंशिअल को पूरे सेल, वर्तमान-क्लैंप मोड में पृथक वयस्क जेब्राफिश वेंट्रिकुलर और एट्रियल मायोसाइट्स से दर्ज किया गया था, एक संगत डिजिटाइज़र के साथ पैच-क्लैंप एम्पलीफायर का उपयोग करके (सामग्री की तालिका देखें)। एक्शन पोटेंशिअल (एपी) माप के लिए बाह्य रिकॉर्डिंग समाधान में एनएसीएल (140 एमएम), केसीएल (4 एमएम), सीएसीएल2 (1.8 एमएम), एमजीसीएल2 (1 एमएम), ग्लूकोज (10 एमएम), एचईपीईएस (10 एमएम), और ब्लेबिस्टैटिन (0.01 एमएम, पीएच 7.4) शामिल थे; इंट्रासेल्युलर रिकॉर्डिंग समाधान में केसीएल (120 एमएम), ईजीटीए (5 एमएम), के2एटीपी (5 एमएम), एमजीसीएल2 (5 एमएम), और एचईपीईएस (10 एमएम, पीएच 7.2) शामिल थे। पैच पिपेट सोडा-लाइम ग्लास से खींचे गए थे और इंट्रासेल्युलर समाधान से भरे होने पर 3 - 5 एमΩ के प्रतिरोध थे। वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स स्थिर हाइपरपोलराइज्ड झिल्ली क्षमता प्रदर्शित करते हैं, और एक्शन पोटेंशिअल पैच पिपेट (चित्रा 3 ई) के माध्यम से वर्तमान इंजेक्शन के माध्यम से उत्तेजित किए गए थे, जबकि एट्रियल मायोसाइट्स ने सहज एक्शन पोटेंशियल फायरिंग (चित्रा 3 एफ) का प्रदर्शन किया था। एक्शन पोटेंशियल गुणों को तालिका 3 में संक्षेप ति किया गया है।
चित्रा 1: आलिंद, वेंट्रिकुलर और बल्बनुमा धमनी कोशिकाओं का अलगाव। एट्रियल (ए), वेंट्रिकुलर (बी), और बल्बनुमा धमनी (सी) कोशिकाओं के अलगाव को चित्रित करने के लिए योजनाबद्ध। प्रत्येक पृथक सेल प्रकार (नीचे) को दर्शाने वाली छवियों में प्रत्येक मामले में स्केल बार = 50 μm है। चिकनी मांसपेशी कोशिका ट्रांसजेनिक रिपोर्टर जेब्राफिश लाइनों (टीजी (टैगलन: ईजीएफपी)11,12) से अलग बीए कोशिकाएं हरे प्रतिदीप्ति के लिए सकारात्मक हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2: भ्रूण के दिल के अलगाव को चित्रित करने के लिए योजनाबद्ध। (ए) निषेचित भ्रूण को प्रजनन टैंक से हटा दिया जाता है और ई 3 पानी युक्त पेट्री डिश में रखा जाता है और 5 दिनों तक 28 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा जाता है। (बी) वांछित उम्र में, भ्रूण को ट्राइकेन का उपयोग करके सीटू में संवेदनाहारी किया जाता है और पृथक्करण के लिए 5 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों में पीबी में स्थानांतरित किया जाता है। (सी) भ्रूण हृदय अलगाव तंत्र में एक बेंच स्टैंड पर पृथक्करण ट्यूब के ऊपर घुड़सवार 19 जी सुई से जुड़ी 10 मिलीलीटर सिरिंज होती है, जिससे हाथों को ट्रिट्यूरेशन करने की अनुमति मिलती है। (डी) एक पैच-क्लैंप पिपेट से जुड़े पृथक दिल (दिन 4) की छवि। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: पृथक जेब्राफिश कार्डियोवैस्कुलर ऊतकों से प्रतिनिधि पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग ( ए, बी ) एटीपी-संवेदनशील केएटीपी चैनल वयस्क जेब्राफिश से अलग एट्रियल (ए) और वेंट्रिकुलर (बी) कार्डियोमायोसाइट्स के अंदर-बाहर एक्साइज्ड पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग से। (सी) केएटीपी चैनल चालकता वयस्क जेब्राफिश से पृथक वीएसएम कोशिकाओं के पूरे सेल पैच-क्लैंपिंग से दर्ज की गई थी। (डी) जेब्राफिश भ्रूण दिल (4 डीपीएफ) से उत्सर्जित झिल्ली पैच में एकल के + चैनल गतिविधि। सभी एक्साइज्ड पैच रिकॉर्डिंग -50 एमवी झिल्ली क्षमता पर झिल्ली के दोनों किनारों पर 140 एमएम केसीएल के साथ बनाई गई थी। पूरे सेल धाराओं को -70 एमवी पर क्लैंप की गई झिल्ली क्षमता के साथ दर्ज किया गया था। (ई) पृथक वेंट्रिकुलर मायोसाइट से उदाहरण वर्तमान-क्लैंप रिकॉर्डिंग। एक्शन पोटेंशिअल को वर्तमान इंजेक्शन द्वारा उत्तेजित किया गया था जैसा कि नीचे दिखाया गया है। (एफ) पृथक आलिंद मायोसाइट से उदाहरण वर्तमान-क्लैंप रिकॉर्डिंग सहज कार्रवाई संभावित फायरिंग दिखा रही है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| छिड़काव बफर (पीबी) | 10 एमएम एचईपीईएस, 30 एमएम टॉरिन, 5.5 एमएम ग्लूकोज, 10 एमएम बीडीएम। फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) में समाधान बनाएं, पीएच को 7.4 में समायोजित करें | ||
| पाचन बफर (डीबी) | पीबी + 12.5 μM सीएसीएल2 + 5 मिलीग्राम / एमएल कर्नल द्वितीय + 5 मिलीग्राम / एमएल कर्नल चतुर्थ + 5 एनजी / एमएल इंसुलिन | ||
| बफर रोकना (एसबी) | पीबी + 10% एफबीएस + 12.5 μM सीएसीएल2 + 10 मिलीग्राम / | ||
तालिका 1: ज़ेब्राफिश कार्डियोमायोसाइट्स के अलगाव के लिए समाधान।
| एस 1 बफर | वी), 145 एमएम एनएसीएल, 4 एमएम केसीएल, 10 एमएम एचईपीईएस, 10 एमएम ग्लूकोज, 0.05 एमएम सीएसीएल 2, 1 एमएम एमजीसीएल2, एनएओएच का उपयोग करके पीएच 7.4 में समायोजित | ||
| एस 2 बफर | 2 एमएल एस 1, 4 मिलीग्राम पपैन, 2 मिलीग्राम डीटीटी | ||
| एस 3 बफर | 2 एमएल एस 1, 3 मिलीग्राम कोलेजनेज टाइप एच, 2 मिलीग्राम ट्रिप्सिन अवरोधक, 1 मिलीग्राम इलास्टेज | ||
तालिका 2: ज़ेब्राफिश वीएसएम कोशिकाओं के अलगाव के लिए समाधान।
| वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स (एन = 3 रिकॉर्डिंग) | |||
| वीएम (एमवी) | एपीए (एमवी) | एपीडी 50 (एमएस) | |
| -75.7 ± 3.9 | -119.6 ± 3.8 | 329 ± 163 | |
| आलिंद मायोसाइट्स (एन = 3 रिकॉर्डिंग) | |||
| एपी दर (न्यूनतम -1) | एमडीपी (एमवी) | एपीए (एमवी) | एपीडी 50 (एमएस) |
| 107.3 ± 32.6 | -71.2 ± 5.1 | 98.4 ± 4.7 | 141 ± 12 |
तालिका 3: पृथक जेब्राफिश कार्डियोमायोसाइट्स से एक्शन पोटेंशियल गुण। वर्तमान क्लैंप मोड में दर्ज किया गया। एसडी वी एम = झिल्ली क्षमता ± माध्य के रूपमें दिखाया गया डेटा; एपीए = एक्शन पोटेंशियल आयाम; एपीडी 50 = 50% पुनर्ध्रुवीकरण के लिए एक्शन पोटेंशिअल की अवधि; एमडीपी = अधिकतम डायस्टोलिक क्षमता।
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Discussion
ज़ेब्राफिश वेंट्रिकुलर मायोसाइट्स 5,6 को अलग करने के लिए पिछले तरीके, जिसका उद्देश्य संस्कृति या इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययनों के लिए मायोसाइट्स उत्पन्न करना है, ने कम उपज की कोशिकाएं प्रदान कीं और कई सेंट्रीफ्यूजेशन के लंबे चरण शामिल थे जो सेल की गुणवत्ता और व्यवहार्यता पर प्रतिकूल प्रभाव डालते थे। यहां वर्णित प्रोटोकॉल विश्वसनीय हैं, प्रत्येक महत्वपूर्ण कार्डियोवैस्कुलर ऊतकों (वेंट्रिकल, अटरिया और वीएसएम) को कवर करते हैं, और महत्वपूर्ण रूप से जीवित कोशिकाओं के तीव्र अलगाव के लिए काफी व्यावहारिक हैं। बीए13 के माध्यम से वेंट्रिकल के कैनुलेशन से जुड़े अलगाव दृष्टिकोण वेंट्रिकुलर कार्डियोमायोसाइट्स के लिए एक परिष्कृत विकल्प हो सकते हैं लेकिन उच्च स्तर की निपुणता की आवश्यकता होती है और एट्रियल अलगाव को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकती है। वर्तमान प्रोटोकॉल में विस्तृत दृष्टिकोण एक सरल और कुशल विकल्प प्रदान करता है।
लार्वा कार्डियक ऊतक अलगाव के लिए अतिरिक्त विचार हैं: (1) चरण 1.4 में, मछली की उम्र और उपलब्ध आवर्धन के आधार पर, पेक्टोरल मांसपेशियों को हटाने से पहले भी ऊतक दिखाई दे सकते हैं, इस स्थिति में ऊतकों को सीधे पूर्व सर्जरी के बिना मछली से "तोड़ा" जा सकता है, और फिर गैर-सीवी ऊतकों को सुपरफाइन संदंश का उपयोग करके हटाया जा सकता है; (2) चरण 2.2 में, 14 दिनों से कम उम्र के लार्वा के लिए, दिल का उपयोग एंजाइमी पृथक्करण की आवश्यकता के बिना इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययन के लिए सीधे किया जा सकता है।
जैसा कि ऊपर उल्लेख किया गया है, और आमतौर पर सामान्य रूप से एंजाइमी पृथक्करण विधियों के बारे में सच है, हर बार ताजा बफर और एंजाइमों का उपयोग करना महत्वपूर्ण साबित हुआ है। हालांकि, छिड़काव बफर (पीबी) और एस 1 बफर अग्रिम में तैयार किया जा सकता है और 1 महीने के लिए 4-8 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
सफल ऊतक अलगाव का समय प्रति मछली ~ 90 एस से अधिक नहीं होना चाहिए, और ऊतकों को हवा के संपर्क में नहीं आना चाहिए। जब पृथक्करण में अधिक समय लगता है, तो सेल की गुणवत्ता (यानी अस्तित्व) कम हो जाती है। ऊतकों को ट्राइट्यूरेट करते समय, हवा के बुलबुले पैदा करने से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए, जो सेल की गुणवत्ता को भी कम करता है। वीएसएम सेल अलगाव एस 3 बफर में कोलेजनेज द्वारा पाचन के प्रति संवेदनशील है। पाचन के पहले 3 मिनट के बाद, ट्यूब को हर मिनट थर्मोशेकर से बाहर निकाला जाना चाहिए और फ्लोटिंग पतला और पारभासी ऊतकों के लिए जांच की जानी चाहिए। एक बार ऊतक विखंडन स्पष्ट हो जाने के बाद, पाचन चरण को बंद कर दिया जाना चाहिए।
यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इन प्रोटोकॉल को कैल्शियम-सहिष्णु कार्डियोमायोसाइट्स को अलग करने के लिए बड़े पैमाने पर अनुकूलित नहीं किया गया है, जैसा कि संकुचन अध्ययन के लिए आवश्यक होगा। हालांकि, जैसा कि दिखाया गया है, कार्डियोमायोसाइट एक्शन पोटेंशिअल की विश्वसनीय रिकॉर्डिंग शारीरिक बाह्य कैल्शियम सांद्रता 7,14 की उपस्थिति में प्राप्त की जा सकती है। ब्लेबिस्टैटिन, उत्तेजना और संकुचन को कम करने और इन प्रयोगों में गीगा-ओम सील गठन और रिकॉर्डिंग दक्षता में सुधार करने के लिए शामिल है, पहले बरकरार जेब्राफिश दिल14 में एपी मापदंडों को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित नहीं करने के लिए दिखाया गया है। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए, कोशिकाओं की पूर्ण उपज भी नियमित रूप से दर-सीमित नहीं है। इस प्रोटोकॉल उपज के लिए अनुकूलित नहीं किया गया है, के रूप में पृथक कोशिकाओं के जैव रासायनिक अध्ययन के लिए आवश्यक हो सकता है। फिर भी, इन विधियों के साथ प्राप्त उपज इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल अध्ययन और संभवतः कई अन्य दृष्टिकोणों के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है।
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Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा नहीं करते हैं।
Acknowledgments
इस कार्य को एनआईएच द्वारा सीजीएन को एचएल 140024 और सीएमसी को एचएल 150277 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। चित्रा 1 और चित्रा 2 BioRender.com के साथ बनाए गए थे।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Centrifuge Tubes | Eppendorf | 22364111 | |
| 10 mL Syringe | Fisher Scientific | 14-955-459 | |
| 19 Guage Needle | BD | 305187 | |
| 2,3-Butanedione Monoxime (BDM) | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 5 mL Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | EP0030119479 | For embryonic heart isolation |
| Axopatch 200B amplifier and Digidata 1200 digitizer | Molecular Devices | Used for action potential recordings | |
| Benchtop Mini Centrifuge | Southern Labware | MLX-106 | |
| Blebbistatin | Sigma-Aldrich | 203390 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| Cell-Strainer Sieve | Cole-Parmer | EW-06336-71 | 100 μm sieve for embryonic heart isolation |
| Collagenase Type H | Sigma-Aldrich | C8051 | |
| Collagenase Type II | Worthington | LS004176 | |
| Collagenase Type IV | Worthington | LS004188 | |
| Curved Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | |
| DTT | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | 324626 | |
| Elastase | Worthington | LS003118 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| Fine Forceps | Dumont | Style #5 | Ceramic-coated forceps for adult and juvenile CV tissue isolation (Need two) |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2643 | |
| K2ATP | Sigma-Aldrich | A8937 | |
| Large Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5981 | For dissociation |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Micro-Hematocrit Capillary Tubes | Kimble Chase | 41A2502 | Soda lime glass for patch pipettes |
| Papain | Worthington | LS003118 | |
| Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-6A | |
| Petri Dish | Sigma-Aldrich | P5606 | 100 mm x 20 mm, for embryonic heart isolation |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Sigma-Aldrich | 806552 | |
| Potassium Chloride | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14090-09 | For adult and juvenile zebrafish decapitation |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Super Fine Forceps | Dumont | Style #SF | For isolating larval CV tissues (Need two) |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 | |
| Thermoshaker | ThermoFisher Scientific | 13687711 | |
| Tricaine Methanesulfonate (MS222) | For anaesthetizing zebrafish larvae | ||
| Trypsin Inhibitor | Sigma-Aldrich | T6522 |
References
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