Summary
Åben søgning muliggør identifikation af glycopeptider dekoreret med tidligere ukendte glycansammensætninger. Inden for denne artikel præsenteres en strømlinet tilgang til at foretage åben søgning og efterfølgende glycanfokuserede glycopeptidsøgninger for bakterieprøver ved hjælp af Acinetobacter baumannii som model.
Abstract
Proteinglykosylering anerkendes i stigende grad som en almindelig modifikation inden for bakterielle organismer, der bidrager til prokaryot fysiologi og optimal infektivitet af patogene arter. På grund af dette er der stigende interesse for at karakterisere bakteriel glykosylering og et behov for analytiske værktøjer med høj gennemstrømning til at identificere disse begivenheder. Selvom bottom-up-proteomics let muliggør generering af rige glycopeptiddata, gør bredden og mangfoldigheden af glycaner, der observeres i prokaryote arter, identifikationen af bakterielle glykosyleringshændelser ekstremt udfordrende.
Traditionelt gjorde den manuelle bestemmelse af glycansammensætninger inden for bakterielle proteomiske datasæt dette til en stort set skræddersyet analyse begrænset til feltspecifikke eksperter. For nylig er åbne søgebaserede tilgange opstået som et stærkt alternativ til identifikation af ukendte ændringer. Ved at analysere hyppigheden af unikke modifikationer observeret på peptidsekvenser tillader åbne søgeteknikker identifikation af almindelige glycaner bundet til peptider inden for komplekse prøver. Denne artikel præsenterer en strømlinet arbejdsgang til fortolkning og analyse af glycoproteomiske data, der viser, hvordan åbne søgeteknikker kan bruges til at identificere bakterielle glycopeptider uden forudgående kendskab til glycansammensætningerne.
Ved hjælp af denne tilgang kan glycopeptider i prøver hurtigt identificeres for at forstå glycosyleringsforskelle. Ved hjælp af Acinetobacter baumannii som model muliggør disse tilgange sammenligning af glycansammensætninger mellem stammer og identifikation af nye glycoproteiner. Samlet set demonstrerer dette arbejde alsidigheden af åbne databasesøgningsteknikker til identifikation af bakteriel glykosylering, hvilket gør karakteriseringen af disse meget forskellige glycoproteomer lettere end nogensinde før.
Introduction
Proteinglykosylering, processen med at binde kulhydrater til proteinmolekyler, er en af de mest almindelige post-translationelle modifikationer (PTM'er) i naturen 1,2. På tværs af alle livets domæner har der udviklet sig en række komplekse maskiner dedikeret til generering af glycoproteiner, der påvirker et utal af cellulære funktioner 1,3,4,5. Mens proteinglykosylering forekommer på en række aminosyrer 6,7, er N-bundne og O-bundne glycosyleringshændelser to dominerende former observeret i naturen. N-bundet glykosylering involverer fastgørelse af glycaner til et nitrogenatom af asparagin (Asn) rester, mens glycaner i O-bundet glykosylering er bundet til et oxygenatom af serin (Ser), threonin (Thr) eller tyrosin (Tyr) rester7. På trods af lighederne i restkoncentrationer målrettet mod glykosyleringssystemer resulterer forskellene inden for glycanerne bundet til proteiner i, at glycosylering er den mest kemisk forskelligartede klasse af PTM'er, der findes i naturen.
Mens eukaryote glykosyleringssystemer besidder glycandiversitet, er disse systemer typisk begrænset i antallet af unikke kulhydrater, der anvendes. Den resulterende mangfoldighed stammer fra, hvordan disse kulhydrater er arrangeret i glycaner 8,9,10,11,12. I modsætning hertil besidder bakterielle og arkæale arter næsten ubegrænset glycandiversitet på grund af det store udvalg af unikke sukkerarter, der genereres inden for disse systemer 2,10,13,14,15,16,17. Disse forskelle i glycandiversiteten observeret på tværs af livets domæner udgør en betydelig analytisk udfordring for karakterisering og identifikation af glykosyleringshændelser. For eukaryot glycosylering har evnen til at foregribe glykansammensætninger lettet den voksende interesse for glykobiologi; Alligevel gælder det samme ikke for bakteriel glykosylering, som stadig stort set er begrænset til undersøgelse af specialiserede laboratorier. Da tilgængeligheden af massespektrometri (MS) instrumentering er steget i biovidenskaberne, er MS-baserede tilgange nu den primære metode til glykoproteomisk analyse.
MS har vist sig som det vigtigste værktøj til karakterisering af glykosylering, med både top-down og bottom-up tilgange, der nu almindeligvis anvendes til at karakterisere glycoproteiner6. Mens top-down proteomics bruges til at vurdere globale glykosyleringsmønstre af specifikke proteiner 18,19, anvendes bottom-up-tilgange til at muliggøre den glykanspecifikke karakterisering af glycopeptider, selv fra komplekse blandinger 6,20,21,22,23. Til analyse af glycopeptider er genereringen af informativ fragmenteringsinformation afgørende for karakteriseringen af glycosyleringshændelser24,25. En række fragmenteringsmetoder er nu rutinemæssigt tilgængelige på instrumenter, herunder resonansionfældebaseret kollisionsinduceret dissociation (IT-CID), stråle-type kollisionsinduceret dissociation (CID) og elektronoverførselssociation (ETD). Hver tilgang besidder forskellige styrker og svagheder for glycopeptidanalyse25,26, med betydelige fremskridt i løbet af det sidste årti med at anvende disse fragmenteringsmetoder til at analysere glykosylering 6,20. For bakteriel glykosyleringsanalyse har den kritiske begrænsning imidlertid ikke været evnen til at fragmentere glycopeptider, men snarere manglende evne til at forudsige de potentielle glykansammensætninger i prøver. Inden for disse systemer begrænser den ukendte karakter af forskellige bakterielle glycaner identifikationen af glycopeptider, selv med glycosyleringsfokuserede søgeværktøjer, der nu er almindelige til analyse af eukaryote glycopeptider, såsom O-Pair27, GlycopeptideGraphMS28 og GlycReSoft29. For at løse dette problem kræves en alternativ søgemetode med brug af åbne søgeværktøjer, der fremstår som en stærk tilgang til undersøgelsen af bakteriel glykosylering30.
Åben søgning, også kendt som blind eller wildcard søgning, tillader identifikation af peptider med ukendte eller uventede PTM'er 21,30,31,32. Åbne søgninger bruger en række beregningsteknikker, herunder kuraterede modifikationssøgninger, databasesøgninger i flere trin eller tolerant søgning i bred masse 33,34,35,36,37. Selvom åben søgning har stort potentiale, er dets anvendelse typisk blevet hindret af den betydelige stigning i analysetider og tab i følsomhed ved påvisning af umodificerede peptider sammenlignet med begrænsede søgninger31,32. Faldet i påvisning af umodificerede peptid-spektrale matches (PSM'er) er et resultat af de øgede falsk-positive PSM-hastigheder forbundet med disse teknikker, hvilket kræver øget streng filtrering for at opretholde de ønskede falske opdagelseshastigheder (FDR'er)33,34,35,36,37 . For nylig er flere værktøjer blevet tilgængelige, der forbedrer tilgængeligheden af åben søgning betydeligt, herunder Byonic31,38, Open-pFind39, ANN-SoLo40 og MSFragger21,41. Disse værktøjer muliggør robust identifikation af glykosyleringshændelser ved at reducere analysetiderne betydeligt og implementere tilgange til håndtering af heterogene glycansammensætninger.
Denne artikel præsenterer en strømlinet metode til identifikation af bakterielle glycopeptider ved åben søgning ved hjælp af det gramnegative nosokonialpatogen, Acinetobacter baumannii, som model. A. baumannii besidder et bevaret O-bundet glycosyleringssystem, der er ansvarlig for modifikationen af flere proteinsubstrater, kendt som PglL-proteinglykosyleringssystemet 42,43,44. Mens lignende proteiner er målrettet mod glykosylering mellem stammer, er PglL-glykosyleringssystemet meget variabelt på grund af biosyntesen af glycanen, der anvendes til proteinglykosylering, der er afledt af kapsellodusen (kendt som K-locus)44,45,46. Dette resulterer i, at forskellige glycaner (også kendt som en K-enhed), afledt af enkelte eller begrænsede polymeriserede K-enheder, tilsættes til proteinsubstrater 30,44,46. Inden for dette arbejde bruges brugen af det åbne søgeværktøj, MSfragger, inden for softwaren FragPipe til at identificere glycaner på tværs af A. baumannii-stammer. Ved at kombinere åben søgning og manuel kuratering kan "glycanfokuserede søgninger" foretages for yderligere at forbedre identifikationen af bakterielle glycopeptider. Sammen muliggør denne flertrinsidentifikationsmetode identifikation af glycopeptider uden stor erfaring med karakterisering af nye glykosyleringshændelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Fremstilling og analyse af bakterielle glycopeptidprøver kan opdeles i fire sektioner (figur 1). Til denne undersøgelse blev glycosyleringen af tre sekventerede A. baumannii-stammer vurderet (tabel 1). Proteome FASTA-databaser for hver af disse stammer er tilgængelige via Uniprot. Se tabel 2 for sammensætningen af buffere, der anvendes i denne protokol.
1. Fremstilling af proteinprøver til proteomisk analyse
- Isolering af proteomprøver af interesse
- Hvis du bruger hele celler, skal du sikre dig, at cellerne er blevet vasket med en fosfatbufret saltopløsning (PBS) for at fjerne potentielle proteinforurenende stoffer, der er til stede i medierne. Snap-frys hele celler efter vask og opbevar dem ved -80 °C, indtil det er nødvendigt.
- Hvis der anvendes fraktionerede prøver (f.eks. membranpræparater), skal det sikres, at de anvendte reagenser ikke forstyrrer analysen af væskekromatografi MS (LC-MS) nedstrøms50.
- Hvis der er anvendt vaskemidler, såsom natriumdodecylsulfat (SDS), Triton X-100, NP-40 eller lauroylsarcosin, skal du fjerne disse rengøringsmidler ved hjælp af acetoneudfældning, SP3-prøveforberedelsesmetoder51 eller kommercielle proteomiske oprydningskolonner såsom S-fælder52. Alternativt kan du erstatte uforenelige rengøringsmidler med et MS-kompatibelt eller aftageligt vaskemiddel, såsom natriumdeoxycholat (SDC) eller octylglukcopyranosid.
- Sørg for, at alle plastvarer og glasvarer, der skal bruges til prøveforberedelse, ikke er autoklaveret. Autoklaveret glasvarer og plast er typisk stærkt forurenet med små molekylvægtsforbindelser, såsom polymerer, som let påvises inden for MS.
- Opløselighed af helcelleprøver
- Resuspend ~ 10 mg vaskede, snapfrosne celler i 200 μL frisklavet natriumdeoxycholatlysebuffer (SDC-lysisbuffer: 4% SDC i 100 mM Tris, pH 8,5).
BEMÆRK: Proteasehæmmere kan tilsættes til SDC-lysisbufferen for at begrænse proteinnedbrydning. - Prøverne koges i 10 minutter ved 95 °C med omrystning (2000 o/min på en termomixer), og lad dem derefter ligge på is i 10 minutter. Gentag denne proces to gange for at sikre effektiv lysis og opløselighed af prøverne.
BEMÆRK: Prøver kan opbevares på lang sigt på dette tidspunkt ved -80 °C. Hvis det opbevares, resolubiliseres ved opvarmning ved 95 °C inden videre forarbejdning.
- Resuspend ~ 10 mg vaskede, snapfrosne celler i 200 μL frisklavet natriumdeoxycholatlysebuffer (SDC-lysisbuffer: 4% SDC i 100 mM Tris, pH 8,5).
- Kvantificer prøveproteinkoncentrationer ved hjælp af et bicinsyreproteinassay (BCA)53. Opbevar prøver på is, mens du foretager kvantificering for at begrænse proteinnedbrydning.
BEMÆRK: Til total proteomanalyse er 20-100 μg protein mere end tilstrækkeligt til nano LC-MS, som typisk kræver mindre end 2 μg proteinfordøjelse pr. Analyse. Fremstillingen af overskydende peptid muliggør replikatanalyse eller yderligere fraktionering, hvis dyb proteomisk dækning er påkrævet. Til glycopeptidberigelsesbaseret analyse ved anvendelse af hydrofil interaktionskromatografi (HILIC) kræves 100-500 μg protein. - Reducer og alkylatprøver.
- Der tilsættes 1/10th volumen af 10x reduktions-/alkyleringsbuffer (100 mM Tris 2-carboxyethylphosphinhydrochlorid; 400 mM 2-chloracetamid i 1 M Tris, pH 8,5) til prøver til en endelig koncentration på 1x og inkubere prøver i mørke i 30 minutter ved 45 °C med omrystning ved 1.500 o / min.
BEMÆRK: Kontroller pH-værdien i 10x reduktions-/alkyleringsbufferen for at sikre en pH på ca. 7,0-8,0, før der tilsættes til prøverne, da en lavere pH vil få SDC til at udfælde.
- Der tilsættes 1/10th volumen af 10x reduktions-/alkyleringsbuffer (100 mM Tris 2-carboxyethylphosphinhydrochlorid; 400 mM 2-chloracetamid i 1 M Tris, pH 8,5) til prøver til en endelig koncentration på 1x og inkubere prøver i mørke i 30 minutter ved 45 °C med omrystning ved 1.500 o / min.
- Spin kortvarigt prøverne ned og tilsæt proteaserne Trypsin / Lys-C (~ 10 μL, resuspended i 100 mM Tris, pH 8,5) for et endeligt protease: proteinforhold på 1: 100. Inkubere fordøjelserne natten over ved 37 °C med omrystning ved 1.500 o/min (op til 18 timer). For at sikre fuldstændig proteinfordøjelse skal du bruge et Trypsin/Lys-C protease:protein-forhold på 1:50 til 1:200.
- Quench fordøjes ved at tilsætte 1,25 volumener 100% isopropanol til prøverne. Vortex prøverne i 1 minut for at blande og spinde dem kort ned.
BEMÆRK: Prøverne kan opbevares ved -20 °C for at blive yderligere behandlet senere. - Forsur prøverne ved at tilsætte 0,115 volumener 10% trifluoreddikesyre (TFA; endelig koncentration på ~ 1% TFA), hvirvel prøverne og spinde dem kort ned.
2. Behandling af proteomprøver
- Peptidoprydning af proteomprøver
- Der forberedes et styrendivinylbenzen-reverse-phase sulfonat (SDB-RPS) Stop-and-go-extraction (Stage) Tip for hver prøve som tidligere beskrevet54.
- Empirisk, for at binde 50 μg peptid, udskære tre SDB-RPS-skiver fra en 47 mm2 SDB-RPS-membran ved hjælp af en stump nål (14 G). For større peptidmængder øges antallet af diske i overensstemmelse hermed.
- Før du bruger SDB-RPS Stage Tips, skal du forberede spidserne ved sekventielt at tilføje mindst ti sengevolumener af følgende buffere og enten dreje bufferen gennem søjlen ved centrifugering (25 °C, 3 min, 500 × g) eller ved at skubbe bufferen gennem søjlen ved forsigtigt at påføre tryk ved hjælp af en sprøjte.
- Våd spidserne med 150 μL 100% acetonitril.
- Vask spidserne med 150 μL 30% methanol, 1% TFA i 18,2 MΩH20.
- Ligevægt spidserne med 150 μL 90% isopropanol, 1% TFA afbalanceret med 18,2 MΩH20.
- Prøverne (indeholdende 50 % isopropanol, 1 % TFA) lægges på SDB-RPS-trinspidserne ved centrifugering (25 °C, 3 min, 500 × g) eller ved forsigtigt at påføre tryk ved hjælp af en sprøjte.
- SDB-RPS-trinspidserne vaskes med følgende buffere ved centrifugering (25 °C, 3 min, 500 × g) eller ved forsigtigt at påføre tryk ved hjælp af en sprøjte.
BEMÆRK: Yderligere vaske eller alternative buffere kan bruges til at fjerne ikke-peptidforurenende stoffer, såsom brugen af ethylacetat i stedet for isopropanol55.- Vask spidserne med 150 μL 90% isopropanol, 1% TFA.
- Vask spidserne med 150 μL 1% TFA i 18,2 MΩH20.
- Eluter peptiderne fra SDB-RPS Stage Tips med 150 μL 5% ammoniumhydroxid i 80% acetonitril ved centrifugering eller ved forsigtigt at påføre tryk ved hjælp af en sprøjte. Saml prøverne i de enkelte rør.
BEMÆRK: Forbered 5% ammoniumhydroxid i 80% acetonitril i en plastbeholder umiddelbart før brug i en stinkhætte. - De elverede peptider tørres ved vakuumcentrifugering ved 25 °C.
BEMÆRK: Hvis der foretages HILIC-berigelse, kan 1-10% af peptidets eluater fjernes på dette tidspunkt, tørres og anvendes som total proteomindgangskontrol.
- Der forberedes et styrendivinylbenzen-reverse-phase sulfonat (SDB-RPS) Stop-and-go-extraction (Stage) Tip for hver prøve som tidligere beskrevet54.
- Berigelse af glycopeptidprøver
- Forbered Zwitterionic Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography (ZIC-HILIC) Stage Tips som tidligere beskrevet54,56.
- Kort fortalt skal du skære en C8-skive fra en 47 mm2 C8-membran ved hjælp af en stump nål (14 G) og pakke disken i en P200-spids for at skabe en frit. Tilsæt ca. 5 mm ZIC-HILIC-materiale, der er resuspenderet i 50% acetonitril, 50% 18,2 MΩH20, på fritt ved forsigtigt at påføre tryk ved hjælp af en sprøjte.
- Før du bruger ZIC-HILIC Stage Tips, skal du konditionere harpiksen ved sekventielt at tilsætte følgende buffere og forsigtigt påføre tryk ved hjælp af en sprøjte.
BEMÆRK: For at sikre integriteten af pseudo-vandlaget på overfladen af ZIC-HILIC-harpiksen (kræves for at berige glycopeptider), skal harpiksen altid forblive våd. Når du vasker harpiksen, skal du altid efterlade ~ 10 μL opløsningsmiddel over harpiksen og sikre, at vaskene / prøverne pipetteres direkte ind i dette resterende opløsningsmiddel.- Harpiksen udlignes med 20 sengevolumener (200 μL) ZIC-HILIC elueringsbuffer (0,1% TFA i 18,2 MΩH20).
- Vask harpiksen med 20 sengevolumener (200 μL) ZIC-HILIC-præparatbuffer (95% acetonitril i 18,2 MΩH20).
- Vask harpiksen med 20 sengevolumener (200 μL) ZIC-HILIC-belastnings-/vaskebuffer (80 % acetonitril, 1 % TFA afbalanceret med 18,2 MΩH20).
- De tørrede fordøjede prøver (fra trin 2.1.6) i ZIC-HILIC-belastnings-/vaskebufferen suspenderes til en endelig koncentration på 4 μg/μL (f.eks. for 200 μg peptid, resuspend i 50 μL ZIC-HILIC-belastnings-/vaskebuffer). Vortex kortvarigt i 1 min. for at sikre, at prøverne bliver resuspended, og spindes ned i 1 min ved 2.000 × g ved 25 °C.
- Læg den resuspenderede peptidprøve på en konditioneret ZIC-HILIC-søjle.
- Vask tre gange med 20 sengevolumener (200 μL) ZIC-HILIC-ilægnings-/vaskebuffer (for 60 sengevolumenvaske i alt) ved forsigtigt at lægge tryk ved hjælp af en sprøjte.
- Elute glycopeptider med 20 sengs volumener (200 μL) ZIC-HILIC elueringsbuffer i et 1,5 ml rør ved forsigtigt at påføre tryk ved hjælp af en sprøjte og derefter tørre eluatet ved vakuumcentrifugering ved 25 °C.
- Forbered Zwitterionic Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography (ZIC-HILIC) Stage Tips som tidligere beskrevet54,56.
3. LC-MS af proteom/glycopeptidberigede prøver
- Prøverne i buffer A* (2 % acetonitril, 0,1 % TFA) suspenderes til en endelig koncentration på 1 μg/μL (f.eks. for 50 μg peptid, resuspend i 50 μL buffer A*).
- Læg prøverne på en HPLC/UPLC koblet til en MS for at muliggøre adskillelse og identifikation af glycopeptider.
BEMÆRK: Kolonneparametrene, herunder indvendig diameter, længde, strømningshastigheder, type kromatografiharpiks og krævede peptidinjektionsmængder, bør optimeres til den analytiske opsætning og gradientlængde, der skal anvendes; For et eksempel på, hvordan man foretager optimering af analytiske opsætninger, se57. - Overvåg indsamlingen af de resulterende MS-data, der sikrer, at dataene indsamles med de ønskede parametre.
BEMÆRK: Til sammensætningsanalyse er CID-fragmentering tilstrækkelig. På grund af tilsætningen af glycaner til glycopeptider observeres glycopeptidioner typisk med en højere m / z og lavere ladningstæthed end unglycosylerede peptider. For at sikre, at disse ioner kan observeres, skal du tillade et MS1-masseområde fra 400 til 2.000 m/z. - Fragment udvalgte ioner ved hjælp af CID, hvilket sikrer indsamling af fragmentioner med lavt m/z-indhold , der indeholder oxoniumioner, der er vigtige for karakteriseringen af glycaner.
BEMÆRK: Fragmentering af glycopeptider ved anvendelse af CID påvirkes af både peptid- og glycansekvenserne såvel som den energi, der påføres under fragmentering 25,58,59. Mens en række forskellige kollisionsenergier kan anvendes, er en optimal strategi til fragmentering af glycopeptider brugen af trinvise kollisionsenergier, der kombinerer brugen af flere kollisionsenergier 25,59,60. - Brug alternative fragmenteringsmetoder, hvis de er tilgængelige, såsom ETD til lokalisering af lokaliteter eller IT-CID til at hjælpe med at bestemme glycansammensætninger.
BEMÆRK: Ingen af disse fragmenteringsmetoder er afgørende for sammensætningsanalyse, men kan indsamles for at muliggøre yderligere forhør af glycopeptider af interesse.
4. Analyse af proteom/glycopeptidberigede prøver
- Forfiltrering af datafiler for at muliggøre søgning i FragPipe
- Hvis ETD- eller IT-CID-scanninger er blevet erhvervet i datasæt, skal du filtrere disse scanningshændelser fra datafilerne ved hjælp af MSConvert61 , før du søger med FragPipe.
BEMÆRK: For de åbne søgeparametre, der er beskrevet nedenfor, kræves kun stråletype CID-data.
- Hvis ETD- eller IT-CID-scanninger er blevet erhvervet i datasæt, skal du filtrere disse scanningshændelser fra datafilerne ved hjælp af MSConvert61 , før du søger med FragPipe.
- Udførelse af åbne søgninger i FragPipe
- Åbn FragPipe, og klik på fanen Arbejdsgang . I rullemenuen i arbejdsgangen skal du vælge indstillingen Åbn søgning og klikke på Tilføj filer for at importere de datafiler, der skal søges i, til FragPipe (figur 2A).
- Klik på fanen Database, og start downloadmanageren ved at klikke på Download. Dette gør det muligt at downloade proteomdatabaser fra Uniprot ved hjælp af et Uniprot Proteome ID. Klik på indstillingen Tilføj lokkefugle og forurenende stoffer i downloadmanageren for at indarbejde lokke- og forurenende proteiner i databaser.
- Hvis du vil have strengere FDR-tærskler, skal du klikke på fanen Validering og redigere filter - og rapportværdien fra 0,01 til den påkrævede FDR.
BEMÆRK: Standard FragPipe-indstillingerne sikrer en 1% FDR på proteinniveau. - Klik på fanen MSfragger . I feltet Peak matching skal du øge precursormassetolerancen fra standard 500 Da til 2.000 Da for at muliggøre identifikation af store ændringer (figur 2A).
- Klik på fanen Kør , og definer placeringen af FragPipe-output. Klik på knappen Kør for at starte søgningen.
- Ved hjælp af de PSM'er, der er identificeret på tværs af datasæt (indeholdt i psm.tsv-output fra FragPipe), skal du identificere potentielle glycaner ved at plotte hyppigheden af observerede deltamasser i datasæt (figur 3). Opret deltamasseplots fra MSfragger-output ved hjælp af R-scripts, der er tilgængelige via PRIDE-tiltrædelse PXD027820.
BEMÆRK: Minimal efterbehandling af de åbne søgeresultater udføres inden for disse scripts, da hovedformålet med disse scripts er at hjælpe med visualiseringen af delta-masseprofiler. Det er vigtigt, at observationen af rigelige deltamasser alene ikke er bevis for, at en modifikation er en potentiel glycan, da tildeling af deltamasser som glycaner kræver yderligere analyse af de tilsvarende MS2-hændelser. - For at muliggøre karakterisering af glycopeptider i prøver skal der fokuseres på deltamasseidentifikationer med høj tillid, svarende til opgaver med høje hyperscorer.
- For at hjælpe med at vurdere glycopeptidspektre skal du bruge peptidannotationsværktøjer, såsom Interactive Peptide Spectral Annotator63, som muliggør tildeling af peptid-associerede ioner inden for spektre, hvilket muliggør manuel identifikation af de glycan-associerede ioner (figur 4).
BEMÆRK: Inden for de datasæt, der præsenteres her, betragtes hyperscorer på >30 som høj score, da disse svarer til scoringer inden for de øverste 50% af alle identificerede glycopeptider (figur 5).
- For at hjælpe med at vurdere glycopeptidspektre skal du bruge peptidannotationsværktøjer, såsom Interactive Peptide Spectral Annotator63, som muliggør tildeling af peptid-associerede ioner inden for spektre, hvilket muliggør manuel identifikation af de glycan-associerede ioner (figur 4).
- Med tildelte glycopeptider med høj tillid identificeres almindeligt observerede glycan-associerede ioner (figur 4) for at forbedre identifikationen af glycopeptider.
BEMÆRK: Ved at inkorporere glycan-associerede ioner i søgninger, kendt som glycan-fokuserede søgninger, kan kvaliteten af glycopeptidopgaver forbedres.- Klik på fanen MSfragger i FragPipe, indarbejd de bestemte deltamasser af de observerede glycaner i sektionerne Variable modifikationer og Masseforskydninger . Tilføj disse masser ved at skrive værdier i afsnittene Variable modifikationer og Masseforskydninger med individuelle masser adskilt med en /. Tilsæt de glycan-associerede fragmentmasser af disse glycaner i Glyco / Labile mods sektionen af MSFragger.
BEMÆRK: Figur 2B skitserer de nøgleoplysninger, der kræves til en glycanfokuseret søgning af A. baumannii-stammen AB307-0294.
- Klik på fanen MSfragger i FragPipe, indarbejd de bestemte deltamasser af de observerede glycaner i sektionerne Variable modifikationer og Masseforskydninger . Tilføj disse masser ved at skrive værdier i afsnittene Variable modifikationer og Masseforskydninger med individuelle masser adskilt med en /. Tilsæt de glycan-associerede fragmentmasser af disse glycaner i Glyco / Labile mods sektionen af MSFragger.
- Upload alle MS-data, der er forbundet med proteomiske undersøgelser, til centraliserede proteomiske arkiver såsom PRIDE- eller MASSIVE-arkiverne.
BEMÆRK: Alle data i forbindelse med denne undersøgelse er blevet deponeret i PRIDE proteomic repository og kan tilgås via PRIDE tiltrædelsen: PXD027820.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at illustrere nytten af åben søgning efter bakteriel glycopeptidanalyse blev den kemiske mangfoldighed af O-bundne glycaner inden for tre stammer af A. baumannii-AB307-0294, ACICU og D1279779-vurderet. De O-bundne glycoproteomer er meget variable mellem A. baumannii-stammer, da glycanerne, der anvendes til glycosylering, er afledt af den meget variable kapsel loci 44,45,46. Denne kemiske mangfoldighed gør A. baumannii til et ideelt modelsystem til åbne søgestudier. Mens glycoproteomerne af de tre stammer ikke tidligere er blevet vurderet, er kapselstrukturerne af to af disse stammer, AB307-029464 og ACICU65, kendt, idet kapslen af D1279779 endnu ikke er belyst.
I overensstemmelse med kapslen AB307-0294 afslørede åben søgning på AB307-0294 to dominerende deltamasser, svarende til 648,25 Da og 692,28 Da (figur 3A). Disse masser svarer til de kapselstrukturer, der tidligere blev bestemt af Russo et al., -β-D-QuiNAc4NR-α-GlcNAc6OAc-α-d-GalNAcA, hvor QuiNAc4NR-resten svarer til 2,4-diamino-2,4,6-trideoxy-glucose, modificeret med enten 3-OH-butyrat eller en acetylgruppe64. Tilsvarende vides ACICU-kapslen at være sammensat af en tetrasaccharid K-enhed, tidligere identificeret som Pse5Ac7Ac-β-D-Glc p-β-D-Gal p-β-D-Gal p-NAc-, svarende til en forventet masse på 843,31 Da65. Denne kapselstruktur er i overensstemmelse med den hyppigst observerede deltamasse i ACICU-dataene (figur 3B). Endelig afslørede åben søgeanalyse af stammen D1279779 tilstedeværelsen af flere deltamasser i overensstemmelse med 203.08, 794.31 og 1588.62 Da (figur 3C). Mens massen 203,08 er i overensstemmelse med massen for en enkelt HexNAc-rest, svarer 794,31 og 1588,62 til ukendte modifikationer. Det skal bemærkes, at massen 1588,62 er nøjagtigt dobbelt så stor som 794,31, hvilket tyder på, at disse peptider er dekoreret med glycan K-enhedsdimer, som det tidligere er blevet observeret inden for andre Acinetobacter glycoproteomer 30,44,46.
Delta masseplots giver en hurtig og effektiv måde at vurdere hyppigheden af observerede modifikationer inden for prøver. For komplekse modifikationer, såsom glycaner, giver tilstedeværelsen af en deltamasse alene imidlertid ikke oplysningerne til at definere den nøjagtige sammensætning af en glycan. For at hjælpe med at bestemme glycansammensætninger kan de resulterende MS/MS-data for PSM'er, der er tildelt specifikke deltamasser, anvendes. Ved at fokusere på glycopeptidopgaver med høj tillid (i MSFragger svarende til PSM'er med høje hyperscorer) kan manuel analyse bruges til yderligere at karakterisere de glycaner, der anvendes af en stamme til proteinglykosylering. Det skal bemærkes, at høj-konfiktionspeptidtildelinger typisk indeholder robust glycaninformation, der muliggør bestemmelse af glycansammensætninger baseret på Y-ioner. Disse oplysninger kan bruges til at identificere de tilsvarende fragmenter, hvor glycanerne er forblevet bundet til peptider, såvel som til B- og oxoniumrelaterede ioner, der er nyttige til tildeling af glycaner66. Detaljerede retningslinjer for, hvordan man tildeler glycansammensætninger, er tidligere blevet skitseret, og læsere anbefales at konsultere Harvey et al.67. Ved hjælp af værktøjer som Interactive Peptide Spectral Annotator63 kan peptid-associerede ioner let identificeres, så brugerne kan bestemme identiteten af de glycaner, der er bundet til peptider.
Ved hjælp af Interactive Peptide Spectral Annotator blev glycopeptider identificeret på tværs af disse tre A. baumannii-prøver vurderet, hvilket afslørede potentielle glycan-associerede ioner. Overvej MS/MS-spektrene i AB307-0294-glycopeptidet SAGDQAASDIATATDNASAK, dekoreret med glycanerne 648,25 og 692,28 Da (figur 4A,B); under lignende fragmenteringsbetingelser er de glycanrelaterede ioner meget ens, men alligevel skifter i masse med 44,02 Da. Analyse af glycanionerne inden for disse PSM'er muliggør bekræftelse af, at deltamasserne observeret for disse glycopeptider svarer til trisaccharider indeholdende fire forskellige kulhydrater: dHexNAcNAc (228 Da), dHexNAcNBu (272 Da), HexNAcA (217 Da) og HexNAc (203 Da). Det skal bemærkes, at når der tildeles glycanfragmenter, er flere monosaccharider tilbøjelige til at miste vand, når de fragmenteres ved anvendelse af CID. Dette kan ses i Glycan af ACICU, hvor monosaccharid Pse5Ac7Ac (316 Da) fører til dannelsen af to fremtrædende glykanrelaterede fragmenter: MH+ 299.12 og 317.13, forskellen i masse svarende til vandmassen (18.01 Da) (figur 4C).
Derudover er det almindeligt at observere uventede monosaccharidmasser svarende til sukkerarter, der ikke observeres i eukaryoter, når man analyserer bakterielle glycaner. Et eksempel på dette kan ses inden for glycopeptid-PSM'erne i D1279779, hvor analyse af den hyppigste deltamasse 794,31 Da afslører tilstedeværelsen af et usædvanligt monosaccharid dHexNAc (187 Da, observeret som en MH+ på 188,09, figur 4D), som tidligere er blevet observeret inden for A. baumannii O-bundne glycaner44. Mens målinger med høj massenøjagtighed og glycanernes karakteristiske opførsel som labile modifikationer, der går tabt fra peptidrygraden, kan hjælpe med at bestemme potentielle kemiske sammensætninger af glycaner, anbefales det at minimere overfortolkningen af MS-data. Hvis stereokemi af specifikke sukkerarter eller sammenkædningsoplysningerne for en glycan er ukendt, er det bedste praksis at anvende strukturelt agonistiske opgaver, herunder at henvise til monosaccharider af deres specifikke klasser. Et eksempel på dette er at henvise til 203.08 Da-rester som N-acetylhexosaminer (HexNAc) og undgå tildeling af forbindelsestyper. Om nødvendigt anbefales det, at der anvendes yderligere teknikker til at definere de nøjagtige kemiske identiteter af en ukendt modifikation, såsom brugen af nuklear magnetisk resonans (NMR).
Mens åbne søgetilgange muliggør hurtig identifikation af modificerede peptider, er det vigtigt at bemærke, at denne søgemetode kan overse potentielle glycopeptider inden for datasæt. Inden for åbne søgninger kan glycopeptider ikke identificeres af flere grunde, herunder utilstrækkelig peptidfragmenteringsinformation eller straf af det tildelte peptid på grund af tilstedeværelsen af flere ikke-tildelte ioner inden for MS2-begivenheden. Sidstnævnte gælder især for bakterielle glycopeptid PSM'er, da disse spektre kan indeholde glycan-associerede fragmenter, der ikke betragtes som standard åbne søgeparametre. Da uovertrufne træk påvirker psm'ernes score negativt, muliggør minimering af uovertrufne ioner inden for MS / MS-spektre identifikation af glycopeptider, der oprindeligt blev udelukket på grund af de FDR-kontrollerede minimale scoretærskler. For at overvinde denne begrænsning kan de masser, der er defineret ud fra de åbne søgninger (figur 3) og de manuelt definerede glycan-associerede ioner (figur 4), indarbejdes i søgeparametre for at forbedre identifikationen af glycopeptider. Det er vigtigt at bemærke, at disse glycan-associerede ioner kan identificeres manuelt baseret på de novo-bestemmelse af glycanen, forudgående kendskab til almindelige oxoniumioner44,68 eller brugen af værktøjer, der kan fange tilbagevendende ioner inden for spektre, såsom SPectral Immonium Ion Detection tool69,76.
For at demonstrere dette blev masserne af atypiske glycanfragmenter, der blev identificeret gennem åben søgeanalyse, indarbejdet i søgeparametrene i MSFragger, og glycanfokuseret søgning blev foretaget (de glycanfokuserede indstillinger for stammen AB307-0294 er vist i figur 2B). Det skal bemærkes, at når flere glycaner søges sammen, skal man være forsigtig med udvælgelsen af Y-ion og diagnostiske masser for at sikre, at de nøjagtigt afspejler fragmentionerne forbundet med hver deltamasse. Selv om dette måske ikke altid er muligt for kombinationer af Y og diagnostiske masser, der udelukker hinanden, såsom fragmenterne af 648,25 og 692,28 glycaner af AB307-0294 (figur 4A,B), er glykanfokuseret søgning stadig mulig, omend dette kan påvirke søgeresultaternes robusthed. Glycanfokuserede søgninger førte til en bemærkelsesværdig stigning i det samlede antal glycopeptid-PSM'er, der blev identificeret på tværs af alle tre A. baumannii-stammer, svarende til en stigning på 37% i ACICU, en stigning på 117% i AB307-0294 og en stigning på 363% i D1279779 (figur 5A-C). For individuelle MS-hændelser resulterer inkluderingen af glycanspecifikke oplysninger typisk i en stigning inden for den observerede hyperscore, selv om denne stigning er meget glycanafhængig (figur 5D,E). Ved at forfine søgeparametrene ved hjælp af masserne af glycaner, der afsløres gennem åben søgning og efterfølgende inkorporere manuelt kurateret glycanfragmentinformation i målrettede søgninger, kan der således opnås en mere detaljeret analyse af glycopeptider i prøver.
Figur 1: Oversigt over de vigtigste trin i fremstillingen og analysen af bakterielle glycopeptider. Den vellykkede identifikation af bakterielle glycopeptider er afhængig af dannelsen af prøver af høj kvalitet indeholdende glycopeptider. Glycopeptidholdige prøver analyseres derefter af LC-MS, og efterfølgende anvendes åbne søgetilgange til at identificere potentielle glycopeptider baseret på unikke deltamasser. Ved hjælp af manuel kuratering kan disse deltamasser identificeres som glycaner. Endelig, for at forbedre identifikationen af glycopeptider, kan glycaninformation indarbejdes i glycanfokuserede databasesøgninger. Forkortelser: LC-MS = væskekromatografi koblet til massespektrometri; OD = optisk densitet; SDB-RPS = styrendivinylbenzen-omvendt fase sulfonat; ZIC-HILIC = Zwitterionisk hydrofil interaktion væskekromatografi; PSM'er = peptid-spektrale kampe; CID = kollisionsinduceret dissociation; ETD = elektronoverførselssociation. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Oversigt over, hvordan du aktiverer åben søgning og glycanfokuserede søgninger i FragPipe. (A) Åben søgning kan aktiveres ved at indlæse Open Workflow under fanen Workflow i FragPipe. For at muliggøre identifikation af glycaner større end 500 Da i størrelse skal du øge precursormassetolerancevinduet til 2.000 Da. (B) Glycanfokuserede søgninger efter atypiske glycaner kræver indtastning af glycanoplysninger i MSFragger-fanen for at definere de forventede masser af modifikationerne (i afsnittene Variable modifikationer og Masseforskydninger ), de Y-ioner, der er forbundet med disse glycaner (i listen over Y-ionmasser i Glyco/Labile sektion) og glycanfragmentionerne med lav masse (i listen over diagnostiske fragmentmasser i glyko/labilsektionen ). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Delta masseplotter af åbne søgeresultater for de tre stammer af Acinetobacter baumannii (AB307-0294, ACICU og D1279779). I overensstemmelse med mangfoldigheden af kapselloci har hver A. baumannii-stamme en unik deltamasseprofil med fremtrædende modifikationer på mere end 140 Da i størrelse, betegnet med de observerede deltamasser. (A) Inden for masseplottet AB307-0294 svarer masserne 648,25 og 692,28 til modifikationer, der er i overensstemmelse med -β-d-QuiNAc4NR-α-GlcNAc6OAc-α-d-GalNAcA-, hvor QuiNAc4NR er modificeret med enten et 3-OH-butyrat eller acetylgruppe64. (B) Inden for ACICU delta masseplottet svarer masserne 203.08 og 843.31 til modifikationer i overensstemmelse med HexNAc og Pse5Ac7Ac-β-D-Glc p-β-D-Gal p-β-D-Gal p-NAc, henholdsvis65. (C) Inden for D1279779 delta masseplottet svarer masserne 203.08, 794.31 og 1588.62 til HexNAc, HexNAc-217-187-187 og en dimer af HexNAc-217-187-187. Deltamasser vurderes og bekræftes manuelt i figur 4 at være glycaner betegnet med *. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: MS/MS-karakterisering af deltamasser observeret på tværs af de tre stammer af Acinetobacter baumannii. (A, B) AB307-0294, (C) ACICU og (D) D1279779. Interaktive peptidspektrale annotatorassisterede kommenterede spektre af repræsentative glycopeptider. For hvert spektrum betegnes peptidfragmentionerne i blåt og rødt, mens de manuelt tildelte glycan-associerede ioner betegnes med grønt. Glycaner er blevet kommenteret ved hjælp af symbolnomenklaturen for glykaner med HexNAc betegnet som en firkant, Hex som en cirkel og atypiske monosaccharider betegnet som trapezoider med massen af glycanen betegnet i trapezoiderne. Forkortelse: MS/MS = tandemmassespektrometri. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Sammenligning af glycopeptider identificeret på tværs af stammer af Acinetobacter baumannii ved hjælp af åben vs glycanfokuseret søgning. (A-C) Sammenligning af hyperscorer og antal PSM-opgaver inden for D1279779, ACICU og AB307-0294 ved hjælp af åben og glycanfokuseret søgning. (D-F) Sammenligning af individuelle MS2-hændelser tildelt den samme peptidsekvens ved hjælp af åbne og glycanfokuserede søgninger efter D1279779, ACICU og AB307-0294. Forkortelse: PSM = peptid-spektral match. Klik her for at se en større version af denne figur.
| A. baumannii Stammer | Uniprot Proteome-id'er |
| AB307-0294 15 | UP000006924 |
| ACICU 47,48 | UP000008839 |
| Svendborg, Svendborg | UP000011860 |
Tabel 1. Stamme og Uniprot Proteome ID'er, der anvendes i denne undersøgelse.
| Buffer navn | Buffersammensætning / pH | |
| Buffer A* | 2% acetonitril i 18,2 MΩ H2O, 0,1% triflureddikesyre / pH 1,0 | |
| PBS | 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4 og 2 mM KH2PO4 / pH 7,4 | |
| Reduktions-/alkyleringsbuffer | 100 mM Tris 2-carboxyethylphosphinhydrochlorid, 400 mM 2-chloracetamid i 1 M Tris / pH 7,5 | |
| SDB-RPS Stage Tip eluering buffer | 5% ammoniumhydroxid i 80% acetonitril / pH 11 | |
| SDB-RPS Stage Tip ækvibrationsbuffer | 30% methanol, 1% triflureddikesyre, i 18,2 MΩH20/ pH 1,0 | |
| SDB-RPS Stage Tip ækvibration/vaskebuffer | 90% isopropanol, 1% triflureddikesyre / pH 1,0 | |
| SDB-RPS Stage Tip vaskebuffer | 1% triflureddikesyre i 18,2 MΩH20/ pH 1,0 | |
| SDC lysis buffer | 4% SDC i 100 mM Tris / pH 8,5 | |
| ZIC-HILIC elueringsbuffer | 0,1% triflureddikesyre i 18,2 MΩH20/pH 1,0 | |
| ZIC-HILIC belastnings-/vaskebuffer | 80% acetonitril, 1% triflureddikesyre i 18,2 MΩH20/ pH 1,0 | |
| ZIC-HILIC forberedelsesbuffer | 95% acetonitril i 18,2 MΩH20/ pH 7,0 | |
Tabel 2: Sammensætning af buffere anvendt i denne undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Åben søgning er en effektiv og systematisk metode til identifikation af ukendte modifikationer. Mens identifikationen af ukendte glycaner inden for bakterielle proteomprøver traditionelt har været en tidskrævende og teknisk specialiseret virksomhed, muliggør den seneste udvikling af værktøjer som MSfragger21,41 og Byonic31,38 nu hurtig og effektiv identifikation af deltamasser til yderligere karakterisering som potentielle glycaner knyttet til peptider. Åben søgning af både standard- og glycopeptidberigede proteomprøver kan identificere potentielle glycopeptider (figur 1). Fællestrækket og overfloden af glycopeptider inden for proteomet i mange bakteriesystemer gør den direkte påvisning af disse modifikationer mulig uden glycopeptidberigelse6. Selvom glycopeptidberigelsesmetoder typisk stadig overgår ikke-berigelsesbaserede metoder til mange glykosyleringssystemer70, er det bemærkelsesværdigt, at ikke alle glycaner er lige modtagelige for berigelse 71,72. Denne kendsgerning bør overvejes, når man bestemmer den mest hensigtsmæssige tilgang til identifikation af glykosyleringshændelser ved hjælp af åben søgning efter en given biologisk prøve.
Mens åben søgning effektivt identificerer glycaner observeret med høj frekvens i en prøve, forbliver den ineffektiv til at identificere glykosyleringshændelser, der sjældent forekommer inden for datasæt. I praksis skal der, for at en unik deltamasse af en glycan kan identificeres, være mindst 10 PSM'er med en identisk deltamasse til stede i prøverne. Denne minimumsfrekvens gør det muligt at skelne en potentiel glykan over baggrundsdeltamassetildelinger (figur 3). Mens dette kriterium typisk opfyldes af generelle glykosyleringssystemer, der er rettet mod flere substrater til glycosylering, kan systemer, hvor et enkelt protein er målrettet mod glykosylering, være mindre modtagelige for denne tilgang. Efterhånden som MS-instrumenternes hastighed og følsomhed forbedres, er det sandsynligt, at dette i stigende grad vil gøre det muligt at vurdere glycopeptidpopulationer med lavere forekomst, hvilket igen vil øge effektiviteten af åbne søgetilgange, forudsat at der kan genereres tilstrækkelige kvalitetsspektre for sjældne/lavglende glykoformer.
Mens MS muliggør effektiv identifikation af nye glycaner, er det vigtigt at bemærke, at denne indsigt alene sjældent giver en fuldstændig strukturel karakterisering af glycopeptider / glycaner, hvor værktøjer som NMR-spektroskopi stadig er kritiske for fuldstændig glycankarakterisering. Som observeret her gav MS supplerende bekræftelse af K-enheder, der tidligere var bestemt ved anvendelse af NMR fra isolerede kapsler af A. baumannii ACICU og AB307-029464,65. For den store glycan, der blev identificeret i D1279779, var det imidlertid kun oplysninger om de formodede klasser af monosaccharider inden for denne glycan, der kunne tildeles ms, der ikke gav nogen oplysninger om forbindelsestyperne eller stereokemien af disse sukkerenheder (figur 4). Efterhånden som nye MS-fragmenteringsmetoder bliver mere bredt tilgængelige, såsom ultraviolet fotodissociation73,74, kan mere detaljeret strukturel karakterisering af glycopeptider være mulig. Der skal dog være forsigtighed, når man udleder koblinger eller stereokemisk information med den aktuelle instrumentering. Ud over disse overvejelser er der for nylig blevet rejst spørgsmål om hensigtsmæssigheden af FDR-baserede kontroller til åben søgning75. Mens åben søgning er en stærk tilgang, fremhæver disse overvejelser således behovet for omhu i fortolkningen af glycanopgaver baseret på åben søgeinformation alene.
Mens dette arbejde viser, at åben søgning er en effektiv tilgang til uovervåget identifikation af glycaner, der anvendes til bakteriel glykosylering, giver åben søgning alene adgang til kun en delmængde af alle glycopeptider indeholdt i prøver. På grund af glycanernes labile karakter indeholder glycopeptid-PSM'er typisk en bred vifte af glycan-associerede fragmenter, der, hvis de ikke tages i betragtning, vil påvirke psm'ernes scoring negativt. For at løse dette problem og muliggøre mere dybtgående identifikation af glycopeptider kan glycanoplysningerne opnået gennem åben søgning efterfølgende bruges til at informere glycanfokuserede søgninger (figur 2B). På denne måde kan åben søgning kombineret med manuel bestemmelse af glycan-associerede fragmenter bruges til at forbedre kvaliteten og mængden af glycopeptider, der er tildelt i prøver (figur 5). Selvom forfining af glycopeptidsøgningsparametre udføres manuelt med aktuelle versioner af værktøjer, såsom MSfragger, er det sandsynligt, at når feltet modnes, vil disse trin blive udført på en automatiseret måde. Undersøgelser har allerede vist beregningsmæssige tilgange til at identificere gentagne ioner med lav molekylvægt forbundet med specifikke PTM'er69 samt strategier til identifikation af oxoniumioner og gentagne Y-ion-masser forbundet med ukendte glycopeptider76. Det er således sandsynligt, at disse trin vil blive indarbejdet i nye iterationer af værktøjer som FragPipe, hvilket gør det endnu lettere at identificere tidligere ukendte glykosyleringshændelser inden for bakterielle og eukaryote prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
N.E.S er støttet af et Australian Research Council Future Fellowship (FT200100270) og et ARC Discovery Project Grant (DP210100362). Vi takker Melbourne Mass Spectrometry and Proteomics Facility fra Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute for adgang til MS-instrumentering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 G Kel-F Hub point style 3 | Hamilton company | hanc90514 | |
| 2-Chloroacetamide | Sigma Aldrich Pty Ltd | C0267-100G | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich Pty Ltd | 34851-4L | |
| Ammonium hydroxide (28%) | Sigma Aldrich Pty Ltd | 338818-100ML | |
| BCA Protein Assay Reagent A | Pierce | 23228 | |
| BCA Protein Assay Reagent B | Pierce | 23224 | |
| C8 Empore SPE | Sigma Aldrich Pty Ltd | 66882-U | An alterative vendor for C8 material is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/) |
| Formic acid | Sigma Aldrich Pty Ltd | 5.33002 | |
| Isopropanol | Sigma Aldrich Pty Ltd | 650447-2.5L | |
| Methanol | Fisher Chemical | M/4058/17 | |
| SDB-RPS Empore SPE (Reversed-Phase Sulfonate) | Sigma Aldrich Pty Ltd | 66886-U | An alterative vendor for SDB-RPS is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/) |
| Sodium Deoxycholate | Sigma Aldrich Pty Ltd | D6750-100G | |
| ThermoMixer C | Eppendorf | 2232000083 | |
| trifluoroacetic acid | Sigma Aldrich Pty Ltd | 302031-10X1ML | |
| Tris 2-carboxyethyl phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich Pty Ltd | C4706-2G | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma Aldrich Pty Ltd | 252859-500G | |
| Trypsin/Lys-C protease mixture | Promega | V5073 | |
| Vacuum concentrator | Labconco | 7810040 | |
| ZIC-HILIC material | Merck | 1504580001 | Resin for use in single use SPE columns can be obtain by emptying a larger form column and using the free resin |
References
- Essentials of glycobiology. Varki, A., et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2015).
- Schaffer, C., Messner, P.
- Abu-Qarn, M., Eichler, J., Sharon, N. Not just for Eukarya anymore: Protein glycosylation in bacteria and archaea. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 544-550 (2008).
- Szymanski, C. M., Yao, R., Ewing, C. P., Trust, T. J., Guerry, P. Evidence for a system of general protein glycosylation in Campylobacter jejuni. Molecular Microbiology. 32 (5), 1022-1030 (1999).
- Koomey, M. O-linked protein glycosylation in bacteria: snapshots and current perspectives. Current Opinion in Structural Biology. 56, 198-203 (2019).
- Riley, N. M., Bertozzi, C. R., Pitteri, S. J. A pragmatic guide to enrichment strategies for mass spectrometry-based glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100029 (2020).
- Spiro, R. G. Protein glycosylation: nature, distribution, enzymatic formation, and disease implications of glycopeptide bonds. Glycobiology. 12 (4), 43-56 (2002).
- Hu, H., Khatri, K., Klein, J., Leymarie, N., Zaia, J. A review of methods for interpretation of glycopeptide tandem mass spectral data. Glycoconjugate Journal. 33 (3), 285-296 (2016).
- Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: Diversity, synthesis and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (7), 448-462 (2012).
- Bohm, M., et al. Glycosciences.DB: An annotated data collection linking glycomics and proteomics data (2018 update). Nucleic Acids Research. 47, 1195-1201 (2019).
- Kawano, S., Hashimoto, K., Miyama, T., Goto, S., Kanehisa, M. Prediction of glycan structures from gene expression data based on glycosyltransferase reactions. Bioinformatics. 21 (21), 3976-3982 (2005).
- McDonald, A. G., Tipton, K. F., Davey, G. P. A knowledge-based system for display and prediction of O-glycosylation network behaviour in response to enzyme knockouts. PLOS Computational Biology. 12 (4), 1004844 (2016).
- Eichler, J., Koomey, M. Sweet new roles for protein glycosylation in prokaryotes. Trends in Microbiology. 25 (8), 662-672 (2017).
- Scott, N. E., et al. Simultaneous glycan-peptide characterization using hydrophilic interaction chromatography and parallel fragmentation by CID, higher energy collisional dissociation, and electron transfer dissociation MS applied to the N-linked glycoproteome of Campylobacter jejuni. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 10 (2), (2011).
- Russo, T. A., et al. The K1 capsular polysaccharide of Acinetobacter baumannii strain 307-0294 is a major virulence factor. Infection and Immunity. 78 (9), 3993-4000 (2010).
- Szymanski, C. M., Wren, B. W.
- Imperiali, B. Bacterial carbohydrate diversity - a brave new world. Current Opinion in Chemical Biology. 53, 1-8 (2019).
- Caval, T., Buettner, A., Haberger, M., Reusch, D., Heck, A. J. R. Discrepancies between high-resolution native and glycopeptide-centric mass spectrometric approaches: A case study into the glycosylation of erythropoietin variants. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (8), 2099-2104 (2021).
- Caval, T., Heck, A. J. R., Reiding, K. R. Meta-heterogeneity: Evaluating and describing the diversity in glycosylation between sites on the same glycoprotein. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100010 (2020).
- Thomas, D. R., Scott, N. E.
- Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).
- Cao, W., et al. Recent advances in software tools for more generic and precise intact glycopeptide analysis. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. , (2021).
- Yu, A., et al.
- Reiding, K. R., Bondt, A., Franc, V., Heck, A. J. R. The benefits of hybrid fragmentation methods for glycoproteomics. Trends in Analytical Chemistry. 108, 260-268 (2018).
- Riley, N. M., Malaker, S. A., Driessen, M., Bertozzi, C. R. Optimal dissociation methods differ for N- and O-glycopeptides. Journal of Proteome Research. 19 (8), 3286-3301 (2020).
- Mao, Y., et al. Systematic evaluation of fragmentation methods for unlabeled and isobaric mass tag-labeled O-glycopeptides. Analytical Chemistry. 93 (32), 11167-11175 (2021).
- Lu, L., Riley, N. M., Shortreed, M. R., Bertozzi, C. R., Smith, L. M. O-Pair Search with MetaMorpheus for O-glycopeptide characterization. Nature Methods. 17 (11), 1133-1138 (2020).
- Choo, M. S., Wan, C., Rudd, P. M., Nguyen-Khuong, T. GlycopeptideGraphMS: Improved glycopeptide detection and identification by exploiting graph theoretical patterns in mass and retention time. Analytical Chemistry. 91 (11), 7236-7244 (2019).
- Maxwell, E., et al. GlycReSoft: a software package for automated recognition of glycans from LC/MS data. PLoS One. 7 (9), 45474 (2012).
- Ahmad Izaham, A. R., Scott, N. E. Open database searching enables the identification and comparison of bacterial glycoproteomes without defining glycan compositions prior to searching. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 19 (9), 1561-1574 (2020).
- Bern, M., Kil, Y. J., Becker, C. Byonic: Advanced peptide and protein identification software. Current Protocols in Bioinformatics. , Chapter 13, Unit 13.20 (2012).
- Na, S., Bandeira, N., Paek, E. Fast multi-blind modification search through tandem mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 11 (4), 010199 (2012).
- Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Error tolerant searching of uninterpreted tandem mass spectrometry data. Proteomics. 2 (10), 1426-1434 (2002).
- Craig, R., Beavis, R. C. TANDEM: Matching proteins with tandem mass spectra. Bioinformatics. 20 (9), 1466-1467 (2004).
- Ahrné, E., Nikitin, F., Lisacek, F., Müller, M. QuickMod: A tool for open modification spectrum library searches. Journal of Proteome Research. 10 (7), 2913-2921 (2011).
- Shortreed, M. R., et al. Global identification of protein post-translational modifications in a single-pass database search. Journal of Proteome Research. 14 (11), 4714-4720 (2015).
- Chick, J. M., et al. A mass-tolerant database search identifies a large proportion of unassigned spectra in shotgun proteomics as modified peptides. Nature Biotechnology. 33 (7), 743-749 (2015).
- Roushan, A., et al. Peak filtering, peak annotation, and wildcard search for glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100011 (2020).
- Chi, H., et al. Comprehensive identification of peptides in tandem mass spectra using an efficient open search engine. Nature Biotechnology. , (2018).
- Bittremieux, W., Laukens, K., Noble, W. S. Extremely fast and accurate open modification spectral library searching of high-resolution mass spectra using feature hashing and graphics processing units. Journal of Proteome Research. 18 (10), 3792-3799 (2019).
- Polasky, D. A., Yu, F., Teo, G. C., Nesvizhskii, A. I. Fast and comprehensive N- and O-glycoproteomics analysis with MSFragger-Glyco. Nature Methods. 17 (11), 1125-1132 (2020).
- Harding, C. M., et al. Acinetobacter strains carry two functional oligosaccharyltransferases, one devoted exclusively to type IV pilin, and the other one dedicated to O-glycosylation of multiple proteins. Molecular Microbiology. 96 (5), 1023-1041 (2015).
- Iwashkiw, J. A., et al. Identification of a general O-linked protein glycosylation system in Acinetobacter baumannii and its role in virulence and biofilm formation. PLoS Pathogens. 8 (6), 1002758 (2012).
- Scott, N. E., et al. Diversity within the O-linked protein glycosylation systems of Acinetobacter species. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 13 (9), 2354-2370 (2014).
- Kenyon, J. J., Hall, R. M. Variation in the complex carbohydrate biosynthesis loci of Acinetobacter baumannii genomes. PLoS One. 8 (4), 62160 (2013).
- Lees-Miller, R. G., et al. A common pathway for O-linked protein-glycosylation and synthesis of capsule in Acinetobacter baumannii. Molecular Microbiology. 89 (5), 816-830 (2013).
- Iacono, M., et al. Whole-genome pyrosequencing of an epidemic multidrug-resistant Acinetobacter baumannii strain belonging to the European clone II group. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (7), 2616-2625 (2008).
- Hamidian, M., et al. Insights from the revised complete genome sequences of Acinetobacter baumannii strains AB307-0294 and ACICU belonging to global clones 1 and 2. Microbial Genomics. 5 (10), 000298 (2019).
- Farrugia, D. N., et al. The complete genome and phenome of a community-acquired Acinetobacter baumannii. PLoS One. 8 (3), 58628 (2013).
- Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
- Batth, T. S., et al. Protein aggregation capture on microparticles enables multipurpose proteomics sample preparation. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 18 (5), 1027-1035 (2019).
- HaileMariam, M., et al. S-Trap, an ultrafast sample-preparation approach for shotgun proteomics. Journal of Proteome Research. 17 (9), 2917-2924 (2018).
- Smith, P. K., et al.
- Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
- Harney, D. J., et al. Proteomic analysis of human plasma during intermittent fasting. Journal of Proteome Research. 18 (5), 2228-2240 (2019).
- Scott, N. E. Characterizing glycoproteins by mass spectrometry in Campylobacter jejuni. Methods in Molecular Biology. 1512, 211-232 (2017).
- Bian, Y., et al. Robust microflow LC-MS/MS for proteome analysis: 38000 runs and counting. Analytical Chemistry. 93 (8), 3686-3690 (2021).
- Diedrich, J. K., Pinto, A. F., Yates, J. R. Energy dependence of HCD on peptide fragmentation: stepped collisional energy finds the sweet spot. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (11), 1690-1699 (2013).
- Liu, M. Q., et al. pGlyco 2.0 enables precision N-glycoproteomics with comprehensive quality control and one-step mass spectrometry for intact glycopeptide identification. Nature Communications. 8 (1), 438 (2017).
- Hinneburg, H., et al. The art of destruction: Optimizing collision energies in quadrupole-time of flight (Q-TOF) instruments for glycopeptide-based glycoproteomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (3), 507-519 (2016).
- Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , http://www.r-project.org/index.html (2020).
- Brademan, D. R., Riley, N. M., Kwiecien, N. W., Coon, J. J. Interactive peptide spectral annotator: A versatile web-based tool for proteomic applications. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 18, 193-201 (2019).
- Russo, T. A., et al. The K1 capsular polysaccharide from Acinetobacter baumannii is a potential therapeutic target via passive immunization. Infection and Immunity. 81 (3), 915-922 (2013).
- Senchenkova, S. N., et al. Structure of the capsular polysaccharide of Acinetobacter baumannii ACICU containing di-N-acetylpseudaminic acid. Carbohydrate Research. 391, 89-92 (2014).
- Domon, B., Costello, C. E. A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentations in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates. Glycoconjugate Journal. 5 (4), 397-409 (1988).
- Harvey, D. J., Dwek, R. A., Rudd, P. M. Determining the structure of glycan moieties by mass spectrometry. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 12, Unit 12.7 (2006).
- Medzihradszky, K. F., Kaasik, K., Chalkley, R. J. Characterizing sialic acid variants at the glycopeptide level. Analytical Chemistry. 87 (5), 3064-3071 (2015).
- Kelstrup, C. D., Frese, C., Heck, A. J., Olsen, J. V., Nielsen, M. L. Analytical utility of mass spectral binning in proteomic experiments by SPectral Immonium Ion Detection (SPIID). Molecular & Cellular Proteomics:MCP. 13 (8), 1914-1924 (2014).
- Ahmad Izaham, A. R., et al. What are we missing by using hydrophilic enrichment? Improving bacterial glycoproteome coverage using total proteome and FAIMS analyses. Journal of Proteome Research. 20 (1), 599-612 (2021).
- Neue, K., Mormann, M., Peter-Katalinic, J., Pohlentz, G. Elucidation of glycoprotein structures by unspecific proteolysis and direct nanoESI mass spectrometric analysis of ZIC-HILIC-enriched glycopeptides. Journal of Proteome Research. 10 (5), 2248-2260 (2011).
- Mysling, S., Palmisano, G., Hojrup, P., Thaysen-Andersen, M. Utilizing ion-pairing hydrophilic interaction chromatography solid phase extraction for efficient glycopeptide enrichment in glycoproteomics. Analytical Chemistry. 82 (13), 5598-5609 (2010).
- Escobar, E. E., et al. Precision mapping of O-Linked N-acetylglucosamine sites in proteins using ultraviolet photodissociation mass spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 142 (26), 11569-11577 (2020).
- Madsen, J. A., et al. Concurrent automated sequencing of the glycan and peptide portions of O-linked glycopeptide anions by ultraviolet photodissociation mass spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (19), 9253-9261 (2013).
- Lysiak, A., Fertin, G., Jean, G., Tessier, D. Evaluation of open search methods based on theoretical mass spectra comparison. BMC Bioinformatics. 22, 65 (2021).
- Pabst, M., et al. A general approach to explore prokaryotic protein glycosylation reveals the unique surface layer modulation of an anammox bacterium. ISME Journal. , (2021).
