Summary
Burada, Aeromonas'ın boş mutantlarının spesifik glikoziltransferazlarda veya glikoziltransferazlar içeren bölgelerde yapımını, motilitesi testlerini ve flagella saflaştırmasını, kodlanmış enzimlerinin bir glikanın biyosentezindeki katılımını ve işlevini ve bu glikanın bakteriyel patogenezdeki rolünü tanımlamaktayız.
Abstract
Prokaryotlarda glikozilasyon çalışması hızla büyüyen bir alandır. Bakteriler, yüzeylerinde glikanları suşa özgü bir barkod oluşturan farklı glikozile yapılar barındırır. İlişkili glikanlar, şeker bileşiminde ve yapısında ökaryotlarınkinden daha yüksek çeşitlilik gösterir ve bakteriyel-konakçı tanıma süreçlerinde ve çevre ile etkileşimde önemlidir. Patojenik bakterilerde, glikoproteinler enfeksiyöz sürecin farklı aşamalarında yer almıştır ve glikan modifikasyonları glikoproteinlerin spesifik fonksiyonlarına müdahale edebilir. Bununla birlikte, glikan bileşiminin, yapısının ve biyosentez yolaklarının anlaşılmasında kaydedilen ilerlemelere rağmen, glikoproteinlerin patojenite veya çevre ile etkileşimdeki rolünün anlaşılması çok sınırlı kalmaktadır. Ayrıca, bazı bakterilerde, protein glikozilasyonu için gerekli enzimler, lipopolisakkarit ve kapsül biyosentetik yollar gibi diğer polisakkarit biyosentetik yollarla paylaşılır. Glikozilasyonun fonksiyonel önemi, glikozilasyon sürecine dahil olduğu düşünülen spesifik genlerin mutasyonu ve hedef glikoprotein ve modifiye edici glikan'ın ekspresyonu üzerindeki etkisinin incelenmesi yoluyla birçok bakteride açıklığa kavuşturulmuştur. Mezofilik Aeromonas tek ve O-glikozile polar flagelluma sahiptir. Flagellar glikanlar, karbonhidrat bileşiminde ve Aeromonas suşları arasındaki zincir uzunluğunda çeşitlilik gösterir. Bununla birlikte, bugüne kadar analiz edilen tüm suşlar, serin veya treonin kalıntılarını değiştiren bağlantı şekeri olarak bir pseudaminik asit türevi göstermektedir. Pseudaminik asit türevi polar flagella montajı için gereklidir ve kaybının yapışma, biyofilm oluşumu ve kolonizasyon üzerinde etkisi vardır. Bu makalede ayrıntılı olarak açıklanan protokol, null mutantların yapımının, bir flagellar glikan'ın biyosentezinde varsayılan glikoziltransferazlar içeren genlerin veya genom bölgelerinin katılımını anlamak için nasıl kullanılabileceğini açıklamaktadır. Bu, ilgili glikoziltransferazların işlevini ve glikan'ın rolünü anlama potansiyelini içerir. Bu, glikan eksikliği olan mutantı vahşi tip suşla karşılaştırarak elde edilecektir.
Introduction
Protein glikozilasyonu hem Gram-pozitif hem de Gram-negatif bakterilerde tanımlanmıştır ve bir glikan'ın bir amino asit yan zincirine kovalent bağlanmasından oluşur 1,2. Prokaryotlarda, bu süreç genellikle iki ana enzimatik mekanizma ile gerçekleşir: O- ve N-glikozilasyon 3. O-glikozilasyonda, glikan bir serin (Ser) veya treonin (Thr) kalıntısının hidroksil grubuna bağlanır. N-glikozilasyonda, glikan, X'in prolin hariç herhangi bir amino asit olabileceği Tripeptit dizileri Asn-X-Ser / Thr içindeki bir asparagin (Asn) kalıntısının yan zincir amid azotuna bağlanır.
Glikanlar doğrusal veya dallanmış yapıları benimseyebilir ve glikosidik bağlarla kovalent olarak bağlanmış monosakkaritlerden veya polisakkaritlerden oluşur. Prokaryotlarda, glikanlar genellikle ökaryotik glikanlara kıyasla şeker bileşiminde ve yapısında çeşitlilik gösterir4. Ayrıca, glikanın nasıl monte edildiği ve alıcı proteine nasıl aktarıldığı konusunda farklılık gösteren iki farklı bakteriyel glikozilasyon yolu tanımlanmıştır: sıralı ve en blok glikozilasyon 5,6. Sıralı glikozilasyon için, kompleks glikan, monosakaritlerin art arda eklenmesiyle doğrudan protein üzerinde oluşturulur. En blok glikozilasyonda, önceden monte edilmiş bir glikan, özel bir oligosakkariltransferaz (OTaz) tarafından lipite bağlı bir oligosakkaritten proteine aktarılır. Her iki yolun da N- ve O-glikozilasyon işlemlerinde rol oynadığı gösterilmiştir7.
Protein glikozilasyonu, proteinlerin fizikokimyasal ve biyolojik özelliklerinin modüle edilmesinde rol oynar. Bir glikanın varlığı, proteinin biyolojik aktivitesini etkileyen proteinin ligandı ile nasıl etkileşime girdiğini etkileyebilir, ancak protein stabilitesini, çözünürlüğünü, proteolize duyarlılığını, immünojenitesini ve mikrop-konakçı etkileşimlerini de etkileyebilir 8,9. Bununla birlikte, glikan sayısı, glikan bileşimi, pozisyon ve bağlanma mekanizması gibi çeşitli glikozilasyon parametreleri de protein fonksiyonunu ve yapısını etkileyebilir.
Glikoziltransferazlar (GT'ler), kompleks glikanların ve glikokonjugatların biyosentezinde anahtar enzimlerdir. Bu enzimler, aktive edilmiş bir donör molekülünden gelen bir şeker parçası ile spesifik bir substrat alıcısı arasındaki glikosidik bağ oluşumunu katalize eder. GT'ler hem nükleotitleri hem de nükleotit olmayanları donör moleküller olarak kullanabilir ve proteinler, sakaritler, nükleik asitler ve lipitler gibi farklı substrat alıcılarını hedefleyebilir10. Bu nedenle, GT'leri moleküler düzeyde anlamak, etki mekanizmalarını ve özgüllüklerini tanımlamak için önemlidir ve ayrıca ilgili molekülleri değiştiren glikanların şeker bileşiminin patojenite ile nasıl ilişkili olduğunu anlamayı sağlar. Karbonhidrat Aktif enzim veritabanı (CAZy)11, GT'leri dizi homolojilerine göre sınıflandırır, bu da GT ailelerinin çoğunda yapısal kıvrım ve etki mekanizmaları değişmez olduğu için öngörücü bir araç sağlar. Bununla birlikte, dört neden birçok GT'nin substrat özgüllüğünü tahmin etmeyi zorlaştırmaktadır: 1) prokaryotlarda substrat özgüllüğünü belirleyen net bir dizi motifi belirlenmemiştir 12, 2) birçok GT ve OTaz, substrat karışıklığı göstermektedir13,14, 3) fonksiyonel GT'lerin rekombinant formda yüksek verimde üretilmesi zordur ve 4) hem donör hem de alıcı substratların tanımlanması karmaşıktır. Buna rağmen, son mutagenez çalışmaları, katalitik mekanizmaların anlaşılmasında ve GT'lerin bağlanmasının çıkarılmasında önemli ilerlemeler elde etmeyi mümkün kılmıştır.
Bakterilerde, O-glikozilasyon, N-glikozilasyondan daha yaygın görünmektedir. O-glikozilasyon bölgeleri bir konsensüs dizisi göstermez ve O-glikozile proteinlerin çoğu salgılanır veya flagellinler, pili veya ototransporterler gibi hücre yüzeyi proteinleri1. Flagellin glikozilasyonu, alıcı bölgelerin sayısında, glikan bileşiminde ve yapısında değişkenlik gösterir. Örneğin, Burkholderia spp flagellin'lerin yalnızca bir alıcı bölgesi varken, Campylobacter jejuni'de flagellinlerin 19 alıcı bölgesi15,16'ya kadar vardır. Ayrıca, bazı bakteriler için glikan tek bir monosakarittir, diğer bakteriler ise oligosakaritler oluşturmak için farklı monosakaritlerden ödün veren heterojen glikanlara sahiptir. Bu heterojenlik, aynı türün suşları arasında bile meydana gelir. Helicobacter flagellinleri sadece pseudaminic asit (PseAc)17 tarafından modifiye edilir ve Campylobacter flagellinler, pseudaminic asidin (PseAm) veya lejyonaminik asidin (LegAm) asetamidin formu olan PseAc ve asetil, N-asetilglukozamin veya propiyonik ikameler18,19 ile bu şekerlerden türetilen glikanlar tarafından modifiye edilebilir. Aeromonas'ta, flagellinler, bileşimi tek bir PseAc asit türevinden heteropolisakkarit20'ye kadar değişen glikanlar tarafından modifiye edilir ve glikanların flagellin monomerlerine bağlanması her zaman bir PseAc türevi aracılığıyladır.
Genel olarak, flagellinlerin glikozilasyonu, flagellar filament montajı, motilite, virülans ve konakçı özgüllüğü için gereklidir. Bununla birlikte, C. jejuni16, H. pylori17 ve Aeromonas sp. 21, protein monomerleri glikozile edilmedikçe, Pseudomonas spp. ve Burkholderia spp. olmadıkça filament halinde birleşemez. 15 flagella montajı için glikozilasyon gerektirmez. Ayrıca, bazı C. jejuni suşlarında, flagella glikanının şeker bileşimindeki değişiklikler bakteriyel-konakçı etkileşimini etkiler ve bazı bağışıklık tepkilerinden kaçınmada rol oynayabilir16. Otoaglütinasyon, flagellinlerle ilişkili glikanların bileşimindeki modifikasyonlardan etkilenen başka bir fenotipik özelliktir. Daha düşük bir otoaglütinasyon, mikrokoloniler ve biyofilm22 oluşturma yeteneğinde bir azalmaya yol açar. Bazı bakterilerde, flagella'nın pro-inflamatuar bir yanıtı tetikleme yeteneği, flagellin glikozilasyonu ile bağlantılıydı. Bu nedenle, P. aeruginosa'da, glikozile flagellin, glikozillenmiş olmayan23'ten daha yüksek bir pro-inflamatuar yanıtı indükler.
Aeromonas, çevrede her yerde bulunan Gram-negatif bakterilerdir, bu da tüm One Health bileşenlerinin arayüzünde olmalarını sağlar24. Mezofilik Aeromonas, yapısal olarak üretilen tek bir polar flagellum'a sahiptir. Klinik izolatların yarısından fazlası, yüksek viskoziteli ortamlarda veya plakalarda indüklenebilen lateral flagellin eksprese eder. Farklı çalışmalar her iki flagella tipini de bakteriyel patogenezin erken evreleri ile ilişkilendirmiştir25. Bugüne kadar bildirilen polar flagellinler, merkezi immünojenik alanlarının 5-8 Ser veya Thr kalıntılarında O-glikozile edilirken, lateral flagellinler tüm suşlarda O-glikozile edilmemiştir. Farklı suşlardan polar flagella glikanları, karbonhidrat bileşimlerinde ve zincir uzunluklarında20 çeşitlilik göstermesine rağmen, bağlantı şekerinin bir pseudaminik asit türevi olduğu gösterilmiştir.
Bu makalenin amacı, ilgili polisakkaritlerin biyosentezine ve bakteriyel patojeniteye katılımlarını ve glikan'ın kendisinin rolünü analiz etmek için belirli GT'lerde veya GT'leri içeren kromozomal bölgelerde boş mutantlar elde etmek için bir yöntemi tanımlamaktır. Örnek olarak, polar flagellin glikozilasyonuna katılımını belirlemek ve flagellin glikanının rolünü analiz etmek için Aeromonas'ın GT'lerini içeren kromozomal bir bölgeyi tanımlar ve sileriz. Bu glikan'ın biyosentezindeki işlevini ve modifiye glikan'ın rolünü belirlemek için belirli bir GT'nin nasıl silineceğini gösteriyoruz. Örnek olarak Aeromonas kullanılmasına rağmen, prensip diğer Gram-negatif bakterilerin flagella glikozilasyon adalarını tanımlamak ve incelemek ve O-antijen lipopolisakkarit gibi diğer glikanların biyosentezinde yer alan GT'lerin işlevini analiz etmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prosedürün şematik gösterimi Şekil 1'de gösterilmiştir.
1. Aeromonas'ta flagella glikozilasyon adasının (FGI'lar) biyoinformatik tanımlanması
- Aeromonas genomlarındaki PseAc biyosentetik kümelerini tanımlamak için, NCBI veritabanı26'daki tblastn aracını kullanın. İlk olarak, sıralanmış Aeromonas suşlarının veritabanlarından A. piscicola AH-3'ün PseC ve PseI'sine (tanımlama kodları OCA61126.1 ve OCA61113.1) ortolog proteinleri alın ve ardından çevrilmiş nükleotid dizilerini aramak için tblastn aracını kullanın.
NOT: Pse genleri, kümenin bir ucunda pseB ve pseC ve diğer ucunda bulunan pseI ile Aeromonas FGI'ları çevreler. Pse genlerinin geri kalanının yeri bir FGI grubundan diğerine farklı olabilir. - Birçok suşun polar flagellin genlerinin FGI'lara bitişik olduğu göz önüne alındığında, A. piscicola AH-3'ün polar flagellinleri FlaA ve FlaB'sine (tanımlama kodları OCA61104.1 ve OCA61105.1'dir) ve bunları kodlayan genlere ortolog proteinler bulmak için NCBI veritabanından tblastn kullanın.
- Ek olarak, heteropolisakkaridik glikanların (grup II) biyosentezinde yer alan Aeromonas FGI'ler, luxC ve luxE gibi yağ asidi sentezinde yer alan enzimleri kodlayan birkaç gen içerir. NCBI veritabanındaki tblastn'ı, A. piscicola AH-3'ün LuxC'sine (tanımlama kodu OCA61121.1'dir) ve onu kodlayan gene ortolog proteinler bulmak için kullanın.
2. Flagella glikozilasyon adası genlerinde null mutantların oluşumu
NOT: Bu mutagenez yöntemi, intihar vektörü pDM428 (GenBank: KC795686.1) kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) çerçeve içi delesyon ürünlerinin allelik değişimine dayanmaktadır. pDM4 vektörünün replikasyonu lambda pir'e bağımlıdır ve vektör üzerinde bulunan sacB geni kullanılarak tam allelik değişim zorlanır.
- PCR çerçeve içi silme ürünlerinin yapımı.
- Silinecek seçilen gen veya bölgenin DNA bölgelerini yukarı akış (A ve B primerleri) ve aşağı akış (C ve D primerleri) yükselten iki çift primer tasarlayın (Şekil 2B).
- Primer A ve D'nin, silinecek gen veya genlerin sırasıyla başlangıcından itibaren 600 bp'den fazla yukarı akışa ve duraktan aşağı akışa sahip olduğundan emin olun. Bu iki primerin 5' ucunda, pDM4'te klonlamaya izin veren bir endonükleaz için bir kısıtlama bölgesi içermesi gerekir.
NOT: A ve D astarlarının 5' ucunda bulunan kısıtlama bölgesi, AB veya CD amplikonları içindeki sitelerle aynı olmamalıdır. - Primer B ve C'nin silinecek genin içinde veya silinecek bölgenin sırasıyla ilk ve son geninin içinde olduğundan emin olun. Her iki primerin de (B ve C) çerçeve içinde olduğundan ve genin içindeki 5-6 kodon arasında bulunduğundan emin olun. Ayrıca, her iki primerin de 5' ucunda, DNA amplikonları AB ve CD'nin birleştirilmesine izin veren 21 bp tamamlayıcı bir dizi (Tablo 1) içerdiğinden emin olun.
- Seçilen Aeromonas suşunu 30 °C'de gece boyunca (O/N) 5 mL triptik soya suyu (TSB) içinde büyütün. Genomik DNA saflaştırması için piyasada satılan bir kit kullanın ve üreticinin talimatlarını izleyin (Malzeme Tablosu). Bir spektrofotometre kullanarak saflaştırılmış DNA'nın 2 μL'sini sayın.
NOT: Çift damıtılmış suyu boş olarak kullanın, cihaz 260 nm'de absorbans kaydedecek şekilde ayarlanmıştır. 2 μL saflaştırılmış DNA ile emilimi 3-5 kez kaydedin ve ortalama bir absorbans okuması hesaplayın. DNA konsantrasyonunu hesaplamak için Beer-Lambert yasasını kullanın, burada A = Ɛ.c.l. burada "A" absorbanstır, "Ɛ" DNA için molar ortalama yok olma katsayısıdır, "c" DNA konsantrasyonudur ve "l" yol uzunluğudur (her bir enstrümanın yol uzunluğu için üreticinin talimatına bakın). - A-B ve C-D primerleri olan iki asimetrik PCR setinde şablon olarak 100 ng saflaştırılmış kromozomal DNA kullanın (Malzeme Tablosu). A:B ve D:C astar çiftlerinin 10:1 molar oranını kullanın (Ek Malzeme).
NOT: Asimetrik PCR'ler, şablonun bir ipliğinin diğerinden daha fazla tercihli amplifikasyonuna izin verir. - PCR ürünlerini% 1'lik bir agaroz jelinde elektroforez ile analiz edin. TAE (40 mM Tris-asetat, 1 mM EDTA) jel çalışma tamponu ve 8 V/cm güç ayarı olarak kullanın. DNA'yı görselleştirmek için, jele ethidyum bromür (0.5 μg / mL) ekleyin ve bir biyo-görüntüleme istasyonu (Malzeme Tablosu) kullanarak PCR ürünlerini görselleştirin.
- Bir neşter kullanarak amplikonları jelden tüketin, üreticinin protokolünü (Malzeme Tablosu) izleyerek saflaştırın ve bunları ölçün.
- AB ve CD amplikonlarını, PCR ürünlerinin 3' ucundaki 21 bp örtüşen dizileriyle birleştirin (Şekil 3). Her amplikodan (AB ve CD) 100 ng'yi PCR reaktifleri (AD öncesi PCR) ile bir PCR tüpünde, ancak primerler olmadan karıştırın ve termosikler programını (Ek Malzeme) kullanarak genişletin. Daha sonra, reaksiyona 100 μM A ve D primer ekleyin (AD PCR) ve tek bir parça olarak yükseltin (Ek Malzeme).
- PCR ürününü (AD amplicon), adım 2.1.6'da açıklanan koşulları kullanarak% 1'lik bir agaroz jelinde elektroforez ile analiz edin, amplikonu jelden ayırın, üreticinin protokolünü izleyerek saflaştırın ve amplikonu (Malzeme Tablosu) sayısallaştırın.
- Çerçeve içi delesyon ile pDM4 rekombinant plazmidin yapımı.
- Luria-Bertani (LB) Miller suyunda (10 mL) pDM4 içeren Escherichia coli cc18λ pir'in 30 ° C'de kloramfenikol (25 μg / mL) ile bir O / N kültürünü büyütün.
- Kültürü 4 ° C'de 5.000 x g'da döndürün ve peleti 600 μL steril damıtılmış suda askıya alın. Plazmid pDM4'ün ekstraksiyonunu ve saflaştırılmasını, sağlayıcının talimatlarını izleyerek ticari olarak temin edilebilen bir plazmid saflaştırma kiti kullanarak gerçekleştirin (Malzeme Tablosu).
- AD amplikonunun her iki ucunu ve pDM4'ün klonlama bölgesini sindirebilen bir endonükleaz ile 2 saat boyunca 1 μg pDM4 ve 400 ng AD amplikonu sindirin (Şekil 3). Reaksiyon koşulları için enzim üreticisinin protokolünü izleyin (Malzeme Tablosu).
- Sindirilmiş plazmidi ve amplikonu bir DNA saflaştırma kiti kullanarak temizleyin ve üreticinin talimatlarını izleyerek bunları ölçün (Malzeme Tablosu).
- Doğrusallaştırılmış pDM4'ün yeniden bağlanmasını önlemek için, üreticinin talimatlarını izleyerek alkali fosfataz enzimini kullanarak fosfat grubunu her iki 5' ucundan çıkarın (Malzeme Tablosu). Ardından, işlenmiş plazmidi temizleyin ve adım 2.1.4'te (Malzeme Tablosu) açıklandığı gibi bir spektrofotometre kullanarak ölçün.
- Sindirilmiş ve fosfataz alkali ile muamele edilmiş pDM4'ün 150 ng'sini 95-100 ng sindirilmiş AD amplikonu ile molar vektör: 1:4'lük bir ekleme oranında birleştirin. Ligasyon reaksiyonunu, üreticinin talimatlarını izleyerek 15 μL'lik bir hacimde hazırlayın (Malzeme Tablosu).
- O/N'yi 20 °C'de veya hafta sonu boyunca 4 °C'de inkübe edin. Kuluçkadan sonra, T4 ligazını 70 ° C'de 20 dakika boyunca inaktive edin.
- Plazmidi elektroporasyon yoluyla Escherichia coli MC1061λpir suşuna sokmak için ligasyon kullanın. Elektroremejman bakteriler ve 2 mm aralıklı elektroporasyon küvetleri kullanın.
- Elektroremetuar E. coli'nin hazırlanması ve pDM4 rekombinant plazmidinin elektroporasyonu
- Tek bir E. coli MC1061λpir kolonisini Luria-Bertani (LB) Miller suyuna aşılayın ve 200 rpm sallama ile 30 ° C'de O / N'yi büyütün.
- Bakteri kültürünün 2 mL'sini 18 mL LB suyunda seyreltin ve 0.4-0.6 arasında bir optik yoğunluğa (OD 600) ulaşılana kadar sallama (200 rpm) ile 30 ° C'de inkübe edin.
- Bakteri kültürünü 5.000 x g ve 4 °C'de 15 dakika boyunca santrifüjleme ile pelet edin. Süpernatantı atın ve peleti 40 mL soğutulmuş damıtılmış H2O'da askıya alın.
- Tüm kültür tuzlarını çıkarmak için bu temizleme adımını iki kez daha tekrarlayın. Son olarak, peleti 4 mL soğutulmuş damıtılmışH2O içinde askıya alın ve süspansiyonun 1 mL'sini dört konik 1.5 mL mikrofüj tüpünün her birine aktarın.
- Bakteri kültürünü 14.000 x g ve 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüjleme ile pelet edin. Peleti rahatsız etmeden süpernatantı çıkarın ve her peleti 100 μL soğutulmuş damıtılmışH2O içinde askıya alın.
- Her tüpe 3-3.5 μL ligasyon karışımı ekleyin ve 5 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Daha sonra, her tüpün içeriğini soğutulmuş 2 mm aralıklı bir elektroporasyon küvetine aktarın ve 2 kV, 129 Ω ve 5 ms civarında sabit zaman uygulayın.
NOT: Elektroporasyon küvetlerini buz üzerinde önceden soğutun. Tüm prosedür boyunca bakterileri buz üzerinde tutun. - Elektroporasyondan sonra, içeriklerini geri kazanmak için dört küvetin her birine 250 μL SOC ortamı ekleyin, bunları bir kültür tüpüne (yaklaşık 1 mL) aktarın ve sallanarak (200 rpm) 30 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edin.
- Luria-Bertani (LB) agar plakaları üzerindeki dönüştürülmüş hücreleri, plakada büyüyen tüm kolonilerin plazmid omurgasına sahip olmasını sağlamak için kloramfenikol (25 μg / mL) ile takviye edilmiş olarak plakalayın.
- LB agar plakalarından kloramfenikollü bazı koloniler seçin ve O / N'yi 30 ° C'de inkübe edin. Koloniler büyüdüğünde, pDM4 klonlama tarafını çevreleyen primerleri kullanarak silme yapısının PCR tarafından pDM4'e yerleştirilmesini kontrol edin: pDM4for ve pDM4rev (Tablo 1) ve şablon olarak lize koloniler (Ek Malzeme).
- Steril bir kürdan ile bir koloni seçin ve 15 μL% 1 Triton X-100, 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 2 mM EDTA pH 8.0 içeren 1.5 mL'lik bir tüpe batırın. Tüpleri 100 ° C'de 5 dakika ve daha sonra buz üzerinde 1 dakika inkübe edin.
- Tüpleri 12.000 x g'lık bir mikrofüjde 10 dakika boyunca bakteri ve döküntüleri pelet etmek için döndürün. PCR reaksiyonunda şablon olarak süpernatantın 1 μL'sini kullanın (Malzeme Tablosu). Astar çiftinin tavlama sıcaklığı 50 ° C'dir ve PCR reaksiyonu% 10 DMSO (Ek Malzeme) gerektirir.
- İlgilenilen ürünü 10 mL LB suyuna kloramfenikol (25 μg / mL) ile yükselten kolonileri aşılayın ve 30 ° C'de O / N'yi büyütün. Plazmidi 2.2.1-2.2.2 adımlarında açıklandığı gibi kültürlerden çıkarın. Üreticinin talimatlarını izleyerek pDM4 astarlarını kullanarak sıralayın (Malzeme Tablosu).
- Çerçeve içi silme işleminin Aeromonas soy
NOT: pDM4 rekombinant plazmidi seçilen kişiye eklenmelidir. Aeromonas triparental çiftleşme ile gerilme (Şekil 4). Aeromonas Suş, triparental çiftleşmesinden sonra seçilmek üzere rifampisine dirençli olmalıdır. Bu nedenle, seçilen O / N suşlarını TSB'de 30 ° C'de, santrifüj 2 mL, 4 mL ve 6 mL kültürleri 5.000 x'te büyütün g 15 dakika boyunca, her peleti 100 μL TSB içinde ve plakayı TSA'da rifampisin (100 μg / mL) ile askıya alın.- 25 μg/mL kloramfenikol (donör suşu) ile LB agar üzerinde pDM4 rekombinant plazmid ile E. coli MC1061λpir'in, TSA'da 100 μg/mL rifampisin (alıcı suşu) ile Aeromonas suşu rifampisin dirençli Aeromonas suşu rifampisin ve 30 °C'de 80 μg/mL spektinomisin (yardımcı suş) ile LB agar üzerinde pRK2073 plazmidli E. coli HB101'in O/N kültürlerini hazırlayın.
- Koloniler büyüdüğünde, donör, alıcı ve yardımcı suşların aynı sayıda kolonisini (10-15 koloni), 150 μL LB içeren üç LB tüpünde steril bir kürdan ile nazikçe askıya alın.
- Daha sonra, bir LB agar plakasında, antibiyotiksiz, üç bakteriyel süspansiyonu bir alıcıda iki damla halinde karıştırın: yardımcı: 5: 1: 1 donör oranı (alıcının 50 μL'si, donörün 10 μL'si ve 10 μL yardımcı). Plakayı 30 °C'de O/N'ye bakacak şekilde inkübe edin. Rekombinant plazmid olmadan donör suşu kullanarak konjugasyonun negatif kontrolünü gerçekleştirin.
NOT: Yardımcı suş konjugatif plazmid pRK2073'ü taşır ve pDM4'ün Aeromonas'a aktarılmasına yardımcı olur. Pili'nin kırılmasını önlemek için donör, alıcı ve yardımcı suşları askıya almak için vorteks kullanmayın. - 1 mL LB suyu ekleyerek ve bakteriyel bir süspansiyon elde etmek için steril bir cam serpme makinesi ile yayarak LB agar plakasından bakteri toplayın. Bakteriyel süspansiyonu konik 1,5 mL mikrofüj tüpüne ve girdabına kuvvetli bir şekilde aktarmak için bir pipet kullanın.
- pDM4 rekombinant plazmidini içeren alıcı kolonileri seçmek için, rifampisin (100 μg / mL) ve kloramfenikol (25 μg / mL) içeren LB agar plakaları üzerinde hasat edilen bakteriyel süspansiyonun 100 μL'lik plakası.
- Numunelerin 200 μL ve 600 μL'sini 15 dakika boyunca 5.000 x g'de bir mikrofüjde döndürün, peleti 100 μL LB suyu ve plakası içinde LB agar üzerine rifampisin (100 μg / mL) ve kloramfenikol (25 μg / mL) ile askıya alın. Tüm plakaları 30 °C'de 24-48 saat boyunca inkübe edin.
- Yetiştirilen kolonileri toplayın, rifampisin (100 μg / mL) ve kloramfenikol (25 μg / mL) içeren LB plakalarına aktarın ve 30 ° C'de O / N'yi inkübe edin. Daha sonra, oksidaz testi29 ile kolonilerin Aeromonas olduğunu ve pDM4 rekombinant plazmidinin, A ve D primerleri (Malzeme Tablosu) ile güçlendirilmiş bölgenin dışına bağlanan E ve F primerleri (Ek Materyal) kullanılarak PCR tarafından spesifik kromozomal bölgeye yerleştirildiğini (ilk rekombinasyon) doğrulayın. Adım 2.3.11'de açıklandığı gibi, şablon olarak 1 μL lize koloni kullanın.
- Çerçeve içi silme için allelik değişimi tamamlamak için, entegre intihar plazmidi ile kolonileri ikinci bir rekombinasyona zorlayın. Rekombinant kolonileri% 10 sakkaroz ile ve antibiyotiksiz, 30 ° C'de O / N'de 2 mL LB içinde büyütün.
- Sakkarozlu LB agar plakası üzerinde 2.4.8 adımından itibaren bakteri kültürlerinin 100 μL'lik plakası (%10). Ayrıca, plaka 100 μL farklı kültür seyreltmeleri (10-2-10-4) ve 30 ° C'de O / N'yi inkübe edin.
- pDM4 kaybını doğrulamak için, kolonileri toplayın, kloramfenikollü (25 μg / mL) LB plakalarına aktarın, 30 ° C'de O / N'yi inkübe edin ve ardından kloramfenikol duyarlı kolonileri seçin.
- Hassas kolonileri, E-F primer çiftini ve 1 μL lize kolonilerini şablon olarak kullanarak PCR ile analiz edin (Malzeme ve Ek Materyal Tablosu). PCR ürünü silinen yapının boyutuyla ilişkili olan kolonileri seçin.
3. Motilite tahlilleri
NOT: Glikozile flagellalı bazı bakteri türlerinde, glikozilasyon veya glikan bileşimi seviyelerindeki değişiklikler, genellikle bir motilite azalması veya hareketlilik yokluğu olarak yansıtılan flagellinlerin montajını etkiler. Bu nedenle, boş mutantlarla iki motilite testi yapıldı.
- Sıvı ortamda motilite testi
- Kültür Aeromonas, 25-30 ° C'de TSB'nin 1 mL'sinde O / N'yi suşlar. Bir mikroskop kapağı slaytını kazılmış bir slayda yapıştırmak için, kürdan ucuyla az miktarda silikon alın ve kapak slaytının dört köşesine küçük bir damla koyun. Daha sonra, kapak slaytının ortasına 1 μL Aeromonas kültürü koyun ve bir damla taze TSB ortamı (2 μL) ile karıştırın.
- Kapak slaytına kazılmış bir slayt yerleştirin. Kazıyı biriken damla ile eşleştirin, hafifçe bastırın ve slaytı baş aşağı çevirin.
- Daldırma yağı kullanarak 100x objektifli bir optik mikroskop (Malzeme Tablosu) kullanarak ışık mikroskobu ile yüzme hareketliliğini analiz edin.
NOT: Aeromonas'ın vahşi tip suşu pozitif kontrol olarak kullanılmalıdır. Negatif bir kontrol olarak, Klebsiella gibi kamçılanmamış bir bakteri kullanın.
- Yarı katı ortamda motilite testi
- Kültür Aeromonas, TSB'de (1 mL) 25-30 °C'de O / N'yi suşlar. Daha sonra, kültürün 3 μL'sini yumuşak bir agar plakasının merkezine (% 1 tripton,% 0.5 NaCl,% 0.25 bacto agar) aktarın ve plakayı 25-30 ° C'de O / N'ye bakacak şekilde inkübe edin.
- Bir cetvel kullanarak, bakteri göçünü agar boyunca plakanın merkezinden çevreye doğru ölçün.
4. Flagella saflaştırma
- Bakteriyel yüzeye tutturulmuş flagellanın izolasyonu
- Kültür Aeromonas 25-30 °C'de TSB'de (10 mL) O/N suşları. Ardından, kültürü TSB (900 mL) ile bir şişeye genişletin ve sallanarak (200 rpm) 25-30 ° C'de O / N'nin büyümesine izin verin.
- 4 °C'de 20 dakika boyunca 5.000 x g'de santrifüj. Peleti 20 mL'lik 100 mM Tris-HCl tamponunda (pH 7.8) askıya alın.
- Ankrajlı flagellayı çıkarmak için, süspansiyonu 3-4 dakika boyunca bir cam çubukla (2-3 mm çapında) bir girdapta kesin ve ardından 21-G şırıngadan tekrar tekrar (en az altı kez) geçirin.
- 4 ° C'de iki ardışık santrifüjleme ile pelet bakterileri: ilk olarak, 30 dakika boyunca 8.000 x g'de . Süpernatantı ve santrifüjü 20 dakika boyunca 18.000 x g'de çıkarın. Ücretsiz flagella içeren süpernatanı toplayın.
- Süpernatantı 4 °C'de 1 saat boyunca 100.000 x g'de ultrasantrifüj yapın ve peleti 100 mM Tris-HCl (pH 7.8) artı 2 mM EDTA tamponunun 150 μL'sinde askıya alın. Pelet flagella filamentleri içerir.
- 4.1.5 adımından itibaren yeniden askıya alınan peletin 5-10 μL'sini% 12'lik bir SDS-Poliakrilamid jelinde elektroforez ile analiz edin ve Coomassie mavi boyama kullanarak proteinleri görselleştirin.
NOT: Protein elektroforezi ve jel boyama için üreticinin talimatlarını izleyin. Glikozile flagellinin pozitif bir kontrolü olarak, vahşi tip suşun saflaştırılmış flagellasını kullanın. Flagella'nın zenginleştirilmiş fraksiyonunu bir sezyum klorür (ClCs) gradyanında saflaştırın.
- Flabella'yı saflaştırmak için sezyum klorür gradyanı.
- 12.1 g CsCl'yi 27 mL damıtılmış H2O ile karıştırın.
- Flagella'nın zenginleştirilmiş fraksiyonunu (150 μL) ince duvarlı ultra berrak bir tüpe (14 mm x 89 mm) (Malzeme Tablosu) aktarın ve 12 mL CsCl çözeltisi ile doldurun.
- Tüpü 60.000 x g'de 4 ° C'de 48 saat boyunca sallanan bir kova rotorunda ultrasantrifüj yapın (Malzeme Tablosu).
- Flagella bandını bir şırınga ve diyaliz ile 100 mM Tris-HCl (pH 7.8) artı 2 mM EDTA'ya karşı CsCl gradyanına toplayın. Daha sonra, diyalize flagella'yı% 12'lik bir SDS-Poliakrilamid jel ve Coomassie mavi boyamasında (adım 4.1.6) elektroforez veya kütle spektrometrisi ile analiz edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu metodoloji, Aeromonas'ın genlerinde veya kromozomal bölgelerinde flagella glikozilasyonunu ve flagella filamentinin rolünü etkileyebilecek null mutantlar üretmek için etkili bir sistem sağlar (Şekil 1).
Protokol, varsayılan FGI'ların ve GT'leri kodlayan genlerin bu bölgede bulunan biyoinformatik tanımlanması ile başlar. Aeromonas'ta, FGI'ların kromozomal yerleşimi üç tip genin tespitine dayanır: pseudaminik asidin (pseI ve pseC) biyosentezinde rol oynayan genler, polar flagellin genleri ve luxC. Polar flagella'sı A. hydrophila AH-130 gibi tek bir pseudaminik asit türevi tarafından glikozile edilen suşlar, FGI'lar grup I27'de bulunan pse genleri arasında GT'leri kodlayan genlere sahip değildir. Bu FGI grubuna ait suşların çoğu, bu bölgeye bitişik polar flagellin genleri göstermektedir. Buna karşılık, polar flagella'sı A. piscicola AH-319 gibi bir heteropolisakkarit glikan ile glikozile edilen suşlar, FGI'lerin grup II27'sinin pse genleri arasında lokalize olan, luxC'nin aşağı yönünde GT'leri kodlayan farklı genler gösterir ve her zaman polar flagellin genlerine bitişik değildir (Şekil 2A).
Flagella heteropolisakkarit glikanının biyosentezinde yer alan bölge ve orada bulunan varsayılan GT'lerin işlevi, boş mutantların yapımı ile doğrulanmıştır. Her mutantın oluşumu dört astar gerektirir: A, B, C ve D (Tablo 1). Astar B, silinecek genin başlangıcının (fgi-4) veya kümenin ilk geninin (fgi-1) aşağı yönünde 5-6 kodon tavlar ve primer A, bu genin başlangıcından (fgi-4 veya fgi-1) 600-800 bp yukarı akım tavlar. Primer C, silinecek genin son 5-6 kodonunun (fgi-4) veya kümenin son geninin (fgi-12) yukarı akımını tavlar ve primer D, bu genin durağından (fgi-4 veya fgi-12) aşağı yönde 600-800 bp tavlar (Şekil 2B). Fgi kümesinin silinmesi için A ve D primerleri ve A. piscicola AH-3'ün fgi-4'ü, 5' uçlarında endonükleaz BamHI için bir kısıtlama bölgesi içerir (Tablo 1). Bu endonükleazın AB veya CD PCR fragmanlarında iç hedefleri yoktur. Önemli bir adım, B ve C astarlarının tasarımıdır. Silinecek genin veya parçanın açık okuma çerçevesini kırmamak için her ikisinin de çerçeve içinde olması gerekir. B ve C primerlerinin 5' ucundaki 21 bp tamamlayıcı diziler, bu amplikonların birleştirilmesine ve genişletilmesine izin veren 3' uç tamamlayıcı dizilerle AB ve CD amplikonlarının üretilmesine izin verir. Amplikonları birleştirmek ve genişletmek için PCR programı, ilk doğallıktan çıkarma adımından ve 54 ° C'lik bir tavlama sıcaklığına sahip beş döngüden oluşur (Ek Malzeme). Daha sonra, A ve D primerlerinin eklenmesi, genişletilmiş parçanın amplifikasyonuna izin verir (Şekil 3). BamHI'in enzimatik etkisi, BglII ile sindirilen intihar vektörü pDM4 ile ligasyon için uyumlu yapışkan uçlu bir amplikona yol açar.
pDM4'ün λpir bağımlı bir plazmid olduğu göz önüne alındığında, ligasyon ürünü E. coli suşu MC1061λ pir (thi thr1 leu6 proA2 his4 argE2 lacY1 galK2 ara14 xyl5 supE44 λ pir) içine elektroporate edildi ve kloramfenikol plakalarda seçildi. pDM4, rekombinant klonları seçmek için doğrudan bir sisteme sahip değildir ve koloniler, klonlama bölgesini çevreleyen bir pDM4 primer çifti (pDM4for ve pDM4rev) (Tablo 1 ve Ek Materyal) ile PCR tarafından analiz edilmiştir. PCR reaksiyonunda negatif kontrol olarak pDM4 içermeyen E. coli suşu MC1061λpir kullanılmıştır.
Alelik değişimi gerçekleştirmek için, rekombinant pDM4 plazmidi alıcı suş A. piscicola AH-3'e transfer edildi. Birçok Aeromona'nın elektroporasyon ile dönüştürülemediği göz önüne alındığında, rekombinant pDM4, triparental çiftleşme kullanılarak konjugasyon yoluyla aktarılmıştır (Şekil 4). Transkonjugant kolonileri seçmek için, konjugasyon çiftleşmesinden Aeromonas suşunun seçilmesine izin veren rifampisine dirençli bir alıcı suşu kullanıyoruz. Ayrıca, seçilen koloniler oksidaz testine tabi tutuldu, çünkü Aeromonas oksidaz pozitifken, E. coli oksidaz negatiftir. Birinci ve ikinci rekombinasyonlar, güçlendirilmiş bölgelerin (AB ve CD fragmanları) harici primerleri (E ve F primerleri) ile PCR ile doğrulandı (Tablo 1, Ek Materyal ve Şekil 5A).
Aeromonas'ta, polar flagellinlerin glikozilasyonu, flagellar filamentin montajı için gereklidir. Fonksiyonel polar flagellanın varlığı, silinmiş GT genleri veya bölgesi olan bakteri kolonilerinin hareketlilik testleri kullanılarak analiz edildi. Işık mikroskobu testleri, sıvı ortamdaki yüzme hareketliliğinin, vahşi tip suşa kıyasla her iki mutantta da azaldığını göstermiştir. Ayrıca, her ikisi de yumuşak agar üzerinde hareketlilik analiz edildiğinde vahşi tip suşa bağlı olarak azalmış radyal genişleme göstermiştir (Şekil 5B). Her iki mutantın da yüzebildiği ancak vahşi tip suşla ilgili olarak hareket kabiliyetinin azaldığı göz önüne alındığında, polar flagellaları saflaştırıldı ve flagellin moleküler ağırlığı% 12'lik bir SDS-poliakrilamid jelinde analiz edildi. Bu analiz, her iki mutantın da vahşi tip suştan daha düşük moleküler ağırlığa sahip kutupsal flagellinlere sahip olduğunu göstermiştir (Şekil 5C), bu da flagella glikanındaki değişiklikleri göstermektedir. CsCl gradyanları tarafından saflaştırılan flagella (Şekil 5C), glikan kompozisyonunu tanımlamak için kütle-spektrometri testlerinde ve glikan ve glikan bileşiminin rolünü tanımlamak için biyofilm, adezyon veya diğer tahlillerde kullanılan boş mutantlarda kullanılacaktır.
Şekil 1: Bu yordamda kullanılan adımlara genel bakış. Aeromonas'ın flagella glikozilasyon adasını ve glikan biyosentezinde yer alan GT'leri tanımlamak için protokolde açıklanan sürecin şeması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Kromozomal bölgelerin biyoinformatik tespiti ve primer tasarımı. (A) A. hydrophila AH-1 ve A. piscicola AH-3'te tanımlanan kromozomal bölgelerin şeması. A. hidrofila AH-1 flagella glikozilasyon adası, flagella glikanı sadece bir pseudaminik asit türevine sahip olan suşları temsil eder ve A. piscicola AH-3 flagella glikozilasyon adası, flagella glikanı heteropolisakkarit olan suşları temsil eder. Siyah ile gösterilen genler, pseudaminik asidin biyosentezinde rol oynar ve sarı gösterilenler varsayılan GT'lerdir. (B) PCR çerçeve içi delesyonları için tasarlanmış primer çiftlerinin kromozomal konumunun şeması. A ve D primerlerindeki mavi kutular, bir endonükleaz için kısıtlama bağlanma bölgesini içerir. B ve C astarlarındaki kırmızı kutular 21 bp tamamlayıcı dizi içerir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İntihar plazmidi pDM4'e PCR çerçeve içi delesyonları ve ligasyonu oluşturma yöntemini gösteren şema. MCS: çoklu klonlama bölgesi, CmR: kloramfenikol dirençli genler, sacB: ekspresyonu sakkaroz tarafından indüklenen ve Gram-negatif bakteriler için ölümcül olan Bacillus subtilis levansucrase'i kodlar ve mafya: mobilizasyon genleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Triparental konjugasyonu ve allelik değişim için kullanılan prosedür. İlk rekombinasyon, λpirin Aeromonas suşlarına yokluğu nedeniyle oluşur ve rekombinant plazmidin seçilen gene entegrasyonuna yol açar. İkinci rekombinasyon,% 10 sakkaroz ile LB'de büyüme ile indüklenir, bu da sacB geninin ekspresyonuna yol açar ve plazmid kromozomdan eksize edilir. Çaprazlamadan sonra, vahşi tip veya mutasyona uğramış gen bakteri kromozomunda kalabilir. Boş mutantlar PCR tarafından harici primerlerle seçilir. RifR: rifampisine dayanıklı; CmR: kloramfenikol dayanıklı; SpcR: spektinomisin dirençlidir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Null mutantların doğrulanması ve polar flagellanın fenotipik analizi. (A) Kloramfenikol duyarlı kolonilerde ikinci rekombinasyondan sonra allelik değişimi doğrulamak için A. piscicola AH-3'ün fgi-4 harici primerleri (EF primerleri) ile PCR. Şerit WT: A. piscicola AH-3; şerit 1-8: ikinci rekombinasyonun kloramfenikole duyarlı kolonileri; St: HyperLadder 1 Kb işaretleyici. Şerit 1-3 ve 5-8, vahşi tip fgi-4 genine sahip kolonileri şerit WT olarak gösterir. (B) A. piscicola AH-3'ün yumuşak agarında ve fgi bölgesindeki (AH-3ΔFgi) ve fgi-4 genindeki (AH-3ΔFgi-4) boş mutantların 25 ° C'de hareketliliği. (C) AH-3'ten (şerit1) Polar flagellum ve fgi bölgesindeki (şerit 2) ve fgi-4 genindeki (şerit 3) boş mutantlar, izole edilmiş, CsCl gradyanlarında saflaştırılmış,% 12 SDS-PAGE'de analiz edilmiş ve Coomassie mavisi kullanılarak boyanmıştır. Boyut standardı (St). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| Astar adı | 5' ila 3' yönde sıralama | Şunun için kullanılır: | ||
| A. piscicola AH-3 | ||||
| A-Flgi1 | CGCGGATCCGACTGTACCCGTTTCAATCA | fgi mutant | ||
| B-Flgi1 | CCCATCCACTAAACTTAAACA GATCACCTCGAACTCGAAA | |||
| C-Flgi12 · | TGTTTAAGTTTAGTGGATGGG GGAACCTTAAATGCCATGA | |||
| D-Flgi12 · | CGCGGATCCCAGTCTTCAGCTCTCATCC | |||
| E-Flgi1 | ACCCGCTTCATTCGCTAT | |||
| F-Flgi12 | TCCGATTTTCTGACTCAGGG | |||
| A-Fgi4 | CGCGGATCCGATGCGTACGCTAATATGAA | fgi-4 mutant | ||
| B-Fgi4 | CCCATCCACTAAACTTAAACA CATATTATCTTGCCCCTGAT | |||
| C-Fgi4 | TGTTTAAGTTTAGTGGATGGG ATGGAGCTAATCACTCGTTT | |||
| D-Fgi4 | CGCGGATCCACATATCAACCCCCAAC | |||
| E-Fgi4 | ATTTCCCTGCCAAATACG | |||
| F-Fgi4 | CCTGCCAACAGGATGTAAG | |||
| pDM4 vektörü | ||||
| pDM4için | AGTGATCTTCCGTCACAGG | pDM4 vektörüne eklemeler | ||
| pDM4rev | AAGGTTTAACGG TTGTGGA | |||
Tablo 1: Boş mutantların yapımında kullanılan astarlar. B ve C astarlarında örtüşen bölgelerin altı çizilir. Arjantin HI sitesi A ve D astarlarında kalındır.
Ek Materyal. AB ve CD amplikonlarını elde etmek için asimetrik PCR'lerde kullanılan reaktifler ve reaksiyonlar, AD amplikonlarını genişletmek ve elde etmek için Pre-AD ve AD PCR'ler, pDM4 vektörüne silinmiş yapının eklenmesini doğrulamak için pDM4 PCR'ler ve birinci ve ikinci rekombinasyonu doğrulamak için EF PCR'ler. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yöntemin kritik erken adımı, flagella ve varsayılan GT'lerin glikozilasyonunda yer alan bölgelerin tanımlanmasıdır, çünkü bu enzimler yüksek homoloji gösterir ve birçok süreçte yer alır. Aeromonas genomlarının halka açık veri tabanlarındaki biyoinformatik analizi, bu bölgenin birçok suşta flagellin genlerini içeren ve pseudaminik asit27'nin biyosentezinde rol oynayan genleri içeren polar flagella bölgesi 2'ye bitişik olduğunu göstermektedir. Bu, Aeromonas'taki flagella glikozilasyon adalarını tespit etmek için, flagellar glikanı pseudaminik asit türevleri içeren diğer bakterilerde bu bölgeyi tanımlamak için kullanılabilecek bir kılavuz geliştirmeyi mümkün kılmıştır. Ek olarak, bu yöntem flagella glikozilasyonunda yer alan bir gen kümesinin nasıl analiz edileceğini açıklasa da, farklı Gram-negatif bakterilerde flagella oluşumu, rotasyonu veya düzenlenmesinde rol oynayabilecek proteinleri kodlayan genleri incelemek için de kullanılabilir.
PCR çerçeve içi silmelerin oluşturulmasında ayrıca B ve C astarlarının tasarımıdır. Bu primerler, silinecek seçilen gen veya bölgenin başlangıç akışının aşağısında (B primer) ve durağın yukarı akışında (C primer) 5-6 kodon lokalize edilmeli ve açık okuma çerçevesini kırmamalıdır. Ayrıca, dikkate alınması gereken önemli bir faktör, AB ve CD amplikonlarını üretmek için yükseltilen homoloji bölgesinin uzunluğudur. Bu protokol, her iki amplikon'un da her biri 600-800 bp'lik bir homolog bölgesi içermesini önerir. Daha kısa homolog bölgeler ilk rekombinasyonu daha zor hale getirir.
Aeromonas suşları, pDM4 intihar plazmidini çoğaltmak için gerekli olan lambda pir genini taşımaz. Bu nedenle, pDM4 rekombinant plazmidi kromozomal DNA'ya entegre olmalıdır. Triparental çiftleşmesinden sonra, ilk rekombinasyonun gerçekleştiği bakteri kolonilerini tanımlamak önemlidir. Bu koloniler, homolog kromozomal bölgeye yerleştirilen rekombinant pDM4'ü içerir. Rekombinant kolonilerin tanımlanması, silinmesi hedeflenen bölgenin dışındaki primerlerle (E ve F primerler) bir PCR reaksiyonu kullanılarak gerçekleştirilir. Standart bir DNA polimeraz kullanılırsa, E-F primerleri sadece vahşi tipte bir PCR ürününün üretilmesine yol açacaktır. Bu primer çifti, pDM4 rekombinant plazmidinin kromozomal DNA'ya yerleştirildiği bakteri kolonilerinde herhangi bir PCR ürünü üretmez. PCR ürününün eksikliği, E ve F primerlerinin tavlama dizileri arasındaki mesafeden kaynaklanmaktadır. Bu mesafe standart polimerazlar tarafından yükseltilemez. Bununla birlikte, diğer faktörler de PCR ürünlerinin oluşumunu önleyebilir. Bu nedenle, ilk rekombinant koloniler, uzun fragman amplifikasyonu için DNA polimerazları veya bir pDM4 ve bir harici primerden oluşan primer çiftleri kullanılarak PCR reaksiyonları ile tanımlanabilir. Büyük genetik kümeler silindiğinde, vahşi tip suştaki amplifikasyon, uzun fragman amplifikasyonu için DNA polimerazlarının kullanılmasını gerektirir. İlk rekombinasyona sahip bakteri kolonileri, pDM4-harici primer çiftleri ile PCR ile tanımlanabilir. Bununla birlikte, birinci ve ikinci rekombinasyonlar genellikle aynı anda üretilir ve pDM4'ü vahşi tiple veya rekombinasyondan sonra silinen genle bırakır. Bu, harici primerler kullanan PCR'si, silinmiş gen veya fragmanla ilişkili olan vahşi tip genin veya küçük amplikonların aynı boyutuna sahip amplikonlar veren kloramfenikol dirençli kolonilere yol açar. Doğru rekombinant ekine sahip olduğu gösterilen koloniler, yerleştirilmemiş pDM4'ü çıkarmak için sakkaroz ile inkübe edildi. Sakkaroz, gram-negatif bakteriler için ölümcül bir enzimi kodlayan pDM4 üzerinde bulunan sacB geninin ekspresyonunu indükler. Bu nedenle, sadece intihar plazmidi olmayan koloniler LB'de sakkaroz ile büyüyecektir. Silinen geni içeren kolonilerin kimliğini desteklemek için, dış primer çifti ile güçlendirilen parça daha sonra sıralanabilir.
Bu çerçeve içi mutasyon yönteminin Aeromonas'ta uygulanması, aşağı akış genlerinin ekspresyon seviyelerinde değişiklik yapmadan daha kararlı null mutantların üretilmesini sağlar. Bir antibiyotik kaseti yerleştirmek gibi diğer yöntemler, aşağı akış genlerinin transkripsiyonunu sağlar, ancak ekspresyon seviyesi değiştirilebilir. Ayrıca, bu yöntem diğer Gram-negatif bakteriler 29,31,32,33 dahil olmak üzere diğer hedef genlere ve bölgelere ekstrapolasyon yapılabilir.
Bazı bakteri suşlarında, flagellinlere bağlı glikanın kaybı veya modifikasyonu, flagella montajının yetersizliğine veya flagella filamentinin dengesizliğine yol açabilir ve bu da polar flagella hareketliliğinin azalmasına neden olabilir. Hareketli olmayan bir fenotipi, sıvı ortamdaki motilitesi tahlillerini kullanarak hareketli bir fenotipten ayırt etmek kolay olsa da, motilitenin derecesindeki farklılıkların ölçülmesi zor olabilir. Motilite plakası testleri, hareketlilik derecesindeki farklılıkları ölçmek için gereklidir. Bununla birlikte, birçok mezofilik Aeromonas suşu da dahil olmak üzere bazı bakteri türleri, kurucu polar flagella'ya ek olarak, yüksek viskoziteli ortamlarda veya plakalarda büyürken indüklenebilir lateral flagella eksprese eder. Her iki flagella tipi de yarı katı plakalardaki bakteriyel hareketliliğe katkıda bulunur. Bu nedenle, polar veya lateral flagella'nın modifikasyonları sadece migrasyon çaplarında azalmaya yol açar. Bu nedenle, AH-3ΔFgi ve AH-3ΔFgi-4 mutantları, vahşi tip suşa göre sadece azaltılmış hareketlilik gösterir. Polar flagella'nın dönüşü ile üretilen hareketliliğin değerlendirmesini geliştirmek için, boş mutantların genleşme çapı sadece vahşi tip suş ile değil, aynı zamanda polar flagellum eksikliği olan bir mutant ile de karşılaştırılmalıdır. Ayrıca, glikan kalıntılarının sayısındaki azalma veya glikan bileşimindeki değişiklikler, glikozile flagellinlerin elektroforetik hareketliliğini etkiler. Örneğin, SDS-PAGE jelleri kullanılarak gözlemlenen glikozile flagellinlerin moleküler ağırlığı, flagellin amino asit dizisinden tahmin edilenden daha yüksektir ve glikandaki bozulmalar, moleküler ağırlıklarında azalma olarak gözlenir. Bazı durumlarda, flagellin proteinindeki glikan modifikasyonundaki değişiklikler SDS-PAGE kullanılarak tespit edilemeyebilir. Bu durumlarda, glikan'ın varlığını ve kütlesini doğrulamak için sağlam protein veya flagellin peptidlerinin kütle spektrometri analizi gerekebilir.
Aeromonas'ın ve diğer Gram-negatif bakterilerin patojenitesi, flagellum yokluğundan ve aynı zamanda flagella glikanlarının bileşimindeki değişikliklerden de etkilenebilir. Bu değişiklikler biyotik ve abiyotik yüzeylere bakteriyel etkileşimi, otoaglütinasyonu etkileyebilir, immün yanıttan kaçınmada ve / veya pro-inflamatuar yanıtın indüklenmesinde rol oynayabilir. Bu nedenle, flagella glikozilasyonu ile Aeromonas patojenitesi arasındaki ilişkiyi değerlendirmek için aderans, biyofilm oluşumu ve pro-inflamatuar yanıt testleri gereklidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma Kanada Ulusal Araştırma Konseyi tarafından, Plan Nacional de I + D (Ministerio de Economía y Competitividad, İspanya) ve Generalitat de Catalunya (Centre de Referència en Biotecnologia) için desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ABI PRISM Big Dye Terminator v. 3.1 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit | Applied Biosystems | 4337455 | Used for sequencing |
| AccuPrime Taq DNA Polymerase, high fidelity | Invitrogen | 12346-086 | Used for amplification of AB, CD and AD fragments |
| Agarose | Conda-Pronadise | 8008 | Used for DNA electrophoresis |
| Alkaline phosphatase, calf intestinal (CIAP) | Promega | M1821 | Used to remove phosphate at the 5’ end |
| Bacto agar | Becton Dickinson | 214010 | Use for motility analysis |
| BamHI | Promega | R6021 | Used for endonuclease restriction |
| BglII | Promega | R6081 | Used for endonuclease restriction |
| BioDoc-It Imagin System | UVP | Bio-imaging station used for DNA visualization | |
| Biotaq polymerase | Bioline | BIO-21040 | Used for colony screening |
| Cesium chloride | Applichem | A1126,0100 | Used for flagella purification |
| Chloramphenicol | Applichem | A1806,0025 | Used for triparental mating |
| Cytiva illustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit | Cytivia | 28-9034-71 | Used for purification of PCR amplicons and DNA fragments. |
| EDTA | Applichem | 131026.1211 | Used for DNA electrophoresis |
| Electroporation cuvettes 2 mm gap | VWR | 732-1133 | Used for transformation |
| Ethidium bromide | Applichem | A1152,0025 | Use for DNA visualization |
| HyperLadder 1 Kb marker | Bioline | BIO-33053 | DNA marker |
| Invitrogen Easy-DNA gDNA Purification Kit | Invitrogen | 10750204 | Used for bacterial chromosomal DNA purification |
| Luria-Bertani (LB) Miller agar | Condalab | 996 | Used for Escherichia coli culture |
| Luria-Bertani (LB) Miller broth | Condalab | 1551 | Used for Escherichia coli culture |
| Nanodrop ND-1000 | NanoDrop Techonologies Inc | Spectrophotometer used for DNA quantification | |
| Rifampicin | Applichem | A2220,0005 | Used for triparental mating |
| SOC Medium | Invitrogen | 15544034 | Used for electroporation recovery |
| Spectinomycin | Applichem | A3834,0005 | Used for triparental mating |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman | 331362 | Used for flagella purification |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224017 | Used for ligation reaction |
| Trypticasein soy agar | Condalab | 1068 | Used for Aeromonas grown |
| Trypticasein soy broth | Condalab | 1224 | Used for Aeromonas grown |
| Tryptone | Condalab | 1612 | Use for motility analysis |
| Tris | Applichem | A2264,0500 | Used for DNA electrophoresis and flagella purification |
| Triton X-100 | Applichem | A4975,0100 | Used for bacterial lysis |
| Ultra Clear tubes (14 mm x 89 mm) | Beckman | 344059 | Used for flagella purification |
| Veriti 96 well Thermal Cycler | Applied Biosystems | Used for PCR reactions | |
| Zyppy Plasmid Miniprep II Kit | Zymmo research | D4020 | Used for isolation of plasmid DNA |
References
- Schäffer, C., Messner, P.
- De Maayer, P., Cowan, D. A. Flashy flagella: flagellin modification is relatively common and highly versatile among the Enterobacteriaceae. BMC Genomics. 17, 377 (2016).
- Nothaft, H., Szymanski, C. M.
- Benz, I., Schmidt, M. A. Never say never again: protein glycosylation in pathogenic bacteria. Molecular Microbiology. 45 (2), 267-276 (2002).
- Guerry, P., Szymanski, C. M.
- Hug, I., Feldman, M. F. Analogies and homologies in lipopolysaccharide and glycoprotein biosynthesis in bacteria. Glycobiology. 21 (2), 138-151 (2011).
- Iwashkiw, J. A., Vozza, N. F., Kinsella, R. L., Feldman, M. F. Pour some sugar on it: the expanding world of bacterial protein O-linked glycosylation. Molecular Microbiology. 89 (1), 14-28 (2013).
- Szymanski, C. M., Wren, B. W.
- Tan, F. Y. Y., Tang, C. M., Exley, R. M. Sugar coating: bacterial protein glycosylation and host-microbe interactions. Trends Biochemistry Sciences. 40 (7), 342-350 (2015).
- Lairson, L. L., Henrissat, B., Davies, G. J., Withers, S. G. Glycosyltransferases: structures, functions, and mechanisms. Annual Review Biochemistry. 77, 521-555 (2008).
- Lombard, V., Golaconda Ramulu, H., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013. Nucleic Acids Research. 42, Database Issue 490-495 (2014).
- Weerapana, E., Imperiali, B. Asparagine-linked protein glycosylation: from eukaryotic to prokaryotic systems. Glycobiology. 16 (6), 91 (2006).
- Faridmoayer, A., et al. Extreme substrate promiscuity of the Neisseria oligosaccharyl transferase involved in protein O-glycosylation. Journal of Biological Chemistry. 283 (50), 34596-34604 (2008).
- Wacker, M., et al. Substrate specificity of bacterial oligosaccharyltransferase suggests a common transfer mechanism for the bacterial and eukaryotic systems. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (18), 7088-7093 (2006).
- Scott, A. E., et al. Flagellar glycosylation in Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis. Journal of Bacteriology. 193 (14), 3577-3587 (2011).
- Thibault, P., et al. Identification of the carbohydrate moieties and glycosylation motifs in Campylobacter jejuni flagellin. Journal of Biological Chemistry. 276 (37), 34862-34870 (2001).
- Schirm, M., et al. Structural, genetic and functional characterization of the flagellin glycosylation process in Helicobacter pylori. Molecular Microbiology. 48 (6), 1579-1592 (2003).
- McNally, D. J., et al. Targeted metabolomics analysis of Campylobacter coli VC167 reveals legionaminic acid derivatives as novel flagellar glycans. Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14463-14475 (2007).
- Logan, S. M., et al. Identification of novel carbohydrate modifications on Campylobacter jejuni 11168 flagellin using metabolomics-based approaches. FEBS Journal. 276 (4), 1014-1023 (2009).
- Wilhelms, M., Fulton, K. M., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. Differential glycosylation of polar and lateral flagellins in Aeromonas hydrophila AH-3. Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27851-27862 (2012).
- Canals, R., et al. Non-structural flagella genes affecting both polar and lateral flagella-mediated motility in Aeromonas hydrophila. Microbiology. 153, Pt 4 1165-1175 (2007).
- Howard, S. L., et al. Campylobacter jejuni glycosylation island important in cell charge, legionaminic acid biosynthesis, and colonization of chickens. Infection and Immunity. 77 (6), 2544-2556 (2009).
- Verma, A., Arora, S. K., Kuravi, S. K., Ramphal, R. Roles of specific amino acids in the N-terminus of Pseudomonas aeruginosa flagellin and of flagellin glycosylation in the innate immune response. Infection and Immunity. 73 (12), 8237-8246 (2005).
- Lamy, B., Baron, S., Barraud, O. Aeromonas: the multifaceted middleman in the One Health world. Current Opinion in Microbiology. 65, 24-32 (2022).
- Gavín, R., et al. Lateral flagella of Aeromonas species are essential for epithelial cell adherence and biofilm formation. Molecular Microbiology. 43 (2), 383-397 (2002).
- Altschul, F. S., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
- Forn-Cuní, G., et al. Polar flagella glycosylation in Aeromonas: Genomic characterization and Involvement of a specific glycosyltransferase (Fgi-1) in heterogeneous flagella glycosylation. Frontiers in Microbiology. 11, 595697 (2021).
- Milton, D. L., O'Toole, R., Horstedt, P., Wolf-Watz, H. Flagellin A is essential for the virulence of Vibrio anguillarum. Journal of Bacteriol.ogy. 178 (5), 1310-1319 (1996).
- Kovács, N. Identification of Pseudomonas pyocyanea by the oxidase reaction. Nature. 178 (4535), 703 (1956).
- Fulton, K. M., Mendoza-Barberá, E., Twine, S. M., Tomás, J. M., Merino, S. Polar glycosylated and lateral non-glycosylated flagella from Aeromonas hydrophila strain AH-1 (Serotype O11). International Journal of Molecular Sciences. 16 (12), 28255-28269 (2015).
- Khider, M., Willassen, N. P., Hansen, H. The alternative sigma factor RpoQ regulates colony morphology, biofilm formation and motility in the fish pathogen Aliivibrio salmonicida. BMC Microbiology. 18 (1), 116 (2018).
- Pawar, S. V., et al. Novel genetic tools to tackle c-di-GMP-dependent signalling in Pseudomonas aeruginosa. Journal of Applied Microbiology. 120 (1), 205-217 (2016).
- Vander Broek, W., Chalmers, K. J., Stevens, M. P., Stevens, J. M. Quantitative proteomic analysis of Burkholderia pseuomallei Bsa Type III secretion system effectors using hypersecreting mutants. The American Society for Biochemistry and Molecular Biology. 14 (4), 905-916 (2015).
