Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Generering af nullmutanter for at belyse rollen som bakterielle glycosyltransferaser i bakteriel motilitet

Published: March 11, 2022 doi: 10.3791/63231
Automatic Translation
1, 2,3, 2,4, 1
1Departamento de Genética, Microbiología y Estadística, Universidad de Barcelona, 2Human Health Therapeutics Research Centre, National Research Council Canada, 3Department of Chemistry, Carleton University, 4Department of Biology, Carleton University

Summary

Her beskriver vi konstruktionen af nulmutanter af Aeromonas i specifikke glycosyltransferaser eller regioner indeholdende glycosyltransferaser, motilitetsassays og flagellarensning udført for at fastslå involvering og funktion af deres kodede enzymer i biosyntesen af en glycan samt denne glycans rolle i bakteriel patogenese.

Abstract

Undersøgelsen af glykosylering i prokaryoter er et hurtigt voksende område. Bakterier har forskellige glykosylerede strukturer på deres overflade, hvis glycaner udgør en stammespecifik stregkode. De tilknyttede glycaner viser større mangfoldighed i sukkersammensætning og struktur end eukaryoter og er vigtige i bakterie-værtsgenkendelsesprocesser og interaktion med miljøet. I patogene bakterier har glycoproteiner været involveret i forskellige stadier af den infektiøse proces, og glycanmodifikationer kan forstyrre specifikke funktioner af glycoproteiner. På trods af de fremskridt, der er gjort i forståelsen af glycansammensætning, struktur og biosynteseveje, forbliver forståelsen af glycoproteinernes rolle i patogenicitet eller interaktion med miljøet imidlertid meget begrænset. Desuden deles de enzymer, der kræves til proteinglykosylering, i nogle bakterier med andre biosyntetiske veje for polysaccharid, såsom lipopolysaccharid og kapselbiosyntetiske veje. Den funktionelle betydning af glycosylering er blevet belyst i flere bakterier gennem mutation af specifikke gener, der menes at være involveret i glykosyleringsprocessen og undersøgelsen af dens indvirkning på ekspressionen af målglycoproteinet og den modificerende glycan. Mesophilic Aeromonas har et enkelt og O-glycosyleret polært flagellum. Flagellarglycaner viser mangfoldighed i kulhydratsammensætning og kædelængde mellem Aeromonas-stammer . Imidlertid viser alle stammer, der er analyseret til dato, et pseudaminsyrederivat som det bindende sukker, der ændrer serin- eller threoninrester. Pseudaminsyrederivatet er nødvendigt for polær flagellasamling, og dets tab har indflydelse på vedhæftning, biofilmdannelse og kolonisering. Protokollen beskrevet i denne artikel, hvordan konstruktionen af nullmutanter kan bruges til at forstå inddragelsen af gener eller genomregioner, der indeholder formodede glycosyltransferaser i biosyntesen af en flagellar glycan. Dette omfatter potentialet til at forstå funktionen af de involverede glycosyltransferaser og glycanens rolle. Dette opnås ved at sammenligne den glykanmangelfulde mutant med vildtypestammen.

Introduction

Proteinglykosylering er beskrevet i både gram-positive og gram-negative bakterier og består af den kovalente fastgørelse af en glycan til en aminosyresidekæde 1,2. I prokaryoter forekommer denne proces normalt via to store enzymatiske mekanismer: O- og N-glycosylering3. Ved O-glycosylering er glycanen bundet til hydroxylgruppen af en serin (Ser) eller threonin (Thr) rest. Ved N-glycosylering er glycanen bundet til sidekædeamidnitrogenet af en asparagin (Asn) rest inden for tripeptidsekvenserne Asn-X-Ser / Thr, hvor X kunne være enhver aminosyre undtagen prolin.

Glycaner kan vedtage lineære eller forgrenede strukturer og er sammensat af monosaccharider eller polysaccharider kovalent bundet af glycosidbindinger. I prokaryoter viser glycaner normalt mangfoldighed i sukkersammensætning og struktur i forhold til eukaryote glycaner4. Desuden er to forskellige bakterielle glykosyleringsveje, der adskiller sig i, hvordan glycanen samles og overføres til acceptorproteinet, blevet beskrevet: sekventiel og en bloc glycosylering 5,6. Til sekventiel glykosylering opbygges den komplekse glycan direkte på proteinet ved successiv tilsætning af monosaccharider. I en blokglykosylering overføres en færdigmonteret glycan til proteinet fra et lipidbundet oligosaccharcharid ved hjælp af en specialiseret oligosaccharyltransferase (OTase). Begge veje har vist sig at være involveret i N- og O-glycosyleringsprocesser7.

Proteinglykosylering har en rolle i moduleringen af proteiners fysisk-kemiske og biologiske egenskaber. Tilstedeværelsen af en glycan kan påvirke, hvordan proteinet interagerer med dets ligand, hvilket påvirker proteinets biologiske aktivitet, men kan også påvirke proteinstabilitet, opløselighed, modtagelighed for proteolyse, immunogenicitet og mikrobe-værtsinteraktioner 8,9. Imidlertid kan flere glykosyleringsparametre, såsom antallet af glycaner, glycansammensætning, position og fastgørelsesmekanisme, også påvirke proteinfunktion og struktur.

Glycosyltransferaser (GT'er) er de vigtigste enzymer i biosyntesen af komplekse glycaner og glycokonjugater. Disse enzymer katalyserer den glykosidiske bindingsdannelse mellem en sukkermoiety fra et aktiveret donormolekyle og en specifik substratacceptor. GT'er kan anvende både nukleotider og ikke-nukleotider som donormolekyler og målrette mod forskellige substratacceptorer, såsom proteiner, saccharider, nukleinsyrer og lipider10. Derfor er det vigtigt at forstå GT'er på molekylært niveau for at identificere deres virkningsmekanismer og specificitet og muliggør også forståelse af, hvordan sukkersammensætningen af glycaner, der ændrer relevante molekyler, er relateret til patogenicitet. Carbohydrate Active Enzyme Database (CAZy)11 klassificerer GT'er i henhold til deres sekvenshomologi, hvilket giver et prædiktivt værktøj, da den strukturelle fold og virkningsmekanismer i de fleste GT-familier er invariante. Fire grunde gør det imidlertid vanskeligt at forudsige substratspecikaliteten for mange GT'er: 1) der er ikke bestemt noget klart sekvensmotiv, der bestemmer substratspecikaliteten i prokaryoter12, 2) mange GT'er og OTaser viser substratpromiskuitet 13,14, 3) funktionelle GT'er er vanskelige at producere i højt udbytte i rekombinant form, og 4) identifikationen af både donor- og acceptorsubstrater er kompleks. På trods af dette har nylige mutageneseundersøgelser gjort det muligt at opnå betydelige fremskridt i forståelsen af katalytiske mekanismer og trække binding af GT'er.

I bakterier synes O-glycosylering at være mere udbredt end N-glycosylering. O-glycosyleringsstederne viser ikke en konsensussekvens, og mange af de O-glycosylerede proteiner udskilles eller celleoverfladeproteiner, såsom flagelliner, pili eller autotransportører1. Flagellinglykosylering viser variation i antallet af acceptorsteder, glykansammensætning og struktur. For eksempel har Burkholderia spp flagelliner kun et acceptorsted, mens flagelliner i Campylobacter jejuni har så mange som 19 acceptorsteder15,16. Desuden er glycan for nogle bakterier et enkelt monosaccharid, mens andre bakterier besidder heterogene glycaner kompromitteret af forskellige monosaccharider for at danne oligosaccharider. Denne heterogenicitet forekommer selv blandt stammer af samme art. Helicobacter flagelliner er kun modificeret af pseudaminsyre (PseAc)17, og Campylobacter flagelliner kan modificeres af PseAc, acetamidinoformen af pseudaminsyre (PseAm) eller legionaminsyre (LegAm) og glycaner afledt af disse sukkerarter med acetyl, N-acetylglucosamin eller propioniske substitutioner18,19. I Aeromonas modificeres flagelliner af glycaner, hvis sammensætning spænder fra et enkelt PseAc-syrederivat til et heteropolysaccharid20, og fastgørelsen af glycaner til flagellinmonomererne sker altid via et PseAc-derivat.

Generelt er glykosylering af flagelliner afgørende for flagellar filamentsamling, bevægelighed, virulens og værtssotientitet. Men mens flagelliner af C. jejuni16, H. pylori17 og Aeromonas sp. 21 kan ikke samles i filament, medmindre proteinmonomererne er glykosylerede, Pseudomonas spp. og Burkholderia spp. 15 kræver ikke glykosylering til samling af flageller. Desuden påvirker ændringer i flagellaglycanens sukkersammensætning i nogle C. jejuni-stammer bakterie-værtsinteraktion og kan spille en rolle i at undgå visse immunresponser16. Autoagglutination er en anden fænotypisk egenskab påvirket af ændringer i sammensætningen af glycaner forbundet med flagelliner. En lavere autoagglutination fører til en reduktion i evnen til at danne mikrokolonier og biofilm22. I nogle bakterier var flagellas evne til at udløse et proinflammatorisk respons forbundet med flagellinglykosylering. I P. aeruginosa inducerer glycosyleret flagellin således et højere proinflammatorisk respons end unglycosyleret23.

Aeromonas er gramnegative bakterier, der er allestedsnærværende i miljøet, hvilket gør det muligt for dem at være ved grænsefladen mellem alle One Health-komponenter 24. Mesophilic Aeromonas har et enkelt polært flagellum, som er konstitutivt produceret. Mere end halvdelen af kliniske isolater udtrykker også lateral flagellin, der kan induceres i medier eller plader med høj viskositet. Forskellige undersøgelser har relateret begge flagellatyper med de tidlige stadier af bakteriel patogenese25. Mens polære flagelliner, der er rapporteret til dato, er O-glycosyleret ved 5-8 Ser- eller Thr-rester af dets centrale immunogene domæner, er laterale flagelliner ikke O-glycosyleret i alle stammerne. Selvom polære flagellaglycaner fra forskellige stammer viser mangfoldighed i deres kulhydratsammensætning og kædelængde20, har det bindende sukker vist sig at være et pseudaminsyrederivat.

Målet med dette manuskript er at beskrive en metode til opnåelse af nulmutanter i specifikke GT'er eller kromosomale regioner indeholdende GT'er for at analysere deres involvering i biosyntesen af relevante polysaccharider og i bakteriel patogenicitet samt selve glycanens rolle. Som et eksempel identificerer og sletter vi en kromosomal region, der indeholder GT'er af Aeromonas for at fastslå dets involvering i polær flagellinglykosylering og analysere flagellinglycanens rolle. Vi viser, hvordan man sletter en bestemt GT for at etablere dens funktion i biosyntesen af denne glycan og rollen som modificeret glycan. Selvom man bruger Aeromonas som et eksempel, kan princippet bruges til at identificere og studere flagellaglykosyleringsøer af andre gramnegative bakterier og analysere funktionen af GT'er involveret i biosyntesen af andre glycaner såsom O-antigen lipopolysaccharid.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den skematiske gengivelse af proceduren er vist i figur 1.

1. Bioinformatisk identifikation af flagellaglykosyleringsøen (FGIs) i Aeromonas

  1. For at identificere pseAc biosyntetiske klynger i Aeromonas-genomerne skal du bruge tblastnværktøjet fra NCBI-databasen26. Først skal du hente ortologe proteiner til PseC og PseI af A. piscicola AH-3 (identifikationskoder er OCA61126.1 og OCA61113.1) fra databaser over sekventerede Aeromonas-stammer , og brug derefter tblastnværktøjet til at søge i deres oversatte nukleotidsekvenser.
    BEMÆRK: PSE-generne flankerer Aeromonas FGI'erne med pseB og pseC placeret i den ene ende af klyngen og pseI i den anden ende. Placeringen af resten af pse-generne kan være forskellig fra den ene FGI-gruppe til den anden.
  2. I betragtning af at disse polære flagellingener af mange stammer støder op til FGI'erne, skal du bruge tblasten fra NCBI-databasen til at finde ortologe proteiner til de polære flagelliner FlaA og FlaB fra A. piscicola AH-3 (identifikationskoder er OCA61104.1 og OCA61105.1) og de gener, der koder for dem.
  3. Derudover indeholder Aeromonas FGI'er involveret i biosyntesen af heteropolysaccharidiske glycaner (gruppe II)27 flere gener, der koder for enzymer involveret i fedtsyresyntesen, såsom luxC og luxE. Brug tblasten fra NCBI-databasen til at finde ortologe proteiner til LuxC af A. piscicola AH-3 (identifikationskode er OCA61121.1) og det gen, der koder for det.

2. Generation af null mutanter i flagella glycosylering ø gener

BEMÆRK: Denne mutagenesemetode er baseret på alleludveksling af polymerasekædereaktion (PCR) in-frame deletionsprodukter ved anvendelse af selvmordsvektoren pDM428 (GenBank: KC795686.1). Replikation af pDM4-vektor er lambda pir-afhængig , og den komplette alleludveksling tvinges ved at udnytte sacB-genet placeret på vektoren.

  1. Konstruktion af PCR-produkter til sletning i rammen.
    1. Design to par primere, der forstærker DNA-regioner opstrøms (A- og B-primere) og nedstrøms (C- og D-primere) af det valgte gen eller område, der skal slettes (figur 2B).
    2. Sørg for, at primer A og D har mere end 600 bp opstrøms fra henholdsvis starten og nedstrøms fra stoppet af det eller de gener, der skal slettes. Disse to primere skal i 5'-enden indeholde et restriktionssted for en endonuklease, der tillader kloning i pDM4.
      BEMÆRK: Begrænsningsstedet, der er inkluderet i 5' enden af A- og D-primere, bør ikke være det samme som steder inden for AB- eller CD-ampliconer.
    3. Sørg for, at primer B og C er inden for genet, der skal slettes, eller inde i henholdsvis det første og sidste gen i den region, der skal slettes. Sørg for, at begge primere (B og C) er i rammen og placeret mellem 5-6 kodoner inde i genet. Sørg desuden for, at begge primere i 5'-enden inkluderer en 21 bp komplementær sekvens (tabel 1), der gør det muligt at forbinde DNA-ampliconerne AB og CD.
    4. Den valgte Aeromonas-stamme dyrkes i 5 ml tryptisk sojabouillon (TSB) natten over (O/N) ved 30 °C. Brug et kommercielt tilgængeligt sæt til genomisk DNA-oprensning og følg producentens anvisninger (Table of Materials). Kvantificer 2 μL af det rensede DNA ved hjælp af et spektrofotometer.
      BEMÆRK: Brug dobbeltdestilleret vand som et emne, hvor instrumentet er indstillet til at registrere absorbans ved 260 nm. Registrer absorbans med 2 μL renset DNA 3-5 gange, og beregn en gennemsnitlig absorbansaflæsning. Brug Beer-Lambert-loven til at beregne DNA-koncentrationen, hvor A = Ɛ.c.l., hvor "A" er absorbans, "Ɛ" er den molære gennemsnitlige udryddelseskoefficient for DNA, "c" er DNA-koncentration, og "l" er stilængden (se producentens instruktion for stilængden for hvert instrument).
    5. Brug 100 ng renset kromosomalt DNA som skabelon i to sæt asymmetriske PCR'er med A-B- og C-D-primere (Table of Materials). Brug et 10:1 molært forhold mellem A:B og D:C primerpar (supplerende materiale).
      BEMÆRK: Asymmetriske PCR'er tillader præferenceforstærkning af den ene streng i skabelonen mere end den anden.
    6. Analyser PCR-produkterne ved elektroforese i en 1% agarosegel. Brug TAE (40 mM Tris-acetat, 1 mM EDTA) som gelløbsbuffer og en effektindstilling på 8 V/cm. For at visualisere DNA tilsættes ethidiumbromid (0,5 μg / ml) til gelen og visualiserer PCR-produkterne ved hjælp af en biobilleddannelsesstation (Table of Materials).
    7. Punktafgift amplikonerne fra gelen ved hjælp af en skalpel, rens efter producentens protokol (Table of Materials) og kvantificer dem.
    8. Deltag i AB- og CD-ampliconer ved deres 21 bp overlappende sekvenser i 3' slutningen af PCR-produkter (figur 3). Bland 100 ng af hver amplicon (AB og CD) i et PCR-rør med PCR-reagenser (pre-AD PCR), men uden primere, og forstræk ved hjælp af termocyklistprogrammet (supplerende materiale). Derefter tilsættes 100 μM A- og D-primere til reaktionen (AD PCR) og forstærkes som et enkelt fragment (supplerende materiale).
    9. Analyser PCR-produktet (AD amplicon) ved elektroforese i en 1% agarosegel ved hjælp af de betingelser, der er beskrevet i trin 2.1.6, udsej amplicon fra gelen, rens efter producentens protokol og kvantificer amplicon (Tabel over materialer).
  2. Konstruktion af pDM4 rekombinant plasmid med in-frame deletion.
    1. En O/N-kultur af Escherichia coli cc18λ pir indeholdende pDM4 dyrkes i Luria-Bertani (LB) Miller bouillon (10 ml) med chloramphenicol (25 μg/ml) ved 30 °C.
    2. Spin ned kulturen ved 5.000 x g ved 4 ° C og suspendere pelleten i 600 μL sterilt destilleret vand. Udfør ekstraktion og oprensning af plasmid pDM4 ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt plasmidrensningssæt efter udbyderens anvisninger (Table of Materials).
    3. Fordøje 1 μg pDM4 og 400 ng AD-amplicon i 2 timer med en endonuklease, der er i stand til at fordøje begge ender af AD-ampliconen og kloningsstedet for pDM4 (figur 3). Følg enzymproducentens protokol for reaktionsbetingelser (Table of Materials).
    4. Ryd op i det fordøjede plasmid og amplicon ved hjælp af et DNA-rensningssæt og kvantificer dem efter producentens anvisninger (Table of Materials).
    5. For at forhindre religation af den lineariserede pDM4 skal fosfatgruppen fjernes fra begge 5' ender ved hjælp af det alkaliske phosphataseenzym efter producentens anvisninger (Table of Materials). Ryd derefter op i det behandlede plasmid og kvantificer det ved hjælp af et spektrofotometer som beskrevet i trin 2.1.4 (Materialetabel).
    6. Kombiner 150 ng af den fordøjede og fosfatase alkaliske behandlede pDM4 med 95-100 ng fordøjet AD-amplicon ved et molært vektor: indsæt-forhold på 1: 4. Forbered ligationsreaktionen i et volumen på 15 μL efter producentens anvisninger (Materialetabel).
    7. Inkuber O/N ved 20 °C eller i weekenden ved 4 °C. Efter inkubation inaktiveres T4-ligasen ved 70 °C i 20 minutter.
    8. Brug ligation til at indføre plasmidet i Escherichia coli MC1061λpir stamme ved elektroporation. Brug elektrokompetente bakterier og 2 mm-gap elektroporation kuvetter.
  3. Fremstilling af elektrokompetent E. coli og elektroporation af pDM4 rekombinant plasmid
    1. Inokuler en enkelt koloni af E. coli MC1061λpir stamme i Luria-Bertani (LB) Miller bouillon og dyrk O / N ved 30 ° C med 200 o / min rystelser.
    2. 2 ml af bakteriekulturen fortyndes i 18 ml LB-bouillon og inkuberes ved 30 °C med omrystning (200 o/min.), indtil der opnås en optisk densitet (OD600) på mellem 0,4-0,6.
    3. Pellets bakteriekulturen ved centrifugering ved 5.000 x g og 4 °C i 15 min. Supernatanten kasseres, og pillen suspenderes i 40 ml køletdestilleret H20.
    4. Gentag dette rengøringstrin to gange mere for at fjerne alle kultursalte. Til sidst suspenderes pelleten i 4 ml kølet destilleretH20og overføres 1 ml af suspensionen til hver af fire koniske 1,5 ml mikrofugerør.
    5. Pellets bakteriekulturen ved centrifugering ved 14.000 x g og 4 °C i 5 min. Fjern supernatanten uden at forstyrre pelleten, og suspender hver pellet i 100 μL køletdestilleret H20.
    6. Tilsæt 3-3,5 μL af ligationsblandingen til hvert rør og inkuber på is i 5 minutter. Overfør derefter indholdet af hvert rør til en kølet elektroporationskuvette med 2 mm mellemrum og påfør 2 kV, 129 Ω og tidskonstant omkring 5 ms.
      BEMÆRK: Forkøl elektroporationskilleterne på is. Oprethold bakterierne på is under hele proceduren.
    7. Efter elektroporation tilsættes 250 μL SOC-medium til hver af de fire kuvetter for at genvinde deres indhold, overføres til et kulturrør (ca. 1 ml) og inkuberes i 1 time ved 30 °C med omrystning (200 o / min).
    8. Plade de transformerede celler på Luria-Bertani (LB) agarplader suppleret med chloramphenicol (25 μg / ml) for at sikre, at alle kolonier, der vokser i pladen, har plasmidrygraden.
    9. Pluk nogle kolonier fra LB-agarpladerne med chloramphenicol og inkuber O /N ved 30 °C. Når kolonier vokser, skal du kontrollere indsættelsen af sletningskonstruktionen i pDM4 ved hjælp af PRIMERE, DER FLANKERER pDM4-KLONINGSSIDEN: pDM4FOR og pDM4rev (tabel 1) og lyserede kolonier som skabelon (Supplerende materiale).
    10. Vælg en koloni med et sterilt tandstikker og dypp det i et 1,5 ml rør indeholdende 15 μL 1% Triton X-100, 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 2 mM EDTA pH 8,0. Inkuber rørene ved 100 °C i 5 minutter og derefter 1 minut på is.
    11. Spin rørene i en mikrofuge ved 12.000 x g i 10 minutter for at pelletere bakterier og snavs. Brug 1 μL af supernatanten som skabelon i PCR-reaktionen (Table of Materials). Udglødningstemperaturen for primerparret er 50 °C, og PCR-reaktionen kræver 10 % DMSO (supplerende materiale).
    12. Inokuler de kolonier, der forstærkede produktet af interesse i 10 ml LB bouillon med chloramphenicol (25 μg / ml) og vokse O / N ved 30 ° C. Plasmidet ekstraheres fra kulturer som beskrevet i trin 2.2.1-2.2.2. Sekvens ved hjælp af pDM4-primere efter producentens anvisninger (Materialetabel).
  4. Overførsel af sletning i rammen til Aeromonas stamme
    BEMÆRK: Det pDM4-rekombinante plasmid skal indføres i det valgte Aeromonas stamme ved triparental parring (Figur 4). Aeromonas stammen skal være rifampicinbestandig for at blive valgt efter triparental parring. Dyrk derfor de udvalgte stammer O/N på TSB ved 30 °C, centrifuge 2 ml, 4 ml og 6 ml kulturer ved 5.000 x g i 15 minutter suspenderes hver pellet i 100 μL TSB og plade i TSA med rifampicin (100 μg/ml).
    1. O/N-kulturer af E. coli MC1061λpir forberedes med det pDM4-rekombinante plasmid på LB-agar med 25 μg/ml chloramphenicol (donorstamme), Aeromonas-stammen rifampicinresistent på TSA med 100 μg/ml rifampicin (recipientstamme) og E. coli HB101 med pRK2073-plasmidet på LB-agar med 80 μg/ml spectinomycin (hjælperstamme) ved 30 °C.
    2. Når kolonierne er vokset, suspenderes det samme antal kolonier (10-15 kolonier) af donor-, modtager- og hjælperstammerne forsigtigt med en steril tandstikker i tre LB-rør med 150 μL LB.
    3. Derefter blandes de tre bakterielle suspensioner på en LB-agarplade uden antibiotika i to dråber hos en modtager: hjælper: donorforhold på 5: 1: 1 (50 μL modtager, 10 μL af donoren og 10 μL hjælper). Inkuber pladen med forsiden mod O/N ved 30 °C. Udfør negativ kontrol af konjugering ved hjælp af donorstammen uden rekombinant plasmid.
      BEMÆRK: Hjælperstammen bærer det konjugative plasmid pRK2073 og hjælper overførslen af pDM4 til Aeromonas. Brug ikke hvirvel til at suspendere donor-, modtager- og hjælperstammerne for at undgå at bryde pili.
    4. Høst bakterier fra LB agar pladen ved at tilsætte 1 ml LB bouillon og sprede den med en steril glasspreder for at opnå en bakteriel suspension. Brug en pipette til at overføre bakteriesuspensionen til et konisk 1,5 ml mikrofugerør og hvirvel kraftigt.
    5. For at udvælge modtagerkolonierne indeholdende det pDM4-rekombinante plasmid, plade 100 μL af den høstede bakteriesuspension på LB-agarplader med rifampicin (100 μg/ml) og chloramphenicol (25 μg/ml).
    6. 200 μL og 600 μL af prøverne spindes ned i en mikrofuge ved 5.000 x g i 15 minutter, pelleten suspenderes i 100 μL LB bouillon og plade på LB agar med rifampicin (100 μg/ml) og chloramphenicol (25 μg/ml). Inkuber alle plader i 24-48 timer ved 30 °C.
    7. De dyrkede kolonier afhentes, overføres til LB-plader med rifampicin (100 μg/ml) og chloramphenicol (25 μg/ml), og de inkuberes O/N ved 30 °C. Bekræft derefter, at kolonierne er Aeromonas vedoxidasetesten 29 , og at pDM4-rekombinant plasmid blev indsat (første rekombination) i det specifikke kromosomale område ved PCR ved hjælp af E- og F-primerne (supplerende materiale), som binder uden for regionen forstærket med A- og D-primerne (materialetabellen). Som beskrevet i trin 2.3.11 skal du bruge 1 μL lyserede kolonier som skabelon.
    8. For at fuldføre den alleliske udveksling for sletning i rammen skal du tvinge kolonierne med det integrerede selvmordsplasmid til en anden rekombination. De rekombinante kolonier dyrkes i 2 ml LB med 10 % saccharose og uden antibiotika, O/N ved 30 °C.
    9. Plade 100 μL af bakteriekulturerne fra trin 2.4.8 på LB agarplade med saccharose (10%). Desuden plade 100 μL af forskellige kulturfortyndinger (10-2-10-4) og inkuberer O/N ved 30 °C.
    10. For at bekræfte tabet af pDM4 skal du afhente kolonierne, overføre til LB-plader med og uden chloramphenicol (25 μg/ml), inkubere dem O/N ved 30 °C og derefter vælge de chloramphenicolfølsomme kolonier.
    11. Analyser de følsomme kolonier ved PCR ved hjælp af E-F-primerparret og 1 μL lyserede kolonier som skabelon (Tabel over materialer og supplerende materiale). Vælg de kolonier, hvis PCR-produkt korrelerede med størrelsen af den slettede konstruktion.

3. Motilitetsanalyser

BEMÆRK: I nogle bakteriearter med glykosyleret flagella påvirker ændringer i niveauerne af glycosylering eller glycansammensætning samlingen af flagelliner, hvilket normalt afspejles som en motilitetsreduktion eller fravær af bevægelighed. Derfor blev der udført to motilitetsassays med null-mutanterne.

  1. Motilitetsassay i flydende medier
    1. Kultur Aeromonas stammer O/N i 1 ml TSB ved 25-30 °C. For at klæbe et mikroskopdæksel glider til et udgravet dias, skal du hente en lille mængde silikone med spidsen af et tandstikker og lægge en lille dråbe på de fire hjørner af dækslets dias. Aflejr derefter 1 μL af Aeromonas-kulturen midt på dækslet og bland en dråbe friske TSB-medier (2 μL) i.
    2. Placer et udgravet dias på dækslets dias. Match udgravningen med den aflejrede dråbe, tryk forsigtigt, og vend glideren på hovedet.
    3. Analyser svømmemotilitet ved lysmikroskopi ved hjælp af et optisk mikroskop (Table of Materials) med et 100x mål ved hjælp af nedsænkningsolie.
      BEMÆRK: Aeromonas ' vildtypestamme skal anvendes som den positive kontrol. Som en negativ kontrol skal du bruge en ikke-flagelleret bakterie som Klebsiella.
  2. Motilitetsassay i halvfaste medier
    1. Kultur Aeromonas stammer O/N i TSB (1 ml) ved 25-30 °C. Derefter overføres 3 μL af kulturen til midten af en blød agarplade (1% trypton, 0,5% NaCl, 0,25% bacto agar) og inkuberer pladen med forsiden op mod O / N ved 25-30 ° C.
    2. Ved hjælp af en lineal måles bakteriemigrationen gennem agaren fra pladens centrum mod periferien.

4. Flagella rensning

  1. Isolering af flagella forankret til bakterieoverfladen
    1. Kultur Aeromonas stammer O/N i TSB (10 ml) ved 25-30 °C. Derefter udvides kulturen til en kolbe med TSB (900 ml) og lad den vokse O/N ved 25-30 °C med omrystning (200 o/min).
    2. Centrifuge ved 5.000 x g i 20 minutter ved 4 °C. Ophæng pelleten i 20 ml 100 mM Tris-HCl-buffer (pH 7,8).
    3. For at fjerne den forankrede flagella skal du skære suspensionen i en hvirvel med en glasstang (2-3 mm diameter) i 3-4 minutter og derefter passere gentagne gange (mindst seks gange) gennem en 21-G sprøjte.
    4. Pelletsbakterier med to på hinanden følgende centrifugeringer ved 4 °C: først ved 8.000 x g i 30 min. Fjern supernatanten og centrifugen ved 18.000 x g i 20 minutter. Saml supernatanten, som indeholder fri flagella.
    5. Ultracentrifugering af supernatanten ved 100.000 x g i 1 time ved 4 °C og suspendere pelleten i 150 μL 100 mM Tris-HCl (pH 7,8) plus 2 mM EDTA-buffer. Pelleten indeholder flagellafilamenter.
    6. Analyser 5-10 μL af den resuspenderede pellet fra trin 4.1.5 ved elektroforese i en 12% SDS-Polyacrylamid gel og visualiser proteinerne ved hjælp af Coomassie blå farvning.
      BEMÆRK: Følg producentens anvisninger for proteinelektroforese og gelfarvning. Som en positiv kontrol af glycosyleret flagellin skal du bruge den rensede flagella af vildtypestammen. Rens den berigede fraktion af flagella i en cæsiumchlorid (ClCs) gradient.
  2. Cæsiumchloridgradient for at rense flagella.
    1. Bland 12,1 g CsCl med 27 ml destilleretH20.
    2. Overfør den berigede del af flagellaen (150 μL) til et tyndvægget ultraklart rør (14 mm x 89 mm) (Materialetabel) og fyld det med 12 ml CsCl-opløsning.
    3. Ultracentrifugering af røret ved 60.000 x g i 48 timer ved 4 °C i en svingende skovlrotor (Table of Materials).
    4. Saml flagellabåndet i CsCl-gradienten med en sprøjte og dialyser mod 100 mM Tris-HCl (pH 7,8) plus 2 mM EDTA. Derefter analyseres den dialyserede flagella ved elektroforese i en 12% SDS-Polyacrylamidgel og Coomassie blå farvning (trin 4.1.6) eller ved massespektrometri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Denne metode giver et effektivt system til at generere nulmutanter i gener eller kromosomale regioner i Aeromonas , der kan påvirke flagellaglykosylering og flagellafilamentets rolle (figur 1).

Protokollen starter med bioinformatisk identifikation af formodede FFI'er og de gener, der koder for GT'er, der er til stede i denne region. I Aeromonas er den kromosomale placering af FGIs baseret på påvisning af tre typer gener: gener involveret i biosyntesen af pseudaminsyren (pseI og pseC), polære flagellingener og luxC. Stammer, hvis polære flageller er glycosyleret af et enkelt pseudaminsyrederivat, såsom A. hydrophila AH-130, har ikke gener, der koder for GT'er mellem pse-generne placeret i FGIs gruppe I27. De fleste af de stammer, der tilhører denne FGI-gruppe, viser polære flagellingener, der støder op til denne region. I modsætning hertil viser stammer, hvis polære flagella er glycosyleret med en heteropolysaccharidglycan, såsom A. piscicola AH-319, forskellige gener, der koder for GT'er nedstrøms for luxC, lokaliseret mellem pse-gener i FGIs gruppe II27, og de støder ikke altid op til polære flagellingener (figur 2A).

Regionen involveret i biosyntesen af flagella heteropolysaccharidglycan og funktionen af formodede GT'er indeholdt der blev bekræftet ved konstruktionen af nullmutanter. Genereringen af hver mutant kræver fire primere: A, B, C og D (tabel 1). Primer B annealer 5-6 kodoner nedstrøms for starten af genet (fgi-4) eller det første gen i hoben (fgi-1), der skal slettes, og primer A annealer 600-800 bp opstrøms fra starten af dette gen (fgi-4 eller fgi-1). Primer C-annealer opstrøms for de sidste 5-6 kodoner af genet (fgi-4) eller det sidste gen i hoben (fgi-12), der skal slettes, og primer D-annealer 600-800 bp nedstrøms fra stoppet af dette gen (fgi-4 eller fgi-12) (figur 2B). Primer A og D til sletning af fgi-klynge og fgi-4 af A. piscicola AH-3 indeholder et restriktionssted for endonukleasen BamHI i deres 5' ender (tabel 1). Denne endonuklease har ingen interne mål i AB eller CD PCR-fragmenter. Et vigtigt skridt er designet af B- og C-primere. Begge skal være in-frame for ikke at bryde den åbne læserammen for gen eller fragment, der skal slettes. De 21 bp komplementære sekvenser i 5' enden af B- og C-primere tillader generering af AB- og CD-ampliconer med 3' ende komplementære sekvenser, som tillader sammenføjning og udvidelse af disse amplikoner. PCR-programmet til at forbinde og udvide ampliconerne består af et indledende denaturaliseringstrin og fem cyklusser med en udglødningstemperatur på 54 ° C (supplerende materiale). Derefter tillader tilføjelsen af A- og D-primere forstærkning af det udvidede fragment (figur 3). Den enzymatiske virkning af BamHI giver anledning til en amplicon med klæbrige ender, der er kompatible til ligation med selvmordsvektoren pDM4 fordøjet med BglII.

I betragtning af at pDM4 er et λpirafhængigt plasmid, blev ligationsproduktet elektroporated i E. coli-stammen MC1061λpir (denne thr1 leu6 proA2 his4 argE2 lacY1 galK2 ara14 xyl5 supE44 λ pir) og valgt i chloramphenicolplader. pDM4 har ikke et direkte system til at vælge de rekombinante kloner, og kolonier blev analyseret af PCR med et pDM4-primerpar (pDM4for og pDM4rev) (tabel 1 og supplerende materiale), der flankerer kloningsområdet. E. coli-stammen MC1061λpir uden pDM4 blev anvendt som den negative kontrol i PCR-reaktionen.

For at udføre den alleliske udveksling blev det rekombinante pDM4-plasmid overført til modtagerstammen A. piscicola AH-3. I betragtning af at mange Aeromonas ikke kan transformeres ved elektroporation, blev den rekombinante pDM4 overført ved konjugering ved hjælp af triparental parring (figur 4). For at vælge de transkonjugerende kolonier bruger vi en rifampicin-resistent modtagerstamme, som gør det muligt at vælge Aeromonas-stammen fra konjugationsparringen. Desuden blev de udvalgte kolonier underkastet oxidasetesten, fordi mens Aeromonas er oxidase-positiv, er E. coli oxidase-negativ. Den første og anden rekombination blev bekræftet af PCR med eksterne primere (E- og F-primere) af forstærkede regioner (AB- og CD-fragmenter) (tabel 1, supplerende materiale og figur 5A).

I Aeromonas er glykosylering af polære flagelliner afgørende for samlingen af det flagellare filament. Tilstedeværelsen af funktionel polær flagella blev analyseret ved hjælp af motilitetsassays af bakteriekolonierne med slettede GT-gener eller region. Lette mikroskopi-assays viste, at svømmemotiliteten i flydende medium blev reduceret i begge mutanter i forhold til vildtypestammen. Desuden viste begge en nedsat radial ekspansion i forhold til vildtypestammen, når bevægeligheden blev analyseret på blød agar (figur 5B). I betragtning af at begge mutanter var i stand til at svømme, men med nedsat bevægelighed i forhold til vildtypestammen, blev deres polære flagella renset, og flagellinmolekylvægten blev analyseret i en 12% SDS-polyacrylamidgel. Denne analyse viste, at begge mutanter har polære flagelliner med lavere molekylvægt end vildtypestammen (figur 5C), hvilket tyder på ændringer i flagellaglycanen. Flagella renset af CsCl-gradienter (figur 5C) vil blive anvendt i massespektrometriassays til at identificere glycansammensætning og nulmutanter, der anvendes i biofilm, vedhæftning eller andre assays til at identificere glycan- og glycansammensætningens rolle.

Figure 1
Figur 1: Oversigt over de trin, der anvendes i denne procedure. Skema over den proces, der er beskrevet i protokollen til identifikation af flagellaglykosyleringsøen Aeromonas, og GT'er involveret i glycanbiosyntese. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Bioinformatisk detektion af kromosomale regioner og primerdesign. A) Skema over kromosomale regioner identificeret i A. hydrophila AH-1 og A. piscicola AH-3. A. hydrophila AH-1 flagellaglykosyleringsø er repræsentativ for stammer, hvis flagellaglycan kun har et pseudaminsyrederivat, og A. piscicola AH-3 flagellaglykosyleringsø er repræsentativ for stammer, hvis flagellaglycan er et heteropolysaccharid. Gener betegnet med sort er involveret i biosyntesen af pseudaminsyre, og de betegnede gule er formodede GT'er. (B) Skema over den kromosomale placering af primerpar designet til PCR-in-frame-deletioner. Blå kasser i A- og D-primere indeholder begrænsningsbindingsstedet for en endonuklease. Røde felter i B- og C-primere indeholder 21 bp komplementære sekvenser. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Skema, der viser metoden til at konstruere PCR-sletninger i rammen og ligering til selvmordsplasmidet pDM4. MCS: multi kloningssted, CmR: chloramphenicolresistente gener, sacB: koder for Bacillus subtilis levansucrase, hvis ekspression induceres af saccharose og er dødelig for gramnegative bakterier og mob: mobiliseringsgener. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Triparental bøjning og procedure anvendt til allelisk udveksling. Første rekombination sker på grund af fraværet af λpir i Aeromonas-stammerne og giver anledning til integration af det rekombinante plasmid i det valgte gen. Anden rekombination induceres af vækst i LB med 10% saccharose, hvilket fører til ekspression af sacB-gen , og plasmidet udskæres fra kromosomet. Efter cross-over kan vildtypen eller det muterede gen forblive på bakteriekromosomet. Null mutanter vælges af PCR med eksterne primere. RifR: rifampicin-resistent; CmR: chloramphenicol resistent; SpcR: spectinomycin resistent. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 5
Figur 5: Bekræftelse af null mutanter og fænotypisk analyse af polar flagella. A) PCR med fgi-4 eksterne primere (EF-primere) af A. piscicola AH-3 for at bekræfte alleludvekslingen efter anden rekombination i chloramphenicolfølsomme kolonier. Bane WT: A. piscicola AH-3; bane 1-8: chloramphenicolfølsomme kolonier af den anden rekombination; St: HyperLadder 1 Kb markør. Bane 1-3 og 5-8 viser kolonierne med vildtype fgi-4 gen som bane WT. Bane 4 viser en koloni med det slettede fgi-4 gen. (B) Motilitet på blød agar af A. piscicola AH-3 og null mutanter i fgi-regionen (AH-3ΔFgi) og fgi-4 gen (AH-3ΔFgi-4) ved 25 ° C. (C) Polært flagellum fra AH-3 (bane1) og nullmutanterne i fgi-regionen (bane 2) og fgi-4 genet (bane 3), isoleret, renset i CsCl-gradienter, analyseret i 12% SDS-PAGE og farvet ved hjælp af Coomassie blå. Størrelse standard (St). Klik her for at se en større version af denne figur.

Primer navn Sekvens i 5' til 3' retning Bruges til
A. piscicola AH-3
A-Flgi1 CGCGGATCCGACTGTACCCGTTTCAATCA fgi mutant
B-Flgi1 CCCATCCACTAAACTTAAACA GATCACCTCGAACTCGAAA
C-Flgi12 TGTTTAAGTTTAGTGGATGGG GGAACCTTAAATGCCATGA
D-Flgi12 CGCGGATCCCAGTCTTCAGCTTCCATCC
E-Flgi1 ACCCGCTTCATTCGCTAT
F-Flgi12 TCCGATTTTCTGACTCAGGG
A-Fgi4 CGCGGATCCGATGCGTACGCTAATATGAA fgi-4 mutant
B-Fgi4 CCCATCCACTAAACTTAAACA CATATTATCTTGCCCCTGAT
C-Fgi4 TGTTTAAGTTTAGTGGATGGG ATGGAGCTAATCACTCGTTT
D-Fgi4 CGCGGATCCACATATCAACCCCCAAC
E-Fgi4 ATTTCCCTGCCAAATACG
F-Fgi4 CCTGCCAACAGGATGTAAG
pDM4 vektor
pDM4for AGTGATCTTCCGTCACAGG Indsættelser i pDM4-vektoren
pDM4rev AAGGTTTAACGG TTGTGGA

Tabel 1: Primere anvendt til konstruktion af nullmutanter. Overlappende regioner i primere B og C understreges. Bam HI-webstedet er med fed skrift i primerne A og D.

Supplerende materiale. Reagenser og reaktioner, der anvendes i asymmetriske PCR'er til opnåelse af AB- og CD-ampliconer, Pre-AD- og AD-PCR'er til at udvide og opnå AD-amplikonerne, pDM4 PCR'er til at verificere indsættelsen af slettet konstruktion i pDM4-vektor og EF PCR'er til at verificere den første og anden rekombination. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det kritiske tidlige trin i denne metode er identifikationen af regioner, der er involveret i glykosylering af flageller og formodede GT'er, fordi disse enzymer viser høj homologi og er involveret i mange processer. Bioinformatisk analyse af Aeromonas-genomer i offentlige databaser viser, at denne region støder op til den polære flagellaregion 2, som indeholder flagellingenerne i mange stammer og indeholder gener, der er involveret i biosyntesen af pseudaminsyre27. Dette har gjort det muligt at udvikle en retningslinje til påvisning af flagellaglykosyleringsøer i Aeromonas , der kan bruges til at identificere denne region i andre bakterier, hvis flagellar glycan indeholder pseudaminsyrederivater. Derudover, selvom denne metode beskriver, hvordan man analyserer en genklynge involveret i flagellaglykosylering, kan den også bruges til at studere gener, der koder for proteiner, der kan være involveret i flagelladannelse, rotation eller regulering i forskellige gramnegative bakterier.

Også vigtigt i genereringen af PCR-sletninger i rammen er designet af B- og C-primere. Disse primere skal lokaliseres 5-6 kodoner nedstrøms for start (B-primer) og opstrøms for stop (C-primer) for det valgte gen eller område, der skal slettes, og bør ikke bryde den åbne læseramme. Desuden er en vigtig faktor at overveje længden af homologiområdet forstærket for at generere AB- og CD-ampliconerne. Denne protokol anbefaler, at begge amplikoner indeholder en homolog region på 600-800 bp hver. Kortere homologregioner gør den første rekombination mere udfordrende.

Aeromonas-stammer bærer ikke lambda pir-genet , som er nødvendigt for at replikere pDM4-selvmordsplasmidet. Derfor skal det pDM4-rekombinante plasmid integreres i det kromosomale DNA. Efter den triparentale parring er det vigtigt at identificere de bakteriekolonier, hvor den første rekombination har fundet sted. Disse kolonier indeholder den rekombinante pDM4 indsat i det homologe kromosomale område. Identifikation af rekombinante kolonier udføres ved hjælp af en PCR-reaktion med primere (E- og F-primere) uden for det område, der er målrettet mod at blive slettet. Hvis der anvendes en standard DNA-polymerase, vil E-F-primerne kun føre til generering af et PCR-produkt i vildtypen. Dette primerpar vil ikke producere noget PCR-produkt i bakteriekolonier, hvor det pDM4-rekombinante plasmid er blevet indsat i det kromosomale DNA. Manglen på PCR-produkt skyldes afstanden mellem udglødningssekvenserne af E- og F-primere. Denne afstand kan ikke forstærkes af standardpolymeraser. Andre faktorer kan dog også forhindre dannelsen af PCR-produkter. Derfor kan de første rekombinante kolonier identificeres ved DNA-polymeraser til lang fragmentamplifikation eller ved PCR-reaktioner ved anvendelse af par primere bestående af en pDM4 og en ekstern primer. Når store genetiske klynger slettes, kræver amplifikation i vildtypestammen anvendelse af DNA-polymeraser til lang fragmentamplifikation. Bakteriekolonier med den første rekombination kan identificeres ved PCR med pDM4-eksterne par primere. Imidlertid produceres første og anden rekombination normalt på samme tid, hvilket efterlader pDM4 med vildtypen eller med det slettede gen efter rekombination. Dette fører til chloramphenicolresistente kolonier, hvis PCR ved hjælp af eksterne primere giver amplikoner med samme størrelse som vildtypegenet eller små amplikoner, som korrelerer med det slettede gen eller fragment. Kolonier, der viste sig at have den korrekte rekombinante indsats, blev inkuberet med saccharose for at fjerne den ikke-indsatte pDM4. Saccharose inducerer ekspressionen af sacB-genet placeret på pDM4, som koder for et dødeligt enzym for gramnegative bakterier. Derfor vil kun kolonier, der mangler selvmordsplasmidet, vokse i LB med saccharose. For at understøtte identiteten af kolonier, der indeholder det slettede gen, kan fragmentet forstærket med det eksterne primerpar derefter sekventeres.

Implementering af denne in-frame mutationsmetode i Aeromonas muliggør generering af mere stabile null-mutanter uden ændringer i ekspressionsniveauerne af downstream-gener. Andre metoder, såsom indsættelse af en antibiotikakassette, sikrer transkription af downstream-gener, men ekspressionsniveauet kan ændres. Desuden kan denne metode ekstrapoleres til andre målgener og regioner, herunder andre gramnegative bakterier 29,31,32,33.

I nogle bakteriestammer kan tab eller modifikation af glycan forbundet med flagelliner føre til manglende evne til flagellasamling eller ustabilitet af flagellafilament, hvilket fører til en reduktion af polær flagellamotilitet. Mens det er let at skelne en ikke-bevægelig fænotype fra en bevægelig ved hjælp af motilitetsassays i flydende medier, kan forskelle i graden af bevægelighed være vanskelige at kvantificere. Motilitetspladeassays er nødvendige for at måle forskelle i graden af bevægelighed. Imidlertid udtrykker nogle bakteriearter, herunder mange mesofile Aeromonas-stammer , inducerbar lateral flagella, når de vokser i højviskøse medier eller plader, ud over den konstitutive polære flagella. Begge flagellatyper bidrager til bakteriemotiliteten i halvfaste plader. Derfor fører ændringer af polær eller lateral flag kun til reduktioner i migrationsdiametrene. Således viser AH-3ΔFgi og AH-3ΔFgi-4 mutanter kun nedsat bevægelighed i forhold til vildtypestammen. For at forbedre evalueringen af motilitet produceret ved rotation af polær flagella bør ekspansionsdiameteren af null-mutanter sammenlignes i forhold til ikke kun vildtypestammen, men også en mutant, der mangler det polære flagellum. Desuden påvirker en reduktion i antallet af glycanrester eller ændringer i glycansammensætningen den elektroforetiske bevægelighed af glycosylerede flagelliner. For eksempel er molekylvægten af glycosylerede flagelliner observeret ved anvendelse af SDS-PAGE geler højere end forudsagt fra flagellinaminosyresekvensen, og forstyrrelser i glycanen observeres som reduktioner i deres molekylvægt. I nogle tilfælde kan ændringerne i glycanmodifikation af flagellinproteinet muligvis ikke påvises ved hjælp af SDS-PAGE. I disse tilfælde kan massespektrometrianalyse af enten intakt protein eller flagellinpeptider være nødvendig for at bekræfte tilstedeværelsen og massen af glycan.

Patogenicitet af Aeromonas såvel som andre gramnegative bakterier kan påvirkes af fraværet af flagellum, men også af ændringer i sammensætningen af flagellaglycaner. Disse ændringer kan påvirke bakteriel interaktion med biotiske og abiotiske overflader, autoagglutination, spille en rolle i at undgå immunrespons og / eller induktion af proinflammatorisk respons. Derfor kræves overholdelse, biofilmdannelse og proinflammatoriske responsassays for at evaluere forholdet mellem flagellaglykosylering og Aeromonas-patogenicitet .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Research Council Canada, for Plan Nacional de I + D (Ministerio de Economía y Competitividad, Spanien) og for Generalitat de Catalunya (Centre de Referència en Biotecnologia).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit Applied Biosystems 4337455 Used for sequencing
AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity Invitrogen 12346-086 Used for amplification of AB, CD and AD fragments
Agarose Conda-Pronadise 8008 Used for DNA electrophoresis
Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP) Promega M1821 Used to remove phosphate at the 5’ end
Bacto agar Becton Dickinson 214010 Use for motility analysis
BamHI Promega R6021 Used for endonuclease restriction
BglII Promega R6081 Used for endonuclease restriction
BioDoc-It Imagin System UVP Bio-imaging station used for DNA visualization
Biotaq polymerase Bioline BIO-21040 Used for colony screening
Cesium chloride Applichem A1126,0100 Used for flagella purification
Chloramphenicol Applichem A1806,0025 Used for triparental mating
Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit Cytivia 28-9034-71 Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments.
EDTA Applichem 131026.1211 Used for DNA electrophoresis
Electroporation cuvettes 2 mm gap VWR 732-1133 Used for transformation
Ethidium bromide Applichem A1152,0025 Use for DNA visualization
HyperLadder 1 Kb marker Bioline BIO-33053 DNA marker
Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit Invitrogen 10750204 Used for bacterial chromosomal DNA purification
Luria-Bertani (LB) Miller agar Condalab 996 Used for Escherichia coli culture
Luria-Bertani (LB) Miller broth Condalab 1551 Used for Escherichia coli culture
Nanodrop ND-1000 NanoDrop Techonologies Inc Spectrophotometer used for DNA quantification
Rifampicin Applichem A2220,0005 Used for triparental mating
SOC Medium Invitrogen 15544034 Used for electroporation recovery
Spectinomycin Applichem A3834,0005 Used for triparental mating
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor Beckman 331362 Used for flagella purification
T4 DNA ligase Invitrogen 15224017 Used for ligation reaction
Trypticasein soy agar Condalab 1068 Used for Aeromonas grown
Trypticasein soy broth Condalab 1224 Used for Aeromonas grown
Tryptone Condalab 1612 Use for motility analysis
Tris Applichem A2264,0500 Used for DNA electrophoresis and flagella purification
Triton X-100 Applichem A4975,0100 Used for bacterial lysis
Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm) Beckman 344059 Used for flagella purification
Veriti 96 well Thermal Cycler Applied Biosystems Used for PCR reactions
Zyppy Plasmid Miniprep II Kit Zymmo research D4020 Used for isolation of plasmid DNA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schäffer, C., Messner, P. Emerging facets of prokaryotic glycosylation. FEMS Microbiology Review. 41 (1), 49-91 (2017).
  2. De Maayer, P., Cowan, D. A. Flashy flagella: flagellin modification is relatively common and highly versatile among the Enterobacteriaceae. BMC Genomics. 17, 377 (2016).
  3. Nothaft, H., Szymanski, C. M. Protein glycosylation in bacteria: sweeter than ever. Nature Review Microbiology. 8 (11), 765-778 (2010).
  4. Benz, I., Schmidt, M. A. Never say never again: protein glycosylation in pathogenic bacteria. Molecular Microbiology. 45 (2), 267-276 (2002).
  5. Guerry, P., Szymanski, C. M. Campylobacter sugars sticking out. Trends in Microbiology. 16 (9), 428-435 (2008).
  6. Hug, I., Feldman, M. F. Analogies and homologies in lipopolysaccharide and glycoprotein biosynthesis in bacteria. Glycobiology. 21 (2), 138-151 (2011).
  7. Iwashkiw, J. A., Vozza, N. F., Kinsella, R. L., Feldman, M. F. Pour some sugar on it: the expanding world of bacterial protein O-linked glycosylation. Molecular Microbiology. 89 (1), 14-28 (2013).
  8. Szymanski, C. M., Wren, B. W. Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens. Nature Review Microbiology. 3, 225-237 (2005).
  9. Tan, F. Y. Y., Tang, C. M., Exley, R. M. Sugar coating: bacterial protein glycosylation and host-microbe interactions. Trends Biochemistry Sciences. 40 (7), 342-350 (2015).
  10. Lairson, L. L., Henrissat, B., Davies, G. J., Withers, S. G. Glycosyltransferases: structures, functions, and mechanisms. Annual Review Biochemistry. 77, 521-555 (2008).
  11. Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013. Nucleic Acids Research. 42, Database Issue 490-495 (2014).
  12. Weerapana, E., Imperiali, B. Asparagine-linked protein glycosylation: from eukaryotic to prokaryotic systems. Glycobiology. 16 (6), 91 (2006).
  13. Faridmoayer, A., et al. Extreme substrate promiscuity of the Neisseria oligosaccharyl transferase involved in protein O-glycosylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34596-34604 (2008).
  14. Wacker, M., et al. Substrate specificity of bacterial oligosaccharyltransferase suggests a common transfer mechanism for the bacterial and eukaryotic systems. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7088-7093 (2006).
  15. Scott, A. E., et al. Flagellar glycosylation in Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Journal of Bacteriology. 193 (14), 3577-3587 (2011).
  16. Thibault, P., et al. Identification of the carbohydrate moieties and glycosylation motifs in Campylobacter jejuni flagellin. Journal of Biological Chemistry. 276 (37), 34862-34870 (2001).
  17. Schirm, M., et al. Structural, genetic and functional characterization of the flagellin glycosylation process in Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 48 (6), 1579-1592 (2003).
  18. McNally, D. J., et al. Targeted metabolomics analysis of Campylobacter coli VC167 reveals legionaminic acid derivatives as novel flagellar glycans. Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14463-14475 (2007).
  19. Logan, S. M., et al. Identification of novel carbohydrate modifications on Campylobacter jejuni 11168 flagellin using metabolomics-based approaches. FEBS Journal. 276 (4), 1014-1023 (2009).
  20. Wilhelms, M., Fulton, K. M., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. Differential glycosylation of polar and lateral flagellins in Aeromonas hydrophila AH-3. Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27851-27862 (2012).
  21. Canals, R., et al. Non-structural flagella genes affecting both polar and lateral flagella-mediated motility in Aeromonas hydrophila. Microbiology. 153, Pt 4 1165-1175 (2007).
  22. Howard, S. L., et al. Campylobacter jejuni glycosylation island important in cell charge, legionaminic acid biosynthesis, and colonization of chickens. Infection and Immunity. 77 (6), 2544-2556 (2009).
  23. Verma, A., Arora, S. K., Kuravi, S. K., Ramphal, R. Roles of specific amino acids in the N-terminus of Pseudomonas aeruginosa flagellin and of flagellin glycosylation in the innate immune response. Infection and Immunity. 73 (12), 8237-8246 (2005).
  24. Lamy, B., Baron, S., Barraud, O. Aeromonas: the multifaceted middleman in the One Health world. Current Opinion in Microbiology. 65, 24-32 (2022).
  25. Gavín, R., et al. Lateral flagella of Aeromonas species are essential for epithelial cell adherence and biofilm formation. Molecular Microbiology. 43 (2), 383-397 (2002).
  26. Altschul, F. S., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
  27. Forn-Cuní, G., et al. Polar flagella glycosylation in Aeromonas: Genomic characterization and Involvement of a specific glycosyltransferase (Fgi-1) in heterogeneous flagella glycosylation. Frontiers in Microbiology. 11, 595697 (2021).
  28. Milton, D. L., O'Toole, R., Horstedt, P., Wolf-Watz, H. Flagellin A is essential for the virulence of Vibrio anguillarum. Journal of Bacteriol.ogy. 178 (5), 1310-1319 (1996).
  29. Kovács, N. Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature. 178 (4535), 703 (1956).
  30. Fulton, K. M., Mendoza-Barberá, E., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. Polar glycosylated and lateral non-glycosylated flagella from Aeromonas hydrophila strain AH-1 (Serotype O11). International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28255-28269 (2015).
  31. Khider, M., Willassen, N. P., Hansen, H. The alternative sigma factor RpoQ regulates colony morphology, biofilm formation and motility in the fish pathogen Aliivibrio salmonicida. BMC Microbiology. 18 (1), 116 (2018).
  32. Pawar, S. V., et al. Novel genetic tools to tackle c-di-GMP-dependent signalling in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Applied Microbiology. 120 (1), 205-217 (2016).
  33. Vander Broek, W., Chalmers, K. J., Stevens, M. P., Stevens, J. M. Quantitative proteomic analysis of Burkholderia pseuomallei Bsa Type III secretion system effectors using hypersecreting mutants. The American Society for Biochemistry and Molecular Biology. 14 (4), 905-916 (2015).

Tags

Immunologi og infektion udgave 181 O-glycosylering glycosyltransferaser heteroglycan in-frame mutanter mesofile Aeromonas flagelliner flagellarensning CsCl-gradient
Generering af nullmutanter for at belyse rollen som bakterielle glycosyltransferaser i bakteriel motilitet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tomás, J. M., Fulton, K. M.,… More

Tomás, J. M., Fulton, K. M., Twine, S. M., Merino, S. Generation of Null Mutants to Elucidate the Role of Bacterial Glycosyltransferases in Bacterial Motility. J. Vis. Exp. (181), e63231, doi:10.3791/63231 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter