Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Acinetobacter baumannii O-bağlantılı Glikopeptitlerlerin Tanımlanması için Açık Arama Tabanlı Yaklaşımların Uygulanması

Published: November 2, 2021 doi: 10.3791/63242
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, The University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

Açık arama, daha önce bilinmeyen glikan bileşimleriyle süslenmiş glikopeptidlerin tanımlanmasını sağlar. Bu makalede, Acinetobacter baumannii'yi model olarak kullanan bakteriyel örnekler için açık arama ve müteakip glikan odaklı glikopeptid aramaları yapmak için kolaylaştırılmış bir yaklaşım sunulmuştur.

Abstract

Protein glikozilasyonu, bakteriyel organizmalar içinde yaygın bir modifikasyon olarak giderek daha fazla kabul görmekte ve prokaryotik fizyolojiye ve patojenik türlerin optimal enfektivitesine katkıda bulunmaktadır. Bu nedenle, bakteriyel glikozilasyonun karakterize edilmesine olan ilgi artmakta ve bu olayları tanımlamak için yüksek verimli analitik araçlara ihtiyaç duyulmaktadır. Aşağıdan yukarıya proteomikler, zengin glikopeptid verilerinin üretilmesini kolayca sağlasa da, prokaryotik türlerde gözlenen glikanların genişliği ve çeşitliliği, bakteriyel glikozilasyon olaylarının tanımlanmasını son derece zorlaştırmaktadır.

Geleneksel olarak, bakteriyel proteomik veri kümeleri içindeki glikan bileşimlerinin manuel olarak belirlenmesi, bunu alana özgü uzmanlarla sınırlı büyük ölçüde ısmarlama bir analiz haline getirmiştir. Son zamanlarda, açık arama tabanlı yaklaşımlar, bilinmeyen değişikliklerin tanımlanması için güçlü bir alternatif olarak ortaya çıkmıştır. Peptit dizileri üzerinde gözlenen benzersiz modifikasyonların sıklığını analiz ederek, açık arama teknikleri, karmaşık numuneler içindeki peptitlere bağlı ortak glikanların tanımlanmasına izin verir. Bu makale, glikoproteomik verilerin yorumlanması ve analizi için kolaylaştırılmış bir iş akışı sunmakta ve glikan bileşimleri hakkında önceden bilgi sahibi olmadan bakteriyel glikopeptidleri tanımlamak için açık arama tekniklerinin nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Bu yaklaşımı kullanarak, glikozilasyon farklılıklarını anlamak için numunelerdeki glikopeptidler hızla tanımlanabilir. Acinetobacter baumannii'yi model olarak kullanan bu yaklaşımlar, suşlar arasındaki glikan bileşimlerinin karşılaştırılmasını ve yeni glikoproteinlerin tanımlanmasını sağlar. Birlikte ele alındığında, bu çalışma, bakteriyel glikozilasyonun tanımlanması için açık veritabanı arama tekniklerinin çok yönlülüğünü göstermekte ve bu çok çeşitli glikoproteomların karakterizasyonunu her zamankinden daha kolay hale getirmektedir.

Introduction

Karbonhidratların protein moleküllerine bağlanma işlemi olan protein glikozilasyonu, doğada en yaygın post-translasyonel modifikasyonlardan (PTM'ler) biridir 1,2. Yaşamın tüm alanlarında, sayısız hücresel fonksiyonu etkileyen glikoproteinlerin üretimine adanmış bir dizi karmaşık makine gelişmiştir 1,3,4,5. Protein glikozilasyonubir dizi amino asit 6,7 üzerinde meydana gelirken, N'ye bağlı ve O'ya bağlı glikozilasyon olayları doğada gözlenen iki baskın formdur. N'ye bağlı glikozilasyon, glikanların asparagin (Asn) kalıntılarının bir azot atomuna bağlanmasını içerirken, O'ya bağlı glikozilasyonda, glikanlar serin (Ser), treonin (Thr) veya tirozin (Tyr) kalıntılarının bir oksijen atomuna bağlanır7. Glikozilasyon sistemleri tarafından hedeflenen kalıntılardaki benzerliklere rağmen, proteinlere bağlı glikanlar içindeki farklılıklar, glikozilasyonun doğada bulunan PTM'lerin kimyasal olarak en çeşitli sınıfı olmasına neden olur.

Ökaryotik glikozilasyon sistemleri glikan çeşitliliğine sahipken, bu sistemler tipik olarak kullanılan benzersiz karbonhidrat sayısında sınırlıdır. Ortaya çıkan çeşitlilik, bu karbonhidratlarınglikanlara nasıl düzenlendiğinden kaynaklanmaktadır 8,9,10,11,12. Buna karşılık, bakteri ve arkeal türler, bu sistemlerde üretilen benzersiz şekerlerin çok çeşitliolması nedeniyle neredeyse sınırsız glikan çeşitliliğine sahiptir 2,10,13,14,15,16,17. Yaşam alanları arasında gözlenen glikan çeşitliliğindeki bu farklılıklar, glikozilasyon olaylarının karakterizasyonu ve tanımlanması için önemli bir analitik zorluğu temsil etmektedir. Ökaryotik glikozilasyon için, glikan bileşimlerini tahmin etme yeteneği, glikobiyolojiye artan ilgiyi kolaylaştırmıştır; Bununla birlikte, aynı şey, hala büyük ölçüde uzmanlaşmış laboratuvarlar tarafından çalışılmakla sınırlı olan bakteriyel glikozilasyon için geçerli değildir. Biyobilimlerde kütle spektrometresi (MS) enstrümantasyonunun erişilebilirliği arttıkça, MS tabanlı yaklaşımlar artık glikoproteomik analiz için birincil yöntemdir.

MS, glikozilasyonun karakterizasyonu için mükemmel bir araç olarak ortaya çıkmıştır ve hem yukarıdan aşağıya hem de aşağıdan yukarıya yaklaşımlar şimdi glikoproteinleri karakterize etmek için yaygın olarak kullanılmaktadır6. Yukarıdan aşağıya proteomikler, spesifik proteinlerin18,19 küresel glikozilasyon paternlerini değerlendirmek için kullanılırken, aşağıdan yukarıya yaklaşımlar, glikopeptidlerin glikana özgü karakterizasyonunu sağlamak için, karmaşık karışımlardan bile6,20,21,22,23 kullanılır. Glikopeptidlerin analizi için, bilgilendirici parçalanma bilgisinin üretilmesi, glikozilasyon olaylarının karakterizasyonu için gereklidir24,25. Rezonans iyon tuzağına dayalı çarpışma kaynaklı ayrışma (IT-CID), ışın tipi çarpışma kaynaklı ayrışma (CID) ve elektron transferi ayrışması (ETD) dahil olmak üzere bir dizi parçalanma yaklaşımına artık aletler üzerinde rutin olarak erişilebilir. Her yaklaşım, glikopeptid analizi 25,26 için farklı güçlü ve zayıf yönlere sahiptir ve son on yılda bu parçalanma yaklaşımlarının glikozilasyonu analiz etmek için uygulanmasında önemli ilerlemeler kaydedilmiştir 6,20. Bununla birlikte, bakteriyel glikozilasyon analizi için kritik sınırlama, glikopeptidleri parçalama yeteneği değil, numuneler içindeki potansiyel glikan bileşimlerini tahmin edememe olmuştur. Bu sistemlerde, çeşitli bakteriyel glikanların bilinmeyen doğası, O-Pair27, GlycopeptideGraphMS28 ve GlycReSoft29 gibi ökaryotik glikopeptidlerin analizi için artık yaygın olan glikozilasyon odaklı arama araçlarıyla bile, glikopeptidlerin tanımlanmasını sınırlar. Bu sorunun üstesinden gelmek için, bakteriyel glikozilasyon çalışması için güçlü bir yaklaşım olarak ortaya çıkan açık arama araçlarının kullanımı ile alternatif bir arama yöntemi gereklidir30.

Kör veya joker karakter arama olarak da bilinen açık arama, bilinmeyen veya beklenmeyen PTM'lere sahip peptitlerin tanımlanmasına izin verir 21,30,31,32. Açık aramalar, seçilmiş değişiklik aramaları, çok adımlı veritabanı aramaları veya geniş kütle toleranslı arama33,34,35,36,37 dahil olmak üzere çeşitli hesaplama tekniklerini kullanır. Açık arama büyük bir potansiyele sahip olmasına rağmen, kullanımı tipik olarak, analiz sürelerindeki önemli artış ve sınırlı aramalara kıyasla değiştirilmemiş peptitlerin tespitindeki hassasiyet kaybı nedeniyle engellenmiştir31,32. Modifiye edilmemiş peptid-spektral eşleşmelerin (PSM'ler) tespitindeki azalma, istenen yanlış keşif oranlarını (FDR'ler) korumak için artan sıkı filtreleme gerektiren bu tekniklerle ilişkili artan yanlış pozitif PSM oranlarının bir sonucudur 33,34,35,36,37 . Son zamanlarda, Byonic 31,38, Open-pFind39, ANN-SoLo 40 ve MSFragger21,41 dahil olmak üzere açık aramanın erişilebilirliğini önemli ölçüde artıran çeşitli araçlar kullanıma sunulmuştur. Bu araçlar, analiz sürelerini önemli ölçüde azaltarak ve heterojen glikan bileşimlerini işlemek için yaklaşımlar uygulayarak glikozilasyon olaylarının sağlam bir şekilde tanımlanmasını sağlar.

Bu makalede, Gram-negatif nozokomiyal patojen Acinetobacter baumannii'yi model olarak kullanarak, bakteriyel glikopeptidlerin açık arama yoluyla tanımlanması için kolaylaştırılmış bir yöntem sunulmaktadır. A. baumannii, PglL protein glikozilasyon sistemi42,43,44 olarak bilinen çoklu protein substratlarının modifikasyonundan sorumlu korunmuş bir O-bağlantılı glikozilasyon sistemine sahiptir. Benzer proteinler suşlar arasında glikozilasyon için hedeflenirken, PglL glikozilasyon sistemi, kapsül lokusundan (K-lokus olarak bilinir) türetilen protein glikozilasyonu için kullanılan glikanın biyosentezi nedeniyle oldukça değişkendir4,45,46. Bu, tek veya sınırlı polimerize K-birimlerinden türetilen çeşitli glikanların (K-birimi olarak da bilinir) protein substratlarına 30,44,46 eklenmesiyle sonuçlanır. Bu çalışmada, FragPipe yazılımı içindeki açık arama aracı MSfragger'ın kullanımı, A. baumannii suşları arasındaki glikanları tanımlamak için kullanılmıştır. Açık arama ve manuel kürasyonu birleştirerek, bakteriyel glikopeptidlerin tanımlanmasını daha da iyileştirmek için "glikan odaklı aramalar" yapılabilir. Birlikte, bu çok adımlı tanımlama yaklaşımı, yeni glikozilasyon olaylarının karakterizasyonunda geniş deneyime sahip olmadan glikopeptidlerin tanımlanmasını sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

NOT: Bakteriyel glikopeptid numunelerinin hazırlanması ve analizi dört bölüme ayrılabilir (Şekil 1). Bu çalışmada üç sıralı A. baumannii suşunun glikozilasyonu değerlendirilmiştir (Tablo 1). Bu suşların her birinin Proteome FASTA veritabanlarına Uniprot üzerinden erişilebilir. Bu protokolde kullanılan arabelleklerin bileşimi için Tablo 2'ye bakın.

1. Proteomik analiz için protein numunelerinin hazırlanması

  1. İlgilenilen proteom örneklerinin izolasyonu
    1. Bütün hücreleri kullanıyorsanız, ortamda bulunan potansiyel protein kirleticilerini gidermek için hücrelerin fosfat tamponlu bir salin çözeltisi (PBS) ile yıkandığından emin olun. Yıkadıktan sonra tüm hücreleri çıtçıtlayın ve gerekene kadar -80 ° C'de saklayın.
    2. Fraksiyone numuneler kullanılıyorsa (membran preparatları gibi), kullanılan reaktiflerin çıkış yönündeki sıvı kromatografisi MS (LC-MS) analizine müdahale etmeyeceğinden emin olun50.
    3. Sodyum dodesil sülfat (SDS), Triton X-100, NP-40 veya lauroylsarcosine gibi deterjanlar kullanılmışsa, bu deterjanları aseton çökeltme, SP3 numune hazırlama yöntemleri51 veya S-tuzakları52 gibi ticari proteomik temizleme sütunları kullanarak çıkarın. Alternatif olarak, uyumsuz deterjanları sodyum deoksikolat (SDC) veya oktil glukopiranosid gibi MS uyumlu veya çıkarılabilir bir deterjanla değiştirin.
    4. Numune hazırlamada kullanılacak tüm plastik eşya ve cam eşyaların otoklavlanmadığından emin olun. Otoklavlanmış cam eşyalar ve plastikler tipik olarak, MS içinde kolayca tespit edilen polimerler gibi küçük moleküler ağırlıklı bileşiklerle ağır şekilde kirlenir.
  2. Tüm hücre örneklerinin çözündürülmesi
    1. 200 μL taze hazırlanmış sodyum deoksikolat lizis tamponunda ~10 mg yıkanmış, çıtçıtla dondurulmuş hücreleri yeniden askıya alın (SDC lizis tamponu: 100 mM Tris'te %4 SDC, pH 8.5).
      NOT: Protein yıkımını sınırlamak için SDC lizis tamponuna proteaz inhibitörleri eklenebilir.
    2. Numuneleri sallayarak 95 ° C'de 10 dakika kaynatın (bir termomikserde 2000 rpm) ve ardından 10 dakika buz üzerinde bırakın. Numunelerin verimli bir şekilde parçalanmasını ve çözünmesini sağlamak için bu işlemi iki kez tekrarlayın.
      NOT: Numuneler bu noktada -80 °C'de uzun süreli olarak saklanabilir. Depolanırsa, daha fazla işlemden önce 95 ° C'de ısıtılarak çözünür.
  3. Bisinkoninik asit (BCA) protein testi53 kullanarak numune protein konsantrasyonlarını sayısallaştırın. Protein bozulmasını sınırlamak için nicelleştirme yaparken numuneleri buz üzerinde saklayın.
    NOT: Toplam proteom analizi için, 20-100 μg protein, analiz başına tipik olarak 2 μg'dan az protein sindirimi gerektiren nano LC-MS için fazlasıyla yeterlidir. Fazla peptidin hazırlanması, derin proteomik kapsama alanı gerekiyorsa replikasyon analizine veya daha fazla fraksiyonasyona izin verir. Hidrofilik etkileşim kromatografisi (HILIC) kullanılarak glikopeptid zenginleştirme bazlı analiz için 100-500 μg protein gereklidir.
  4. Örnekleri azaltın ve alkilat alın.
    1. 1x'lik son konsantrasyon için numunelere 10x indirgeme/alkilasyon tamponunun hacminin 1/10'da 10'unu (100 mM Tris 2-karboksiletil fosfin hidroklorür; 1 M Tris'te 400 mM 2-kloroasetamid, pH 8,5) ekleyin ve numuneleri karanlıkta 45 °C'de 30 dakika boyunca 1.500 rpm'de çalkalayarak inkübe edin.
      NOT: Daha düşük bir pH, SDC'nin çökelmesine neden olacağından, numunelere eklemeden önce yaklaşık 7,0-8,0 pH değerini sağlamak için 10x indirgeme/alkilasyon tamponunun pH'ını kontrol edin.
  5. Numuneleri kısaca döndürün ve 1:100'lük son proteaz:protein oranı için proteazlar Tripsin/Lys-C'yi (~10 μL, 100 mM Tris, pH 8.5'te yeniden askıya alınmış) ekleyin. Sindirimi gece boyunca 37 ° C'de 1.500 rpm'de (18 saate kadar) çalkalayarak inkübe edin. Tam protein sindirimini sağlamak için, 1:50 ila 1:200 arasında bir Tripsin / Lys-C proteaz: protein oranı kullanın.
  6. Numunelere 1.25 hacim %100 izopropanol ekleyerek sindirimi söndürün. Numuneleri karıştırmak ve kısaca döndürmek için 1 dakika boyunca vorteks yapın.
    NOT: Numuneler daha sonra işlenmek üzere -20 °C'de saklanabilir.
  7. 0.115 hacimde% 10 trifloroasetik asit (TFA; ~% 1 TFA'nın son konsantrasyonu) ekleyerek numuneleri asitleştirin, numuneleri vorteksleyin ve kısaca aşağı doğru döndürün.

2. Proteom numunelerinin işlenmesi

  1. Proteom örneklerinin peptit temizliği
    1. Daha önce açıklandığı gibi her numune için bir stirendivinilbenzen-ters fazlı sülfonat (SDB-RPS) Dur-kalk ekstraksiyonu (Aşama) Ucu hazırlayın54.
      1. Ampirik olarak, 50 μg peptidi bağlamak için, künt bir iğne (14 G) kullanarak 47mm2 SDB-RPS membranından üç SDB-RPS diskini çıkarın. Daha büyük peptit miktarları için, buna göre disk sayısını artırın.
    2. SDB-RPS Aşama İpuçlarını kullanmadan önce, aşağıdaki tamponlardan en az on yatak hacmini sırayla ekleyerek ve tamponu santrifüjleme (25 °C, 3 dakika, 500 × g) ile kolon boyunca döndürerek veya bir şırınga kullanarak yavaşça basınç uygulayarak tamponu kolondan geçirerek uçları hazırlayın.
      1. Uçları 150 μL% 100 asetonitril ile ıslatın.
      2. Uçları 150 μL% 30 metanol,% 1 TFA ile 18.2 MΩ H2O'da yıkayın.
      3. Uçları 150 μL% 90 izopropanol,% 1 TFA ile dengeleyin 18.2 MΩ H2O ile dengeleyin.
    3. Numuneleri (%50 izopropanol, %1 TFA içeren) santrifüjleme (25 °C, 3 dk, 500 × g) veya bir şırınga kullanarak nazikçe basınç uygulayarak SDB-RPS Aşama Uçlarına yükleyin.
    4. SDB-RPS Aşama Uçlarını aşağıdaki tamponlarla santrifüjleme (25 °C, 3 dakika, 500 × g) veya bir şırınga kullanarak nazikçe basınç uygulayarak yıkayın.
      NOT: İzopropanol55 yerine etil asetat kullanımı gibi peptit olmayan kirleticileri gidermek için ek yıkamalar veya alternatif tamponlar kullanılabilir.
      1. Uçları 150 μL% 90 izopropanol,% 1 TFA ile yıkayın.
      2. Uçları 18.2 MΩ H2O'da 150 μL% 1 TFA ile yıkayın.
    5. SDB-RPS Aşama Uçlarından peptidleri, santrifüjleme yoluyla veya bir şırınga kullanarak nazikçe basınç uygulayarak %80 asetonitril içinde 150 μL %5 amonyum hidroksit ile süzün. Örnekleri tek tek tüplerde toplayın.
      NOT: Bir duman davlumbazında kullanmadan hemen önce plastik bir kapta %80 asetonitril içinde %5 amonyum hidroksit hazırlayın.
    6. Salınan peptitleri 25 °C'de vakum santrifüjleme ile kurutun.
      NOT: HILIC zenginleştirme işlemi gerçekleştiriliyorsa, peptid sızıntılarının% 1-10'u bu noktada çıkarılabilir, kurutulabilir ve toplam proteom giriş kontrolleri olarak kullanılabilir.
  2. Glikopeptid örneklerinin zenginleştirilmesi
    1. Zwitterionic Hidrofilik Etkileşim Sıvı Kromatografisi (ZIC-HILIC) Aşama İpuçlarını daha önce açıklandığı gibi hazırlayın54,56.
      1. Kısaca, künt bir iğne (14 G) kullanarak 47 mm2 C 8 membrandan bir C8 diski çıkarın ve bir frit oluşturmak için diski bir P200 ucuna paketleyin. % 50 asetonitril,% 50 18.2 MΩ H2O içinde yeniden askıya alınmış yaklaşık 5 mm ZIC-HILIC malzemeyi, bir şırınga kullanarak hafifçe basınç uygulayarak frit üzerine ekleyin.
    2. ZIC-HILIC Aşama Uçlarını kullanmadan önce, aşağıdaki tamponları sırayla ekleyerek ve bir şırınga kullanarak hafifçe basınç uygulayarak reçineyi şartlandırın.
      NOT: ZIC-HILIC reçinesinin yüzeyindeki sahte su tabakasının bütünlüğünü sağlamak için (glikopeptidleri zenginleştirmek için gereklidir), reçine daima ıslak kalmalıdır. Reçineyi yıkarken, reçinenin üzerinde her zaman ~10 μL çözücü bırakın ve yıkamaların/numunelerin doğrudan bu artık çözücüye pipetlendiğinden emin olun.
      1. Reçineyi 20 yatak hacmi (200 μL) ZIC-HILIC elüsyon tamponu (18.2 MΩ H2O'da %0.1 TFA) ile dengeleyin.
      2. Reçineyi 20 yatak hacmi (200 μL) ZIC-HILIC preparat tamponu (18.2 MΩ H2O'da% 95 asetonitril) ile yıkayın.
      3. Reçineyi 20 yatak hacmi (200 μL) ZIC-HILIC yükleme/yıkama tamponu ile yıkayın (%80 asetonitril, %1 TFA 18,2 MΩ H2O ile dengelenmiştir).
    3. Kurutulmuş sindirilmiş numuneleri (adım 2.1.6'dan itibaren) ZIC-HILIC yükleme/yıkama tamponunda 4 μg/μL'lik son konsantrasyona kadar yeniden askıya alın (örneğin, 200 μg peptid için, 50 μL ZIC-HILIC yükleme/yıkama tamponunda yeniden askıya alın). Numunelerin yeniden askıya alındığından emin olmak için 1 dakika boyunca kısaca vorteks yapın ve 25 ° C'de 2.000 × g'de 1 dakika aşağı doğru döndürün.
    4. Yeniden askıya alınmış peptit numunesini şartlandırılmış bir ZIC-HILIC kolonuna yükleyin.
      1. Bir şırınga kullanarak nazikçe basınç uygulayarak 20 yatak hacmi (200 μL) ZIC-HILIC yükleme/yıkama tamponu (toplam 60 yatak hacmi yıkaması için) ile üç kez yıkayın.
      2. 20 yatak hacimli (200 μL) ZIC-HILIC elüsyon tamponuna sahip suute glikopeptidleri, bir şırınga kullanarak hafifçe basınç uygulayarak 1,5 mL'lik bir tüpe yerleştirin ve ardından 25 ° C'de vakum santrifüjleme ile elüatı kurutun.

3. Proteom/glikopeptid ile zenginleştirilmiş örneklerin LC-MS'si

  1. Tampon A* (% 2 asetonitril, % 0.1 TFA) içindeki numuneleri 1 μg / μL'lik bir nihai konsantrasyona kadar yeniden askıya alın (örneğin, 50 μg peptid için, 50 μL Tampon A* içinde yeniden askıya alın).
  2. Glikopeptitlerlerin ayrılmasını ve tanımlanmasını sağlamak için numuneleri bir MS'e bağlı bir HPLC / UPLC üzerine yükleyin.
    NOT: İç çap, uzunluk, akış hızları, kromatografi reçinesinin tipi ve gerekli peptid enjeksiyon miktarları dahil olmak üzere sütun parametreleri, kullanılacak analitik kurulum ve gradyan uzunluğu için optimize edilmelidir; analitik kurulumların optimizasyonunun nasıl gerçekleştirileceğine dair bir örnek için bkz:57.
  3. Elde edilen MS verilerinin toplanmasını izleyin ve verilerin istenen parametrelerle toplandığından emin olun.
    NOT: Kompozisyonel analiz için CID parçalanması yeterlidir. Glikopeptidlere glikanların eklenmesi nedeniyle, glikopeptid iyonları tipik olarak glikozillenmemiş peptitlerden daha yüksek m / z ve daha düşük yük yoğunluğu ile gözlenir. Bu iyonların gözlemlenebilir olmasını sağlamak için, 400 ila 2.000 m / z arasında bir MS1 kütle aralığına izin verin.
  4. CID kullanılarak seçilen iyonların fragmanı, glikanların karakterizasyonu için önemli olan oksonyum iyonlarını içeren düşük m / z fragman iyonlarının toplanmasını sağlar.
    NOT: CID kullanılarak glikopeptidlerin parçalanması, hem peptit hem de glikan dizilerinden ve ayrıca parçalanma sırasında uygulanan enerjiden etkilenir25,58,59. Bir dizi farklı çarpışma enerjisi kullanılabilirken, glikopeptidleri parçalamak için en uygun strateji, çoklu çarpışma enerjilerinin kullanımını birleştiren kademeli çarpışma enerjilerinin kullanılmasıdır25,59,60.
  5. Varsa, saha lokalizasyonu için ETD veya glikan bileşimlerinin belirlenmesine yardımcı olması için IT-CID gibi alternatif parçalanma yöntemleri kullanın.
    NOT: Bu parçalanma yaklaşımlarının hiçbiri bileşimsel analiz için gerekli değildir, ancak ilgilenilen glikopeptitlerlerin daha fazla sorgulanmasını sağlamak için toplanabilir.

4. Proteom/glikopeptid ile zenginleştirilmiş numunelerin analizi

  1. FragPipe'da aramayı etkinleştirmek için veri dosyalarını önceden filtreleme
    1. Veri kümeleri içinde ETD veya IT-CID taramaları alınmışsa, FragPipe ile arama yapmadan önce MSConvert61'i kullanarak bu tarama olaylarını veri dosyalarından filtreleyin.
      NOT: Aşağıda özetlenen açık arama parametreleri için yalnızca ışın tipi CID verileri gereklidir.
  2. FragPipe'da açık aramalar gerçekleştirme
    1. FragPipe'ı açın ve İş Akışı sekmesini tıklatın. İş akışı açılır menüsünde, Aramayı aç seçeneğini belirleyin ve aranacak veri dosyalarını FragPipe'a içe aktarmak için Dosya ekle'yi tıklatın (Şekil 2A).
    2. Veritabanı sekmesini tıklatın ve İndir'i tıklatarak indirme yöneticisini başlatın. Bu, proteom veritabanlarının bir Uniprot Proteome ID kullanılarak Uniprot'tan indirilmesine izin verir. Tuzakları ve kirletici proteinleri veritabanlarına dahil etmek için indirme yöneticisindeki Tuzakları ve kirleticileri ekle seçeneğini tıklatın.
    3. Daha katı FDR eşikleri için Doğrulama sekmesini tıklatın ve Filtre ve rapor değerini 0,01'den gerekli FDR'ye değiştirin.
      NOT: Varsayılan FragPipe ayarları, protein seviyesinde% 1'lik bir FDR sağlayacaktır.
    4. MSfragger sekmesini tıklatın. Tepe eşleştirme kutusunda, büyük değişikliklerin tanımlanmasına izin vermek için Öncü kütle toleransını varsayılan 500 Da'dan 2.000 Da'ya yükseltin (Şekil 2A).
    5. Çalıştır sekmesine tıklayın ve FragPipe çıktılarının konumunu tanımlayın. Aramaya başlamak için Çalıştır düğmesini tıklatın.
  3. Veri kümeleri arasında tanımlanan PSM'leri kullanarak (FragPipe'ın psm.tsv çıktılarında bulunur), veri kümeleri içinde gözlemlenen delta kütlelerinin sıklığını çizerek potansiyel glikanları tanımlayın (Şekil 3). PRIDE katılımı PXD027820 aracılığıyla erişilebilen R betiklerini kullanarak MSfragger çıktılarından delta kütle grafikleri oluşturun.
    NOT: Açık arama sonuçlarının en az sonradan işlenmesi bu komut dosyalarında gerçekleştirilir, çünkü bu komut dosyalarının temel amacı delta kütle profillerinin görselleştirilmesine yardımcı olmaktır. Önemli olarak, bol miktarda delta kütlesinin tek başına gözlemlenmesi, bir modifikasyonun potansiyel bir glikan olduğunun kanıtı değildir, çünkü delta kütlelerinin glikanlar olarak atanması, karşılık gelen MS2 olaylarının daha fazla analizini gerektirir.
  4. Numuneler içindeki glikopeptidlerin karakterizasyonunu sağlamak için, yüksek hiperskorlu atamalara karşılık gelen yüksek güvenilirlikli delta kütle tanımlamalarına odaklanın.
    1. Glikopeptid spektrumlarının değerlendirilmesine yardımcı olmak için, glikan ile ilişkili iyonların manuel olarak tanımlanmasına izin veren spektrumlar içinde peptid ile ilişkili iyonların atanmasını sağlayan İnteraktif Peptit Spektral Açıklamalı63 gibi peptid ek açıklama araçlarını kullanın (Şekil 4).
      NOT: Burada sunulan veri kümelerinde, >30'luk hiperskorlar, tanımlanan tüm glikopeptitlerlerin en üst% 50'sindeki puanlara karşılık geldiğinden, yüksek puanlama olarak kabul edilir (Şekil 5).
  5. Yüksek güvenilirliğe sahip glikopeptidler atandığında, glikopeptidlerin tanımlanmasını iyileştirmek için yaygın olarak gözlenen glikan ile ilişkili iyonları tanımlayın (Şekil 4).
    NOT: Glikan odaklı aramalar olarak bilinen aramalara glikan ile ilişkili iyonları dahil ederek, glikopeptid atamalarının kalitesi artırılabilir.
    1. FragPipe'ın MSfragger sekmesini tıklatın, gözlemlenen glikanların belirlenen delta kütlelerini Değişken modifikasyonlar ve Kütle Ofsetleri bölümlerine ekleyin. Değişken modifikasyonları ve Kütle Ofsetleri bölümlerine değerleri / ile ayrılmış ayrı ayrı kütlelerle yazarak bu kütleleri ekleyin. Bu glikanların glikanla ilişkili fragman kütlelerini MSFragger'ın Gliko/Labil modları bölümüne ekleyin.
      NOT: Şekil 2B, A. baumannii suşu AB307-0294'ün glikan odaklı bir araştırması için gereken temel bilgileri özetlemektedir.
  6. Proteomik çalışmalarla ilişkili tüm MS verilerini PRIDE veya MASSIVE depoları gibi merkezi Proteomik depolara yükleyin.
    NOT: Bu çalışmayla ilişkili tüm veriler PRIDE proteomik deposuna yatırılmıştır ve PRIDE katılımı aracılığıyla erişilebilir: PXD027820.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bakteriyel glikopeptid analizi için açık aramanın yararlılığını göstermek için, A. baumannii-AB307-0294, ACICI ve D1279779-'un üç suşu içindeki O'ya bağlı glikanların kimyasal çeşitliliği değerlendirildi. O-bağlı glikoproteomlar A. baumannii suşları arasında oldukça değişkendir, çünkü glikozilasyon için kullanılan glikanlar oldukça değişken kapsül lokus44,45,46'dan türetilir. Bu kimyasal çeşitlilik, A. baumannii'yi açık arama çalışmaları için ideal bir model sistem haline getirmektedir. Üç suşun glikoproteomları daha önce değerlendirilmemiş olsa da, bu suşlardan ikisinin, AB307-0294 64 ve ACICU65'in kapsül yapıları bilinmektedir ve D1279779'un kapsülü henüz aydınlatılamamıştır.

AB307-0294 kapsülü ile tutarlı olarak, AB307-0294'ün açık araştırması, 648.25 Da ve 692.28 Da'ya karşılık gelen iki baskın delta kütlesi ortaya çıkardı (Şekil 3A). Bu kütleler, daha önce Russo ve ark., -β-D-QuiNAc4NR-α-GlcNAc6OAc-α-d-GalNAcA tarafından belirlenen kapsül yapılarıyla eşleşir; burada QuiNAc4NR kalıntısı, 3-OH-bütirat veya bir asetil grubu64 ile modifiye edilmiş 2,4-diamino-2,4,6-trideoksi-glukoza karşılık gelir. Benzer şekilde, ACICU kapsülünün daha önce Pse5Ac7Ac-β-D-Glc p-β-D-Gal p-β-D-Gal p-NAc- olarak tanımlanan ve 843.31 Da65'lik öngörülen bir kütleye karşılık gelen bir tetrasakkarit K-biriminden oluştuğu bilinmektedir. Bu kapsül yapısı, ACICU verilerinde en sık gözlenen delta kütlesi ile tutarlıdır (Şekil 3B). Son olarak, D1279779 suşunun açık arama analizi, 203.08, 794.31 ve 1588.62 Da ile tutarlı çoklu delta kütlelerinin varlığını ortaya koymuştur (Şekil 3C). Kütle 203.08, tek bir HexNAc kalıntısınınkiyle tutarlı olsa da, 794.31 ve 1588.62 bilinmeyen modifikasyonlara karşılık gelir. 1588.62 kütlesinin 794.31'in tam olarak iki katı olduğu belirtilmelidir, bu da bu peptitlerin daha önce diğer Acinetobacter glikoproteomları 30,44,46'da gözlemlendiği gibi glikan K-birimi dimerleri ile süslendiğini düşündürmektedir.

Delta kütle grafikleri, numuneler içinde gözlemlenen değişikliklerin sıklığını değerlendirmek için hızlı ve etkili bir yol sağlar. Bununla birlikte, glikanlar gibi karmaşık modifikasyonlar için, tek başına bir delta kütlesinin varlığı, bir glikan'ın tam bileşimini tanımlamak için bilgi sağlamaz. Glikan bileşimlerinin belirlenmesine yardımcı olmak için, belirli delta kütlelerine atanan PSM'lerin elde edilen MS / MS verileri kullanılabilir. Yüksek güvenilirlikli glikopeptid atamalarına odaklanarak (MSFragger'da yüksek hiperskorlu PSM'lere karşılık gelir), protein glikozilasyonu için bir suş tarafından kullanılan glikanları daha da karakterize etmek için manuel analiz kullanılabilir. Yüksek güvenilirlikli peptit atamalarının tipik olarak Y iyonlarına dayalı glikan bileşimlerinin belirlenmesine izin veren sağlam glikan bilgileri içerdiği belirtilmelidir. Bu bilgi, glikanların peptitlere bağlı kaldığı ilgili fragmanları ve ayrıca glikanların66'nın atanması için yararlı olan B ve oksonyum ile ilgili iyonları tanımlamak için kullanılabilir. Glikan bileşimlerinin nasıl atanacağına dair ayrıntılı kılavuzlar daha önce özetlenmiştir ve okuyucuların Harvey ve ark.67'ye danışmaları önerilir. İnteraktif Peptit Spektral Not Verici63 gibi araçlar kullanılarak, peptitle ilişkili iyonlar kolayca tanımlanabilir ve kullanıcıların peptitlere bağlı glikanların kimliğini belirlemelerine olanak tanır.

İnteraktif Peptit Spektral Ek Açıklaması kullanılarak, bu üç A. baumannii örneğinde tanımlanan glikopeptidler değerlendirildi ve potansiyel glikan ile ilişkili iyonlar ortaya çıkarıldı. 648.25 ve 692.28 Da glikanları ile süslenmiş AB307-0294 glikopeptid SAGDQAASDIATATDNASAK'ın MS / MS spektrumlarını düşünün (Şekil 4A, B); Benzer parçalanma koşulları altında, glikanla ilişkili iyonlar oldukça benzerdir, ancak kütle olarak 44.02 Da. Bu PSM'ler içindeki glikan iyonlarının analizi, bu glikopeptitler için gözlemlenen delta kütlelerinin dört farklı karbonhidrat içeren trisakkaritlere karşılık geldiğini doğrulamayı sağlar: dHexNAcNAc (228 Da), dHexNAcNBu (272 Da), HexNAcA (217 Da) ve HexNAc (203 Da). Glikan fragmanları atanırken, çoklu monosakaritlerin CID kullanılarak parçalandığında su kaybetmeye eğilimli olduğu belirtilmelidir. Bu, monosakkarit Pse5Ac7Ac'nin (316 Da) iki belirgin glikanla ilişkili fragmanın oluşumuna yol açtığı ACICU'nun glikanında görülebilir: MH + 299.12 ve 317.13, su kütlesine karşılık gelen kütle farkı (18.01 Da) (Şekil 4C).

Ek olarak, bakteriyel glikanları analiz ederken, ökaryotlarda gözlenmeyen şekerlere karşılık gelen beklenmedik monosakkarit kütlelerini gözlemlemek yaygındır. Bunun bir örneği, en sık görülen delta kütlesi 794.31 Da'nın analizinin, daha önce A. baumannii O'ya bağlı glikanlar 44'te gözlemlenen olağandışı bir monosakkarit dHexNAc'nin (187 Da, 188.09'un MH + 'sı olarak gözlenen, Şekil 4D) varlığını ortaya koyduğu D1279779'un glikopeptid PSM'lerinde görülebilir. Yüksek kütle doğruluğu ölçümleri ve glikanların peptid omurgasından kaybolan kararsız modifikasyonlar olarak karakteristik davranışı, glikanların potansiyel kimyasal bileşimlerinin belirlenmesinde yardımcı olabilirken, MS verilerinin aşırı yorumlanmasını en aza indirmeniz önerilir. Belirli şekerlerin stereokimyası veya bir glikanın bağlantı bilgisi bilinmiyorsa, monosakkaritlere belirli sınıflarına göre atıfta bulunmak da dahil olmak üzere yapısal olarak agonistik atamaları kullanmak en iyi uygulamadır. Bunun bir örneği, 203.08 Da kalıntılarına N-asetilhekzozaminler (HexNAc) olarak atıfta bulunmak ve bağlantı tiplerinin atanmasından kaçınmaktır. Gerekirse, Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) kullanımı gibi bilinmeyen bir modifikasyonun tam kimyasal kimliklerini tanımlamak için ek tekniklerin kullanılması önerilir.

Açık arama yaklaşımları, modifiye peptitlerin hızlı bir şekilde tanımlanmasını sağlarken, bu arama yaklaşımının veri kümelerindeki potansiyel glikopeptidleri göz ardı edebileceğini belirtmek önemlidir. Açık aramalarda, glikopeptidler, yetersiz peptid parçalanma bilgisi veya MS2 olayı içinde birden fazla atanmamış iyonun varlığı nedeniyle atanan peptidin cezalandırılması gibi çeşitli nedenlerle tanımlanamayabilir. İkincisi, bakteriyel glikopeptid PSM'leri için özellikle geçerlidir, çünkü bu spektrumlar, varsayılan açık arama parametreleri tarafından dikkate alınmayan glikanla ilişkili fragmanlar içerebilir. Eşsiz özellikler PSM'lerin puanlamasını olumsuz yönde etkilediğinden, MS / MS spektrumlarındaki eşsiz iyonları en aza indirmek, FDR kontrollü minimum puan eşikleri nedeniyle başlangıçta dışlanan glikopeptidlerin tanımlanmasını sağlar. Bu sınırlamanın üstesinden gelmek için, açık aramalardan tanımlanan kütleler (Şekil 3) ve manuel olarak tanımlanmış glikan ile ilişkili iyonlar (Şekil 4), glikopeptidlerin tanımlanmasını iyileştirmek için arama parametrelerine dahil edilebilir. Bu glikanla ilişkili iyonların, glikanın de novo belirlenmesine, ortak oksonyum iyonları44,68 hakkında önceden bilgiye veya SPectral Immonium Ion Detection tool 69,76 gibi spektrumlarda tekrarlanan iyonları yakalayabilen araçların kullanımına dayanarak manuel olarak tanımlanabileceğini belirtmek önemlidir.

Bunu göstermek için, açık arama analizi ile tanımlanan atipik glikan fragmanlarının kütleleri MSFragger'daki arama parametrelerine dahil edildi ve glikan odaklı arama yapıldı (AB307-0294 suşu için glikan odaklı ayarlar Şekil 2B'de gösterilmiştir). Çoklu glikanlar birlikte aranırken, her delta kütlesi ile ilişkili fragman iyonlarını doğru bir şekilde yansıttıklarından emin olmak için Y iyonu ve tanısal kütlelerin seçiminde dikkatli olunması gerektiği belirtilmelidir. Bu, AB307-0294'ün 648.25 ve 692.28 glikanlarının parçaları gibi birbirini dışlayan Y ve tanısal kütlelerin kombinasyonları için her zaman mümkün olmasa da (Şekil 4A, B), glikan odaklı arama, arama sonuçlarının sağlamlığını etkileyebilse de, hala mümkündür. Glikan odaklı aramalar, ACICU'da% 37'lik bir artışa, AB307-0294'te% 117'lik bir artışa ve D1279779'da% 363'lük bir artışa karşılık gelen üç A. baumannii suşunun hepsinde tanımlanan toplam glikopeptid PSM sayısında kayda değer bir artışa yol açmıştır (Şekil 5A-C). Bireysel MS olayları için, glikan-spesifik bilgilerin dahil edilmesi tipik olarak gözlenen hiperskorda bir artışa neden olur, ancak bu artış yüksek oranda glikana bağımlıdır (Şekil 5D, E). Böylece, açık arama yoluyla ortaya çıkarılan glikan kütlelerini kullanarak arama parametrelerini rafine ederek ve daha sonra manuel olarak küratörlüğünde glikan fragmanı bilgilerini hedeflenen aramalara dahil ederek, örneklerdeki glikopeptidlerin daha ayrıntılı bir analizi elde edilebilir.

Figure 1
Şekil 1: Bakteriyel glikopeptitlerlerin hazırlanması ve analizindeki temel adımlara genel bakış. Bakteriyel glikopeptidlerin başarılı bir şekilde tanımlanması, glikopeptidler içeren yüksek kaliteli örneklerin üretilmesine bağlıdır. Glikopeptid içeren örnekler daha sonra LC-MS ile analiz edilir ve daha sonra, benzersiz delta kütlelerine dayanan potansiyel glikopeptidleri tanımlamak için açık arama yaklaşımları kullanılır. Manuel kürasyon kullanılarak, bu delta kütleleri glikanlar olarak tanımlanabilir. Son olarak, glikopeptidlerin tanımlanmasını iyileştirmek için, glikan bilgileri glikan odaklı veritabanı aramalarına dahil edilebilir. Kısaltmalar: LC-MS = kütle spektrometrisine bağlı sıvı kromatografisi; OD = optik yoğunluk; SDB-RPS = stirendivinilbenzen-ters faz sülfonat; ZIC-HILIC = Zwitterionic Hidrofilik Etkileşim Sıvı Kromatografisi; PSM'ler = peptid-spektral eşleşmeler; CID = çarpışma kaynaklı ayrışma; ETD = elektron transferi ayrışması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: FragPipe'da açık arama ve glikan odaklı aramaların nasıl etkinleştirileceğine genel bakış. (A) Açık arama, FragPipe'ın İş Akışı sekmesindeki Açık İş Akışı yüklenerek etkinleştirilebilir. 500 Da'dan büyük glikanların tanımlanmasını sağlamak için, Precursor kütle toleransı penceresini 2.000 Da'ya yükseltin. (B) Atipik glikanlar için glikan odaklı aramalar, modifikasyonların beklenen kütlelerini (Değişken modifikasyonlar ve Kütle Ofsetleri bölümlerinde), bu glikanlarla ilişkili Y iyonlarını (Gliko / Labil'in Y İyon Kütleleri listesinde) tanımlamak için MSFragger sekmesine glikan bilgilerinin girilmesini gerektirir. bölümü) ve düşük kütleli glikan fragman iyonları (Gliko/Labil bölümünün Tanısal Fragman Kütleleri listesine). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Acinetobacter baumannii'nin üç suşu (AB307-0294, ACICI ve D1279779) için açık arama sonuçlarının Delta kütle grafikleri. Kapsül lokuslarının çeşitliliği ile tutarlı olarak, her A. baumannii suşu, gözlemlenen delta kütleleri ile gösterilen, 140 Da'dan daha büyük boyutta belirgin modifikasyonlara sahip benzersiz bir delta kütle profiline sahiptir. (A) AB307-0294 delta kütle grafiği içinde, 648.25 ve 692.28 kütleleri, -β-d-QuiNAc4NR-α-GlcNAc6OAc-α-d-GalNAcA- ile tutarlı modifikasyonlara karşılık gelir; burada QuiNAc4NR, 3-OH-bütirat veya asetil grubu64 ile modifiye edilir. (B) ACICU delta kütle grafiği içinde, 203.08 ve 843.31 kütleleri, sırasıyla HexNAc ve Pse5Ac7Ac-β-D-Glc p-β-D-Gal p-β-D-Gal p-NAc ile tutarlı değişikliklere karşılık gelir,65. (C) D1279779 delta kütle grafiği içinde, 203.08, 794.31 ve 1588.62 kütleleri HexNAc, HexNAc-217-187-187 ve HexNAc-217-187-187'nin bir dimerine karşılık gelir. Delta kütleleri manuel olarak değerlendirilmiş ve Şekil 4'te * ile gösterilen glikanlar olarak doğrulanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Acinetobacter baumannii'nin üç suşu boyunca gözlenen delta kütlelerinin MS/MS karakterizasyonu. (A, B)  AB307-0294, (C) ACICU ve (D) D1279779. İnteraktif Peptit Spektral Açıklayıcı destekli temsili glikopeptidlerin açıklamalı spektrumları. Her spektrum için, peptid fragman iyonları mavi ve kırmızı ile gösterilirken, manuel olarak atanan glikan ile ilişkili iyonlar yeşil renkle gösterilir. Glikanlar, kare olarak gösterilen HexNAc, bir daire olarak Hex ve yamuklarda belirtilen glikan kütlesi ile yamuk olarak gösterilen atipik monosakkaritler ile Glikanlar için Sembol İsimlendirmesi kullanılarak açıklığa kavuşturulmuştur. Kısaltma: MS/MS = tandem kütle spektrometrisi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Açık ve glikan odaklı arama kullanılarak Acinetobacter baumannii suşları arasında tanımlanan glikopeptidlerin karşılaştırılması. (A-C) Açık ve glikan odaklı arama kullanılarak D1279779, ACICU ve AB307-0294 içindeki hiperskorların ve PSM atamalarının sayısının karşılaştırılması. (D-F) D1279779, ACICI ve AB307-0294 için açık ve glikan odaklı aramalar kullanılarak aynı peptit dizisine atanan tek tek MS2 olaylarının karşılaştırılması. Kısaltma: PSM = peptid-spektral eşleşme. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

A. baumannii Suş Uniprot Proteom Kimlikleri
AB307-0294 15 UP000006924
ACICU 47,48 UP000008839
D1279779 49 UP000011860

Tablo 1. Bu çalışmada gerinim ve Uniprot Proteom ID'leri kullanılmıştır.

Arabellek Adı Tampon bileşimi / pH
Arabellek A* 18.2 MΩ H2O'da %2 asetonitril, %0.1 trifluroasetik asit / pH 1.0
PBS 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na 2 HPO 4 ve 2 mM KH2PO 4 / pH7,4
İndirgeme/alkilasyon tamponu 100 mM Tris 2-karboksietil fosfin hidroklorür, 400 mM 2-Kloroasetamid 1 M Tris / pH 7.5 içinde
SDB-RPS Kademe Ucu elüsyon tamponu %80 asetonitril / pH 11 içinde %5 amonyum hidroksit
SDB-RPS Aşama Ucu dengeleme tamponu % 30 metanol,% 1 trifluroasetik asit, 18.2 MΩ H2O / pH 1.0
SDB-RPS Kademe Ucu dengeleme/yıkama tamponu %90 izopropanol, %1 trifluroasetik asit / pH 1.0
SDB-RPS Kademe Ucu yıkama tamponu 18.2 MΩH 2O / pH 1.0'da% 1 trifluroasetik asit
SDC lizis tamponu 100 mM Tris / pH 8,5'te %4 SDC
ZIC-HILIC elüsyon tamponu 18.2 MΩH2O / pH 1.0'da% 0.1 trifluroasetik asit
ZIC-HILIC yükleme/yıkama tamponu %80 asetonitril, %1 trifluroasetik asit 18.2 MΩH2O / pH 1.0
ZIC-HILIC hazırlama tamponu 18.2 MΩ H 2 O / pH7.0'da% 95 asetonitril

Tablo 2: Bu çalışmada kullanılan tamponların bileşimi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Açık arama, bilinmeyen değişikliklerin tanımlanması için etkili ve sistematik bir yöntemdir. Bakteriyel proteom numuneleri içinde bilinmeyen glikanların tanımlanması geleneksel olarak zaman alıcı ve teknik olarak uzmanlaşmış bir girişim olsa da, MSfragger 21,41 ve Byonic 31,38 gibi araçların son gelişmeleri, peptitlere bağlı potansiyel glikanlar olarak daha fazla karakterizasyon için delta kütlelerinin hızlı ve etkili bir şekilde tanımlanmasını sağlamaktadır. Hem standart hem de glikopeptid ile zenginleştirilmiş proteom örneklerinin açık bir şekilde araştırılması, potansiyel glikopeptidleri tanımlayabilir (Şekil 1). Birçok bakteri sisteminin proteomu içindeki glikopeptidlerin ortaklığı ve bolluğu, glikopeptid zenginleştirmesi olmadan bu modifikasyonların doğrudan tespitini mümkün kılmaktadır6. Her ne kadar glikopeptid zenginleştirme yaklaşımları tipik olarak hala birçok glikozilasyon sistemi için zenginleştirme bazlı olmayan yöntemlerden daha iyi performans gösterse de70, tüm glikanların zenginleştirme 71,72'ye eşit derecede uygun olmadığı dikkat çekicidir. Bu gerçek, belirli bir biyolojik numune için açık arama kullanarak glikozilasyon olaylarını tanımlamak için en uygun yaklaşımı belirlerken göz önünde bulundurulmalıdır.

Açık arama, bir numune içinde yüksek sıklıkta gözlenen glikanları etkili bir şekilde tanımlarken, veri kümelerinde nadiren meydana gelen glikozilasyon olaylarını tanımlamada etkisiz kalır. Pratik açıdan, bir glikan'ın benzersiz bir delta kütlesinin tanımlanması için, numunelerde aynı delta kütlesine sahip en az 10 PSM bulunmalıdır. Bu minimum frekans, potansiyel bir glikanın, arka plan delta kütle atamalarının üzerinde ayırt edilebilir olmasını sağlar (Şekil 3). Bu kriter tipik olarak glikozilasyon için birden fazla substratı hedefleyen genel glikozilasyon sistemleri tarafından karşılanırken, glikozilasyon için tek bir proteinin hedeflendiği sistemler bu yaklaşıma daha az uygun olabilir. MS cihazlarının hızı ve duyarlılığı arttıkça, bunun giderek daha düşük bolluktaki glikopeptid popülasyonlarının değerlendirilmesini mümkün kılması muhtemeldir, bu da nadir / düşük bol glikoformlar için yeterli kalite spektrumunun üretilebilmesi koşuluyla, açık arama yaklaşımlarının etkinliğini artıracaktır.

MS, yeni glikanların etkili bir şekilde tanımlanmasını sağlarken, bu içgörünün tek başına nadiren glikopeptidlerin / glikanların tam bir yapısal karakterizasyonunu sağladığını, NMR spektroskopisi gibi araçların tam glikan karakterizasyonu için hala kritik olduğunu belirtmek önemlidir. Burada gözlemlendiği gibi, MS, A. baumannii ACICU ve AB307-029464,65'in izole kapsüllerinden NMR kullanılarak daha önce belirlenen K-birimlerinin tamamlayıcı doğrulamasını sağlamıştır. Bununla birlikte, D1279779'da tanımlanan majör glikan için, bu glikandaki monosakaritlerin varsayılan sınıfları hakkında sadece bilgi, bu şeker birimlerinin bağlantı tipleri veya stereokimyası hakkında hiçbir bilgi sağlamayan MS ile atanabilir (Şekil 4). Ultraviyole fotodissosiyasyon73,74 gibi yeni MS fragmantasyon yöntemleri daha yaygın hale geldikçe, glikopeptidlerin daha ayrıntılı yapısal karakterizasyonu mümkün olabilir. Bununla birlikte, mevcut enstrümantasyonla bağlantılar veya stereokimya bilgileri çıkarırken dikkatli olunmalıdır. Bu hususlara ek olarak, son zamanlarda FDR tabanlı kontrollerin açık arama75 için uygunluğu hakkında sorular ortaya çıkmıştır. Bu nedenle, açık arama güçlü bir yaklaşım olsa da, bu hususlar, yalnızca açık arama bilgilerine dayanan glikan atamalarının yorumlanmasında özen gösterilmesi gerektiğini vurgulamaktadır.

Bu çalışma, açık aramanın bakteriyel glikozilasyon için kullanılan glikanların denetimsiz tanımlanması için etkili bir yaklaşım olduğunu gösterirken, tek başına açık arama, numunelerde bulunan tüm glikopeptidlerin yalnızca bir alt kümesine erişim sağlar. Glikanların kararsız doğası nedeniyle, glikopeptid PSM'ler tipik olarak, hesaba katılmazsa, PSM'lerin puanlamasını olumsuz yönde etkileyecek çeşitli glikanla ilişkili fragmanlar içerir. Bu sorunun üstesinden gelmek ve glikopeptidlerin daha derinlemesine tanımlanmasına izin vermek için, açık arama yoluyla elde edilen glikan bilgisi daha sonra glikan odaklı aramaları bilgilendirmek için kullanılabilir (Şekil 2B). Bu şekilde, glikanla ilişkili fragmanların manuel olarak belirlenmesi ile birleştiğinde, açık arama, numuneler içinde atanan glikopeptidlerin kalitesini ve miktarını artırmak için kullanılabilir (Şekil 5). Glikopeptid arama parametrelerinin iyileştirilmesi, MSfragger gibi araçların güncel sürümleriyle manuel olarak gerçekleştirilmesine rağmen, alan olgunlaştıkça bu adımların otomatik bir şekilde yapılması muhtemeldir. Çalışmalar, spesifik PTM'ler69 ile ilişkili tekrarlanan düşük moleküler ağırlıklı iyonları tanımlamak için hesaplamalı yaklaşımların yanı sıra, bilinmeyen glikopeptidlerle ilişkili oksonyum iyonlarını ve tekrarlayan Y-iyon kütlelerini tanımlama stratejilerini76 göstermiştir. Bu nedenle, bu adımların FragPipe gibi araçların yeni yinelemelerine dahil edilmesi muhtemeldir, bu da bakteriyel ve ökaryotik numunelerde daha önce bilinmeyen glikozilasyon olaylarını tanımlamayı daha da kolaylaştırır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

N.E.S, Avustralya Araştırma Konseyi Gelecek Bursu (FT200100270) ve ARC Keşif Projesi Bursu (DP210100362) tarafından desteklenmektedir. MS enstrümantasyonuna erişim için Bio21 Moleküler Bilim ve Biyoteknoloji Enstitüsü'nün Melbourne Kütle Spektrometresi ve Proteomik Tesisi'ne teşekkür ederiz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
14 G Kel-F Hub point style 3 Hamilton company hanc90514
2-Chloroacetamide Sigma Aldrich Pty Ltd C0267-100G
Acetonitrile Sigma Aldrich Pty Ltd 34851-4L
Ammonium hydroxide (28%) Sigma Aldrich Pty Ltd 338818-100ML
BCA Protein Assay Reagent A Pierce 23228
BCA Protein Assay Reagent B Pierce 23224
C8 Empore SPE Sigma Aldrich Pty Ltd 66882-U An alterative vendor for C8 material is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)
Formic acid Sigma Aldrich Pty Ltd 5.33002
Isopropanol Sigma Aldrich Pty Ltd 650447-2.5L
Methanol Fisher Chemical M/4058/17
SDB-RPS Empore SPE (Reversed-Phase Sulfonate) Sigma Aldrich Pty Ltd 66886-U An alterative vendor for SDB-RPS is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)
Sodium Deoxycholate Sigma Aldrich Pty Ltd D6750-100G
ThermoMixer C Eppendorf 2232000083
trifluoroacetic acid Sigma Aldrich Pty Ltd 302031-10X1ML
Tris 2-carboxyethyl phosphine hydrochloride Sigma Aldrich Pty Ltd C4706-2G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma Aldrich Pty Ltd 252859-500G
Trypsin/Lys-C protease mixture Promega V5073
Vacuum concentrator Labconco 7810040
ZIC-HILIC material Merck 1504580001 Resin for use in single use SPE columns can be obtain by emptying a larger form column and using the free resin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Essentials of glycobiology. Varki, A., et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2015).
  2. Schaffer, C., Messner, P. Emerging facets of prokaryotic glycosylation. FEMS Microbiology Reviews. 41 (1), 49-91 (2017).
  3. Abu-Qarn, M., Eichler, J., Sharon, N. Not just for Eukarya anymore: Protein glycosylation in bacteria and archaea. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 544-550 (2008).
  4. Szymanski, C. M., Yao, R., Ewing, C. P., Trust, T. J., Guerry, P. Evidence for a system of general protein glycosylation in Campylobacter jejuni. Molecular Microbiology. 32 (5), 1022-1030 (1999).
  5. Koomey, M. O-linked protein glycosylation in bacteria: snapshots and current perspectives. Current Opinion in Structural Biology. 56, 198-203 (2019).
  6. Riley, N. M., Bertozzi, C. R., Pitteri, S. J. A pragmatic guide to enrichment strategies for mass spectrometry-based glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100029 (2020).
  7. Spiro, R. G. Protein glycosylation: nature, distribution, enzymatic formation, and disease implications of glycopeptide bonds. Glycobiology. 12 (4), 43-56 (2002).
  8. Hu, H., Khatri, K., Klein, J., Leymarie, N., Zaia, J. A review of methods for interpretation of glycopeptide tandem mass spectral data. Glycoconjugate Journal. 33 (3), 285-296 (2016).
  9. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: Diversity, synthesis and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (7), 448-462 (2012).
  10. Bohm, M., et al. Glycosciences.DB: An annotated data collection linking glycomics and proteomics data (2018 update). Nucleic Acids Research. 47, 1195-1201 (2019).
  11. Kawano, S., Hashimoto, K., Miyama, T., Goto, S., Kanehisa, M. Prediction of glycan structures from gene expression data based on glycosyltransferase reactions. Bioinformatics. 21 (21), 3976-3982 (2005).
  12. McDonald, A. G., Tipton, K. F., Davey, G. P. A knowledge-based system for display and prediction of O-glycosylation network behaviour in response to enzyme knockouts. PLOS Computational Biology. 12 (4), 1004844 (2016).
  13. Eichler, J., Koomey, M. Sweet new roles for protein glycosylation in prokaryotes. Trends in Microbiology. 25 (8), 662-672 (2017).
  14. Scott, N. E., et al. Simultaneous glycan-peptide characterization using hydrophilic interaction chromatography and parallel fragmentation by CID, higher energy collisional dissociation, and electron transfer dissociation MS applied to the N-linked glycoproteome of Campylobacter jejuni. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 10 (2), (2011).
  15. Russo, T. A., et al. The K1 capsular polysaccharide of Acinetobacter baumannii strain 307-0294 is a major virulence factor. Infection and Immunity. 78 (9), 3993-4000 (2010).
  16. Szymanski, C. M., Wren, B. W. Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens. Nature Reviews Microbiology. 3 (3), 225-237 (2005).
  17. Imperiali, B. Bacterial carbohydrate diversity - a brave new world. Current Opinion in Chemical Biology. 53, 1-8 (2019).
  18. Caval, T., Buettner, A., Haberger, M., Reusch, D., Heck, A. J. R. Discrepancies between high-resolution native and glycopeptide-centric mass spectrometric approaches: A case study into the glycosylation of erythropoietin variants. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (8), 2099-2104 (2021).
  19. Caval, T., Heck, A. J. R., Reiding, K. R. Meta-heterogeneity: Evaluating and describing the diversity in glycosylation between sites on the same glycoprotein. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100010 (2020).
  20. Thomas, D. R., Scott, N. E. Glycoproteomics: growing up fast. Current Opinion in Structural Biology. 68, 18-25 (2020).
  21. Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).
  22. Cao, W., et al. Recent advances in software tools for more generic and precise intact glycopeptide analysis. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. , (2021).
  23. Yu, A., et al. Advances in mass spectrometry-based glycoproteomics. Electrophoresis. 39 (24), 3104-3122 (2018).
  24. Reiding, K. R., Bondt, A., Franc, V., Heck, A. J. R. The benefits of hybrid fragmentation methods for glycoproteomics. Trends in Analytical Chemistry. 108, 260-268 (2018).
  25. Riley, N. M., Malaker, S. A., Driessen, M., Bertozzi, C. R. Optimal dissociation methods differ for N- and O-glycopeptides. Journal of Proteome Research. 19 (8), 3286-3301 (2020).
  26. Mao, Y., et al. Systematic evaluation of fragmentation methods for unlabeled and isobaric mass tag-labeled O-glycopeptides. Analytical Chemistry. 93 (32), 11167-11175 (2021).
  27. Lu, L., Riley, N. M., Shortreed, M. R., Bertozzi, C. R., Smith, L. M. O-Pair Search with MetaMorpheus for O-glycopeptide characterization. Nature Methods. 17 (11), 1133-1138 (2020).
  28. Choo, M. S., Wan, C., Rudd, P. M., Nguyen-Khuong, T. GlycopeptideGraphMS: Improved glycopeptide detection and identification by exploiting graph theoretical patterns in mass and retention time. Analytical Chemistry. 91 (11), 7236-7244 (2019).
  29. Maxwell, E., et al. GlycReSoft: a software package for automated recognition of glycans from LC/MS data. PLoS One. 7 (9), 45474 (2012).
  30. Ahmad Izaham, A. R., Scott, N. E. Open database searching enables the identification and comparison of bacterial glycoproteomes without defining glycan compositions prior to searching. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 19 (9), 1561-1574 (2020).
  31. Bern, M., Kil, Y. J., Becker, C. Byonic: Advanced peptide and protein identification software. Current Protocols in Bioinformatics. , Chapter 13, Unit 13.20 (2012).
  32. Na, S., Bandeira, N., Paek, E. Fast multi-blind modification search through tandem mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 11 (4), 010199 (2012).
  33. Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Error tolerant searching of uninterpreted tandem mass spectrometry data. Proteomics. 2 (10), 1426-1434 (2002).
  34. Craig, R., Beavis, R. C. TANDEM: Matching proteins with tandem mass spectra. Bioinformatics. 20 (9), 1466-1467 (2004).
  35. Ahrné, E., Nikitin, F., Lisacek, F., Müller, M. QuickMod: A tool for open modification spectrum library searches. Journal of Proteome Research. 10 (7), 2913-2921 (2011).
  36. Shortreed, M. R., et al. Global identification of protein post-translational modifications in a single-pass database search. Journal of Proteome Research. 14 (11), 4714-4720 (2015).
  37. Chick, J. M., et al. A mass-tolerant database search identifies a large proportion of unassigned spectra in shotgun proteomics as modified peptides. Nature Biotechnology. 33 (7), 743-749 (2015).
  38. Roushan, A., et al. Peak filtering, peak annotation, and wildcard search for glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100011 (2020).
  39. Chi, H., et al. Comprehensive identification of peptides in tandem mass spectra using an efficient open search engine. Nature Biotechnology. , (2018).
  40. Bittremieux, W., Laukens, K., Noble, W. S. Extremely fast and accurate open modification spectral library searching of high-resolution mass spectra using feature hashing and graphics processing units. Journal of Proteome Research. 18 (10), 3792-3799 (2019).
  41. Polasky, D. A., Yu, F., Teo, G. C., Nesvizhskii, A. I. Fast and comprehensive N- and O-glycoproteomics analysis with MSFragger-Glyco. Nature Methods. 17 (11), 1125-1132 (2020).
  42. Harding, C. M., et al. Acinetobacter strains carry two functional oligosaccharyltransferases, one devoted exclusively to type IV pilin, and the other one dedicated to O-glycosylation of multiple proteins. Molecular Microbiology. 96 (5), 1023-1041 (2015).
  43. Iwashkiw, J. A., et al. Identification of a general O-linked protein glycosylation system in Acinetobacter baumannii and its role in virulence and biofilm formation. PLoS Pathogens. 8 (6), 1002758 (2012).
  44. Scott, N. E., et al. Diversity within the O-linked protein glycosylation systems of Acinetobacter species. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 13 (9), 2354-2370 (2014).
  45. Kenyon, J. J., Hall, R. M. Variation in the complex carbohydrate biosynthesis loci of Acinetobacter baumannii genomes. PLoS One. 8 (4), 62160 (2013).
  46. Lees-Miller, R. G., et al. A common pathway for O-linked protein-glycosylation and synthesis of capsule in Acinetobacter baumannii. Molecular Microbiology. 89 (5), 816-830 (2013).
  47. Iacono, M., et al. Whole-genome pyrosequencing of an epidemic multidrug-resistant Acinetobacter baumannii strain belonging to the European clone II group. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (7), 2616-2625 (2008).
  48. Hamidian, M., et al. Insights from the revised complete genome sequences of Acinetobacter baumannii strains AB307-0294 and ACICU belonging to global clones 1 and 2. Microbial Genomics. 5 (10), 000298 (2019).
  49. Farrugia, D. N., et al. The complete genome and phenome of a community-acquired Acinetobacter baumannii. PLoS One. 8 (3), 58628 (2013).
  50. Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
  51. Batth, T. S., et al. Protein aggregation capture on microparticles enables multipurpose proteomics sample preparation. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 18 (5), 1027-1035 (2019).
  52. HaileMariam, M., et al. S-Trap, an ultrafast sample-preparation approach for shotgun proteomics. Journal of Proteome Research. 17 (9), 2917-2924 (2018).
  53. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  54. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  55. Harney, D. J., et al. Proteomic analysis of human plasma during intermittent fasting. Journal of Proteome Research. 18 (5), 2228-2240 (2019).
  56. Scott, N. E. Characterizing glycoproteins by mass spectrometry in Campylobacter jejuni. Methods in Molecular Biology. 1512, 211-232 (2017).
  57. Bian, Y., et al. Robust microflow LC-MS/MS for proteome analysis: 38000 runs and counting. Analytical Chemistry. 93 (8), 3686-3690 (2021).
  58. Diedrich, J. K., Pinto, A. F., Yates, J. R. Energy dependence of HCD on peptide fragmentation: stepped collisional energy finds the sweet spot. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (11), 1690-1699 (2013).
  59. Liu, M. Q., et al. pGlyco 2.0 enables precision N-glycoproteomics with comprehensive quality control and one-step mass spectrometry for intact glycopeptide identification. Nature Communications. 8 (1), 438 (2017).
  60. Hinneburg, H., et al. The art of destruction: Optimizing collision energies in quadrupole-time of flight (Q-TOF) instruments for glycopeptide-based glycoproteomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (3), 507-519 (2016).
  61. Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
  62. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , http://www.r-project.org/index.html (2020).
  63. Brademan, D. R., Riley, N. M., Kwiecien, N. W., Coon, J. J. Interactive peptide spectral annotator: A versatile web-based tool for proteomic applications. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 18, 193-201 (2019).
  64. Russo, T. A., et al. The K1 capsular polysaccharide from Acinetobacter baumannii is a potential therapeutic target via passive immunization. Infection and Immunity. 81 (3), 915-922 (2013).
  65. Senchenkova, S. N., et al. Structure of the capsular polysaccharide of Acinetobacter baumannii ACICU containing di-N-acetylpseudaminic acid. Carbohydrate Research. 391, 89-92 (2014).
  66. Domon, B., Costello, C. E. A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentations in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates. Glycoconjugate Journal. 5 (4), 397-409 (1988).
  67. Harvey, D. J., Dwek, R. A., Rudd, P. M. Determining the structure of glycan moieties by mass spectrometry. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 12, Unit 12.7 (2006).
  68. Medzihradszky, K. F., Kaasik, K., Chalkley, R. J. Characterizing sialic acid variants at the glycopeptide level. Analytical Chemistry. 87 (5), 3064-3071 (2015).
  69. Kelstrup, C. D., Frese, C., Heck, A. J., Olsen, J. V., Nielsen, M. L. Analytical utility of mass spectral binning in proteomic experiments by SPectral Immonium Ion Detection (SPIID). Molecular & Cellular Proteomics:MCP. 13 (8), 1914-1924 (2014).
  70. Ahmad Izaham, A. R., et al. What are we missing by using hydrophilic enrichment? Improving bacterial glycoproteome coverage using total proteome and FAIMS analyses. Journal of Proteome Research. 20 (1), 599-612 (2021).
  71. Neue, K., Mormann, M., Peter-Katalinic, J., Pohlentz, G. Elucidation of glycoprotein structures by unspecific proteolysis and direct nanoESI mass spectrometric analysis of ZIC-HILIC-enriched glycopeptides. Journal of Proteome Research. 10 (5), 2248-2260 (2011).
  72. Mysling, S., Palmisano, G., Hojrup, P., Thaysen-Andersen, M. Utilizing ion-pairing hydrophilic interaction chromatography solid phase extraction for efficient glycopeptide enrichment in glycoproteomics. Analytical Chemistry. 82 (13), 5598-5609 (2010).
  73. Escobar, E. E., et al. Precision mapping of O-Linked N-acetylglucosamine sites in proteins using ultraviolet photodissociation mass spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 142 (26), 11569-11577 (2020).
  74. Madsen, J. A., et al. Concurrent automated sequencing of the glycan and peptide portions of O-linked glycopeptide anions by ultraviolet photodissociation mass spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (19), 9253-9261 (2013).
  75. Lysiak, A., Fertin, G., Jean, G., Tessier, D. Evaluation of open search methods based on theoretical mass spectra comparison. BMC Bioinformatics. 22, 65 (2021).
  76. Pabst, M., et al. A general approach to explore prokaryotic protein glycosylation reveals the unique surface layer modulation of an anammox bacterium. ISME Journal. , (2021).

Tags

Biyokimya Sayı 177 Glikozilasyon,Acinetobacter baumannii Açık arama Posttranslasyonel modifikasyonlar Proteomik
<em>Acinetobacter baumannii</em> O-bağlantılı Glikopeptitlerlerin Tanımlanması için Açık Arama Tabanlı Yaklaşımların Uygulanması
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lewis, J. M., Coulon, P. M. L.,… More

Lewis, J. M., Coulon, P. M. L., McDaniels, T. A., Scott, N. E. The Application of Open Searching-based Approaches for the Identification of Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides. J. Vis. Exp. (177), e63242, doi:10.3791/63242 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter