Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Rensing av endogene Drosophila transiente reseptorpotensialkanaler

Published: December 28, 2021 doi: 10.3791/63260
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Shenzhen Key Laboratory for Neuronal Structural Biology, Biomedical Research Institute, Shenzhen Peking University-The Hong Kong University of Science and Technology Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Basert på monteringsmekanismen til INAD-proteinkomplekset, ble det i denne protokollen utviklet en modifisert affinitetsrensing pluss konkurransestrategi for å rense den endogene Drosophila TRP-kanalen.

Abstract

Drosophila fototransduksjon er en av de raskeste kjente G-proteinkoblede signalveiene. For å sikre spesifisiteten og effektiviteten til denne kaskaden, binder kalsium (Ca2+)-permeabel kationkanal, transient reseptorpotensial (TRP), tett til stillasproteinet, inaktivering-no-after-potential D (INAD), og danner et stort signalproteinkompleks med øyespesifikk proteinkinase C (ePKC) og fosfolipase Cβ/No-reseptorpotensial A (PLCβ/NORPA). Imidlertid er de biokjemiske egenskapene til Drosophila TRP-kanalen fortsatt uklare. Basert på monteringsmekanismen til INAD-proteinkomplekset ble det utviklet en modifisert affinitetsrensing pluss konkurransestrategi for å rense den endogene TRP-kanalen. Først ble det rensede histidinmerkede NORPA 863-1095-fragmentet bundet til Ni-perler og brukt som agn for å trekke ned det endogene INAD-proteinkomplekset fra Drosophila hodehomogenater. Deretter ble overdreven renset glutation S-transferase (GST) -merket TRP 1261-1275 fragment lagt til Ni-perlene for å konkurrere med TRP-kanalen. Til slutt ble TRP-kanalen i supernatanten skilt fra det overdrevne TRP 1261-1275-peptidet ved størrelseseksklusjonskromatografi. Denne metoden gjør det mulig å studere gatingmekanismen til Drosophila TRP-kanalen fra både biokjemiske og strukturelle vinkler. Elektrofysiologiegenskapene til rensede Drosophila TRP-kanaler kan også måles i fremtiden.

Introduction

Fototransduksjon er en prosess der absorberte fotoner omdannes til elektriske koder for nevroner. Den videresender utelukkende opsiner og følgende G-proteinkoblede signalkaskade hos både virveldyr og virvelløse dyr. I Drosophila, ved å bruke sine fem PDZ-domener, organiserer stillasproteininaktivering-no-after-potential D (INAD) et supramolekylært signalkompleks, som består av en transient reseptorpotensial (TRP) kanal, fosfolipase Cβ / No reseptorpotensial A (PLCβ / NORPA) og øyespesifikk proteinkinase C (ePKC) 1. Dannelsen av dette supramolekylære signalkomplekset garanterer riktig subcellulær lokalisering, høy effektivitet og spesifisitet av Drosophila fototransduksjonsmaskineri. I dette komplekset fungerer lysfølsomme TRP-kanaler som nedstrøms effektorer av NORPA og medierer kalsiumtilstrømning og depolarisering av fotoreseptorer. Tidligere studier viste at åpningen av Drosophila TRP-kanalen er mediert av protoner, forstyrrelse av det lokale lipidmiljøet eller mekanisk kraft 2,3,4. Drosophila TRP-kanalen interagerer også med calmodulin5 og moduleres av kalsium ved både positiv og negativ tilbakemelding 6,7,8.

Så langt var elektrofysiologistudier på gatingmekanismen til Drosophila TRP og TRP-lignende (TRPL) kanaler basert på utskårne membranplaster, helcelleopptak fra dissosierte wild-type Drosophila fotoreceptorer og hetero-uttrykte kanaler i S2, SF9 eller HEK-celler 2,9,10,11,12,13, men ikke på rensede kanaler. Den strukturelle informasjonen til Drosophila TRP-kanalen i full lengde er også uklar. For å studere de elektrofysiologiske egenskapene til renset protein i et rekonstituert membranmiljø og for å få strukturell informasjon om Drosophila TRP-kanalen i full lengde, er det nødvendig første trinnet å oppnå rensede TRP-kanaler i full lengde, i likhet med metodene som brukes i pattedyrs TRP-kanalstudier 14,15,16,17.

Nylig, basert på monteringsmekanismen til INAD-proteinkomplekset18,19,20, ble en affinitetsrensing pluss konkurransestrategi først utviklet for å rense TRP-kanalen fra Drosophila hodehomogenater av streptavidinperler5. Med tanke på den lave kapasiteten og dyre kostnaden for streptavidinperler, introduseres en forbedret renseprotokoll her som bruker His-tagged agnprotein og tilsvarende lavpris Ni-perler med mye høyere kapasitet. Den foreslåtte metoden vil bidra til å studere TRP-kanalens gatingmekanisme fra strukturelle vinkler og å måle de elektrofysiologiske egenskapene til TRP-kanalen med rensede proteiner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Rensing av GST-merkede TRP og His-taggede NORPA-fragmenter

  1. Rens GST-merket TRP 1261-1275 fragment
    1. Transformer pGEX 4T-1 TRP 1261-1275 plasmid10 til Escherichia coli (E. coli) BL21 (DE3) celler ved hjelp av CaCl2 varmesjokk transformasjonsmetode21. Inokulere en enkelt koloni i 10 ml Luria Bertani (LB) medium og vokse over natten ved 37 ° C. Deretter forsterker du 10 ml såkultur i 1 liter LB medium ved 37 °C.
    2. Etter at den optiske tettheten (OD600) av cellene når 0,5, kjøl ned cellene til 16 ° C og tilsett 0,1 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG; endelig konsentrasjon) for å indusere overekspresjonen av målproteinet og inkubere ved 16 ° C i 18 timer.
    3. Etter overekspresjon ble pellet 1 liter dyrkede celler ved sentrifugering ved 3 993 × g i 20 minutter og resuspendert i 40 ml fosfatbufret saltvannsbuffer (PBS).
    4. Legg de resuspenderte cellene i en høytrykkshomogenisator forkjølt ved 4 °C. Øk homogenisatortrykket sakte til 800 bar. Åpne innløpskranen og la de resuspenderte cellene passere sirkulært gjennom en ventil med svært smale spalter.
      MERK: Cellene homogeniseres av de høye skjærekreftene forårsaket av et stort trykkfall og kavitasjon.
    5. Last 5 ml glutationperler til en tyngdekraftstrømkolonne og vask perlene med 50 ml PBS-buffer totalt tre ganger.
    6. Sentrifuger cellelysatet fra høytrykkshomogenisatoren ved 48 384 x g. Tilsett supernatanten til sentrifugert cellelysat (40 ml) til de likevektede glutationperlene i gravitasjonsstrømningskolonnen og inkuber i 30 minutter ved 4 °C. Resuspender glutationperlene hvert 10. minutt.
    7. Etter 30 minutters inkubasjon, åpne kolonneutløpskranen for å skille perlene og gjennomstrømningsfraksjonen. Kast gjennomstrømningsfraksjonen. Skyll de resterende glutationperlene to ganger med 50 ml PBS-buffer.
    8. Tilsett 15 ml elueringsbuffer til glutationperlene og rug i 30 minutter. Resuspender perlene hvert 10. minutt.
    9. Etter 30 minutters inkubasjon eluerer du det GST-merkede TRP 1261-1275-fragmentet i et 50 ml konisk rør og laster i en størrelseseksklusjonskolonne (forberedelsesgrad), som er likevektet ved bruk av 50 mM Tris (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT) buffer.
    10. Hold elueringsstrømningshastigheten til størrelseseksklusjonskolonnen til 3 ml / min. Samle de emulerte proteinene med en hastighet på 5 ml / rør.
    11. Identifiser toppen av målproteinet i størrelseseksklusjonskolonnen ved å analysere UV-absorpsjonssignalene ved 280 nm og verifiser ved SDS-PAGE gelanalyse (elektroforeseparametere: 150 V for stablingsgelen; 200 V for oppløsningsgelen). Beis gelen med Coomassie blå R250.
    12. Konsentrer det rensede GST-merkede TRP 1261-1275-fragmentet fra størrelseseksklusjonskolonnen til 1 ml ved hjelp av en 15 ml ultrafiltreringsspinnkolonne sentrifugert ved 3000 x g ved 4 °C i en nedkjølt sentrifuge på skrivebordet.
    13. Bestem konsentrasjonen av konsentrert protein ved hjelp av Beer-Lambert Law. Mål UV-absorpsjonen av GST-merket TRP 1261-1275-fragment ved 280 nm ved hjelp av et spektrofotometer.
    14. Oppnå utryddelseskoeffisienten ved 280 nm ved å importere proteinsekvensene til Protparam-programmet (https://web.expasy.org/protparam/). Vanligvis gir 1 L kultur av GST-merket TRP 1261-1275 1 ml 600 μM protein (6 x 10-7 mol). Se tabell 1 for nødvendige materialer.
  2. Rensing av His-tagged NORPA 863-1095 fragment
    1. Transformer pETM.3C NORPA 863-1095 plasmid20 til E. coli BL21 (DE3) celler ved hjelp av CaCl2 varmesjokk transformasjonsmetode21. Inokuler en enkelt koloni i 10 ml LB medium og vokse over natten ved 37 ° C. Deretter forsterker du 10 ml såkulturen i 1 liter LB medium ved 37 °C.
    2. Etter at OD600 av cellene når 0,5, kjøl ned cellene til 16 ° C og tilsett 0,1 mM IPTG (endelig konsentrasjon) for å indusere overuttrykk av målprotein og inkubere ved 16 ° C i 18 timer.
    3. Etter overekspresjon pellets 1 liter dyrkede celler ved sentrifugering ved 3,993 x g i 20 minutter og resuspenderer i 40 ml bindingsbuffer. Deretter lyses de resuspenderte cellene i en høytrykkshomogenisator ved 4 °C som beskrevet i trinn 1.1.4.
    4. Legg 5 ml Ni-perler i en gravitasjonsstrømkolonne og vask tre ganger med 50 ml bindingsbuffer.
    5. Sentrifuger cellelysatet fra høytrykkshomogenisatoren ved 48 384 x g. Tilsett supernatanten til sentrifugert cellelysat til de likevektede Ni-perlene i gravitasjonsstrømningskolonnen og inkuber i 30 minutter ved 4 °C. Resuspender Ni-perlene hvert 10. minutt.
    6. Etter 30 minutters inkubasjon, åpne kolonneutløpskranen for å skille perlene og gjennomstrømningsfraksjonen. Kast gjennomstrømningsfraksjonen og vask de resterende Ni-perlene to ganger med 50 ml vaskebuffer.
    7. Tilsett 15 ml elueringsbuffer til Ni-perlene og rug i 30 minutter. Resuspender Ni-perlene hvert 10. minutt.
    8. Etter 30 minutters inkubasjon samler du det eluterte His-taggede NORPA 863-1095-fragmentet i et 50 ml konisk rør og lastes inn i en størrelseseksklusjonskolonne (prepareringsgrad), som likevektes ved bruk av 50 mM Tris (pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT).
    9. Hold elueringsstrømningshastigheten til størrelseseksklusjonskolonnen til 3 ml / min. Samle det eluerte proteinet med en hastighet på 5 ml / rør.
    10. Identifiser toppen av målproteinet i størrelseseksklusjonskolonnen ved å analysere UV-absorpsjonssignalene ved 280 nm og verifiser ved SDS-PAGE gelanalyse (elektroforeseparametere: 150 V for stablingsgelen; 200 V for oppløsningsgelen). Beis gelen med Coomassie blå R250.
    11. Konsentrer det rensede His-taggede NORPA 863-1095-fragmentet fra størrelseseksklusjonskolonnen til 1 ml ved hjelp av en 15 ml ultrafiltreringsspinnkolonne sentrifugert ved 3000 x g ved 4 °C i en skrivebordskjølt sentrifuge.
    12. Bestem konsentrasjonen av konsentrert protein ved hjelp av Beer-Lambert Law. Mål UV-absorpsjonen av His-tagged NORPA 863-1095 fragment ved 280 nm ved hjelp av et spektrofotometer.
    13. Oppnå utryddelseskoeffisienten ved 280 nm ved å importere proteinsekvensene til Protparam-programmet (https://web.expasy.org/protparam/). Typisk gir 1 L kultur av His-tagged NORPA 863-1095 fragment 1 ml 600 μM protein (6 x 10-7 mol). Se tabell 2 for nødvendige materialer.

2. Forberedelse av Drosophila hoder

  1. Samle voksne fluer i 50 ml koniske sentrifugeringsrør ved hjelp av CO 2-bedøvelsesmetoden22,23; frys umiddelbart inn flytende nitrogen i 10 minutter og oppbevar i en fryser på -80 °C.
  2. Etter å ha samlet et tilstrekkelig antall fluer, rist kraftig de frosne 50 ml koniske rørene for hånd for å skille fluenes ben, hoder, vinger og kropper. Overfør blandingen til tre sekvensielt stablede forkjølte sikter i rustfritt stål (henholdsvis 20/30/40 maskevidde) og rist siktene.
  3. Deretter, siden hodene ikke kan passere gjennom 40-nettingsikten, bruk en børste for å feie fluehodene av 40-nettingsikten, overfør dem til 50 ml koniske rør og lagre dem ved -80 ° C.
  4. Samle fluene og hodene deres kontinuerlig og oppbevar dem i en fryser på -80 °C til de når den nødvendige mengden som trengs for eksperimentering (0,5 g). Vanligvis, for å samle 0,5 g hoder, er det nødvendig med 35 ml fluer i et 50 ml konisk rør. Se tabell 3 for nødvendige materialer.

3. Drosophila TRP kanal rensing

  1. Vei totalt 0,5 g hoder og homogeniser helt i flytende nitrogen ved hjelp av en forkjølt mørtel-pestle. Løs opp de homogeniserte hodene i 10x v/w lysisbuffer (5 ml), inkuber i en shaker ved 4 °C i 20 minutter, og sentrifuger deretter ved 20 817 x g i 20 minutter ved 4 °C.
  2. Samle spin-down supernatanten ("20817 g S", figur 4) og sentrifuger den ytterligere ved 100 000 x g i 60 minutter ved 4 °C. Bruk spin-down supernatant ("100 000 g S", figur 4) for følgende nedtrekksanalyse.
  3. Tilsett 1 ml Ni-perler i gravitasjonsstrømningskolonnen og vask perlene med 10 ml dobbeltdestillert H2O (ddH2O) ved 4 °C totalt tre ganger. Utjevne perlene med 10 kolonnevolumer lysisbuffer tre ganger ved 4 °C.
  4. Tilsett 500 μL 600 μM renset His-merket NORPA 863-1095 protein (3 x 10-7 mol) i Ni-kolonnen og rug i 30 minutter ved 4 °C. Resuspender perlene hvert 10. minutt.
  5. Åpne kolonneutløpskranen for å skille perlene og gjennomstrømningsfraksjonen. Ta gjennomstrømningsfraksjonen for SDS-PAGE-analyse (NORPA F, figur 4). I denne delen immobiliseres agnproteinene på Ni-perlene.
  6. Vask Ni-perlene med 10 kolonnevolumer lysisbuffer (10 ml) ved 4 °C og behold vaskefraksjonen for SDS-PAGE-analyse (Vask 1, figur 4A). Gjenta trinnene ovenfor og behold prøven for SDS-PAGE-analyse (Vask 2, figur 4A). I denne delen fjernes de overdrevne agnproteinene på Ni-perlene.
  7. Tilsett supernatanten av Drosophila hodehomogenat etter 100 000 x g sentrifugering i Ni-kolonnen ved 4 °C, hvor det His-merkede NORPA 863-1095-fragmentet er immobilisert.
  8. Inkuber supernatanten med Ni-perlene ved 4 °C i 30 minutter. Resuspender perlene hvert 10. minutt. Åpne deretter kolonneutløpskranen for å skille perlene og gjennomstrømningsfraksjonen.
  9. Samle supernatanten for SDS-PAGE-analyse (Dro head lysis F, figur 4A). I dette avsnittet fanges INAD-proteinkompleksene (INAD/TRP/ePKC) i hodehomogenatene opp av de immobiliserte NORPA 863-1095-fragmentene på Ni-perlene.
  10. Vask Ni-perlene med 10 kolonnevolumer lysisbuffer (10 ml) ved 4 °C og hold supernatanten fra gravitasjonsutfelling for SDS-PAGE-analyse (Vask 3, figur 4A). Gjenta trinnene ovenfor og samle supernatanten for SDS-PAGE-analyse (Vask 4, figur 4A). I denne delen fjernes de ubundne proteinene på Ni-perlene.
  11. Tilsett 500 μL 600 μM GST-merket TRP 1261-1275 protein (3 x 10-7 mol) i Ni-perlene og rug i 20 minutter ved 4 °C. Resuspender perlene hvert 10. minutt.
  12. Samle den eluterte fraksjonen fra gravitasjonskolonnen (TRP E1, figur 4B), som inneholder den endogene Drosophila TRP-kanalen. Gjenta trinnene ovenforog samle elueringsfraksjonen (TRP E2, figur 4B). I dette trinnet, ved å bruke de GST-merkede TRP 1261-1275-fragmentene som konkurrent, elueres TRP-kanalene fra de fangede INAD-proteinkompleksene (INAD / TRP / ePKC) på Ni-perlene.
  13. Vask Ni-perlene med 10 kolonnevolumer bindingsbuffer (10 ml; Tabell 1) ved 4 °C og samle opp vaskefraksjonen for SDS-PAGE-analyse (Vask 5, figur 4B).
  14. Tilsett 500 μL elueringsbuffer (tabell 1) i Ni-perlene og rug i 20 minutter ved 4 °C. Samle elueringsfraksjonen fra gravitasjonsstrømningskolonnen (NORPA E1, figur 4B). Gjenta trinnene ovenfor, og samle elueringsfraksjonen (NORPA E2, figur 4B).
  15. Ved hjelp av elueringsbufferen eluerer du det His-taggede NORPA 863-1095-fragmentet sammen med INAD/ePKC-proteinkompleksene. Deretter resuspenderer Ni-perlene i 500 μL bindingsbuffer.
  16. Ta de resuspended Ni-perlene for å kjøre SDS-PAGE (farget av Coomassie blå R250) for å analysere effektiviteten til eluering og vurdere om elueringsbufferen fungerer (perler, figur 4B). Se tabell 4 for materialer som trengs.

4. Størrelse-ekskludering kolonne rensing av Drosophila TRP kanal

  1. Installer en størrelseseksklusjonskolonne (analytisk karakter) på proteinrensingssystemet. Utjevne kolonnen med kolonnebufferen (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 2 mM DTT, 0,75 mM DDM), som filtreres av et filter på 0,45 μm.
  2. Konsentrer TRP E1- og E2-fraksjonen fra trinn 3,14 ved hjelp av en 4 ml ultrafiltreringsspinnkolonne, sentrifugert ved 3000 x g ved 4 °C i en nedkjølt sentrifuge.
  3. Skyll prøvesløyfen med kolonnebufferen og last prøven inn i prøvesløyfen. Injiser prøven i størrelseseksklusjonskolonnen og eluer proteinene med riktig strømningshastighet (0,5 ml / min).
  4. Identifiser toppen av målproteinet ved absorpsjon ved 280 nm og kjør en SDS-PAGE gel for å oppdage den rensede endogene Drosophila TRP-kanalen (figur 5). Se tabell 5 for nødvendige materialer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I denne artikkelen er det vist en proteinrensingsmetode for å rense endogen Drosophila TRP-kanal (figur 1).

Først påføres rekombinant proteinuttrykk og rensing for å oppnå agn og konkurrentproteiner. Deretter uttrykkes et GST-merket TRP 1261-1275-fragment i E. coli BL21 (DE3) celler i LB-medium og renses ved hjelp av glutationperler og en størrelseseksklusjonskolonne (figur 2). Prøvene ble verifisert ved hjelp av SDS-PAGE-analyse med Coomassie blå R250-farging. I SDS-PAGE prøveprepareringsprosessen blandes 30 μL proteinprøve med 10 μL 4x innlastingsfargestoff og kokes ved 100 °C i 10 minutter. Deretter lastes 15 μL kokt prøve individuelt inn i hver brønn. Det His-taggede NORPA 863-1095-fragmentet uttrykkes også tilsvarende i E. coli BL21 (DE3)-celler i LB-medium og renses med Ni-perler og størrelseseksklusjonskolonne (figur 3). Den rensede GST-merkede TRP 1261-1275 og His-taggede NORPA 863-1095 er konsentrert for rensing av den endogene Drosophila TRP-kanalen.

For det andre samles Drosophila-hoder og homogeniseres i flytende nitrogen ved hjelp av en forkjølt mørtel-pestle, og oppløses deretter i 10x v / w lysisbuffer (tabell 4). Det oppløste hodehomogenatet inkuberes i en shaker ved 4 °C i 20 minutter og sentrifugeres ved 20 817 x g i 20 minutter ved 4 °C. Spin-down supernatanten (20817 g S, figur 4A) samles og sentrifugeres videre ved 100 000 x g i 60 minutter ved 4 °C. Den andre spin-down supernatanten (100 000 g S, figur 4A) brukes til den påfølgende nedtrekksanalysen.

Til slutt, basert på prinsippene om nedtrekking og konkurranseanalyse, brukes affinitetsrensing pluss konkurransestrategi for å rense den endogene TRP-kanalen. Det rensede His-taggede NORPA 863-1095-fragmentet bindes til Ni-perler og brukes som agn for å trekke ned de endogene INAD-proteinkompleksene fra Drosophila hodehomogenater. Deretter tilsettes overdreven renset GST-merket TRP 1261-1275-fragment for å konkurrere om TRP-kanalen fra de fangede INAD-kompleksene på Ni-perlene (TRP E1, TRP E2, figur 4B). Til slutt skilles den eluterte TRP-kanalen fra det overdrevne GST-merkede TRP 1261-1275-peptidet ved størrelseseksklusjonskromatografi (figur 5). I SDS-PAGE prøveprepareringsprosessen blandes 30 μL proteinprøve med 10 μL 4x innlastingsfargestoff og kokes ved 100 °C i 10 minutter. Deretter lastes prøven på 15 μL individuelt inn i hver brønn. Som et biprodukt kan INAD-ePKC-NORPA 863-1095-kompleksene også oppnås ved å eluere Ni-perlene etter TRP 1261-1275 peptidkonkurranse (NORPA E1, NORAP E2, figur 4B). Ved hjelp av denne metoden er det typiske utbyttet av den endelige rensede Drosophila TRP-kanalen fra 0,5 g fluehoder 50 μL 3 μM TRP-protein (1,5 x 10-10 mol). Hvis det er behov for flere rensede TRP-kanaler, oppskaler mengden fluehoder, Ni-perler, agnprotein og konkurrent tilsvarende.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk diagram for rensing av endogene Drosophila TRP-kanal. (A) Renset His-merket NORPA 863-1095 proteiner immobiliseres på Ni-perlene. (B) Drosophila-hoder homogeniseres og spin-down supernatanten etter 100 000 x g sentrifugering tilsettes de NORPA-bundne Ni-perlene, der NORPA 863-1095-proteinet fungerer som agn for å fange de endogene INAD-proteinkompleksene (INAD/TRP/ePKC). (C) Det GST-merkede TRP 1261-1275-fragmentet tilsettes for å konkurrere om den endogene Drosophila TRP-kanalen fra de fangede INAD-proteinkompleksene. (D) Det eluterte TRP-proteinet renses ytterligere av en størrelseseksklusjonskolonne for å skille det overdrevne GST-merkede TRP 1261-1275-fragmentet. De røde pilene markerer henholdsvis elueringsposisjonene til TRP-kanalen og det GST-merkede TRP 1261-1275-fragmentet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Rensing av GST-merket TRP-CT 1261-1275 protein ved glutationperler og størrelseseksklusjonskromatografi. (A) Renseprofil av GST-merket TRP-CT 1261-1275 protein i en størrelseseksklusjonskolonne (preparatgrad). Fraksjonene samles ved 5 ml / rør. Fraksjonene i pilposisjon (rør 44-48) samles og konsentreres for følgende rensing av den endogene TRP-kanalen. (B) Coomassie blå R250 farget SDS-PAGE gel som viser GST-merket TRP 1261-1275 fragment i Glutathione-perler affinitet rensing og påfølgende størrelse-utelukkelse kolonne rensing. Pilen fremhever posisjonen til det GST-merkede TRP 1261-1275-fragmentet i SDS-PAGE-gelen. Forkortelser: P: pellet fra E. coli. BL21 (DE3) cellelysat etter homogenisering i PBS-buffer og sentrifugering ved 48 384 x g; S: supernatant fra E. coli. BL21 (DE3) cellelysat etter homogenisering og sentrifugering ved 48 384 x g; F: gjennomstrømningsfraksjon etter tidligere S-fraksjon inkubert med glutationperler i 30 minutter ved 4 °C; W1 og W2: den første og andre vaskefraksjonen med 10 kolonnevolumer PBS-buffer; B: Ikke-eluert protein på de resuspenderte glutationperlene analyseres av SDS-PAGE gel for å evaluere elueringseffektiviteten; E: elueringsfraksjon fra glutationperler ved elueringsbuffer. Bufferoppskriften for GST-merket proteinrensing er beskrevet i tabell 1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Rensing av His-tagged NORPA 863-1095 protein med Ni-perler og størrelseseksklusjonskromatografi. (A) Renseprofil av His-tagged NORPA 863-1095 protein i en størrelseseksklusjonskolonne. Strømningshastighet = 3 ml/min. Fraksjonene samles ved 5 ml / rør. Fraksjonene i pilposisjon (rør 44-49) samles og konsentreres for følgende rensing av den endogene TRP-kanalen. (B) Coomassie blå R250 farget SDS-PAGE gel som viser det His-merkede NORPA 863-1095 proteinet i Ni-kolonne rensing og påfølgende størrelse-eksklusjon kolonne rensing. Pilen markerer posisjonen til det His-taggede NORPA 863-1095-proteinet i SDS-PAGE gelen. Forkortelser: P: pellet fra E. coli. BL21 (DE3) cellelysat etter homogenisering i bindingsbuffer og sentrifugering ved 48 384 x g; S: supernatantfraksjon fra E. coli. BL21 (DE3) cellelysat etter homogenisering og sentrifugering ved 48 384 x g; F: gjennomstrømningsfraksjon etter at den forrige S-fraksjonen inkuberes med Ni-perler i 30 minutter ved 4 °C; W1 og W2: den første og andre vaskefraksjonen med 10 kolonnevolumer vaskebuffer; B: U-eluert protein på de resuspenderte Ni-perlene etter eluering; E: elueringsfraksjoner fra Ni-perler ved elueringsbufferen. Bufferoppskriften for His-tagged proteinrensing er oppført i tabell 2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Rensing av endogen Drosophila TRP-kanal. De innsamlede prøvene fra hvert trinn analyseres av SDS-PAGE og farges med Coomassie blå R-250 fargestoff. (A) 20817 g S: supernatantfraksjon av hodehomogenater etter 20 817 x g sentrifugering; NORPA F: gjennomstrømningsfraksjon av Ni-perler etter His-tagged NORPA 863-1095 fragmentbinding; Wash1 og Wash2: den første og andre vaskefraksjonen av Ni-perler med lysisbuffer etter His-merket NORPA 863-1095 binding; 100 000 g S: den forrige 20 817 g S supernatanten sentrifugeres ytterligere ved 100 000 x g og supernatanten samles inn for SDS-PAGE; Dro hodelyse F: gjennomstrømningsfraksjon av Ni-perler etter inkubering med 100 000 g S-prøven; Wash3 og Wash4: vask fraksjoner av Ni-perler med lysisbuffer etter inkubering med 100 000 g S prøve. (B) TRP E1 og E2: den første og andre eluterte TRP-kanalfraksjonen etter GST-merket TRP 1261-1275-fragment; Wash5: vaske fraksjoner av Ni-perler ved bindingsbuffer etter konkurranse av GST-merket TRP 1261-1275; NORPA E1 og E2: den første og andre elueringsfraksjonen av His-taggede NORPA 863-1095-fragmenter med fangede INAD/ePKC-komplekser; perler: u-eluert protein som holder seg i de resuspenderte Ni-perlene etter elueringsbufferbehandling. Bufferoppskriften for endogen Drosophila TRP-kanalrensing er beskrevet i tabell 4. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Rensing av endogent Drosophila TRP-kanalprotein ved størrelseseksklusjonskromatografi. (A) Renseprofil av endogent Drosophila TRP-kanalprotein i størrelseseksklusjonskolonne. Strømningshastighet = 0,5 ml/min. Fraksjonene ble samlet ved 0,5 ml/rør. Fraksjonene i pilposisjon (1E8-1F2) ble samlet og konsentrert. (B) Coomassie blå R-250 farget SDS-PAGE gel som viser det endogene Drosophila TRP-kanalproteinet etter rensing av størrelseseksklusjonskolonne. Posisjonen til renset endogent Drosophila TRP-kanalprotein fremheves av den røde pilen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Materialer som trengs for rensing av det GST-merkede TRP 1261-1275-fragmentet. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Materialer som trengs for rensing av det His-taggede NORPA 863-1095-fragmentet. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 3: Materialer som trengs for forberedelse av Drosophila hoder. Vennligst klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 4: Materialer som trengs for rensing av Drosophila TRP-kanal.

Tabell 5: Materialer som trengs for rensing av størrelseseksklusjonskolonnen for Drosophila TRP-kanalen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

INAD, som inneholder fem PDZ-domener, er kjernearrangøren av Drosophila fototransduksjonsmaskineri. Tidligere studier viste at INAD PDZ3 binder seg til TRP-kanalen C-terminal hale med utsøkt spesifisitet (KD = 0,3 μM)18. INAD PDZ45 tandem interagerer med NORPA 863-1095 fragment med ekstremt høy bindingsaffinitet (KD = 30 nM). Disse funnene gir et solid biokjemisk grunnlag for å utforme strategien affinitetsrensing pluss konkurranse, som gjør at NORPA CC-PBM-fragmentet kan brukes som nedtrekks agn, mens TRP C-terminalhalen (fragment 1261-1275) fungerer som et konkurrerende reagens. Derfor er det første kritiske punktet for denne metoden å forstå monteringsmekanismen til INAD-komplekset og oppnå nok NORPA- og TRP-fragmenter. Samtidig, siden TRP-kanalen er membranproteinet som må ekstraheres fra membranen og stabiliseres i oppløsning, er bruken av vaskemiddel det andre kritiske punktet i denne metoden. Som et populært vaskemiddel for strukturelle og funksjonelle studier av TRP-kanaler 24,25, brukes n-Dodecyl-B-D-Maltosid (DDM) i denne metoden. Hvis renseresultatene ikke er tilfredsstillende, må egenskapene til agnproteinet, konkurrentproteinet og vaskemiddelet kontrolleres nøye. I tillegg kan ekstraksjonseffektiviteten til TRP-kanalene spores av western blot ved bruk av TRP-antistoffet.

I en tidligere studie5 ble dyre streptavidinperler brukt til å rense TRP-kanalen fra fluehodeekstrakter, noe som begrenser rutinemessig rensing i laboratoriet. Derfor ble metoden forbedret ved å bruke et His-merket NORPA 863-1095 fragment kombinert med Ni-perler for å redusere kostnadene og øke utbyttet. For tiden er utbyttet av den rensede TRP-kanalen i den forbedrede metoden tilstrekkelig til å gjennomføre et transmisjonselektronmikroskop (TEM) negativt fargeeksperiment, hvor de rensede TRP-kanalene danner tetramerer (data ikke vist), noe som indikerer at renseprosessen ikke forstyrrer tetramerdannelsen av TRP-kanaler. Derfor vil denne protokollen være potensielt egnet for fremtidige kryo-EM- og elektrofysiologieksperimenter.

Men siden konkurrentene som ble brukt i forsøkene (NORPA 863-1095-fragmentet, TRP 1261-1275-fragmentet) har lignende bindingsaffiniteter med villtypeproteiner, er begrensningen av denne metoden at massive konkurrerende proteiner og perler må brukes til å trekke ned målproteinet. Det vil ikke være praktisk for laboratorier som ikke kan rense agn i stor skala.

En potensiell fremtidig anvendelse av denne metoden vil være å studere den strukturelle informasjonen til Drosophila TRP-kanalen ved hjelp av Cryo-EM-teknikker. I tillegg er det også mulig å måle de elektrofysiologiske egenskapene til rensede endogene TRP-kanaler i den kunstige dobbeltlags lipidmembranen. Videre vil det i dette rekonstituerte modellsystemet være interessant å karakterisere de elektrofysiologiske egenskapene til rensede endogene TRP-kanaler ved å modulere INAD-komplekssammensetningen og lipidsammensetningen. Til slutt, kombinert med strukturell informasjon og elektrofysiologiske egenskaper, kan Gating- og reguleringsmekanismene til TRP-kanalen undersøkes nøye i fremtiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China (nr. 31870746), Shenzhen Basic Research Grants (JCYJ20200109140414636) og Natural Science Foundation of Guangdong Province, Kina (nr. 2021A1515010796) til WL. Vi takker LetPub (www.letpub.com) for språklig hjelp under utarbeidelsen av dette manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bacterial strains
BL21(DE3) Competent Cells Novagen 69450 Protein overexpression
Experiment models
D.melanogaster: W1118 strain Bloomington Drosophila Stock Center BDSC:3605 Drosophila head preparation
Material
20/30/40 mesh stainless steel sieves Jiufeng metal mesh company GB/T6003.1 Drosophila head preparation
30% Acrylamide-N,N′-Methylenebisacrylamide(29:1) Lablead A3291 SDS-PAGE gel preparation
Ammonium Persulfate Invitrogen HC2005 SDS-PAGE gel preparation
Cocktail protease inhibitor Roche 05892953001 Protease inhibitor
Coomassie brilliant blue R-250 Sangon Biotech A100472-0025 SDS-PAGE gel staining
DL-Dithiothreitol (DTT) Sangon Biotech A620058-0100 Size-exclusion column buffer preparation
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) Sangon Biotech A500838-0500 Size-exclusion column buffer preparation
Glycine Sangon Biotech A610235-0005 SDS-PAGE buffer preparation
Glutathione Sepharose 4 Fast Flow beads Cytiva 17513202 Affinity chromatography
Imidazole Sangon Biotech A500529-0001 Elution buffer preparation for Ni-column
Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG) Sangon Biotech A600168-0025 Induction of protein overexpression
LB Broth Powder Sangon Biotech A507002-0250 E.coli. cell culture
L-Glutathione reduced (GSH) Sigma-aldrich G4251-100G Elution buffer preparation for Glutathione beads
Ni-Sepharose excel beads Cytiva 17371202 Affinity chromatography
N-Dodecyl beta-D-maltoside (DDM) Sangon Biotech A610424-001 Detergent for protein purification
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED) Sigma-aldrich T9281-100ML SDS-PAGE gel preparation
PBS Sangon Biotech E607008-0500 Homogenization buffer for E.coli. cell
PMSF Lablead P0754-25G Protease inhibitor
Prestained protein marker Thermo Scientific 26619/26616 Prestained protein ladder
Size exclusion column (preparation grade) Cytiva 28989336 HiLoad 26/60 Superdex 200 PG column
Size exclusion column (analytical grade) Cytiva 29091596 Superose 6 Increase 10/300 GL column
Sodium chloride Sangon Biotech A501218-0001 Protein purification buffer preparation
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Sangon Biotech A500228-0001 SDS-PAGE gel/buffer preparation
Tris base Sigma-aldrich T1503-10KG Protein purification buffer preparation
Ultrafiltration spin column Millipore UFC901096/801096 Protein concentration
Equipment
Analytical Balance DENVER APX-60 Metage of Drosophila head
Desk-top high-speed refrigerated centrifuge for 15mL and 50mL conical centrifugation tubes Eppendorf 5810R Protein concentration
Desk-top high-speed refrigerated centrifuge 1.5mL centrifugation tubes Eppendorf 5417R Centrifugation of Drosophila head lysate after homogenization
Empty gravity flow column (Inner Diameter=1.0cm) Bio-Rad 738-0015 TRP protein purification
Empty gravity flow column (Inner Diameter=2.5cm) Bio-Rad 738-0017 Bait and competitor protein purification from E.coli.
Gel Documentation System Bio-Rad Universal Hood II Gel Doc XR System SDS-PAGE imaging
High-speed refrigerated centrifuge Beckman coulter Avanti J-26 XP Centrifugation of E.coli. cells/cell lysate
High pressure homogenizer UNION-BIOTECH UH-05 Homogenization of E.coli. cells
Liquid nitrogen tank Taylor-Wharton CX-100 Drosophila head preparation
Protein purification system Cytiva AKTA purifier Protein purification
Refrigerator (-80°C) Thermo 900GP Drosophila head preparation
Spectrophotometer MAPADA UV-1200 OD600 measurement of E.coli. cells
Spectrophotometer Thermo Scientific NanoDrop 2000c Determination of protein concentration
Ultracentrifuge Beckman coulter Optima XPN-100 Ultracentrifuge Ultracentrifugation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tsunoda, S., et al. A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade. Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).
  2. Huang, J., et al. Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors. Current Biology: CB. 20 (3), 189-197 (2010).
  3. Chyb, S., Raghu, P., Hardie, R. C. Polyunsaturated fatty acids activate the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL. Nature. 397 (6716), 255-259 (1999).
  4. Hardie, R. C., Franze, K. Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors. Science. 338 (6104), 260-263 (2012).
  5. Chen, W., et al. Calmodulin binds to Drosophila TRP with an unexpected mode. Structure. 29 (4), 330-344 (2021).
  6. Hardie, R. C. Effects of intracellular Ca2+ chelation on the light response in Drosophila photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 177 (6), 707-721 (1995).
  7. Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo. Cell. 91 (3), 375-383 (1997).
  8. Hardie, R. C., Minke, B. Phosphoinositide-mediated phototransduction in Drosophila photoreceptors: the role of Ca2+ and trp. Cell Calcium. 18 (4), 256-274 (1995).
  9. Delgado, R., et al. Light-induced opening of the TRP channel in isolated membrane patches excised from photosensitive microvilli from Drosophila photoreceptors. Neuroscience. 396, 66-72 (2019).
  10. Lev, S., Katz, B., Minke, B. The activity of the TRP-like channel depends on its expression system. Channels (Austin). 6 (2), 86-93 (2012).
  11. Hardie, R. C., Raghu, P. Activation of heterologously expressed Drosophila TRPL channels: Ca2+ is not required and InsP3 is not sufficient. Cell Calcium. 24 (3), 153-163 (1998).
  12. Gutorov, R., et al. Modulation of transient receptor potential C channel activity by cholesterol. Frontiers in Pharmacology. 10, 1487 (2019).
  13. Yagodin, S., et al. Thapsigargin and receptor-mediated activation of Drosophila TRPL channels stably expressed in a Drosophila S2 cell line. Cell Calcium. 23 (4), 219-228 (1998).
  14. Guo, W., Chen, L. Recent progress in structural studies on canonical TRP ion channels. Cell Calcium. 83, 102075 (2019).
  15. Li, X., Fine, M. TRP channel: The structural era. Cell Calcium. 87, 102191 (2020).
  16. Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy. Nature. 504 (7478), 107-112 (2013).
  17. Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms. Nature. 504 (7478), 113-118 (2013).
  18. Liu, W., et al. The INAD scaffold is a dynamic, redox-regulated modulator of signaling in the Drosophila eye. Cell. 145 (7), 1088-1101 (2011).
  19. Ye, F., Liu, W., Shang, Y., Zhang, M. An exquisitely specific PDZ/target recognition revealed by the structure of INAD PDZ3 in complex with TRP channel. Structure. 24 (3), 383-391 (2016).
  20. Ye, F., et al. An unexpected INAD PDZ tandem-mediated plcβ binding in Drosophila photo receptors. eLife. 7, (2018).
  21. Rahimzadeh, M., Sadeghizadeh, M., Najafi, F., Arab, S., Mobasheri, H. Impact of heat shock step on bacterial transformation efficiency. Molecular Biology Research Communications. 5 (4), 257-261 (2016).
  22. Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, S. Drosophila: A laboratory handbook. Second Edition. 80 (2), The Quarterly Review of Biology. (2005).
  23. Nicolas, G., Sillans, D. Immediate and latent effects of carbon dioxide on insects. Annual Review of Entomology. 34 (1), 97-116 (1989).
  24. Arachea, B. T., et al. Detergent selection for enhanced extraction of membrane proteins. Protein Expression and Purification. 86 (1), 12-20 (2012).
  25. Hellmich, U. A., Gaudet, R. Structural biology of TRP channels. Handbook of Experimental Pharmacology. 223, 963-990 (2014).

Tags

Biokjemi utgave 178 proteinrensing Drosophila TRP-kanal INAD
Rensing av endogene <em>Drosophila</em> transiente reseptorpotensialkanaler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, J., Liu, Y., Chen, W., Ding,… More

Liu, J., Liu, Y., Chen, W., Ding, Y., Lan, X., Liu, W. Purification of Endogenous Drosophila Transient Receptor Potential Channels. J. Vis. Exp. (178), e63260, doi:10.3791/63260 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter