Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

היישום של גישות מבוססות חיפוש פתוח לזיהוי של Acinetobacter baumannii O מקושר Glycopeptides

Published: November 2, 2021 doi: 10.3791/63242
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, The University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

חיפוש פתוח מאפשר זיהוי של גליקופפטידים מעוטרים בקומפוזיציות גליקאן שלא היו ידועות קודם לכן. בתוך מאמר זה, גישה יעילה לביצוע חיפוש פתוח וחיפושי גליקופפטיד ממוקדי גליקן הבאים מוצגים עבור דגימות חיידקים באמצעות Acinetobacter baumannii כמודל.

Abstract

גליקוסילציה של חלבון מוכרת יותר ויותר כשינוי נפוץ בתוך אורגניזמים חיידקיים, התורמת לפיזיולוגיה פרוקריוטית ולזיהום אופטימלי של מינים פתוגניים. בשל כך, יש עניין גובר באפיון גליקוסילציה חיידקית וצורך בכלים אנליטיים בעלי תפוקה גבוהה כדי לזהות אירועים אלה. למרות פרוטאומיקה מלמטה למעלה בקלות מאפשרת את הדור של נתוני גליקופפטיד עשירים, הרוחב והמגוון של הגליקנים שנצפו במינים פרוקריוטים הופכים את הזיהוי של אירועי גליקוזילציה חיידקית למאתגר ביותר.

באופן מסורתי, הקביעה הידנית של הרכבי הגליקנים בערכות נתונים פרוטאומיות חיידקיות הפכה את זה לניתוח מותאם אישית במידה רבה המוגבל למומחים ספציפיים לשטח. לאחרונה, גישות פתוחות המבוססות על חיפוש התגלו כחלופה רבת עוצמה לזיהוי שינויים לא ידועים. על ידי ניתוח התדירות של שינויים ייחודיים שנצפו על רצפי פפטיד, טכניקות חיפוש פתוחות מאפשרות זיהוי של גליקנים נפוצים המחוברים לפפטידים בתוך דגימות מורכבות. מאמר זה מציג זרימת עבודה יעילה לפרשנות וניתוח של נתונים גליקופרוטומיים, המדגים כיצד ניתן להשתמש בטכניקות חיפוש פתוחות לזיהוי גליקופפטידים חיידקיים ללא ידע מוקדם על הרכבי הגליקנים.

באמצעות גישה זו, גליקופפטידים בתוך דגימות ניתן לזהות במהירות כדי להבין הבדלי גליקוסילציה. באמצעות Acinetobacter baumannii כמודל, גישות אלה מאפשרות השוואה של קומפוזיציות גליקאניות בין זנים וזיהוי של גליקופרוטאין חדשניים. יחד, עבודה זו מדגימה את הרבגוניות של טכניקות חיפוש מסד נתונים פתוחות לזיהוי גליקוסילציה חיידקית, מה שהופך את האפיון של גליקופרוטומים מגוונים אלה קל יותר מאי פעם.

Introduction

גליקוסילציה של חלבון, תהליך הצמדת פחמימות למולקולות חלבון, הוא אחד השינויים הנפוצים ביותר לאחר התרגום (PTMs) בטבע 1,2. בכל תחומי החיים התפתח מגוון של מכונות מורכבות המוקדשות לדור הגליקופרוטאינים המשפיעים על מספר עצום של פונקציות תאיות 1,3,4,5. בעוד גליקוסילציה חלבון מתרחשת על מגוון של חומצות אמינו 6,7, N מקושר ו O הקשורים Glycosylation אירועים הם שתי צורות דומיננטיות שנצפו בטבע. גליקוסילציה הקשורה ל- N כרוכה בחיבור של גליקנים לאטום חנקן של שאריות אספרגין (Asn), ואילו בגליקוזילציה המקושרת ל- O, הגליקנים מחוברים לאטום חמצן של סרין (Ser), תרונין (Thr) או טירוזין (Tyr) שאריות7. למרות הדמיון בשאריות הממוקדות על ידי מערכות גליקוסילציה, ההבדלים בתוך הגליקנים המחוברים לחלבונים גורמים לגליקוזילציה להיות המעמד המגוון ביותר מבחינה כימית של PTMs שנמצא בטבע.

בעוד שלמערכות הגליקוסילציה האוקריוטית יש מגוון גליקן, מערכות אלה מוגבלות בדרך כלל במספר הפחמימות הייחודיות המנוצלות. המגוון המתקבל נובע מהאופן שבו פחמימות אלה מסודרות בגליקנים 8,9,10,10,11,12. לעומת זאת, מינים חיידקיים וארכאיים בעלי מגוון גליקנים כמעט בלתי מוגבל בשל המערך העצום של סוכרים ייחודיים הנוצרים בתוך מערכות אלה 2,10,13,14,15,16,17. הבדלים אלה במגוון הגליקנים שנצפו בתחומי החיים מייצגים אתגר אנליטי משמעותי לאפיון ולזיהוי של אירועי גליקוזילציה. עבור גליקוסילציה אאוקריוטית, היכולת לצפות קומפוזיציות גליקן הקל על העניין הגובר בגליקוביולוגיה; עם זאת, אותו הדבר אינו נכון לגבי גליקוזיליה חיידקית, אשר עדיין מוגבלת במידה רבה למחקר על ידי מעבדות מיוחדות. ככל שהנגישות של מכשור ספקטרומטריית המסה (MS) גדלה במדעי הביולוגיה, גישות מבוססות טרשת נפוצה הן כעת השיטה העיקרית לניתוח גליקופרוטומי.

טרשת נפוצה התגלתה ככלי המובהק לאפיון הגליקוזילציה, עם גישות מלמעלה למטה ומלמטה למעלה המשמשות כיום לאפיון גליקופרוטאינים6. בעוד פרוטאומיקה מלמעלה למטה משמשת להערכת דפוסי גליקוסילציה גלובליים של חלבונים ספציפיים18,19, גישות מלמטה למעלה משמשות כדי לאפשר אפיון ספציפי לגליקן של גליקופפטידים, אפילו מתערובות מורכבות 6,20,21,22,23. לניתוח של גליקופפטידים, הדור של מידע פיצול אינפורמטיבי חיוני לאפיון אירועי גליקוסילציה24,25. מגוון גישות פיצול נגישות כעת באופן שגרתי במכשירים, כולל דיסוציאציה מבוססת התנגשות מבוססת התנגשות מבוססת תהודה יון (IT-CID), דיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות מסוג קרן (CID) ודיסוציאציה של העברת אלקטרונים (ETD). לכל גישה יש עוצמות וחולשות שונות לניתוח גליקופפטידים25,26, עם התקדמות משמעותית בעשור האחרון ביישום גישות פיצול אלה לניתוח גליקוסילציה 6,20. עם זאת, עבור ניתוח גליקוסילציה חיידקי, המגבלה הקריטית לא הייתה היכולת לפצל גליקופפטידים אלא חוסר היכולת לחזות את הרכבי הגליקאן הפוטנציאליים בתוך דגימות. בתוך מערכות אלה, הטבע הלא ידוע של גלייקנים חיידקיים מגוונים מגביל את הזיהוי של גליקופפטידים, אפילו עם כלי חיפוש ממוקדי גליקוסילציה כיום נפוץ לניתוח של גליקופפטידים אוקריוטיים, כגון O-Pair27, GlycopeptideGraphMS28, ו GlycReSoft29. כדי להתגבר על בעיה זו, נדרשת שיטת חיפוש חלופית, עם שימוש בכלי חיפוש פתוחים המתעוררים כגישה רבת עוצמה לחקר הגליקוזילציה החיידקית30.

חיפוש פתוח, הידוע גם בשם חיפוש עיוור או כללי, מאפשר זיהוי של פפטידים עם PTMs לא ידועים או בלתי צפויים 21,30,31,32. חיפושים פתוחים משתמשים במגוון טכניקות חישוביות, כולל חיפושי שינויים שאצרו, חיפושים במסדי נתונים מרובי שלבים או חיפוש סובלני בעל מסה רחבה 33,34,35,35,36,37. למרות שלחיפוש פתוח יש פוטנציאל גדול, השימוש בו בדרך כלל הופרע על ידי העלייה המשמעותית בזמני הניתוח ואובדן הרגישות לגילוי פפטידים שלא השתנו בהשוואה לחיפושים מוגבלים31,32. הירידה בזיהוי התאמות פפטיד-ספקטרלי (PSMs) שלא השתנו היא תוצאה של שיעורי PSM חיוביים כוזבים הקשורים לטכניקות אלה, הדורשים סינון קפדני מוגבר כדי לשמור על שיעורי הגילוי השגויים הרצויים (FDRs)33,34,35,35,36,37 . לאחרונה, מספר כלים הפכו זמינים המשפרים באופן משמעותי את הנגישות של חיפוש פתוח, כולל Byonic31,38, Open-pFind39, ANN-SoLo40, ו- MSFragger 21,41. כלים אלה מאפשרים זיהוי חזק של אירועי גליקוסילציה על ידי צמצום משמעותי של זמני הניתוח ויישום גישות לטיפול בהרכבי גליקן הטרוגניים.

מאמר זה מציג שיטה יעילה לזיהוי גליקופפטידים חיידקיים על ידי חיפוש פתוח, באמצעות פתוגן נוסוקומי שלילי גרם, Acinetobacter baumannii, כמודל. A. baumannii בעל מערכת גליקוזילטציה מקושרת O משומרת האחראית לשינוי של מצע חלבונים מרובים, המכונה מערכת גליקוזילציה חלבון PglL 42,43,44. בעוד חלבונים דומים מיועדים לגליקוזילציה בין זנים, מערכת הגליקוזילציה PglL משתנה מאוד בשל הביוסינתזה של הגליקן המשמש לגליקוזילציה של חלבון המופקת מהלוקוס של הקפסולה (המכונה K-locus)44,45,46. התוצאה היא גליקנים מגוונים (הידוע גם בשם K-יחידה), נגזר יחיד או מוגבל K-יחידות פולימריות, מתווסף מצע חלבון 30,44,46. במסגרת עבודה זו, השימוש בכלי החיפוש הפתוח, MSfragger, בתוך התוכנה FragPipe, משמש לזיהוי גליקנים על פני זני A. baumannii. על ידי שילוב של חיפוש פתוח ואוצרות ידנית, ניתן לבצע "חיפושים ממוקדי גליקנים" כדי לשפר עוד יותר את הזיהוי של גליקופפטידים חיידקיים. יחד, גישה זו לזיהוי רב-שלבי מאפשרת זיהוי של גליקופפטידים ללא ניסיון רב באפיון אירועי גליקוסילציה חדשניים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: ניתן לחלק את ההכנה והניתוח של דגימות גליקופפטיד חיידקיות לארבעה חלקים (איור 1). עבור מחקר זה, הגליקוזילציה של שלושה זני A. baumannii רצף הוערך (טבלה 1). מסדי נתונים של Proteome FASTA של כל אחד מהזנים האלה נגישים באמצעות Uniprot. עיין בטבלה 2 עבור הרכב המאגרים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. הכנת דגימות חלבון לניתוח פרוטאומי

  1. בידוד של דגימות פרוטאום של עניין
    1. אם אתם משתמשים בתאים שלמים, ודאו שהתאים נשטפו עם תמיסת מלח עם מאגר פוספט (PBS) להסרת מזהמי חלבון פוטנציאליים הנמצאים בתקשורת. יש להקפיא תאים שלמים לאחר הכביסה ולאחסן אותם בטמפרטורה של -80 °C (80 °F) עד הצורך.
    2. אם נעשה שימוש בדגימות מופרדות (כגון תכשירי ממברנה), ודא כי הריאגנטים המשמשים לא יפריעו לניתוח כרומטוגרפיה נוזלית במורד הזרם MS (LC-MS)50.
    3. אם נעשה שימוש בחומרי ניקוי, כגון נתרן דודציל-סולפט (SDS), טריטון X-100, NP-40 או לאורואילסארקוסין, הסר את חומרי הניקוי האלה באמצעות משקעי אצטון, שיטות הכנת מדגם SP351, או עמודות ניקוי פרוטאומיות מסחריות כגון S-traps52. לחלופין, החליפו חומרי ניקוי לא תואמים בחומר ניקוי תואם MS או נשלף כגון נתרן דאוקסיכולט (SDC) או אוקטיל גלוקירנוזיד.
    4. ודא שכל כלי הפלסטיק וכלי הזכוכית שישמשו להכנת מדגם לא שועבדו אוטומטית. כלי זכוכית אוטומטיים ופלסטיק מזוהמים בדרך כלל בכבדות עם תרכובות משקל מולקולריות קטנות, כגון פולימרים, אשר מזוהים בקלות בתוך MS.
  2. Solubilization של דגימות תאים שלמים
    1. Resuspend ~ 10 מ"ג של תאים שטופים, קפואים הצמד ב 200 μL של מאגר תמוגה נתרן מוכן טרי (מאגר תמוגה SDC: 4% SDC ב 100 mM Tris, pH 8.5).
      הערה: ניתן להוסיף מעכבי פרוטאז למאגר תמוגה SDC כדי להגביל את התדרדרות החלבון.
    2. מרתיחים את הדגימות במשך 10 דקות ב 95 °C (95 ° C עם רועד (2000 סל"ד על thermomixer), ולאחר מכן להשאיר על קרח במשך 10 דקות. חזור על תהליך זה פעמיים כדי להבטיח תמוגה יעילה solubilization של הדגימות.
      הערה: ניתן לאחסן דגימות לטווח ארוך בשלב זה בטמפרטורה של -80 °C (80 °F). אם מאוחסן, resolubilize על ידי חימום ב 95 °C (50 °F) לפני עיבוד נוסף.
  3. לכמת ריכוזי חלבון מדגם באמצעות חומצה ביצ'נצ'ונינית (BCA) בדיקת חלבון53. אחסן דגימות על קרח תוך התחייבות לכימות כדי להגביל את התדרדרות החלבון.
    הערה: עבור ניתוח פרוטאום כולל, 20-100 מיקרוגרם של חלבון הוא יותר ממספיק עבור ננו LC-MS, אשר בדרך כלל דורש פחות מ 2 מיקרוגרם של חלבון תקציר לכל ניתוח. הכנת פפטיד עודף מאפשרת ניתוח לשכפל או שבירה נוספת אם כיסוי פרוטאומי עמוק נדרש. לניתוח מבוסס העשרה גליקופפטיד באמצעות כרומטוגרפיה אינטראקציה הידרופילית (HILIC), 100-500 מיקרוגרם של חלבון נדרש.
  4. הפחתה ואלקיאט של דגימות.
    1. הוסף 1/10th את הנפח של מאגר 10x הפחתה/אלקילציה (100 mM Tris 2-carboxyethyl phosphine הידרוכלוריד; 400 מ"מ 2-כלורואצטאמיד ב 1 M Tris, pH 8.5) כדי דגימות לריכוז סופי של 1x ודגימות דגירה בחושך במשך 30 דקות ב 45 °C (45 °F) עם רעד ב 1,500 סל"ד.
      הערה: בדוק את ה- pH של מאגר הפחתה/אלקילציה של 10x כדי להבטיח pH של כ 7.0-8.0 לפני הוספה לדגימות, כמו pH נמוך יותר יגרום SDC לזרז.
  5. בקצרה לסובב את הדגימות ולהוסיף את הפרוטאזים טריפסין / Lys-C (~ 10 μL, resuspended ב 100 mM Tris, pH 8.5) עבור פרוטאז סופי: יחס חלבון של 1:100. לדגור על התקצירים לילה ב 37 °C (50 °F) עם רעד ב 1,500 סל"ד (עד 18 שעות). כדי להבטיח עיכול מלא של חלבונים, יש להשתמש בפרוטאז טריפסין/ליס-C:יחס חלבון של 1:50 עד 1:200.
  6. להרוות מעכל על ידי הוספת 1.25 כרכים של 100% איזופרופנול לדגימות. מערבולת את הדגימות במשך 1 דקה לערבב לזמן קצר לסובב אותם.
    הערה: ניתן לאחסן דוגמאות בטמפרטורה של -20 °C (60 °F) לעיבוד נוסף מאוחר יותר.
  7. החמצת הדגימות על ידי הוספת 0.115 כרכים של 10% חומצה טריפלואורואצטית (TFA; ריכוז סופי של ~ 1% TFA), מערבולת את הדגימות, ולסובב אותם לזמן קצר למטה.

2. עיבוד דגימות פרוטאום

  1. ניקוי פפטיד של דגימות פרוטאום
    1. הכן אחד styrenedivinylbenzene-הפוך שלב סולפונט (SDB-RPS) עצירה ו- go-extraction (שלב) קצה עבור כל מדגם כפי שתואר בעבר54.
      1. אמפירית, לכריכת 50 מיקרוגרם של פפטיד, excise שלושה דיסקים SDB-RPS מקרום SDB-RPS47 מ"מ 2 באמצעות מחט קהה (14 גרם). עבור כמויות פפטיד גדולות יותר, להגדיל את מספר הדיסקים בהתאם.
    2. לפני השימוש בעצות שלב SDB-RPS, הכן את הטיפים על-ידי הוספה רציפה של לפחות עשרה כרכים של המיטות של המאגרים הבאים וסובב את החיץ דרך העמודה על ידי צנטריפוגה (25 °C(25 °C, 3 דקות, 500 × g) או על ידי דחיפת החיץ דרך העמודה על ידי הפעלת לחץ בעדינות באמצעות מזרק.
      1. רטוב את הטיפים עם 150 μL של 100% אצטוניטריל.
      2. לשטוף את הטיפים עם 150 μL של 30% מתנול, 1% TFA ב 18.2 MΩ H2O.
      3. שיווי משקל את הטיפים עם 150 μL של 90% איזופרופנול, 1% TFA מאוזן עם 18.2 MΩ H2O.
    3. טען את הדגימות (המכיל 50% איזופרופנול, 1% TFA) על טיפים שלב SDB-RPS על ידי צנטריפוגה (25 °C (25 °C (3 דקות, 500 × גרם) או על ידי הפעלת לחץ בעדינות באמצעות מזרק.
    4. לשטוף את טיפים שלב SDB-RPS עם המאגרים הבאים על ידי צנטריפוגה (25 °C ,3 דקות, 500 × גרם) או על ידי הפעלת לחץ בעדינות באמצעות מזרק.
      הערה: ניתן להשתמש בשטיפות נוספות או במאגרים חלופיים להסרת מזהמים שאינם פפטידים, כגון שימוש באתיל אצטט במקום איזופרופנול55.
      1. לשטוף את הטיפים עם 150 μL של 90% איזופרופנול, 1% TFA.
      2. לשטוף את הטיפים עם 150 μL של 1% TFA ב 18.2 MΩ H2O.
    5. לרומם את הפפטידים מן טיפים שלב SDB-RPS עם 150 μL של 5% אמוניום הידרוקסיד ב 80% אצטוניטריל על ידי צנטריפוגה או על ידי הפעלת לחץ בעדינות באמצעות מזרק. לאסוף את הדגימות בצינורות בודדים.
      הערה: הכן 5% אמוניום הידרוקסיד ב 80% אצטוניטריל במיכל פלסטיק מיד לפני השימוש בתוך מכסה המנוע אדים.
    6. יבש את הפפטידים המנופחים על ידי צנטריפוגת ואקום בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.
      הערה: אם מתחייבים להעשרת HILIC, ניתן להסיר בשלב זה 1-10% מהפליטים, לייבש אותם ולהשתמש בהם כפקדי קלט פרוטאום כוללים.
  2. העשרת דגימות גליקופפטיד
    1. הכן Zwitterionic הידרופילית אינטראקציה הידרופילית כרומטוגרפיה נוזלית (ZIC-HILIC) טיפים שלב כפי שתואר בעבר54,56.
      1. בקצרה, יש לחתוך דיסק C8 אחד מקרום47 מ"מ 2 C8 באמצעות מחט קהה (14 גרם) ולארוז את הדיסק לתוך קצה P200 כדי ליצור פריט. הוסף כ 5 מ"מ של חומר ZIC-HILIC, resuspended ב 50% אצטוניטריל, 50% 18.2 MΩ H2O, על פריט על ידי החלת לחץ בעדינות באמצעות מזרק.
    2. לפני השימוש בטיפים של שלב ZIC-HILIC, מזג את השרף על-ידי הוספה רציפה של המאגרים הבאים והחלת לחץ בעדינות באמצעות מזרק.
      הערה: כדי להבטיח את שלמות שכבת המים המדומים על פני השטח של שרף ZIC-HILIC (נדרש להעשרת גליקופפטידים), השרף חייב תמיד להישאר רטוב. בעת שטיפת השרף, תמיד להשאיר ~ 10 μL של ממס מעל השרף ולהבטיח את השטיפות / דגימות הם pipetted ישירות לתוך ממס שיורית זה.
      1. שיווי משקל את השרף עם 20 כרכים במיטה (200 μL) של ZIC-HILIC elution מאגר (0.1% TFA ב 18.2 MΩ H2O).
      2. לשטוף את השרף עם 20 כרכים במיטה (200 μL) של חיץ הכנה ZIC-HILIC (95% אצטוניטריל ב 18.2 MΩ H2O).
      3. לשטוף את השרף עם 20 נפחי מיטה (200 μL) של ZIC-HILIC טעינה / חוצץ לשטוף (80% אצטוניטריל, 1% TFA מאוזן עם 18.2 MΩ H2O).
    3. Resuspend את הדגימות המעוכלות היבשות (משלב 2.1.6) במאגר הטעינה/שטיפה ZIC-HILIC לריכוז סופי של 4 מיקרוגרם/ μL (למשל, עבור 200 מיקרוגרם של פפטיד, resuspend ב 50 μL של ZIC-HILIC טעינה / מאגר לשטוף). מערבולת בקצרה במשך 1 דקה כדי להבטיח את הדגימות הם resuspended, ולהסתובב למטה במשך 1 דקה ב 2,000 × גרם ב 25 °C (80 °F).
    4. טען את דגימת הפפטיד המחודשת לעמודת ZIC-HILIC מותנית.
      1. לשטוף שלוש פעמים עם 20 נפחי מיטה (200 μL) של ZIC-HILIC טעינה / מאגר לשטוף (עבור 60 נפח המיטה שוטף בסך הכל) על ידי החלת בעדינות לחץ באמצעות מזרק.
      2. Elute glycopeptides עם 20 נפחי מיטה (200 μL) של חיץ ההמלטה ZIC-HILIC לתוך צינור 1.5 מ"ל על ידי החלה עדינה של לחץ באמצעות מזרק ולאחר מכן לייבש את המלט על ידי צנטריפוגת ואקום ב 25 °C (60 °F).

3. LC-MS של דגימות פרוטאום/גליקופפטיד מועשרות

  1. תוסיפו מחדש את הדגימות ב-Buffer A* (2% אצטוניטריל, 0.1% TFA) לריכוז סופי של 1 מיקרוגרם/μL (לדוגמה, עבור 50 מיקרוגרם של פפטיד, resuspend ב-50 μL של Buffer A*).
  2. טען את הדגימות על HPLC / UPLC יחד עם טרשת נפוצה כדי לאפשר הפרדה וזיהוי של גליקופפטידים.
    הערה: הפרמטרים עמודה, כולל קוטר פנימי, אורך, קצבי זרימה, סוג של שרף כרומטוגרפיה, וכמויות הזרקת פפטיד נדרש, צריך להיות ממוטב עבור ההתקנה האנליטית ואורך שיפוע לשמש; לקבלת דוגמה של אופן ביצוע אופטימיזציה של הגדרות אנליטיות, ראה57.
  3. נטר את איסוף נתוני הטרשת הנפוצה המתקבלים כדי להבטיח שהנתונים נאספים עם הפרמטרים הרצויים.
    הערה: לניתוח קומפוזיציה, פיצול CID מספיק. בשל תוספת של גליקנים גליקופפטידים, יוני גליקופפטיד נצפים בדרך כלל עם m / z גבוה יותר וצפיפות מטען נמוכה יותר מאשר פפטידים unglycosylated. כדי להבטיח שיונים אלה ניתנים לצפייה, אפשר טווח מסה MS1 בין 400 ל -2,000 מ '/z.
  4. יונים נבחרים של קטעים באמצעות CID, המבטיחים את האוסף של יוני שבר m/z נמוכים המכילים יוני אוקסוניום חשובים לאפיון הגליקנים.
    הערה: פיצול של גליקופפטידים באמצעות CID מושפע הן רצפי פפטיד וגליקן, כמו גם את האנרגיה להחיל במהלך פיצול 25,58,59. בעוד שניתן להשתמש במגוון אנרגיות התנגשות שונות, אסטרטגיה אופטימלית לפיצול גליקופפטידים היא שימוש באנרגיות התנגשות מדורגות המשלבות שימוש באנרגיות התנגשות מרובות 25,59,60.
  5. השתמש בשיטות פיצול חלופיות, אם הן זמינות, כגון ETD עבור לוקליזציה של האתר, או IT-CID כדי לסייע בקביעת קומפוזיציות הגליקנים.
    הערה: אף אחת מגישות הפיצול הללו אינה חיונית לניתוח קומפוזיציה, אך ניתן לאסוף אותה כדי לאפשר חקירה נוספת של גליקופפטידים בעלי עניין.

4. ניתוח של דגימות מועשרות פרוטאום/גליקופפטיד

  1. סינון מראש של קבצי נתונים כדי לאפשר חיפוש ב- FragPipe
    1. אם סריקות ETD או IT-CID נרכשו בתוך ערכות נתונים, סנן אירועי סריקה אלה מסנני נתונים אלה באמצעות MSConvert61 לפני החיפוש עם FragPipe.
      הערה: עבור פרמטרי החיפוש הפתוחים המתוארים להלן, נדרשים רק נתוני CID מסוג קרן.
  2. ביצוע חיפושים פתוחים ב- FragPipe
    1. פתח את FragPipe ולחץ על הכרטיסיה זרימת עבודה . בתפריט הנפתח של זרימת העבודה, בחר באפשרות פתח חיפוש ולחץ על הוסף קבצים כדי לייבא את קבצי הנתונים לחיפוש לתוך FragPipe (איור 2A).
    2. לחץ על הכרטיסיה מסד נתונים והפעל את מנהל ההורדות על-ידי לחיצה על הורד. הדבר מאפשר הורדה של מאגרי פרוטאום מ-Uniprot באמצעות מזהה פרוטאום של Uniprot. לחץ על האפשרות הוסף פתיונות ומזהמים במנהל ההורדות כדי לשלב חלבונים דמה ומזהמים במאגרי מידע.
    3. לקבלת סף FDR מחמיר יותר, לחץ על הכרטיסיה אימות ושנה את ערך המסנן והדוח מ - 0.01 ל - FDR הנדרש.
      הערה: הגדרות ברירת המחדל של FragPipe יבטיחו 1% רוזוולט ברמת החלבון.
    4. לחץ על הכרטיסיה MSfragger . בתוך התיבה התאמה שיא , הגדל את עמידות ההמונים של המבשר מ- 500 Da המוגדר כברירת מחדל ל - 2,000 Da כדי לאפשר זיהוי של שינויים גדולים (איור 2A).
    5. לחץ על הכרטיסיה הפעלה והגדר את מיקום היציאות של FragPipe. לחץ על לחצן הפעל כדי להתחיל בחיפוש.
  3. באמצעות PSMs המזוהים בין ערכות נתונים (הכלולות ביציאות psm.tsv מ- FragPipe), זהה גליקנים פוטנציאליים על-ידי התוויית התדירות של מסות דלתא שנצפתו בתוך ערכות נתונים (איור 3). צור התוויות מסה דלתא מיציאות MSfragger באמצעות סקריפטים R נגישים באמצעות גישת PRIDE PXD027820.
    הערה: עיבוד מינימלי של תוצאות החיפוש הפתוחות מתבצע בתוך סקריפטים אלה, שכן המטרה העיקרית של סקריפטים אלה היא לסייע בהדמיה של פרופילי מסה דלתא. חשוב לציין, התצפית על המוני דלתא שופעים בלבד אינה הוכחה לכך ששינוי הוא גליקן פוטנציאלי, שכן הקצאת מסות דלתא כגליקאנים דורשת ניתוח נוסף של אירועי MS2 המתאימים.
  4. כדי לאפשר אפיון של גליקופפטידים בתוך דגימות, להתמקד בזיהוי מסה דלתא בביטחון גבוה, המתאים למשימות עם hyperscores גבוה.
    1. כדי לסייע בהערכת ספקטרום הגליקופפטידים, השתמשו בכלי ביאור פפטיד, כגון ביאור פפטיד ספקטרליאינטראקטיבי 63, המאפשר הקצאה של יונים הקשורים לפפטיד בתוך ספקטרום, ומאפשר זיהוי ידני של היונים הקשורים לגליקן (איור 4).
      הערה: בתוך ערכות הנתונים המוצגות כאן, נקודות-על של >30 נחשבות לניקוד גבוה, שכן אלה תואמות את הציונים בתוך 50 האחוזים העליונים של כל הגליקופטידים המזוהים (איור 5).
  5. עם גליקופטידים בעלי ביטחון גבוה שהוקצו, זהה יונים הקשורים לגליקנים (איור 4) שנצפו בדרך כלל כדי לשפר את הזיהוי של גליקופפטידים.
    הערה: על-ידי שילוב יונים הקשורים לגליקן בחיפושים, המכונים חיפושים ממוקדי גליקן, ניתן לשפר את איכות משימות הגליקופפטידים.
    1. לחץ על הכרטיסיה MSfragger של FragPipe, שלב את מסות הדלתא הנחושות של הגליקנים שנצפו במקטעים שינויים משתנים והיסט מסה. הוסף מסות אלה על-ידי הקלדת ערכים למקטעים 'שינויים משתנים' ו'היסט מסה' עם מסות בודדות המופרדות באמצעות /. הוסף את גושי השברים הקשורים לגליקן של הגליקנים האלה למקטע מודים Glyco / Labile של MSFragger.
      הערה: איור 2B מתאר את המידע המרכזי הדרוש לחיפוש ממוקד גליקן בזן AB307-0294 של זן A. baumannii AB307-0294.
  6. העלה את כל נתוני הטרשת הנפוצה המשויכים למחקרים פרוטאומיים למאגרים פרוטאומיים מרכזיים כגון מאגרי PRIDE או MASSIVE.
    הערה: כל הנתונים המשויכים למחקר זה הופקדו במאגר הפרוטאומי PRIDE וניתן לגשת אליהם באמצעות גישת PRIDE: PXD027820.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כדי להמחיש את התועלת של חיפוש פתוח עבור ניתוח גליקופפטיד חיידקי, המגוון הכימי של glycans מקושר O בתוך שלושה זנים של A. baumannii-AB307-0294, ACICU, ו D1279779-הוערך. הגליקופרוטאומים המקושרים O משתנים מאוד בין זני A. baumannii כמו הגליקנים המשמשים לגליקוזילציה נגזרים מן loci כמוסה משתנה מאוד 44,45,46. מגוון כימי זה הופך את A. baumannii למערכת מודל אידיאלית למחקרי חיפוש פתוחים. בעוד הגליקופרוטאומים של שלושת הזנים לא הוערכו בעבר, מבני הקפסולה של שני זנים אלה, AB307-029464 ו- ACICU65, ידועים, עם הקפסולה של D1279779 עדיין לא הובהר.

בהתאם לקפסולה של AB307-0294, חיפוש פתוח של AB307-0294 חשף שתי מסות דלתא דומיננטיות, המקבילות ל- 648.25 Da ו- 692.28 Da (איור 3A). גושים אלה תואמים את מבני הקפסולה שנקבעו בעבר על ידי רוסו ואח ', -β-D-QuiNAc4NR-α-GlcNAc6OAc-α-d-GalNAcA, שם שאריות QuiNAc4NR תואמות 2,4-דיאמינו-2,4,6-טרידוקסי-גלוקוז, שונה עם 3-OH-butyrate או קבוצת אצטיל64. באופן דומה, כמוסת ACICU ידועה להיות מורכב tetrasaccharide K-יחידה, זוהה בעבר כמו Pse5Ac7Ac-β-D-Glc p-β-D-Gal p-β-D-Galp-NAc-, המקביל למסה חזויה של 843.31 Da65. מבנה קפסולה זה עולה בקנה אחד עם מסת הדלתא הנצפית ביותר בנתוני ACICU (איור 3B). לבסוף, ניתוח חיפוש פתוח של הזן D1279779 חשף את נוכחותם של מסות דלתא מרובות בקנה אחד עם 203.08, 794.31 ו 1588.62 Da (איור 3C). בעוד המסה 203.08 עולה בקנה אחד עם זה של שאריות HexNAc יחיד, 794.31 ו 1588.62 תואמים שינויים לא ידועים. יש לציין כי המסה 1588.62 הוא בדיוק כפול מזה של 794.31, מה שמרמז על פפטידים אלה מעוטרים עם גליקן K-יחידה dimers, כפי שנצפה בעבר בתוך גליקופרוטום Acinetobacter אחרים 30,44,46.

חלקות מסה דלתא מספקות דרך מהירה ויעילה להעריך את התדירות של שינויים שנצפו בתוך דגימות. עם זאת, עבור שינויים מורכבים, כגון גליקנים, נוכחות של מסת דלתא לבדה אינה מספקת את המידע כדי להגדיר את ההרכב המדויק של גליקן. כדי לסייע בקביעה של קומפוזיציות גליקנים, ניתן להשתמש בנתוני MS/MS שהתקבלו של PSMs המוקצים למסות דלתא ספציפיות. על ידי התמקדות במשימות גליקופפטיד בביטחון גבוה (ב- MSFragger המתאים ל- PSMs עם היפר-ציונים גבוהים), ניתן להשתמש בניתוח ידני כדי לאפיין עוד יותר את הגליקנים המנוצלים על ידי זן לגליקוזילציה של חלבון. יש לציין כי משימות פפטיד בביטחון גבוה מכילות בדרך כלל מידע גליקן חזק המאפשר קביעת קומפוזיציות גליקאניות המבוססות על יונים Y. מידע זה יכול לשמש כדי לזהות את השברים המתאימים שבהם הגליקנים נשארו מחוברים לפפטידים, כמו גם ליונים הקשורים ל- B ולאוקסוניום שימושיים להקצאת הגליקנים66. הנחיות מפורטות כיצד להקצות קומפוזיציות גליקן תוארו בעבר, וקוראים מומלץ להתייעץ הארווי et al.67. באמצעות כלים כגון ביאור ספקטרלי פפטיד אינטראקטיבי63, ניתן לזהות בקלות יונים הקשורים לפפטיד, המאפשרים למשתמשים לקבוע את זהות הגליקנים המצורפים לפפטידים.

באמצעות ביאור ספקטרלי פפטיד אינטראקטיבי, גליקופפטידים שזוהו על פני שלוש דגימות A. baumannii אלה הוערכו, חושף יונים פוטנציאליים הקשורים גליקן. קחו למשל את ספקטרום MS/MS של הגליקופטיד AB307-0294 SAGDQAASDIATATDNASAK, המעוטר בגליקנים 648.25 ו-692.28 Da (איור 4A,B); בתנאי פיצול דומים, היונים הקשורים לגליקאן דומים מאוד, אך משתנים במסה ב-44.02 Da. ניתוח היונים הגליקנים בתוך PSMs אלה מאפשר אישור כי גושי הדלתא שנצפו עבור הגליקופטידים האלה תואמים לטריסקפידים המכילים ארבע פחמימות שונות: dHexNAcNAc (228 Da), dHexNAcNBu (272 Da), HexNAcA (217 Da) ו- HexNAc (203 Da). יש לציין כי בעת הקצאת שברי גליקן, monosaccharides מרובים נוטים לאבד מים כאשר מקוטעים באמצעות CID. ניתן לראות זאת בגליקן של ACICU, שם מונוסכריד Pse5Ac7Ac (316 Da) מוביל ליצירת שני שברים בולטים הקשורים לגליקן: MH + 299.12 ו- 317.13, ההבדל במסה המקבילה למסה של מים (18.01 Da) (איור 4C).

בנוסף, כאשר מנתחים גליקנים חיידקיים, זה נפוץ להתבונן גושים מונו-סכריד בלתי צפויים המתאימים לסוכרים שלא נצפו בתוך אאוקריוטים. דוגמה לכך ניתן לראות בתוך PSMs גליקופפטיד של D1279779, שם ניתוח של מסת הדלתא השכיחה ביותר 794.31 Da חושף את נוכחותו של מונוסקופריד dHexNAc יוצא דופן (187 Da, שנצפה כ- MH + של 188.09, איור 4D), אשר נצפתה בעבר בתוך A. baumannii O מקושר glycans44. בעוד מדידות דיוק מסה גבוהה ואת ההתנהגות האופיינית של גליקנים כמו שינויים labile, אשר הולכים לאיבוד מעמוד השדרה פפטיד, יכול לסייע בקביעת הרכבים כימיים פוטנציאליים של גליקנים, מומלץ למזער את פרשנות יתר של נתוני MS. אם סטריאוכימיה של סוכרים ספציפיים או מידע קישור של גליקן אינה ידועה, מומלץ להשתמש במשימות אגוניסטיות מבניות, כולל התייחסות למונוסכרידים על ידי הכיתות הספציפיות שלהם. דוגמה לכך מתייחסת 203.08 שאריות Da כמו N-אצטילהקסוסאמינים (HexNAc) והימנעות מהקצאה של סוגי הצמדה. במידת הצורך, מומלץ להשתמש בטכניקות נוספות כדי להגדיר את הזהויות הכימיות המדויקות של שינוי לא ידוע, כגון שימוש בתהודה מגנטית גרעינית (NMR).

בעוד שגישות חיפוש פתוחות מאפשרות זיהוי מהיר של פפטידים שהשתנו, חשוב לציין כי גישת חיפוש זו יכולה להתעלם מגליקופטידים פוטנציאליים בתוך ערכות נתונים. בתוך חיפושים פתוחים, גליקופפטידים לא ניתן לזהות מספר סיבות, כולל מידע פיצול פפטיד מספיק או ענישה של הפפטיד שהוקצה עקב נוכחות של יונים מרובים שלא הוקצו בתוך האירוע MS2. זה האחרון נכון במיוחד עבור PSMs גליקופפטיד חיידקי, כמו ספקטרום אלה יכולים להכיל שברים הקשורים גליקן לא נחשב על ידי פרמטרי חיפוש פתוח ברירת מחדל. מכיוון שתכונות ללא תחרות משפיעות לרעה על הניקוד של PSMs, מזעור יונים ללא תחרות בתוך ספקטרום MS/MS מאפשר זיהוי של גליקופפטידים שלא נכללו בתחילה עקב סף הניקוד המינימלי הנשלט על-ידי FDR. כדי להתגבר על מגבלה זו, ניתן לשלב את ההמונים המוגדרים מהחיפושים הפתוחים (איור 3) ואת היונים הקשורים לגליקן המוגדרים באופן ידני (איור 4) בפרמטרי חיפוש כדי לשפר את הזיהוי של הגליקופטידים. חשוב לציין כי ניתן לזהות יונים אלה הקשורים לגליקן באופן ידני בהתבסס על קביעת דה נובו של הגליקן, ידע מוקדם של יוני אוקסוניום נפוצים44,68, או שימוש בכלים שיכולים ללכוד יונים חוזרים בתוך ספקטרום, כגון הכלי לזיהוי יון אימוניום ספקטרלי69,76.

כדי להדגים זאת, המוני שברי הגליקאן הלא טיפוסיים שזוהו באמצעות ניתוח חיפוש פתוח שולבו בפרמטרי החיפוש ב- MSFragger, וחיפוש ממוקד גליקן שנעשה (ההגדרות הממוקדות בגליקן עבור הזן AB307-0294 מוצגות באיור 2B). יש לציין כי כאשר גליקנים מרובים מתבצעים חיפוש יחד, יש לנקוט זהירות בבחירת יוני Y ומסות אבחון כדי להבטיח שהם משקפים במדויק את יוני שבר הקשורים לכל מסת דלתא. אמנם זה לא תמיד אפשרי עבור שילובים של Y ומסות אבחון שאינם בלעדיים זה לזה, כגון שברי הגליקנים 648.25 ו 692.28 של AB307-0294 (איור 4A,B), חיפוש ממוקד גליקן עדיין אפשרי, אם כי זה עשוי להשפיע על החוסן של תוצאות החיפוש. חיפושים ממוקדי גליקן הובילו לעלייה ניכרת במספר הכולל של PSMs גליקופפטיד שזוהו בכל שלושת זני A. baumannii, המקבילים לעלייה של 37% ב- ACICU, עלייה של 117% ב- AB307-0294 ועלייה של 363% ב- D1279779 (איור 5A-C). עבור אירועי טרשת נפוצה בודדים, הכללת מידע ספציפי לגליקן גורמת בדרך כלל לעלייה בתוך מעיין העל שנצפה, אם כי עלייה זו תלויה מאוד בגליקן (איור 5D,E). לכן, על ידי שיפור פרמטרי החיפוש באמצעות המוני הגליקנים שנחשפו באמצעות חיפוש פתוח ולאחר מכן שילוב מידע על שבר הגליקן שנאצר באופן ידני בחיפושים ממוקדים, ניתן לקבל ניתוח מפורט יותר של גליקופפטידים בתוך דגימות.

Figure 1
איור 1: סקירה כללית של השלבים המרכזיים בהכנה וניתוח של גליקופפטידים חיידקיים. הזיהוי המוצלח של גליקופפטידים חיידקיים תלוי ביצירת דגימות באיכות גבוהה המכילות גליקופפטידים. דגימות המכילות גליקופפטיד מנותחות לאחר מכן על ידי LC-MS, ולאחר מכן, גישות חיפוש פתוחות משמשות לזיהוי גליקופפטידים פוטנציאליים המבוססים על מסות דלתא ייחודיות. באמצעות אוצרות ידניים, גושי דלתא אלה יכולים להיות מזוהים כגליקאנים. לבסוף, כדי לשפר את הזיהוי של גליקופפטידים, מידע גליקן יכול להיות משולב בחיפושי מסד נתונים ממוקדי גליקן. קיצורים: LC-MS = כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב ספקטרומטריית מסה; OD = צפיפות אופטית; SDB-RPS = styrenedivinylbenzene-reverse-phase sulfonate; ZIC-HILIC = Zwitterionic הידרופילית אינטראקציה הידרופילית כרומטוגרפיה נוזלית; PSMs = משחקי פפטיד-ספקטרלי; CID = דיסוציאציה הנגרמת על ידי התנגשות; ETD = דיסוציאציה להעברת אלקטרונים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: מבט כולל על אופן ההפעלה של חיפוש פתוח וחיפושים ממוקדי גליקן ב- FragPipe. (A) ניתן להפוך חיפוש פתוח לזמין על-ידי טעינת זרימת העבודה הפתוחה בכרטיסיה זרימת עבודה של FragPipe. כדי לאפשר זיהוי של גליקנים שגודלם עולה על 500 Da, הגדל את חלון עמידות ההמונים של Precursor ל- 2,000 Da. (B) חיפושים ממוקדי גליקנים עבור גליקנים לא טיפוסיים דורשים הזנת מידע גליקן בכרטיסייה MSFragger כדי להגדיר את המסות הצפויות של השינויים ( במקטעים שינויים משתנים והיסט המוני ), יוני Y המשויכים לגליקנים אלה (ברשימת מיסות Y Ion של הגליקו/ Labile ), ויוני שבר הגליקאן בעלי המסה הנמוכה (לרשימת גושי שברי האבחון של המקטע גליקו/לאביל ). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: חלקות מסה דלתא של תוצאות חיפוש פתוחות עבור שלושת הזנים של Acinetobacter baumannii (AB307-0294, ACICU, ו- D1279779). בהתאם למגוון של loci הקפסולה, כל זן A. baumannii בעל פרופיל מסה דלתא ייחודי עם שינויים בולטים של יותר מ 140 Da בגודל, מסומן על ידי מסות הדלתא שנצפו. (A) בתוך חלקת המסה דלתא AB307-0294, ההמונים 648.25 ו 692.28 תואמים לשינויים בקנה אחד עם -β-d-QuiNAc4NR-α-GlcNAc6OAc-α-d-GalNAcA-, שבו QuiNAc4NR משתנה עם קבוצת 3-OH-butyrate או אצטיל64. (B) בתוך חלקת המסה דלתא ACICU, ההמונים 203.08 ו 843.31 תואמים לשינויים בקנה אחד עם HexNAc ו Pse5Ac7Ac-β-D-Glc p-β-D-Gal p-β-D-Gal p-NAc, בהתאמה65. (ג) בתוך חלקת מסת הדלתא D1279779, ההמונים 203.08, 794.31, ו 1588.62 תואמים HexNAc, HexNAc-217-187-187, ודימר של HexNAc-217-187-187-187. גושי דלתא שנבדקו באופן ידני ואושרו באיור 4 כגליקאנים שצוינו על ידי *. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: אפיון MS/MS של מסות דלתא שנצפו על פני שלושת הזנים של Acinetobacter baumannii. (א, ב)  AB307-0294, (C) ACICU, ו-(D) D1279779. ספקטרום ביאורים אינטראקטיביים בסיוע פפטיד ספקטרלי של גליקופפטידים מייצגים. עבור כל ספקטרום, יוני שבר הפפטיד מסומנים בכחול ואדום, ואילו היונים הקשורים לגליקן שהוקצו באופן ידני מסומנים בירוק. הגליקנים כבר ביאורים באמצעות המינוח סמל עבור Glycans עם HexNAc מסומן כריבוע, Hex כעיגול, ו monosaccharides לא טיפוסי מסומן כמו טרפזים עם המסה של הגליקן מסומן בטרפזים. קיצור: MS/ MS = ספקטרומטריית מסה דו-מושבית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5: השוואה בין גליקופפטידים שזוהו בזנים שונים של Acinetobacter baumannii באמצעות חיפוש פתוח לעומת חיפוש ממוקד גליקן. (א-ק) השוואה של תוצאות-על ומספר הקצאות PSM בתוך D1279779, ACICU ו- AB307-0294 באמצעות חיפוש פתוח וממוקד בגליקאן. (ד-פ) השוואה של אירועי MS2 בודדים שהוקצו לאותו רצף פפטידים באמצעות חיפושים פתוחים וממוקדים בגליקנים עבור D1279779, ACICU ו- AB307-0294. קיצור: PSM = משחק פפטיד-ספקטרלי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

א. באומן זנים תעודות זהות פרוטאום של Uniprot
AB307-0294 15 UP000006924
ACICU 47,48 UP0000088839
D1279779 49 UP000011860

טבלה 1. זן ומזהי פרוטאום Uniprot המשמשים במחקר זה.

שם מאגר הרכב מאגר / pH
מאגר A* 2% אצטוניטריל ב 18.2 MΩ H2O, 0.1% חומצה טריפלוארואצטית / pH 1.0
PBS 137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 8 מ"מ נה2HPO4, ו 2 מ"מ KH2PO4 / pH 7.4
מאגר הפחתה/אלקילציה 100 מ"מ טריס 2 קרבוקסיתיל פוספין הידרוכלוריד, 400 מ"ר 2-כלורואצטאמיד ב 1 M Tris / pH 7.5
מאגר ההרחבה של קצה השלב SDB-RPS 5% אמוניום הידרוקסיד ב 80% אצטוניטריל / pH 11
מאגר שיווי משקל של קצה שלב SDB-RPS 30% מתנול, 1% חומצה טריפלוארואצטית, ב 18.2 MΩ H2O / pH 1.0
SDB-RPS שלב קצה קצה שיווי משקל / מאגר לשטוף 90% איזופרופנול, 1% חומצה טריפלוארואצטית / pH 1.0
מאגר שטיפת קצה שלב SDB-RPS 1% חומצה טריפלוארואצטית ב 18.2 MΩ H2O / pH 1.0
מאגר תמוגה של SDC 4% SDC ב 100 mM טריס / pH 8.5
מאגר ההרחבה ZIC-HILIC 0.1% חומצה טריפלוארואצטית ב 18.2 MΩ H2O / pH 1.0
ZIC-HILIC טעינה / מאגר כביסה 80% אצטוניטריל, 1% חומצה טריפלוארואצטית ב 18.2 MΩ H2 O /pH 1.0
מאגר הכנה ZIC-HILIC 95% אצטוניטריל ב 18.2 MΩ H2O / pH 7.0

טבלה 2: הרכב המאגרים המשמשים במחקר זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

חיפוש פתוח הוא שיטה יעילה ושיטתית לזיהוי שינויים לא ידועים. בעוד זיהוי של גליקנים לא ידועים בתוך דגימות פרוטאום חיידקי היה באופן מסורתי התחייבות גוזלת זמן ומתמחה מבחינה טכנית, ההתפתחויות האחרונות של כלים כגון MSfragger21,41 ו Byonic31,38 עכשיו לאפשר זיהוי מהיר ויעיל של מסות דלתא לאפיון נוסף כמו גליקנים פוטנציאליים המצורפים פפטידים. חיפוש פתוח של דגימות פרוטאום סטנדרטיות ומועשרות בגליקופטיד יכול לזהות גליקופפטידים פוטנציאליים (איור 1). המשותף והשפע של גליקופפטידים בתוך הפרוטאום של מערכות חיידקים רבות להפוך את הזיהוי הישיר של שינויים אלה אפשרי ללא העשרת גליקופפטיד6. למרות גישות העשרה גליקופפטיד בדרך כלל עדיין ביצועים טובים יותר שיטות מבוססות nonnrichment עבור מערכות גליקוסילציה רבות70, ראוי לציין כי לא כל הגליקנים הם נוחים באותה מידה להעשרה71,72. עובדה זו צריכה להיחשב בעת קביעת הגישה המתאימה ביותר לזיהוי אירועי גליקוסילציה באמצעות חיפוש פתוח אחר מדגם ביולוגי נתון.

בעוד חיפוש פתוח מזהה ביעילות גליקנים שנצפו בתדירות גבוהה בתוך מדגם, זה נשאר לא יעיל בזיהוי אירועי גליקוסילציה המתרחשים לעתים רחוקות בתוך ערכות נתונים. במונחים מעשיים, כדי לזהות מסת דלתא ייחודית של גליקן, לפחות 10 PSMs עם מסת דלתא זהה חייבים להיות נוכחים בתוך דגימות. תדירות מינימלית זו מאפשרת להבחין בגליקן פוטנציאלי מעל הקצאות מסה דלתא ברקע (איור 3). בעוד קריטריון זה הוא מרוצה בדרך כלל על ידי מערכות גליקוסילציה כלליות מיקוד מצעים מרובים עבור גליקוסילציה, מערכות שבהן חלבון יחיד מיועד גליקוסילציה עשוי להיות פחות נוח לגישה זו. ככל שהמהירות והרגישות של מכשירי MS משתפרות, סביר להניח כי זה יאפשר יותר ויותר הערכה של אוכלוסיות גליקופפטידים בשפע נמוך יותר, אשר, בתורו, לשפר את האפקטיביות של גישות חיפוש פתוחות, בתנאי ספקטרום באיכות מספקת יכול להיווצר עבור גליקופורמים נדירים / נמוכים בשפע.

בעוד טרשת נפוצה מאפשרת זיהוי יעיל של גליקנים חדשניים, חשוב לציין כי תובנה זו לבדה מספקת לעתים רחוקות אפיון מבני מלא של גליקופפטידים / גליקנים, עם כלים כגון ספקטרוסקופיה NMR עדיין להיות קריטי לאפיון גליקן מלא. כפי שצוין כאן, טרשת נפוצה סיפקה אישור משלים של יחידות K שנקבעו בעבר באמצעות NMR מקפסולות מבודדות של A. baumannii ACICU ו AB307-029464,65. עם זאת, עבור הגליקנים העיקריים שזוהו ב- D1279779, רק מידע על המעמדות הפוטטיביים של מונוסכרידים בתוך הגליקנים האלה היה ניתן להקצאה עם טרשת נפוצה שלא סיפקה מידע על סוגי ההצמדה או על הסטריאוכימיה של יחידות סוכר אלה (איור 4). ככל ששיטות פיצול טרשת נפוצה חדשות הופכות לזמינות יותר, כגון פוטודיסוציאציה אולטרה סגולה73,74, אפיון מבני מפורט יותר של גליקופפטידים עשוי להיות אפשרי. עם זאת, יש להקפיד בעת הסקת קשרים או מידע סטריאוכימיה עם מכשור נוכחי. בנוסף לשיקולים אלה, לאחרונה הועלו שאלות לגבי התאמתם של פקדים מבוססי רוזוולט לחיפוש פתוח75. לכן, בעוד חיפוש פתוח הוא גישה רבת עוצמה, שיקולים אלה מדגישים את הצורך לנקוט בפרשנות של משימות גליקן המבוססות על מידע חיפוש פתוח בלבד.

בעוד שעבודה זו מדגימה כי חיפוש פתוח הוא גישה יעילה לזיהוי ללא פיקוח של גליקנים המשמשים לגליקוזילציה חיידקית, חיפוש פתוח לבדו מספק גישה רק לקבוצת משנה של כל הגליקופפטידים הכלולים בדגימות. בשל האופי המבולבל של הגליקנים, PSMs גליקופפטידים מכילים בדרך כלל מגוון רחב של קטעים הקשורים לגליקן, שאם לא נלקחו בחשבון, ישפיעו לרעה על הניקוד של PSMs. כדי להתגבר על בעיה זו ולאפשר זיהוי מעמיק יותר של גליקופפטידים, המידע הגליקאני המתקבל באמצעות חיפוש פתוח יכול לשמש לאחר מכן כדי ליידע חיפושים ממוקדי גליקנים (איור 2B). בדרך זו, ניתן להשתמש בחיפוש פתוח, יחד עם הקביעה הידנית של שברים הקשורים לגליקן, כדי לשפר את האיכות והכמות של הגליקופטידים המוקצים בתוך דגימות (איור 5). למרות עידון של פרמטרי חיפוש גליקופפטיד מתבצע באופן ידני עם גירסאות נוכחיות של כלים, כגון MSfragger, סביר להניח כי ככל שהשדה מתבגר, שלבים אלה ייעשו באופן אוטומטי. מחקרים כבר הדגימו גישות חישוביות לזיהוי יונים חוזרים במשקל מולקולרי נמוך הקשורים ל- PTMsספציפיים 69, כמו גם אסטרטגיות לזיהוי אוקסוניום-יונים ומסות Y-יון חוזרות הקשורות לגליקופטידים לא ידועים76. לכן, סביר להניח כי צעדים אלה ישולבו איטרציות חדשות של כלים כגון FragPipe, מה שהופך אותו אפילו קל יותר לזהות אירועי גליקוסילציה לא ידועים בעבר בתוך דגימות חיידקים ואאוקריוטים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים.

Acknowledgments

N.E.S נתמך על ידי מלגת עתיד של מועצת המחקר האוסטרלית (FT200100270) ומענק פרויקט ARC Discovery (DP210100362). אנו מודים לספקטרומטריית המסה של מלבורן ולמתקן הפרוטאומיקה של המכון למדע וביוטכנולוגיה Biotechnology Bio21 על הגישה למכשור טרשת נפוצה.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
14 G Kel-F Hub point style 3 Hamilton company hanc90514
2-Chloroacetamide Sigma Aldrich Pty Ltd C0267-100G
Acetonitrile Sigma Aldrich Pty Ltd 34851-4L
Ammonium hydroxide (28%) Sigma Aldrich Pty Ltd 338818-100ML
BCA Protein Assay Reagent A Pierce 23228
BCA Protein Assay Reagent B Pierce 23224
C8 Empore SPE Sigma Aldrich Pty Ltd 66882-U An alterative vendor for C8 material is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)
Formic acid Sigma Aldrich Pty Ltd 5.33002
Isopropanol Sigma Aldrich Pty Ltd 650447-2.5L
Methanol Fisher Chemical M/4058/17
SDB-RPS Empore SPE (Reversed-Phase Sulfonate) Sigma Aldrich Pty Ltd 66886-U An alterative vendor for SDB-RPS is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)
Sodium Deoxycholate Sigma Aldrich Pty Ltd D6750-100G
ThermoMixer C Eppendorf 2232000083
trifluoroacetic acid Sigma Aldrich Pty Ltd 302031-10X1ML
Tris 2-carboxyethyl phosphine hydrochloride Sigma Aldrich Pty Ltd C4706-2G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma Aldrich Pty Ltd 252859-500G
Trypsin/Lys-C protease mixture Promega V5073
Vacuum concentrator Labconco 7810040
ZIC-HILIC material Merck 1504580001 Resin for use in single use SPE columns can be obtain by emptying a larger form column and using the free resin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Essentials of glycobiology. Varki, A., et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2015).
  2. Schaffer, C., Messner, P. Emerging facets of prokaryotic glycosylation. FEMS Microbiology Reviews. 41 (1), 49-91 (2017).
  3. Abu-Qarn, M., Eichler, J., Sharon, N. Not just for Eukarya anymore: Protein glycosylation in bacteria and archaea. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 544-550 (2008).
  4. Szymanski, C. M., Yao, R., Ewing, C. P., Trust, T. J., Guerry, P. Evidence for a system of general protein glycosylation in Campylobacter jejuni. Molecular Microbiology. 32 (5), 1022-1030 (1999).
  5. Koomey, M. O-linked protein glycosylation in bacteria: snapshots and current perspectives. Current Opinion in Structural Biology. 56, 198-203 (2019).
  6. Riley, N. M., Bertozzi, C. R., Pitteri, S. J. A pragmatic guide to enrichment strategies for mass spectrometry-based glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100029 (2020).
  7. Spiro, R. G. Protein glycosylation: nature, distribution, enzymatic formation, and disease implications of glycopeptide bonds. Glycobiology. 12 (4), 43-56 (2002).
  8. Hu, H., Khatri, K., Klein, J., Leymarie, N., Zaia, J. A review of methods for interpretation of glycopeptide tandem mass spectral data. Glycoconjugate Journal. 33 (3), 285-296 (2016).
  9. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: Diversity, synthesis and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (7), 448-462 (2012).
  10. Bohm, M., et al. Glycosciences.DB: An annotated data collection linking glycomics and proteomics data (2018 update). Nucleic Acids Research. 47, 1195-1201 (2019).
  11. Kawano, S., Hashimoto, K., Miyama, T., Goto, S., Kanehisa, M. Prediction of glycan structures from gene expression data based on glycosyltransferase reactions. Bioinformatics. 21 (21), 3976-3982 (2005).
  12. McDonald, A. G., Tipton, K. F., Davey, G. P. A knowledge-based system for display and prediction of O-glycosylation network behaviour in response to enzyme knockouts. PLOS Computational Biology. 12 (4), 1004844 (2016).
  13. Eichler, J., Koomey, M. Sweet new roles for protein glycosylation in prokaryotes. Trends in Microbiology. 25 (8), 662-672 (2017).
  14. Scott, N. E., et al. Simultaneous glycan-peptide characterization using hydrophilic interaction chromatography and parallel fragmentation by CID, higher energy collisional dissociation, and electron transfer dissociation MS applied to the N-linked glycoproteome of Campylobacter jejuni. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 10 (2), (2011).
  15. Russo, T. A., et al. The K1 capsular polysaccharide of Acinetobacter baumannii strain 307-0294 is a major virulence factor. Infection and Immunity. 78 (9), 3993-4000 (2010).
  16. Szymanski, C. M., Wren, B. W. Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens. Nature Reviews Microbiology. 3 (3), 225-237 (2005).
  17. Imperiali, B. Bacterial carbohydrate diversity - a brave new world. Current Opinion in Chemical Biology. 53, 1-8 (2019).
  18. Caval, T., Buettner, A., Haberger, M., Reusch, D., Heck, A. J. R. Discrepancies between high-resolution native and glycopeptide-centric mass spectrometric approaches: A case study into the glycosylation of erythropoietin variants. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (8), 2099-2104 (2021).
  19. Caval, T., Heck, A. J. R., Reiding, K. R. Meta-heterogeneity: Evaluating and describing the diversity in glycosylation between sites on the same glycoprotein. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100010 (2020).
  20. Thomas, D. R., Scott, N. E. Glycoproteomics: growing up fast. Current Opinion in Structural Biology. 68, 18-25 (2020).
  21. Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).
  22. Cao, W., et al. Recent advances in software tools for more generic and precise intact glycopeptide analysis. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. , (2021).
  23. Yu, A., et al. Advances in mass spectrometry-based glycoproteomics. Electrophoresis. 39 (24), 3104-3122 (2018).
  24. Reiding, K. R., Bondt, A., Franc, V., Heck, A. J. R. The benefits of hybrid fragmentation methods for glycoproteomics. Trends in Analytical Chemistry. 108, 260-268 (2018).
  25. Riley, N. M., Malaker, S. A., Driessen, M., Bertozzi, C. R. Optimal dissociation methods differ for N- and O-glycopeptides. Journal of Proteome Research. 19 (8), 3286-3301 (2020).
  26. Mao, Y., et al. Systematic evaluation of fragmentation methods for unlabeled and isobaric mass tag-labeled O-glycopeptides. Analytical Chemistry. 93 (32), 11167-11175 (2021).
  27. Lu, L., Riley, N. M., Shortreed, M. R., Bertozzi, C. R., Smith, L. M. O-Pair Search with MetaMorpheus for O-glycopeptide characterization. Nature Methods. 17 (11), 1133-1138 (2020).
  28. Choo, M. S., Wan, C., Rudd, P. M., Nguyen-Khuong, T. GlycopeptideGraphMS: Improved glycopeptide detection and identification by exploiting graph theoretical patterns in mass and retention time. Analytical Chemistry. 91 (11), 7236-7244 (2019).
  29. Maxwell, E., et al. GlycReSoft: a software package for automated recognition of glycans from LC/MS data. PLoS One. 7 (9), 45474 (2012).
  30. Ahmad Izaham, A. R., Scott, N. E. Open database searching enables the identification and comparison of bacterial glycoproteomes without defining glycan compositions prior to searching. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 19 (9), 1561-1574 (2020).
  31. Bern, M., Kil, Y. J., Becker, C. Byonic: Advanced peptide and protein identification software. Current Protocols in Bioinformatics. , Chapter 13, Unit 13.20 (2012).
  32. Na, S., Bandeira, N., Paek, E. Fast multi-blind modification search through tandem mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 11 (4), 010199 (2012).
  33. Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Error tolerant searching of uninterpreted tandem mass spectrometry data. Proteomics. 2 (10), 1426-1434 (2002).
  34. Craig, R., Beavis, R. C. TANDEM: Matching proteins with tandem mass spectra. Bioinformatics. 20 (9), 1466-1467 (2004).
  35. Ahrné, E., Nikitin, F., Lisacek, F., Müller, M. QuickMod: A tool for open modification spectrum library searches. Journal of Proteome Research. 10 (7), 2913-2921 (2011).
  36. Shortreed, M. R., et al. Global identification of protein post-translational modifications in a single-pass database search. Journal of Proteome Research. 14 (11), 4714-4720 (2015).
  37. Chick, J. M., et al. A mass-tolerant database search identifies a large proportion of unassigned spectra in shotgun proteomics as modified peptides. Nature Biotechnology. 33 (7), 743-749 (2015).
  38. Roushan, A., et al. Peak filtering, peak annotation, and wildcard search for glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100011 (2020).
  39. Chi, H., et al. Comprehensive identification of peptides in tandem mass spectra using an efficient open search engine. Nature Biotechnology. , (2018).
  40. Bittremieux, W., Laukens, K., Noble, W. S. Extremely fast and accurate open modification spectral library searching of high-resolution mass spectra using feature hashing and graphics processing units. Journal of Proteome Research. 18 (10), 3792-3799 (2019).
  41. Polasky, D. A., Yu, F., Teo, G. C., Nesvizhskii, A. I. Fast and comprehensive N- and O-glycoproteomics analysis with MSFragger-Glyco. Nature Methods. 17 (11), 1125-1132 (2020).
  42. Harding, C. M., et al. Acinetobacter strains carry two functional oligosaccharyltransferases, one devoted exclusively to type IV pilin, and the other one dedicated to O-glycosylation of multiple proteins. Molecular Microbiology. 96 (5), 1023-1041 (2015).
  43. Iwashkiw, J. A., et al. Identification of a general O-linked protein glycosylation system in Acinetobacter baumannii and its role in virulence and biofilm formation. PLoS Pathogens. 8 (6), 1002758 (2012).
  44. Scott, N. E., et al. Diversity within the O-linked protein glycosylation systems of Acinetobacter species. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 13 (9), 2354-2370 (2014).
  45. Kenyon, J. J., Hall, R. M. Variation in the complex carbohydrate biosynthesis loci of Acinetobacter baumannii genomes. PLoS One. 8 (4), 62160 (2013).
  46. Lees-Miller, R. G., et al. A common pathway for O-linked protein-glycosylation and synthesis of capsule in Acinetobacter baumannii. Molecular Microbiology. 89 (5), 816-830 (2013).
  47. Iacono, M., et al. Whole-genome pyrosequencing of an epidemic multidrug-resistant Acinetobacter baumannii strain belonging to the European clone II group. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (7), 2616-2625 (2008).
  48. Hamidian, M., et al. Insights from the revised complete genome sequences of Acinetobacter baumannii strains AB307-0294 and ACICU belonging to global clones 1 and 2. Microbial Genomics. 5 (10), 000298 (2019).
  49. Farrugia, D. N., et al. The complete genome and phenome of a community-acquired Acinetobacter baumannii. PLoS One. 8 (3), 58628 (2013).
  50. Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
  51. Batth, T. S., et al. Protein aggregation capture on microparticles enables multipurpose proteomics sample preparation. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 18 (5), 1027-1035 (2019).
  52. HaileMariam, M., et al. S-Trap, an ultrafast sample-preparation approach for shotgun proteomics. Journal of Proteome Research. 17 (9), 2917-2924 (2018).
  53. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  54. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  55. Harney, D. J., et al. Proteomic analysis of human plasma during intermittent fasting. Journal of Proteome Research. 18 (5), 2228-2240 (2019).
  56. Scott, N. E. Characterizing glycoproteins by mass spectrometry in Campylobacter jejuni. Methods in Molecular Biology. 1512, 211-232 (2017).
  57. Bian, Y., et al. Robust microflow LC-MS/MS for proteome analysis: 38000 runs and counting. Analytical Chemistry. 93 (8), 3686-3690 (2021).
  58. Diedrich, J. K., Pinto, A. F., Yates, J. R. Energy dependence of HCD on peptide fragmentation: stepped collisional energy finds the sweet spot. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (11), 1690-1699 (2013).
  59. Liu, M. Q., et al. pGlyco 2.0 enables precision N-glycoproteomics with comprehensive quality control and one-step mass spectrometry for intact glycopeptide identification. Nature Communications. 8 (1), 438 (2017).
  60. Hinneburg, H., et al. The art of destruction: Optimizing collision energies in quadrupole-time of flight (Q-TOF) instruments for glycopeptide-based glycoproteomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (3), 507-519 (2016).
  61. Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
  62. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , http://www.r-project.org/index.html (2020).
  63. Brademan, D. R., Riley, N. M., Kwiecien, N. W., Coon, J. J. Interactive peptide spectral annotator: A versatile web-based tool for proteomic applications. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 18, 193-201 (2019).
  64. Russo, T. A., et al. The K1 capsular polysaccharide from Acinetobacter baumannii is a potential therapeutic target via passive immunization. Infection and Immunity. 81 (3), 915-922 (2013).
  65. Senchenkova, S. N., et al. Structure of the capsular polysaccharide of Acinetobacter baumannii ACICU containing di-N-acetylpseudaminic acid. Carbohydrate Research. 391, 89-92 (2014).
  66. Domon, B., Costello, C. E. A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentations in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates. Glycoconjugate Journal. 5 (4), 397-409 (1988).
  67. Harvey, D. J., Dwek, R. A., Rudd, P. M. Determining the structure of glycan moieties by mass spectrometry. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 12, Unit 12.7 (2006).
  68. Medzihradszky, K. F., Kaasik, K., Chalkley, R. J. Characterizing sialic acid variants at the glycopeptide level. Analytical Chemistry. 87 (5), 3064-3071 (2015).
  69. Kelstrup, C. D., Frese, C., Heck, A. J., Olsen, J. V., Nielsen, M. L. Analytical utility of mass spectral binning in proteomic experiments by SPectral Immonium Ion Detection (SPIID). Molecular & Cellular Proteomics:MCP. 13 (8), 1914-1924 (2014).
  70. Ahmad Izaham, A. R., et al. What are we missing by using hydrophilic enrichment? Improving bacterial glycoproteome coverage using total proteome and FAIMS analyses. Journal of Proteome Research. 20 (1), 599-612 (2021).
  71. Neue, K., Mormann, M., Peter-Katalinic, J., Pohlentz, G. Elucidation of glycoprotein structures by unspecific proteolysis and direct nanoESI mass spectrometric analysis of ZIC-HILIC-enriched glycopeptides. Journal of Proteome Research. 10 (5), 2248-2260 (2011).
  72. Mysling, S., Palmisano, G., Hojrup, P., Thaysen-Andersen, M. Utilizing ion-pairing hydrophilic interaction chromatography solid phase extraction for efficient glycopeptide enrichment in glycoproteomics. Analytical Chemistry. 82 (13), 5598-5609 (2010).
  73. Escobar, E. E., et al. Precision mapping of O-Linked N-acetylglucosamine sites in proteins using ultraviolet photodissociation mass spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 142 (26), 11569-11577 (2020).
  74. Madsen, J. A., et al. Concurrent automated sequencing of the glycan and peptide portions of O-linked glycopeptide anions by ultraviolet photodissociation mass spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (19), 9253-9261 (2013).
  75. Lysiak, A., Fertin, G., Jean, G., Tessier, D. Evaluation of open search methods based on theoretical mass spectra comparison. BMC Bioinformatics. 22, 65 (2021).
  76. Pabst, M., et al. A general approach to explore prokaryotic protein glycosylation reveals the unique surface layer modulation of an anammox bacterium. ISME Journal. , (2021).

Tags

ביוכימיה גיליון 177 גליקוזילטציה Acinetobacter baumannii חיפוש פתוח שינויים פוסט-טרנסלטיונליים פרוטאומיקה
היישום של גישות מבוססות חיפוש פתוח לזיהוי של <em>Acinetobacter baumannii</em> O מקושר Glycopeptides
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lewis, J. M., Coulon, P. M. L.,… More

Lewis, J. M., Coulon, P. M. L., McDaniels, T. A., Scott, N. E. The Application of Open Searching-based Approaches for the Identification of Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides. J. Vis. Exp. (177), e63242, doi:10.3791/63242 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter