חיפוש פתוח מאפשר זיהוי של גליקופפטידים מעוטרים בקומפוזיציות גליקאן שלא היו ידועות קודם לכן. בתוך מאמר זה, גישה יעילה לביצוע חיפוש פתוח וחיפושי גליקופפטיד ממוקדי גליקן הבאים מוצגים עבור דגימות חיידקים באמצעות Acinetobacter baumannii כמודל.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
היישום של גישות מבוססות חיפוש פתוח לזיהוי של Acinetobacter baumannii O מקושר Glycopeptides
* These authors contributed equally
במאמר זה
סיכום
תקציר
גליקוסילציה של חלבון מוכרת יותר ויותר כשינוי נפוץ בתוך אורגניזמים חיידקיים, התורמת לפיזיולוגיה פרוקריוטית ולזיהום אופטימלי של מינים פתוגניים. בשל כך, יש עניין גובר באפיון גליקוסילציה חיידקית וצורך בכלים אנליטיים בעלי תפוקה גבוהה כדי לזהות אירועים אלה. למרות פרוטאומיקה מלמטה למעלה בקלות מאפשרת את הדור של נתוני גליקופפטיד עשירים, הרוחב והמגוון של הגליקנים שנצפו במינים פרוקריוטים הופכים את הזיהוי של אירועי גליקוזילציה חיידקית למאתגר ביותר.
באופן מסורתי, הקביעה הידנית של הרכבי הגליקנים בערכות נתונים פרוטאומיות חיידקיות הפכה את זה לניתוח מותאם אישית במידה רבה המוגבל למומחים ספציפיים לשטח. לאחרונה, גישות פתוחות המבוססות על חיפוש התגלו כחלופה רבת עוצמה לזיהוי שינויים לא ידועים. על ידי ניתוח התדירות של שינויים ייחודיים שנצפו על רצפי פפטיד, טכניקות חיפוש פתוחות מאפשרות זיהוי של גליקנים נפוצים המחוברים לפפטידים בתוך דגימות מורכבות. מאמר זה מציג זרימת עבודה יעילה לפרשנות וניתוח של נתונים גליקופרוטומיים, המדגים כיצד ניתן להשתמש בטכניקות חיפוש פתוחות לזיהוי גליקופפטידים חיידקיים ללא ידע מוקדם על הרכבי הגליקנים.
באמצעות גישה זו, גליקופפטידים בתוך דגימות ניתן לזהות במהירות כדי להבין הבדלי גליקוסילציה. באמצעות Acinetobacter baumannii כמודל, גישות אלה מאפשרות השוואה של קומפוזיציות גליקאניות בין זנים וזיהוי של גליקופרוטאין חדשניים. יחד, עבודה זו מדגימה את הרבגוניות של טכניקות חיפוש מסד נתונים פתוחות לזיהוי גליקוסילציה חיידקית, מה שהופך את האפיון של גליקופרוטומים מגוונים אלה קל יותר מאי פעם.
מבוא
גליקוסילציה של חלבון, תהליך הצמדת פחמימות למולקולות חלבון, הוא אחד השינויים הנפוצים ביותר לאחר התרגום (PTMs) בטבע 1,2. בכל תחומי החיים התפתח מגוון של מכונות מורכבות המוקדשות לדור הגליקופרוטאינים המשפיעים על מספר עצום של פונקציות תאיות 1,3,4,5. בעוד גליקוסילציה חלבון מתרחשת על מגוון של חומצות אמינו 6,7, N מקושר ו O הקשורים Glycosylation אירועים הם שתי צורות דומיננטיות שנצפו בטבע. גליקוסילציה הקשורה ל- N
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
הערה: ניתן לחלק את ההכנה והניתוח של דגימות גליקופפטיד חיידקיות לארבעה חלקים (איור 1). עבור מחקר זה, הגליקוזילציה של שלושה זני A. baumannii רצף הוערך (טבלה 1). מסדי נתונים של Proteome FASTA של כל אחד מהזנים האלה נגישים באמצעות Uniprot. עיין בטבלה 2 עבור הרכב המאגרים המשמשים בפרוטוקול זה.
1. הכנת דגימות חלבון לניתוח פרוטאומי
- בידוד של דגימות פרוטאום של עניין
- אם אתם משתמשים בתאים שלמים, ודאו שהתאים נשטפו עם תמיסת מלח עם מאגר פוספט (PBS) להסרת מזהמי חלבון פוטנציאליים הנמצאים בתקשורת. יש להקפיא תאים שלמים לאחר הכביסה ולאחסן אותם בטמפרטורה ש....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
כדי להמחיש את התועלת של חיפוש פתוח עבור ניתוח גליקופפטיד חיידקי, המגוון הכימי של glycans מקושר O בתוך שלושה זנים של A. baumannii-AB307-0294, ACICU, ו D1279779-הוערך. הגליקופרוטאומים המקושרים O משתנים מאוד בין זני A. baumannii כמו הגליקנים המשמשים לגליקוזילציה נגזרים מן loci כמוסה משתנה מאוד 44,45,46. מגוון כימי זה הופך את A. baumannii למערכת מודל אידיאלית למחקרי חיפוש פתוחים. בעוד הגל.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
חיפוש פתוח הוא שיטה יעילה ושיטתית לזיהוי שינויים לא ידועים. בעוד זיהוי של גליקנים לא ידועים בתוך דגימות פרוטאום חיידקי היה באופן מסורתי התחייבות גוזלת זמן ומתמחה מבחינה טכנית, ההתפתחויות האחרונות של כלים כגון MSfragger21,41 ו Byonic31,38 עכשיו לאפשר זיהוי מהיר ויעיל של מסות דלתא לאפיון נוסף כמו גליקנים פוטנציאליים המצורפים פפטידים. חיפוש פתוח של דגימות פרוטאום סטנדרטיות ומועשרות בגליקופטיד יכול לזהות גליק.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
למחברים אין ניגודי עניינים.
תודות
N.E.S נתמך על ידי מלגת עתיד של מועצת המחקר האוסטרלית (FT200100270) ומענק פרויקט ARC Discovery (DP210100362). אנו מודים לספקטרומטריית המסה של מלבורן ולמתקן הפרוטאומיקה של המכון למדע וביוטכנולוגיה Biotechnology Bio21 על הגישה למכשור טרשת נפוצה.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| 14 G Kel-F רכזת נקודה סגנון 3 | חברת המילטון | hanc90514 | |
| 2-כלורואצטמיד | סיגמא אולדריץ' Pty בע"מ | C0267-100G | |
| אצטוניטריל | סיגמא אולדריץ' Pty בע"מ | 34851-4L | |
| אמוניום הידרוקסיד (28%) | סיגמא אולדריץ' Pty בע"מ | 338818-100 מ"ל | |
| BCA בדיקת חלבון מגיב A | פירס | 23228 | |
| BCA בדיקת חלבון מגיב B | Pierce | 23224 | |
| C8 Empore SPE | Sigma Aldrich Pty Ltd | 66882-U | ספק חלופי לחומר C8 הוא Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/) |
| חומצה פורמית | Sigma Aldrich Pty Ltd | 5.33002 | |
| Isopropanol | Sigma Aldrich Pty Ltd | 650447-2.5L | |
| מתנול | פישר כימיקל | M/4058/17 | |
| SDB-RPS Empore SPE (סולפונאט שלב הפוך) | Sigma Aldrich Pty Ltd | 66886-U | ספק חלופי עבור SDB-RPS הוא Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/) |
| נתרן דאוקסיכולט | סיגמא אולדריץ' Pty Ltd | D6750-100G | |
| ThermoMixer C | Eppendorf | 2232000083 | |
| חומצה טריפלואורואצטית | Sigma Aldrich Pty Ltd | 302031-10X1ML | |
| Tris 2-carboxyethyl phosphine hydrochloride | Sigma Aldrich Pty Ltd | C4706-2G | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma Aldrich Pty Ltd | 252859-500G | |
| תערובת פרוטאז Trypsin/Lys-C | Promega | V5073 | |
| רכז ואקום | Labconco | 7810040 | |
| חומר | ZIC-HILICניתן להשיג שרף 1504580001 של Merck | לשימוש בעמודות SPE לשימוש חד פעמי על ידי ריקון עמודת צורה גדולה יותר ושימוש בשרף החופשי |
מקורות
- Essentials of glycobiology. Varki, A., et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2015).
- Schaffer, C., Messner, P. Emerging facets of prokaryotic glycosylation. FEMS Microbiology Reviews. 41 (1), 49-91 (2017).
- Abu-Qarn, M., Eichler, J., Sharon, N.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
