Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Anvendelsen av åpne søkebaserte tilnærminger for identifisering av Acinetobacter baumannii O-tilknyttede Glycopeptides

Published: November 2, 2021 doi: 10.3791/63242
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Peter Doherty Institute for Infection and Immunity, The University of Melbourne
* These authors contributed equally

Summary

Åpen søking gjør det mulig å identifisere glykopeptider dekorert med tidligere ukjente glykanske komposisjoner. I denne artikkelen presenteres en strømlinjeformet tilnærming for å gjennomføre åpne søk og påfølgende glykanfokusert glykopeptidsøk for bakterieprøver ved hjelp av Acinetobacter baumannii som modell.

Abstract

Proteinglykosylering blir i økende grad anerkjent som en vanlig modifikasjon innen bakterielle organismer, noe som bidrar til prokaryotisk fysiologi og optimal infektivitet av patogene arter. På grunn av dette er det økende interesse for å karakterisere bakteriell glykosylering og behov for analytiske verktøy med høy gjennomstrømning for å identifisere disse hendelsene. Selv om oppblåst proteomikk lett muliggjør generering av rike glykopeptiddata, gjør bredden og mangfoldet av glykaner observert i prokaryote arter identifisering av bakterielle glykosyleringshendelser ekstremt utfordrende.

Tradisjonelt gjorde den manuelle bestemmelsen av glykansammensetninger innen bakterielle proteomiske datasett dette til en i stor grad skreddersydd analyse begrenset til feltspesifikke eksperter. Nylig har åpne søkebaserte tilnærminger dukket opp som et kraftig alternativ for identifisering av ukjente modifikasjoner. Ved å analysere frekvensen av unike modifikasjoner observert på peptidsekvenser, tillater åpne søketeknikker identifisering av vanlige glykaner festet til peptider i komplekse prøver. Denne artikkelen presenterer en strømlinjeformet arbeidsflyt for tolkning og analyse av glykoproteomiske data, som viser hvordan åpne søketeknikker kan brukes til å identifisere bakterielle glykopeptider uten forkunnskaper om glykansammensetningene.

Ved hjelp av denne tilnærmingen kan glykopeptider i prøver raskt identifiseres for å forstå glykosyleringsforskjeller. Ved å bruke Acinetobacter baumannii som modell, muliggjør disse tilnærmingene sammenligning av glykanske komposisjoner mellom stammer og identifisering av nye glykoproteiner. Samlet viser dette arbeidet allsidigheten til åpne databasesøketeknikker for identifisering av bakteriell glykosylering, noe som gjør karakteriseringen av disse svært varierte glykoproteomene enklere enn noen gang før.

Introduction

Proteinglykosylering, prosessen med å feste karbohydrater til proteinmolekyler, er en av de vanligste postoversettelsesendringene (PTMer) i naturen 1,2. På tvers av alle områder av livet har en rekke komplekse maskiner utviklet seg dedikert til generering av glykoproteiner som påvirker et utall cellulære funksjoner 1,3,4,5. Mens proteinglykosylering forekommer på en rekke aminosyrer 6,7, er N-koblede og O-tilknyttede glykosyleringshendelser to dominerende former observert i naturen. N-koblet glykosylering innebærer vedlegg av glykaner til et nitrogenatom av asparagin (Asn) rester, mens i O-koblet glykosylering er glykaner festet til et oksygenatom av serin (Ser), treonin (Thr) eller tyrosin (Tyr) rester7. Til tross for likhetene i rester målrettet av glykosyleringssystemer, resulterer forskjellene i glykanene festet til proteiner i glykosylering som den mest kjemisk mangfoldige klassen av PTMer som finnes i naturen.

Mens eukaryote glykosyleringssystemer har glykansk mangfold, er disse systemene vanligvis begrenset i antall unike karbohydrater som brukes. Det resulterende mangfoldet stammer fra hvordan disse karbohydratene er ordnet i glykaner 8,9,10,11,12. I motsetning har bakterielle og arkaeale arter nesten ubegrenset glykansk mangfold på grunn av det store utvalget av unike sukkerarter generert i disse systemene 2,10,13,14,15,16,17. Disse forskjellene i det glykanske mangfoldet som observeres på tvers av livets domener, representerer en betydelig analytisk utfordring for karakterisering og identifisering av glykosyleringshendelser. For eukaryotisk glykosylering har evnen til å forutse glykansammensetninger lagt til rette for den økende interessen for glykobiologi; Likevel gjelder det samme ikke for bakteriell glykosylering, som fortsatt i stor grad er begrenset til studier av spesialiserte laboratorier. Etter hvert som tilgjengeligheten av massespektrometri (MS) instrumentering har økt i biovitenskapen, er MS-baserte tilnærminger nå den primære metoden for glykoproteomisk analyse.

MS har dukket opp som det viktigste verktøyet for karakterisering av glykosylering, med både ovenfra og ned og nedenfra og opp tilnærminger som nå ofte brukes til å karakterisere glykoproteiner6. Mens ovenfra-og-ned-proteomikk brukes til å vurdere globale glykosyleringsmønstre av spesifikke proteiner18,19, brukes nedenfra-og-opp-tilnærminger for å muliggjøre glykanspesifikk karakterisering av glykopeptider, selv fra komplekse blandinger 6,20,21,22,23. For analyse av glykopeptider er generering av informativ fragmenteringsinformasjon avgjørende for karakterisering av glykosyleringshendelser24,25. En rekke fragmenteringsmetoder er nå rutinemessig tilgjengelige på instrumenter, inkludert resonansionfellebasert kollisjonsindusert dissosiasjon (IT-CID), kollisjonsindusert dissosiasjon av stråletype (CID) og elektronoverføringsdissosiasjon (ETD). Hver tilnærming har forskjellige styrker og svakheter for glykopeptidanalyse25,26, med betydelig fremgang det siste tiåret i å anvende disse fragmenteringsmetodene for å analysere glykosylering 6,20. Men for bakteriell glykosyleringsanalyse har den kritiske begrensningen ikke vært evnen til å fragmentere glykopeptider, men snarere manglende evne til å forutsi de potensielle glykanske sammensetningene i prøver. Innenfor disse systemene begrenser den ukjente naturen til forskjellige bakterielle glykaner identifiseringen av glykopeptider, selv med glykosyleringsfokuserte søkeverktøy som nå er vanlige for analyse av eukaryote glykopepeptider, som O-Pair27, GlycopeptideGraphMS28 og GlycReSoft29. For å løse dette problemet er det nødvendig med en alternativ søkemetode, med bruk av åpne søkeverktøy som dukker opp som en kraftig tilnærming for studiet av bakteriell glykosylering30.

Åpne søk, også kjent som blind- eller jokertegnsøk, tillater identifisering av peptider med ukjente eller uventede PTMer 21,30,31,32. Åpne søk bruker en rekke beregningsteknikker, inkludert kuraterte endringssøk, flertrinns databasesøk eller omfattende massetolerante søkpå 33,34,35,36,37. Selv om åpen søking har stort potensial, har bruken vanligvis blitt hindret av den betydelige økningen i analysetider og tap i følsomhet for påvisning av umodifiserte peptider sammenlignet med begrensede søk31,32. Nedgangen i påvisning av umodifiserte peptid-spektralkamper (PSM-er) er et resultat av de økte falske positive PSM-ratene knyttet til disse teknikkene, noe som krever økt streng filtrering for å opprettholde de ønskede falske oppdagelsesratene (FDRs) 33,34,35,36,37 . Nylig har flere verktøy blitt tilgjengelige som forbedrer tilgjengeligheten av åpne søk betydelig, inkludert Byonic31,38, Open-pFind39, ANN-SoLo40 og MSFragger21,41. Disse verktøyene muliggjør robust identifisering av glykosyleringshendelser ved å redusere analysetidene betydelig og implementere tilnærminger for å håndtere heterogene glykansammensetninger.

Denne artikkelen presenterer en strømlinjeformet metode for identifisering av bakterielle glykopeptider ved åpen søking, ved hjelp av Gram-negativ nosokomial patogen, Acinetobacter baumannii, som modell. A. baumannii har et konservert O-koblet glykosyleringssystem som er ansvarlig for modifikasjon av flere proteinsubstrater, kjent som PglL-proteinglykosyleringssystemet 42,43,44. Mens lignende proteiner er rettet mot glykosylering mellom stammer, er PglL glykosyleringssystemet svært variabelt på grunn av biosyntesen til glykanen som brukes til proteinglykosylering som er avledet fra kapsellokker (kjent som K-locus)44,45,46. Dette resulterer i at forskjellige glykaner (også kjent som en K-enhet), avledet fra enkle eller begrensede polymeriserte K-enheter, blir tilsatt proteinsubstrater 30,44,46. Innenfor dette arbeidet brukes bruken av det åpne søkeverktøyet, MSfragger, i programvaren FragPipe, til å identifisere glykaner over A. baumannii stammer. Ved å kombinere åpen søking og manuell kurasjon, kan "glykanfokuserte søk" utføres for å forbedre identifiseringen av bakterielle glykopeptider ytterligere. Sammen muliggjør denne multistep identifikasjonsmetoden identifisering av glykopeptider uten omfattende erfaring med karakterisering av nye glykosyleringshendelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: Tilberedning og analyse av bakterielle glykopeptidprøver kan deles inn i fire seksjoner (figur 1). For denne studien ble glykosylering av tre sekvenserte A. baumannii-stammer vurdert (tabell 1). Proteome FASTA-databaser for hver av disse stammene er tilgjengelige via Uniprot. Se tabell 2 for sammensetningen av buffere som brukes i denne protokollen.

1. Fremstilling av proteinprøver for proteomisk analyse

  1. Isolering av proteomprøver av interesse
    1. Hvis du bruker hele celler, må du sørge for at cellene er vasket med en fosfatbufret saltløsning (PBS) for å fjerne potensielle proteinforurensninger som finnes i mediet. Frys hele celler etter vask og oppbevar dem ved -80 °C til det er nødvendig.
    2. Hvis fraksjonerte prøver brukes (for eksempel membranpreparater), må du sørge for at reagensene som brukes ikke forstyrrer nedstrøms væskekromatografi MS (LC-MS) analyse50.
    3. Hvis vaskemidler, som natriumdodecylsulfat (SDS), Triton X-100, NP-40 eller lauroylsarcosin, har blitt brukt, fjern disse vaskemidlene ved hjelp av acetonutfelling, SP3 prøveprepareringsmetoder51 eller kommersielle proteomiske oppryddingskolonner som S-feller52. Alternativt kan du erstatte inkompatible rengjøringsmidler med et MS-kompatibelt eller avtakbart vaskemiddel som natriumdeoksykolat (SDC) eller oktylklukcopyranoside.
    4. Sørg for at alt plasttøy og glass som skal brukes til prøvepreparering ikke er autoklavert. Autoklaved glass og plast er vanligvis sterkt forurenset med små molekylvektforbindelser, for eksempel polymerer, som lett oppdages i MS.
  2. Solubilisering av helcelleprøver
    1. Resuspend ~10 mg vaskede, snap-frosne celler i 200 μL nylagde natriumdeoksycholat lysisbuffer (SDC lysis buffer: 4% SDC i 100 mM Tris, pH 8,5).
      MERK: Proteasehemmere kan tilsettes SDC lysis buffer for å begrense proteinforringelse.
    2. Kok prøvene i 10 min ved 95 °C med risting (2000 o/min på en thermomixer), og la dem stå på is i 10 minutter. Gjenta denne prosessen to ganger for å sikre effektiv lysis og solubilisering av prøvene.
      MERK: Prøver kan lagres på lang sikt på dette tidspunktet ved -80 °C. Hvis den oppbevares, må du resolubilisere ved oppvarming ved 95 °C før videre behandling.
  3. Kvantifisere prøveproteinkonsentrasjoner ved hjelp av en bicinkoninsyre (BCA) proteinanalyse53. Oppbevar prøver på is mens du foretar kvantifisering for å begrense proteinforringelse.
    MERK: For total proteomanalyse er 20-100 μg protein mer enn tilstrekkelig for nano LC-MS, som vanligvis krever mindre enn 2 μg proteinfordøye per analyse. Utarbeidelsen av overflødig peptid muliggjør replikeringsanalyse eller ytterligere fraksjonering hvis dyp proteomisk dekning er nødvendig. For glykopeptid enrichment-basert analyse ved hjelp av hydrofil interaksjon kromatografi (HILIC), er det nødvendig med 100-500 μg protein.
  4. Reduser og alkylatprøver.
    1. Tilsett 1/10th volumet av 10x reduksjon / alkyleringsbuffer (100 mM Tris 2-karboksyetylfosfinhydroklorid; 400 mM 2-kloroacetamid i 1 M Tris, pH 8,5) til prøver for en endelig konsentrasjon på 1x og inkubere prøver i mørket i 30 min ved 45 °C med risting ved 1500 o/min.
      MERK: Kontroller pH-verdien til 10x reduksjons-/alkyleringsbufferen for å sikre en pH på ca. 7,0-8,0 før du legger til prøvene, da en lavere pH vil føre til at SDC utfelles.
  5. Spinn kort ned prøvene og legg til proteasene Trypsin/Lys-C (~10 μL, resuspendert i 100 mM Tris, pH 8,5) for et endelig protease:proteinforhold på 1:100. Inkuber fordøyene over natten ved 37 °C med risting ved 1500 o/min (opptil 18 timer). For å sikre fullstendig protein fordøyelse, bruk en Trypsin / Lys-C protease: proteinforhold på 1:50 til 1:200.
  6. Slukk fordøyer ved å legge til 1,25 volumer på 100% isopropanol i prøvene. Virvel prøvene i 1 min å blande og kort spinne dem ned.
    MERK: Prøver kan oppbevares ved -20 °C for å bli viderebehandlet senere.
  7. Acidifiser prøvene ved å tilsette 0,115 volumer med 10% trifluoroedinsyre (TFA, endelig konsentrasjon på ~ 1% TFA), virvel prøvene, og spinn dem kort ned.

2. Behandling av proteomprøver

  1. Peptidopprydding av proteomprøver
    1. Forbered en styrenedivinylbenzene-reverse-fase sulfonat (SDB-RPS) Stop-and-go-extraction (Stage) Tips for hver prøve som tidligere beskrevet54.
      1. Empirisk, for binding 50 μg peptid, sluk tre SDB-RPS plater fra en 47 mm2 SDB-RPS membran ved hjelp av en stump nål (14 G). For større peptidmengder, øk antall plater tilsvarende.
    2. Før du bruker SDB-RPS Stage Tips, klargjør du spissene ved å legge til minst ti sengevolumer av følgende buffere sekvensielt og enten spinne bufferen gjennom kolonnen ved sentrifugering (25 °C, 3 min, 500 × g) eller ved å skyve bufferen gjennom kolonnen ved å påføre trykket forsiktig ved hjelp av en sprøyte.
      1. Fukt spissene med 150 μL 100% acetonitril.
      2. Vask spissene med 150 μL 30% metanol, 1% TFA i 18,2 MΩ H2O.
      3. Likevekt tipsene med 150 μL 90% isopropanol, 1% TFA balansert med 18,2 MΩ H2O.
    3. Legg prøvene (som inneholder 50 % isopropanol, 1 % TFA) på SDB-RPS Stage Tips ved sentrifugering (25 °C, 3 min, 500 × g) eller ved å bruke trykk forsiktig ved hjelp av en sprøyte.
    4. Vask SDB-RPS Stage Tips med følgende buffere ved sentrifugering (25 °C, 3 min, 500 × g) eller ved å påføre trykket forsiktig ved hjelp av en sprøyte.
      MERK: Ekstra vasker eller alternative buffere kan brukes til å fjerne ikke-peptidkontaminanter, for eksempel bruk av etylacetat i stedet for isopropanol55.
      1. Vask spissene med 150 μL 90% isopropanol, 1% TFA.
      2. Vask spissene med 150 μL 1% TFA i 18,2 MΩ H2O.
    5. Elute peptidene fra SDB-RPS Stage Tips med 150 μL 5% ammoniumhydroksid i 80% acetonitril ved sentrifugering eller ved forsiktig påføring av trykk ved hjelp av en sprøyte. Samle prøvene i individuelle rør.
      MERK: Forbered 5% ammoniumhydroksid i 80% acetonitril i en plastbeholder umiddelbart før bruk i en avtrekkshette.
    6. Tørk de eluterte peptidene ved vakuumsentrifugering ved 25 °C.
      MERK: Hvis du foretar HILIC-berikelse, kan 1-10% av peptid eluates fjernes på dette tidspunktet, tørkes og brukes som totale proteominngangskontroller.
  2. Berikelse av glykopeptidprøver
    1. Forbered Zwitterionic Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography (ZIC-HILIC) Stage Tips som tidligere beskrevet54,56.
      1. Sluk kort en C8-plate fra en 47 mm2 C8-membran ved hjelp av en stump nål (14 G) og pakk platen i en P200-spiss for å lage en frit. Tilsett ca. 5 mm ZIC-HILIC-materiale, resuspendert i 50% acetonitril, 50% 18,2 MΩ H2O, på friten ved å forsiktig påføre trykk ved hjelp av en sprøyte.
    2. Før du bruker ZIC-HILIC Stage Tips, må du kondisjonere harpiksen ved å legge til følgende buffere sekvensielt og forsiktig påføre trykk ved hjelp av en sprøyte.
      MERK: For å sikre integriteten til pseudo-vannlaget på overflaten av ZIC-HILIC-harpiksen (kreves for å berike glykopeptider), må harpiksen alltid forbli våt. Når du vasker harpiksen, må du alltid la ~10 μL oppløsningsvæske over harpiksen og sørge for at vaskene/prøvene pipetteres direkte inn i dette gjenværende løsningsmidlet.
      1. Likevekt harpiksen med 20 sengevolumer (200 μL) ZIC-HILIC elutionbuffer (0,1% TFA i 18,2 MΩ H2O).
      2. Vask harpiksen med 20 sengevolumer (200 μL) ZIC-HILIC forberedelsesbuffer (95% acetonitril i 18,2 MΩ H2O).
      3. Vask harpiksen med 20 sengevolumer (200 μL) ZIC-HILIC laste-/vaskebuffer (80% acetonitril, 1% TFA balansert med 18,2 MΩ H2O).
    3. Resuspend de tørkede fordøyde prøvene (fra trinn 2.1.6) i ZIC-HILIC laste-/vaskebuffer til en endelig konsentrasjon på 4 μg/μL (f.eks. for 200 μg peptid, resuspend i 50 μL ZIC-HILIC laste-/vaskebuffer). Vortex kort i 1 min for å sikre at prøvene blir resuspendert, og spinn ned i 1 min ved 2000 × g ved 25 °C.
    4. Legg den resuspenderte peptidprøven på en betinget ZIC-HILIC-kolonne.
      1. Vask tre ganger med 20 sengevolumer (200 μL) ZIC-HILIC laste-/vaskebuffer (for totalt 60 sengevolumvask) ved å påføre trykket forsiktig med en sprøyte.
      2. Elute glykopeptider med 20 sengevolum (200 μL) ZIC-HILIC elutionbuffer i et 1,5 ml rør ved å forsiktig påføre trykk ved hjelp av en sprøyte og deretter tørke eluate ved vakuum sentrifugering ved 25 °C.

3. LC-MS av proteom/glykopeptidberikede prøver

  1. Resuspend prøvene i Buffer A* (2% acetonitrile, 0,1% TFA) til en endelig konsentrasjon på 1 μg/μL (for eksempel for 50 μg peptid, resuspend i 50 μL buffer A *).
  2. Last prøvene på en HPLC/UPLC koblet til en MS for å muliggjøre separasjon og identifisering av glykopeptider.
    MERK: Kolonneparametrene, inkludert indre diameter, lengde, strømningshastigheter, type kromatografiharpiks og nødvendige peptidinjeksjonsmengder, bør optimaliseres for det analytiske oppsettet og graderingslengden som skal brukes; for et eksempel på hvordan man gjennomfører optimalisering av analytiske oppsett, se57.
  3. Overvåk innsamlingen av de resulterende MS-dataene for å sikre at dataene samles inn med de ønskede parameterne.
    MERK: For komposisjonsanalyse er CID-fragmentering tilstrekkelig. På grunn av tilsetning av glykaner til glykopeptider observeres glykopeptidioner vanligvis med høyere m / z og lavere ladetetthet enn ulakosylerte peptider. For å sikre at disse ionene er observerbare, la en MS1-masse variere fra 400 til 2000 m/ z.
  4. Fragmentvalgt ioner ved hjelp av CID, som sikrer innsamling av lave m/ z fragmentioner som inneholder oksoniumioner som er viktige for karakterisering av glykaner.
    MERK: Fragmentering av glykopeptider ved bruk av CID påvirkes av både peptid- og glykansekvensene, samt energien som påføres under fragmentering 25,58,59. Mens en rekke forskjellige kollisjonsenergier kan brukes, er en optimal strategi for fragmentering av glykopeptider bruk av trappede kollisjonsenergier som kombinerer bruk av flere kollisjonsenergier 25,59,60.
  5. Bruk alternative fragmenteringsmetoder, hvis tilgjengelig, for eksempel ETD for lokalisering av nettstedet, eller IT-CID for å hjelpe til med å bestemme glykansammensetninger.
    MERK: Ingen av disse fragmenteringsmetodene er avgjørende for komposisjonsanalyse, men kan samles inn for å muliggjøre ytterligere avhør av glykopeptider av interesse.

4. Analyse av proteom/glykopeptidberikede prøver

  1. Forhåndsfiltrering av datafiler for å aktivere søk i FragPipe
    1. Hvis ETD- eller IT-CID-skanninger er samlet inn i datasett, filtrerer du disse skannehendelsene fra datafilene ved hjelp av MSConvert61 før du søker med FragPipe.
      MERK: For de åpne søkeparametrene som er beskrevet nedenfor, er det bare stråletype CID-data som kreves.
  2. Utføre åpne søk i FragPipe
    1. Åpne FragPipe, og klikk kategorien Arbeidsflyt . Velg alternativet Åpne søk på rullegardinmenyen for arbeidsflyt, og klikk Legg til filer for å importere datafilene det skal søkes i, til FragPipe (figur 2A).
    2. Klikk kategorien Database og start nedlastingsbehandling ved å klikke Last ned. Dette gjør at proteomdatabaser kan lastes ned fra Uniprot ved hjelp av en Uniprot Proteome ID. Klikk på Legg til decoys og forurensninger alternativet i nedlastingsbehandleren for å innlemme decoy og forurensning proteiner i databaser.
    3. Hvis du vil ha strengere FDR-terskler, klikker du kategorien Validering og endrer filter- og rapportverdien fra 0,01 til den nødvendige FDRen.
      MERK: Standard FragPipe-innstillinger sikrer en 1% FDR på proteinnivå.
    4. Velg kategorien MSfragger . I toppmatchingsboksen øker du forløperens massetoleranse fra standard 500 Da til 2000 Da for å tillate identifisering av store endringer (figur 2A).
    5. Klikk kategorien Kjør , og definer plasseringen av utdataene for FragPipe. Klikk Kjør for å starte søket.
  3. Ved hjelp av PSM-ene som identifiseres på tvers av datasett (som finnes i psm.tsv-utgangene fra FragPipe), identifiserer du potensielle glykaner ved å plotte frekvensen av observerte deltamasser i datasett (figur 3). Lag deltamasseplott fra MSfragger-utganger ved hjelp av R-skriptene som er tilgjengelige via PRIDE-tiltredelse PXD027820.
    MERK: Minimal etterbehandling av de åpne søkeresultatene utføres innenfor disse skriptene, da hovedformålet med disse skriptene er å hjelpe til med visualisering av deltamasseprofiler. Det er viktig at observasjonen av rikelige deltamasser alene ikke er et bevis på at en modifikasjon er en potensiell glykan, da tildeling av deltamasser som glykaner krever ytterligere analyse av de tilsvarende MS2-hendelsene.
  4. For å muliggjøre karakterisering av glykopeptider i prøver, fokuser på høy tillit delta masseidentifikasjoner, tilsvarende oppgaver med høye hyperscores.
    1. For å hjelpe til med å vurdere glykopeptidspektra, bruk peptidmerknadsverktøy, for eksempel Interactive Peptide Spectral Annotator63, som muliggjør tildeling av peptidrelaterte ioner i spektra, slik at manuell identifisering av glykan-tilknyttede ioner (figur 4).
      MERK: Innenfor datasettene som presenteres her, anses hyperscores av >30 som høy score, da disse tilsvarer score innenfor de øverste 50% av alle identifiserte glykopeptider (figur 5).
  5. Med høy tillit glykopeptider tildelt, identifiser ofte observerte glykan-assosierte ioner (figur 4) for å forbedre identifiseringen av glykopeptider.
    MERK: Ved å inkorporere glykan-tilknyttede ioner i søk, kjent som glykanfokuserte søk, kan kvaliteten på glykopeptidoppgaver forbedres.
    1. Klikk kategorien MSfragger i FragPipe, inkorporer de bestemte deltamassene til de observerte glykanene i delene Variable modifikasjoner og Masseforskyvninger . Legg til disse massene ved å skrive inn verdier i delene Variable endringer og Masseforskyvninger med individuelle masser atskilt med en /. Legg til de glykan-tilknyttede fragmentmassene til disse glykanene i Glyco / Labile mods-delen av MSFragger.
      MERK: Figur 2B skisserer nøkkelinformasjonen som kreves for et glykanfokusert søk etter A. baumannii-stammen AB307-0294.
  6. Last opp alle MS-data knyttet til proteomiske studier til sentraliserte proteomiske repositorier som PRIDE- eller MASSIVE-repositorier.
    MERK: Alle data knyttet til denne studien er deponert i PRIDE-proteomiske depot og kan nås via PRIDE-tiltredelsen: PXD027820.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å illustrere nytten av åpen søken etter bakteriell glykopeptidanalyse ble det kjemiske mangfoldet av O-tilknyttede glykaner innenfor tre stammer av A. baumannii-AB307-0294, ACICU og D1279779-vurdert. De O-koblede glykoproteomene er svært variable mellom A. baumannii-stammer, da glykanene som brukes til glykosylering er avledet fra den svært variable kapsel loci 44,45,46. Dette kjemiske mangfoldet gjør A. baumannii til et ideelt modellsystem for åpne søkestudier. Mens glykoproteomene til de tre stammene ikke tidligere er vurdert, er kapselstrukturene til to av disse stammene, AB307-029464 og ACICU65, kjent, med kapselen D1279779 ennå ikke belyst.

I samsvar med kapselen ab307-0294, åpen søking av AB307-0294 avslørt to dominerende delta masser, tilsvarende 648.25 Da og 692.28 Da (Figur 3A). Disse massene samsvarer med kapselstrukturene som tidligere ble bestemt av Russo et al., -β-D-QuiNAc4NR-α-GlcNAc6OAc-α-d-GalNAcA, hvor QuiNAc4NR-rester tilsvarer 2,4-diamino-2,4,6-trideoksy-glukose, modifisert med enten 3-OH-butyrate eller en acetylsgruppe64. På samme måte er ACICU-kapselen kjent for å bestå av en tetrasakkarid K-enhet, tidligere identifisert som Pse5Ac7Ac-β-D-Glc p-β-D-Gal p-β-D-Gal p-NAc-, tilsvarende en anslått masse på 843,31 Da65. Denne kapselstrukturen er i samsvar med den hyppigst observerte deltamassen i ACICU-dataene (figur 3B). Til slutt avslørte åpen søkeanalyse av stammen D1279779 tilstedeværelsen av flere deltamasser i samsvar med 203.08, 794.31 og 1588.62 Da (figur 3C). Mens massen 203.08 er i samsvar med en enkelt HexNAc rester, 794.31 og 1588.62 tilsvarer ukjente modifikasjoner. Det skal bemerkes at massen 1588,62 er nøyaktig dobbelt så stor som i 794,31, noe som tyder på at disse peptidene er dekorert med glykanske K-enhet dimers, som tidligere har blitt observert i andre Acinetobacter glykoproteomer 30,44,46.

Delta masseplott gir en rask og effektiv måte å vurdere frekvensen av observerte modifikasjoner i prøver. Men for komplekse modifikasjoner, for eksempel glykaner, gir tilstedeværelsen av en deltamasse alene ikke informasjonen for å definere den nøyaktige sammensetningen av en glykan. For å hjelpe til med å bestemme glykansammensetninger, kan de resulterende MS/ MS-dataene til PSMer som er tilordnet bestemte deltamasser, brukes. Ved å fokusere på høy tillit glykopeptid oppgaver (i MSFragger tilsvarende PSMs med høye hyperscores), manuell analyse kan brukes til å ytterligere karakterisere glykaner utnyttet av en stamme for protein glykosylering. Det skal bemerkes at peptidoppdrag med høy tillit vanligvis inneholder robust glykaninformasjon som gjør det mulig å bestemme glykansammensetninger basert på Y-ioner. Denne informasjonen kan brukes til å identifisere de tilsvarende fragmentene der glykanene har forblitt festet til peptider, samt til B- og oksoniumrelaterte ioner som er nyttige for tildeling av glykaner66. Detaljerte retningslinjer for hvordan man tildeler glykan komposisjoner har tidligere blitt skissert, og leserne anbefales å konsultere Harvey et al.67. Ved hjelp av verktøy som Interactive Peptide Spectral Annotator63, kan peptid-tilknyttede ioner enkelt identifiseres, slik at brukerne kan bestemme identiteten til glykanene festet til peptider.

Ved hjelp av den interaktive Peptide Spectral Annotator ble glykopeptider identifisert på tvers av disse tre A. baumannii-prøvene vurdert, og avslørte potensielle glykan-assosierte ioner. Vurder MS/MS-spektraet til AB307-0294 glykopeptid SAGDQAASDIATATDNASAK, dekorert med glykanene 648,25 og 692,28 Da (figur 4A,B); under lignende fragmenteringsforhold er glykanrelaterte ioner svært like, men skifte i masse med 44.02 Da. Analyse av glykanioner i disse PSMs muliggjør bekreftelse på at deltamassene observert for disse glykopeptider tilsvarer trisakkarider som inneholder fire forskjellige karbohydrater: dHexNAcNAc (228 Da), dHexNAcNBu (272 Da), HexNAcA (217 Da) og HexNAc (203). Det skal bemerkes at ved tildeling av glykanfragmenter er flere monosakkarider utsatt for å miste vann når de fragmenteres ved hjelp av CID. Dette kan ses i glykanen til ACICU, hvor monosakkaridet Pse5Ac7Ac (316 Da) fører til generering av to fremtredende glykanrelaterte fragmenter: MH + 299.12 og 317.13, forskjellen i masse som tilsvarer massen av vann (18.01 Da) (figur 4C).

I tillegg, når du analyserer bakterielle glykaner, er det vanlig å observere uventede monosakkaridmasser som tilsvarer sukker som ikke observeres i eukaryoter. Et eksempel på dette kan sees i Glycopeptide PSMs av D1279779, der analyse av den hyppigste deltamassen 794.31 Da avslører tilstedeværelsen av en uvanlig monosakkarid dHexNAc (187 Da, observert som en MH+ av 188,09, figur 4D), som tidligere har blitt observert i A. baumannii O-tilknyttede glykaner44. Mens høye massenøyaktighetsmålinger og den karakteristiske oppførselen til glykaner som labile modifikasjoner, som går tapt fra peptid ryggraden, kan hjelpe til med å bestemme potensielle kjemiske sammensetninger av glykaner, anbefales det å minimere overtolkning av MS-data. Hvis stereokjemi av spesifikke sukkerarter eller koblingsinformasjonen til en glykan er ukjent, er det best å bruke strukturelt agonistiske oppgaver, inkludert å referere til monosakkarider av deres spesifikke klasser. Et eksempel på dette refererer til 203.08 Da rester som N-acetylhexosaminer (HexNAc) og unngår tildeling av koblingstyper. Om nødvendig anbefales det at ytterligere teknikker brukes til å definere de nøyaktige kjemiske identitetene til en ukjent modifikasjon, for eksempel bruk av kjernemagnetisk resonans (NMR).

Mens åpne søkemetoder muliggjør rask identifisering av modifiserte peptider, er det viktig å merke seg at denne søkemetoden kan overse potensielle glykopeptider i datasett. Innenfor åpne søk kan glykopeptider ikke identifiseres av flere grunner, inkludert utilstrekkelig peptidfragmenteringsinformasjon eller straffelse av det tildelte peptidet på grunn av tilstedeværelsen av flere ikke-tilordnede ioner i MS2-hendelsen. Sistnevnte gjelder spesielt for bakterielle glykopeptid PSMs, da disse spektraene kan inneholde glykan-tilknyttede fragmenter som ikke vurderes som standard åpne søkeparametere. Ettersom uovertruffen funksjoner har negativ innvirkning på poengsummen til PSM-er, kan minimering av uovertruffen ioner i MS/MS-spektra muliggjør identifisering av glykopeptider som opprinnelig ble utelukket på grunn av FDR-kontrollerte minimale poengsumterskler. For å overvinne denne begrensningen kan massene som er definert fra de åpne søkene (figur 3) og de manuelt definerte glykan-tilknyttede ionene (figur 4), innlemmes i søkeparametere for å forbedre identifiseringen av glykopeptider. Det er viktig å merke seg at disse glykan-assosierte ionene kan identifiseres manuelt basert på de novo-bestemmelse av glykanen, forkunnskaper om vanlige oksoniumioner44,68, eller bruk av verktøy som kan fange tilbakevendende ioner i spektra, for eksempel SPectral Immonium Ion Detection tool69,76.

For å demonstrere dette ble massene av atypiske glykanfragmenter identifisert gjennom åpen søkeanalyse innlemmet i søkeparametrene i MSFragger, og glykanfokusert søk utført (de glykanfokuserte innstillingene for belastningen AB307-0294 er vist i figur 2B). Det skal bemerkes at når flere glykaner blir søkt sammen, bør det tas hensyn til valg av Y-ion og diagnostiske masser for å sikre at de nøyaktig gjenspeiler fragmentionene forbundet med hver deltamasse. Selv om dette kanskje ikke alltid er mulig for kombinasjoner av Y- og diagnostiske masser som utelukker hverandre, for eksempel fragmentene av 648,25 og 692,28 glykaner av AB307-0294 (figur 4A,B), er glykanfokusert søk fortsatt mulig, selv om dette kan påvirke robustheten i søkeresultatene. Glykanfokuserte søk førte til en merkbar økning i det totale antallet Glykopeptid PSM-er identifisert på tvers av alle tre A. baumannii-stammene, tilsvarende en 37% økning i ACICU, en økning på 117% i AB307-0294, og en økning på 363% i D1279779 (figur 5A-C). For individuelle MS-hendelser resulterer inkluderingen av glykanspesifikk informasjon vanligvis i en økning i den observerte hyperscoren, selv om denne økningen er svært glykanavhengig (figur 5D,E). Dermed, ved å raffinere søkeparametrene ved hjelp av massene av glykaner avslørt gjennom åpen søking og deretter innlemme manuelt kuratert glykan fragmentinformasjon i målrettede søk, kan en mer detaljert analyse av glykopeptider i prøver oppnås.

Figure 1
Figur 1: Oversikt over de viktigste trinnene i fremstilling og analyse av bakterielle glykopeptider. Vellykket identifisering av bakterielle glykopeptider er avhengig av generering av høykvalitetsprøver som inneholder glykopeptider. Glykopeptidholdige prøver analyseres deretter av LC-MS, og deretter brukes åpne søkemetoder til å identifisere potensielle glykopeptider basert på unike deltamasser. Ved hjelp av manuell kurasjon kan disse deltamassene identifiseres som glykaner. Til slutt, for å forbedre identifiseringen av glykopeptider, kan glykaninformasjon innlemmes i glykanfokuserte databasesøk. Forkortelser: LC-MS = flytende kromatografi koblet til massespektrometri; OD = optisk tetthet; SDB-RPS = styrenedivinylbenzene-omvendt fase sulfonat; ZIC-HILIC = Switterionic Hydrophilic Interaction Flytende kromatografi; PSMs = peptid-spektral kamper; CID = kollisjonsindusert dissosiasjon; ETD = elektronoverføringsdissosiasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Oversikt over hvordan du aktiverer åpne søk og glykanfokuserte søk i FragPipe. (A) Åpne søk kan aktiveres ved å laste inn den åpne arbeidsflyten i Arbeidsflyt-fanen i FragPipe. For å aktivere identifisering av glykaner større enn 500 Da i størrelse, øke Precursor massetoleranse vinduet til 2,000 Da. (B) Glycan-fokuserte søk etter atypiske glykaner krever oppføring av glykan informasjon i MSFragger fanen for å definere forventede masser av modifikasjoner (i variable modifikasjoner og masse offsets seksjoner), Y ioner knyttet til disse glykaner (i Y Ion Masses listen over Glyco / Labile og de lavmasse glykanfragmentionene (i listen over diagnostiske fragmentmasser i Glyco/Labile-delen ). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Delta masseplott av åpne søkeresultater for de tre stammene av Acinetobacter baumannii (AB307-0294, ACICU og D1279779). I samsvar med mangfoldet av kapselloci, har hver A. baumannii-stamme en unik deltamasseprofil med fremtredende modifikasjoner på større enn 140 Da i størrelse, betegnet av de observerte deltamassene. (A) Innenfor AB307-0294 delta masseplott, Massene 648.25 og 692.28 tilsvarer modifikasjoner i samsvar med -β-d-QuiNAc4NR-α-GlcNAc6OAc-α-d-GalNAcA-, der QuiNAc4NR er modifisert med enten en 3-OH-butyrate eller acetylgruppe64. (B) Innenfor ACICU delta masseplott, massene 203.08 og 843.31 tilsvarer modifikasjoner i samsvar med HexNAc og Pse5Ac7Ac-β-D-Glc p-β-D-Gal p-β-D-Gal p-NAc, henholdsvis65. (C) Innenfor deltamasseplottet D1279779 tilsvarer massene 203,08, 794,31 og 1588,62 HexNAc, HexNAc-217-187-187 og en dimer av HexNAc-217-187-187. Deltamassene vurderes manuelt og bekreftes i figur 4 for å være glykaner merket med *. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: MS/MS-karakterisering av deltamasser observert over de tre stammene av Acinetobacter baumannii. (A, B)  AB307-0294, (C) ACICU og (D) D1279779. Interaktiv Peptide Spectral Annotator-assistert kommentert spektra av representative glykopeptider. For hvert spektrum er peptidfragmentionene betegnet i blått og rødt, mens de manuelt tildelte glykan-tilknyttede ionene er betegnet i grønt. Glykaner har blitt kommentert ved hjelp av Symbol Nomenclature for Glykaner med HexNAc betegnet som en firkant, Hex som en sirkel, og atypiske monosakkarider betegnet som trapesoider med massen av glykan betegnet i trapesoidene. Forkortelse: MS/MS = tandemmassespektrometri. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Sammenligning av glykopeptider identifisert på tvers av stammer av Acinetobacter baumannii ved hjelp av åpen vs glykanfokusert søk. (A-C) Sammenligning av hyperpoengsummer og antall PSM-oppgaver innen D1279779, ACICU og AB307-0294 ved hjelp av åpne og glykanfokuserte søk. (D-F) Sammenligning av individuelle MS2-hendelser tildelt samme peptidsekvens ved hjelp av åpne og glykanfokuserte søk etter D1279779, ACICU og AB307-0294. Forkortelse: PSM = peptid-spektral match. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

A. baumannii Stammer Uniprot Proteome-IDer
AB307-0294 15 UP000006924
ACICU 47,48 UP000008839
D1279779 49 UP000011860

Tabell 1. Stamme- og Uniprot Proteome-IDer som brukes i denne studien.

Navn på buffer Buffersammensetning /pH
Buffer A* 2% acetonitril i 18,2 MΩ H2O, 0,1% trifluroacetisk syre / pH 1,0
PBS 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4 og 2 mM KH2PO4 / pH 7,4
Reduksjons-/alkyleringsbuffer 100 mM Tris 2-karboksyetylfosfinhydroklorid, 400 mM 2-kloroacetamid i 1 M Tris / pH 7,5
Elutionbuffer for SDB-RPS-trinntips 5% ammoniumhydroksid i 80% acetonitril / pH 11
Ekvikasjonsbuffer for SDB-RPS-trinntips 30% metanol, 1% trifluroacetisk syre, i 18,2 MΩ H2O / pH 1,0
SDB-RPS Stage Tip likevekts-/vaskebuffer 90% isopropanol, 1% trifluroacetisk syre / pH 1,0
Vaskebuffer for SDB-RPS Stage Tip 1% trifluroacetisk syre i 18,2 MΩ H2O / pH 1,0
SDC lysis buffer 4% SDC i 100 mM Tris / pH 8,5
SIC-HILIC elution buffer 0,1 % trifluroacetisk syre i 18,2 MΩ H2O/pH 1,0
ZIC-HILIC laste-/vaskebuffer 80% acetonitril, 1% trifluroacetisk syre i 18,2 MΩ H2O / pH 1,0
ZIC-HILIC forberedelsesbuffer 95% acetonitril i 18,2 MΩ H2O / pH 7,0

Tabell 2: Sammensetning av buffere som brukes i denne studien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Åpent søk er en effektiv og systematisk metode for identifisering av ukjente modifikasjoner. Mens identifisering av ukjente glykaner innen bakterielle proteomprøver tradisjonelt har vært et tidkrevende og teknisk spesialisert foretak, muliggjør den nylige utviklingen av verktøy som MSfragger21,41 og Byonic31,38 nå rask og effektiv identifisering av deltamasser for videre karakterisering som potensielle glykaner festet til peptider. Åpne søk etter både standard- og glykopeptidberikede proteomprøver kan identifisere potensielle glykopeptider (figur 1). Fellesnaliteten og overfloden av glykopeptider i proteomet til mange bakterielle systemer gjør direkte deteksjon av disse modifikasjonene mulig uten glykopeptidberikelse6. Selv om glykopeptidberikelsesmetoder vanligvis fortsatt overgår ikke-berikelsesbaserte metoder for mange glykosyleringssystemer70, er det bemerkelsesverdig at ikke alle glykaner er like mottagelige for berikelse 71,72. Dette faktum bør vurderes når du bestemmer den mest hensiktsmessige tilnærmingen for å identifisere glykosyleringshendelser ved hjelp av åpen søking etter en gitt biologisk prøve.

Mens åpne søk effektivt identifiserer glykaner observert med høy frekvens i en prøve, forblir det ineffektivt å identifisere glykosyleringshendelser som sjelden forekommer i datasett. I praksis, for at en unik deltamasse av en glykan skal identifiseres, må minst 10 PSM-er med identisk deltamasse være til stede i prøver. Denne minimumsfrekvensen gjør at en potensiell glykan kan skilles over massetilordninger for bakgrunnsdelta (figur 3). Selv om dette kriteriet vanligvis oppfylles av generelle glykosyleringssystemer rettet mot flere substrater for glykosylering, kan systemer der et enkelt protein er rettet mot glykosylering være mindre egnet for denne tilnærmingen. Etter hvert som hastigheten og følsomheten til MS-instrumenter forbedres, er det sannsynlig at dette i økende grad vil muliggjøre vurdering av lavere overflod glykopeptidpopulasjoner, noe som igjen vil forbedre effektiviteten av åpne søketilnærminger, forutsatt at tilstrekkelig kvalitetsspektra kan genereres for sjeldne / lave rikelige glykoformer.

Mens MS muliggjør effektiv identifisering av nye glykaner, er det viktig å merke seg at denne innsikten alene sjelden gir en fullstendig strukturell karakterisering av glykopeptider / glykaner, med verktøy som NMR-spektroskopi som fortsatt er kritisk for fullstendig glykansk karakterisering. Som observert her, ms gitt komplementær bekreftelse av K-enheter tidligere bestemt ved hjelp av NMR fra isolerte kapsler av A. baumannii ACICU og AB307-029464,65. For den store glykanen som ble identifisert i D1279779, var det imidlertid bare informasjon om putative klasser av monosakkarider i denne glykanen som kunne tildeles MS uten informasjon om koblingstypene eller stereokjemien til disse sukkerenhetene (figur 4). Etter hvert som nye MS-fragmenteringsmetoder blir mer allment tilgjengelige, for eksempel ultrafiolett fotodissosiasjon73,74, kan mer detaljert strukturell karakterisering av glykopeptider være mulig. Det bør imidlertid utvises forsiktighet ved utledning av koblinger eller stereokjemiinformasjon med gjeldende instrumentering. I tillegg til disse vurderingene har det nylig blitt stilt spørsmål om hensiktsmessigheten av FDR-baserte kontroller for åpen søking75. Selv om åpen søking er en kraftig tilnærming, fremhever disse hensynene behovet for omsorg som skal tas i tolkningen av glykanske oppgaver basert på åpen søkeinformasjon alene.

Mens dette arbeidet viser at åpen søking er en effektiv tilnærming for uovervåket identifisering av glykaner som brukes til bakteriell glykosylering, gir åpen søking alene tilgang til bare en undergruppe av alle glykopeptider som finnes i prøver. På grunn av labile naturen til glykaner inneholder glykopeptid PSMs vanligvis et mangfoldig utvalg av glykan-tilknyttede fragmenter som, hvis de ikke er gjort rede for, vil ha negativ innvirkning på poengsummen til PSM-er. For å løse dette problemet og tillate mer dyptgående identifisering av glykopeptider, kan glykaninformasjonen som innhentes gjennom åpent søk, senere brukes til å informere glykanfokuserte søk (figur 2B). På denne måten kan åpen søking, kombinert med manuell bestemmelse av glykan-tilknyttede fragmenter, brukes til å forbedre kvaliteten og mengden glykopeptider tildelt i prøver (figur 5). Selv om forbedringer av glykopeptidsøkeparametere utføres manuelt med gjeldende versjoner av verktøy, for eksempel MSfragger, er det sannsynlig at etter hvert som feltet modnes, vil disse trinnene bli gjort på en automatisert måte. Studier har allerede vist beregningstilnærminger for å identifisere gjentatte lavmolekylære ioner forbundet med spesifikke PTMer69, samt strategier for å identifisere oksoniumioner og gjentatte Y-ionmasser forbundet med ukjente glykopeptider76. Dermed er det sannsynlig at disse trinnene vil bli innlemmet i nye iterasjoner av verktøy som FragPipe, noe som gjør det enda enklere å identifisere tidligere ukjente glykosyleringshendelser innen bakterielle og eukaryote prøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

N.E.S støttes av Australian Research Council Future Fellowship (FT200100270) og et ARC Discovery Project Grant (DP210100362). Vi takker Melbourne Mass Spectrometry and Proteomics Facility of The Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute for tilgang til MS-instrumentering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
14 G Kel-F Hub point style 3 Hamilton company hanc90514
2-Chloroacetamide Sigma Aldrich Pty Ltd C0267-100G
Acetonitrile Sigma Aldrich Pty Ltd 34851-4L
Ammonium hydroxide (28%) Sigma Aldrich Pty Ltd 338818-100ML
BCA Protein Assay Reagent A Pierce 23228
BCA Protein Assay Reagent B Pierce 23224
C8 Empore SPE Sigma Aldrich Pty Ltd 66882-U An alterative vendor for C8 material is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)
Formic acid Sigma Aldrich Pty Ltd 5.33002
Isopropanol Sigma Aldrich Pty Ltd 650447-2.5L
Methanol Fisher Chemical M/4058/17
SDB-RPS Empore SPE (Reversed-Phase Sulfonate) Sigma Aldrich Pty Ltd 66886-U An alterative vendor for SDB-RPS is Affinisep (https://www.affinisep.com/about-us/)
Sodium Deoxycholate Sigma Aldrich Pty Ltd D6750-100G
ThermoMixer C Eppendorf 2232000083
trifluoroacetic acid Sigma Aldrich Pty Ltd 302031-10X1ML
Tris 2-carboxyethyl phosphine hydrochloride Sigma Aldrich Pty Ltd C4706-2G
Tris(hydroxymethyl)aminomethane Sigma Aldrich Pty Ltd 252859-500G
Trypsin/Lys-C protease mixture Promega V5073
Vacuum concentrator Labconco 7810040
ZIC-HILIC material Merck 1504580001 Resin for use in single use SPE columns can be obtain by emptying a larger form column and using the free resin

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Essentials of glycobiology. Varki, A., et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2015).
  2. Schaffer, C., Messner, P. Emerging facets of prokaryotic glycosylation. FEMS Microbiology Reviews. 41 (1), 49-91 (2017).
  3. Abu-Qarn, M., Eichler, J., Sharon, N. Not just for Eukarya anymore: Protein glycosylation in bacteria and archaea. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 544-550 (2008).
  4. Szymanski, C. M., Yao, R., Ewing, C. P., Trust, T. J., Guerry, P. Evidence for a system of general protein glycosylation in Campylobacter jejuni. Molecular Microbiology. 32 (5), 1022-1030 (1999).
  5. Koomey, M. O-linked protein glycosylation in bacteria: snapshots and current perspectives. Current Opinion in Structural Biology. 56, 198-203 (2019).
  6. Riley, N. M., Bertozzi, C. R., Pitteri, S. J. A pragmatic guide to enrichment strategies for mass spectrometry-based glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100029 (2020).
  7. Spiro, R. G. Protein glycosylation: nature, distribution, enzymatic formation, and disease implications of glycopeptide bonds. Glycobiology. 12 (4), 43-56 (2002).
  8. Hu, H., Khatri, K., Klein, J., Leymarie, N., Zaia, J. A review of methods for interpretation of glycopeptide tandem mass spectral data. Glycoconjugate Journal. 33 (3), 285-296 (2016).
  9. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: Diversity, synthesis and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (7), 448-462 (2012).
  10. Bohm, M., et al. Glycosciences.DB: An annotated data collection linking glycomics and proteomics data (2018 update). Nucleic Acids Research. 47, 1195-1201 (2019).
  11. Kawano, S., Hashimoto, K., Miyama, T., Goto, S., Kanehisa, M. Prediction of glycan structures from gene expression data based on glycosyltransferase reactions. Bioinformatics. 21 (21), 3976-3982 (2005).
  12. McDonald, A. G., Tipton, K. F., Davey, G. P. A knowledge-based system for display and prediction of O-glycosylation network behaviour in response to enzyme knockouts. PLOS Computational Biology. 12 (4), 1004844 (2016).
  13. Eichler, J., Koomey, M. Sweet new roles for protein glycosylation in prokaryotes. Trends in Microbiology. 25 (8), 662-672 (2017).
  14. Scott, N. E., et al. Simultaneous glycan-peptide characterization using hydrophilic interaction chromatography and parallel fragmentation by CID, higher energy collisional dissociation, and electron transfer dissociation MS applied to the N-linked glycoproteome of Campylobacter jejuni. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 10 (2), (2011).
  15. Russo, T. A., et al. The K1 capsular polysaccharide of Acinetobacter baumannii strain 307-0294 is a major virulence factor. Infection and Immunity. 78 (9), 3993-4000 (2010).
  16. Szymanski, C. M., Wren, B. W. Protein glycosylation in bacterial mucosal pathogens. Nature Reviews Microbiology. 3 (3), 225-237 (2005).
  17. Imperiali, B. Bacterial carbohydrate diversity - a brave new world. Current Opinion in Chemical Biology. 53, 1-8 (2019).
  18. Caval, T., Buettner, A., Haberger, M., Reusch, D., Heck, A. J. R. Discrepancies between high-resolution native and glycopeptide-centric mass spectrometric approaches: A case study into the glycosylation of erythropoietin variants. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (8), 2099-2104 (2021).
  19. Caval, T., Heck, A. J. R., Reiding, K. R. Meta-heterogeneity: Evaluating and describing the diversity in glycosylation between sites on the same glycoprotein. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100010 (2020).
  20. Thomas, D. R., Scott, N. E. Glycoproteomics: growing up fast. Current Opinion in Structural Biology. 68, 18-25 (2020).
  21. Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).
  22. Cao, W., et al. Recent advances in software tools for more generic and precise intact glycopeptide analysis. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. , (2021).
  23. Yu, A., et al. Advances in mass spectrometry-based glycoproteomics. Electrophoresis. 39 (24), 3104-3122 (2018).
  24. Reiding, K. R., Bondt, A., Franc, V., Heck, A. J. R. The benefits of hybrid fragmentation methods for glycoproteomics. Trends in Analytical Chemistry. 108, 260-268 (2018).
  25. Riley, N. M., Malaker, S. A., Driessen, M., Bertozzi, C. R. Optimal dissociation methods differ for N- and O-glycopeptides. Journal of Proteome Research. 19 (8), 3286-3301 (2020).
  26. Mao, Y., et al. Systematic evaluation of fragmentation methods for unlabeled and isobaric mass tag-labeled O-glycopeptides. Analytical Chemistry. 93 (32), 11167-11175 (2021).
  27. Lu, L., Riley, N. M., Shortreed, M. R., Bertozzi, C. R., Smith, L. M. O-Pair Search with MetaMorpheus for O-glycopeptide characterization. Nature Methods. 17 (11), 1133-1138 (2020).
  28. Choo, M. S., Wan, C., Rudd, P. M., Nguyen-Khuong, T. GlycopeptideGraphMS: Improved glycopeptide detection and identification by exploiting graph theoretical patterns in mass and retention time. Analytical Chemistry. 91 (11), 7236-7244 (2019).
  29. Maxwell, E., et al. GlycReSoft: a software package for automated recognition of glycans from LC/MS data. PLoS One. 7 (9), 45474 (2012).
  30. Ahmad Izaham, A. R., Scott, N. E. Open database searching enables the identification and comparison of bacterial glycoproteomes without defining glycan compositions prior to searching. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 19 (9), 1561-1574 (2020).
  31. Bern, M., Kil, Y. J., Becker, C. Byonic: Advanced peptide and protein identification software. Current Protocols in Bioinformatics. , Chapter 13, Unit 13.20 (2012).
  32. Na, S., Bandeira, N., Paek, E. Fast multi-blind modification search through tandem mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 11 (4), 010199 (2012).
  33. Creasy, D. M., Cottrell, J. S. Error tolerant searching of uninterpreted tandem mass spectrometry data. Proteomics. 2 (10), 1426-1434 (2002).
  34. Craig, R., Beavis, R. C. TANDEM: Matching proteins with tandem mass spectra. Bioinformatics. 20 (9), 1466-1467 (2004).
  35. Ahrné, E., Nikitin, F., Lisacek, F., Müller, M. QuickMod: A tool for open modification spectrum library searches. Journal of Proteome Research. 10 (7), 2913-2921 (2011).
  36. Shortreed, M. R., et al. Global identification of protein post-translational modifications in a single-pass database search. Journal of Proteome Research. 14 (11), 4714-4720 (2015).
  37. Chick, J. M., et al. A mass-tolerant database search identifies a large proportion of unassigned spectra in shotgun proteomics as modified peptides. Nature Biotechnology. 33 (7), 743-749 (2015).
  38. Roushan, A., et al. Peak filtering, peak annotation, and wildcard search for glycoproteomics. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 20, 100011 (2020).
  39. Chi, H., et al. Comprehensive identification of peptides in tandem mass spectra using an efficient open search engine. Nature Biotechnology. , (2018).
  40. Bittremieux, W., Laukens, K., Noble, W. S. Extremely fast and accurate open modification spectral library searching of high-resolution mass spectra using feature hashing and graphics processing units. Journal of Proteome Research. 18 (10), 3792-3799 (2019).
  41. Polasky, D. A., Yu, F., Teo, G. C., Nesvizhskii, A. I. Fast and comprehensive N- and O-glycoproteomics analysis with MSFragger-Glyco. Nature Methods. 17 (11), 1125-1132 (2020).
  42. Harding, C. M., et al. Acinetobacter strains carry two functional oligosaccharyltransferases, one devoted exclusively to type IV pilin, and the other one dedicated to O-glycosylation of multiple proteins. Molecular Microbiology. 96 (5), 1023-1041 (2015).
  43. Iwashkiw, J. A., et al. Identification of a general O-linked protein glycosylation system in Acinetobacter baumannii and its role in virulence and biofilm formation. PLoS Pathogens. 8 (6), 1002758 (2012).
  44. Scott, N. E., et al. Diversity within the O-linked protein glycosylation systems of Acinetobacter species. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 13 (9), 2354-2370 (2014).
  45. Kenyon, J. J., Hall, R. M. Variation in the complex carbohydrate biosynthesis loci of Acinetobacter baumannii genomes. PLoS One. 8 (4), 62160 (2013).
  46. Lees-Miller, R. G., et al. A common pathway for O-linked protein-glycosylation and synthesis of capsule in Acinetobacter baumannii. Molecular Microbiology. 89 (5), 816-830 (2013).
  47. Iacono, M., et al. Whole-genome pyrosequencing of an epidemic multidrug-resistant Acinetobacter baumannii strain belonging to the European clone II group. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (7), 2616-2625 (2008).
  48. Hamidian, M., et al. Insights from the revised complete genome sequences of Acinetobacter baumannii strains AB307-0294 and ACICU belonging to global clones 1 and 2. Microbial Genomics. 5 (10), 000298 (2019).
  49. Farrugia, D. N., et al. The complete genome and phenome of a community-acquired Acinetobacter baumannii. PLoS One. 8 (3), 58628 (2013).
  50. Keller, B. O., Sui, J., Young, A. B., Whittal, R. M. Interferences and contaminants encountered in modern mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 627 (1), 71-81 (2008).
  51. Batth, T. S., et al. Protein aggregation capture on microparticles enables multipurpose proteomics sample preparation. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 18 (5), 1027-1035 (2019).
  52. HaileMariam, M., et al. S-Trap, an ultrafast sample-preparation approach for shotgun proteomics. Journal of Proteome Research. 17 (9), 2917-2924 (2018).
  53. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  54. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  55. Harney, D. J., et al. Proteomic analysis of human plasma during intermittent fasting. Journal of Proteome Research. 18 (5), 2228-2240 (2019).
  56. Scott, N. E. Characterizing glycoproteins by mass spectrometry in Campylobacter jejuni. Methods in Molecular Biology. 1512, 211-232 (2017).
  57. Bian, Y., et al. Robust microflow LC-MS/MS for proteome analysis: 38000 runs and counting. Analytical Chemistry. 93 (8), 3686-3690 (2021).
  58. Diedrich, J. K., Pinto, A. F., Yates, J. R. Energy dependence of HCD on peptide fragmentation: stepped collisional energy finds the sweet spot. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (11), 1690-1699 (2013).
  59. Liu, M. Q., et al. pGlyco 2.0 enables precision N-glycoproteomics with comprehensive quality control and one-step mass spectrometry for intact glycopeptide identification. Nature Communications. 8 (1), 438 (2017).
  60. Hinneburg, H., et al. The art of destruction: Optimizing collision energies in quadrupole-time of flight (Q-TOF) instruments for glycopeptide-based glycoproteomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 27 (3), 507-519 (2016).
  61. Chambers, M. C., et al. A cross-platform toolkit for mass spectrometry and proteomics. Nature Biotechnology. 30 (10), 918-920 (2012).
  62. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. , http://www.r-project.org/index.html (2020).
  63. Brademan, D. R., Riley, N. M., Kwiecien, N. W., Coon, J. J. Interactive peptide spectral annotator: A versatile web-based tool for proteomic applications. Molecular & Cellular Proteomics: MCP. 18, 193-201 (2019).
  64. Russo, T. A., et al. The K1 capsular polysaccharide from Acinetobacter baumannii is a potential therapeutic target via passive immunization. Infection and Immunity. 81 (3), 915-922 (2013).
  65. Senchenkova, S. N., et al. Structure of the capsular polysaccharide of Acinetobacter baumannii ACICU containing di-N-acetylpseudaminic acid. Carbohydrate Research. 391, 89-92 (2014).
  66. Domon, B., Costello, C. E. A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentations in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates. Glycoconjugate Journal. 5 (4), 397-409 (1988).
  67. Harvey, D. J., Dwek, R. A., Rudd, P. M. Determining the structure of glycan moieties by mass spectrometry. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 12, Unit 12.7 (2006).
  68. Medzihradszky, K. F., Kaasik, K., Chalkley, R. J. Characterizing sialic acid variants at the glycopeptide level. Analytical Chemistry. 87 (5), 3064-3071 (2015).
  69. Kelstrup, C. D., Frese, C., Heck, A. J., Olsen, J. V., Nielsen, M. L. Analytical utility of mass spectral binning in proteomic experiments by SPectral Immonium Ion Detection (SPIID). Molecular & Cellular Proteomics:MCP. 13 (8), 1914-1924 (2014).
  70. Ahmad Izaham, A. R., et al. What are we missing by using hydrophilic enrichment? Improving bacterial glycoproteome coverage using total proteome and FAIMS analyses. Journal of Proteome Research. 20 (1), 599-612 (2021).
  71. Neue, K., Mormann, M., Peter-Katalinic, J., Pohlentz, G. Elucidation of glycoprotein structures by unspecific proteolysis and direct nanoESI mass spectrometric analysis of ZIC-HILIC-enriched glycopeptides. Journal of Proteome Research. 10 (5), 2248-2260 (2011).
  72. Mysling, S., Palmisano, G., Hojrup, P., Thaysen-Andersen, M. Utilizing ion-pairing hydrophilic interaction chromatography solid phase extraction for efficient glycopeptide enrichment in glycoproteomics. Analytical Chemistry. 82 (13), 5598-5609 (2010).
  73. Escobar, E. E., et al. Precision mapping of O-Linked N-acetylglucosamine sites in proteins using ultraviolet photodissociation mass spectrometry. Journal of the American Chemical Society. 142 (26), 11569-11577 (2020).
  74. Madsen, J. A., et al. Concurrent automated sequencing of the glycan and peptide portions of O-linked glycopeptide anions by ultraviolet photodissociation mass spectrometry. Analytical Chemistry. 85 (19), 9253-9261 (2013).
  75. Lysiak, A., Fertin, G., Jean, G., Tessier, D. Evaluation of open search methods based on theoretical mass spectra comparison. BMC Bioinformatics. 22, 65 (2021).
  76. Pabst, M., et al. A general approach to explore prokaryotic protein glycosylation reveals the unique surface layer modulation of an anammox bacterium. ISME Journal. , (2021).

Tags

Biokjemi Utgave 177 Glykosylering,Acinetobacter baumannii Åpen søking Posttranslational modifikasjoner Proteomics
Anvendelsen av åpne søkebaserte tilnærminger for identifisering av <em>Acinetobacter baumannii</em> O-tilknyttede Glycopeptides
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lewis, J. M., Coulon, P. M. L.,… More

Lewis, J. M., Coulon, P. M. L., McDaniels, T. A., Scott, N. E. The Application of Open Searching-based Approaches for the Identification of Acinetobacter baumannii O-linked Glycopeptides. J. Vis. Exp. (177), e63242, doi:10.3791/63242 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter