Summary
Här presenterar vi ett reproducerbart in vitro elektroporation protokoll för genetisk manipulation av primära cerebellar granulat cell prekursorer (GCPs) som är kostnadseffektiva, effektiva och livskraftiga. Dessutom visar detta protokoll också en enkel metod för molekylär studie av primära cilium-beroende Hedgehog signalering vägar i primära GCP celler.
Abstract
Det primära ciliumet är en kritisk signalerande organell som finns på nästan varje cell som omvandlar igelkott (Hh) signalerar stimuli från cellytan. I granulatcellprekursoren (GCP) fungerar det primära ciliumet som ett pivotalt signalcenter som orkestrerar prekursorcellproliferation genom att modulera Hh-signalvägen. Undersökningen av primära cilium-beroende Hh signalering maskiner underlättas av in vitro genetisk manipulation av utbildningsavsnittet komponenter att visualisera deras dynamiska lokalisering till det primära cilium. Transfection av transgenes i de primära kulturerna av GCPs med hjälp av de för närvarande kända elektroporationsmetoderna är dock i allmänhet kostsamt och resulterar ofta i låg cell livskraft och oönskad transfektion effektivitet. Detta dokument introducerar ett effektivt, kostnadseffektivt och enkelt elektroporationsprotokoll som visar en hög transfekteringseffektivitet på ~ 80-90% och optimal cellviabilitet. Detta är en enkel, reproducerbar och effektiv genetisk modifieringsmetod som är tillämplig på studien av den primära ciliumberoende Hedgehog-signalvägen i primära GCP-kulturer.
Introduction
Cerebellar GCPs används ofta för att studera maskiner i Hh-signalvägen i neuronala stamceller på grund av deras höga överflöd och höga känslighet för Hh-signalvägen in vivo1,2,3,4. I GCPs fungerar det primära ciliumet som ett pivotalT Hh-signaltransduktionsnav5 som orkestrerar spridningen av prekursorcellerna6,7,8. In vitro visualisering av Hh signalering komponenter på det primära cilium är ofta utmanande på grund av deras låga endogena basala nivåer. Därför är transgene modifiering av protein uttryck nivåer och fluorophore taggning av genen av intresse användbara metoder för att studera vägen vid molekylär upplösning. Genetisk manipulation av GCP primära kulturer med liposom-baserade transfection metoder resulterar dock ofta i låg transfection effektivitet, hindrar ytterligare molekylära undersökningar9. Elektroporation ökar effektiviteten men kräver ofta orimliga leverantörsspecifika och celltypsbegränsade elektroporationsreagenser10.
Detta dokument introducerar en högeffektiv och kostnadseffektiv elektroporationsmetod för att manipulera Hh-signalvägskomponenterna i GCP-primärkulturer. Med hjälp av detta modifierade elektroporationsprotokoll levererades ett grönt fluorescerande protein (GFP)-märkt Smoothened transgene (pEGFP-Smo) effektivt till GCPs och uppnådde hög cellöverlevnad och transfektion (80-90%). Dessutom, vilket framgår av den immunocytochemical färgning, visade de transfected GCPs hög känslighet för utjämnade agonist-inducerad aktivering av Hh signalvägen genom handel EGFP-Smo till de primära cilierna. Detta protokoll ska vara direkt tillämpligt och fördelaktigt för experiment som inbegriper genetisk modifiering in vitro av celltyper som är svåra att transfektera, såsom primära cellkulturer för människor och gnagare, samt humaninducerade pluripotenta stamceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurrelaterade förfaranden utfördes i enlighet med riktlinjerna för djurhantering och det protokoll som godkänts av hälsodepartementet i Hongkong. Djurexperimentlicenser efter Animal (Control of Experiments) Ordinance (Cap. 340) erhölls från Department of Health, Hong Kong Government. Djurarbetet utfördes i enlighet med den djursäkerhetsetik som godkänts av HKBU Research Office och Laboratory Safety Committee. Mer information om allt material som används i det här protokollet finns i tabellen med information om allt material som används i det här protokollet.
1. Förberedelse före projekt
- Förberedelse av kulturmedier och buffertar
- Serumfritt medium (SFM)
- För att bereda 50 ml SFM, tillsätt 500 μL 100x L-glutaminersättning, 500 μL Penicillin-Streptomycin, 1 mM natriumpyveuvat och 12,5 μL 1 M KCl (slutlig 250 μM) till 49 ml Neurobasalmedium.
- Dela upp SFM i 2 alikvoter på 10 ml och 40 ml i 50 ml koniska rör och förvara dem vid 4 °C i upp till en månad.
- Matsmältningsblockeringsmedium: 10% FBS i SFM
- Tillsätt 1,1 ml värmeinaktiverad FBS till en 10 ml SFM för att förbereda matsmältningsblockeringsmediet.
- GCP-odlingsmedium: SFM med B27
- För att förbereda GCP odling medium, tillsätt 800 μL serumfritt B-27 tillägg till en 40 mL alikvot SFM.
OBS: B-27-kompletterad SFM kan förvaras vid 4 °C i upp till en månad. Nyberedd media ger dock optimala resultat.
- För att förbereda GCP odling medium, tillsätt 800 μL serumfritt B-27 tillägg till en 40 mL alikvot SFM.
- Dissekeringsbuffert: EBSS med glukos + HEPES
- Tillsätt 6 g/L glukos till kalcium- och magnesiumfri Earles balanserade saltlösning (EBSS) som innehåller 10 mM HEPES (4-(2-hydroxietyl)-1-piperazineetanesulfonsyra).
- Sterilisera lösningen genom att passera genom ett 0,2 μm sprutfilter och förvara den vid 4 °C för långtidsförvaring.
- Buffert för matsmältning
OBS: Förbered dig nyligen före användning.- Förbered 2 ml matsmältningsbuffert för matsmältningen av 2-4 cerebellar vävnader och 4 ml för 4-10 vävnader. För att bereda 4 ml rötningsbuffert, lös upp 1,5 mg L-cystein (slutlig koncentration 200-400 μg/ml) i 4 ml EBSS. Vänd röret upprepade gånger tills pulvret är helt upplöst.
- Sterilisera lösningen med ett 0,2 μm sprutafilter och en 5 ml spruta och överför lösningen till en steril 35 mm cellodlingsskål.
- Tillsätt 4 μL papain (1:1 000 utspädning från en lagerkoncentration på 20 enheter/mg) och 40 μL DNase I (1:100 utspädning från ett 10 mg/ml lager för en slutlig koncentration på 0,1 mg/ml).
- Inkubera lösningen vid 37 °C i en CO2-inkubator i minst 30 minuter eller fram till användning.
OBS: Det här steget är viktigt för att aktivera papain. För optimala resultat, överskrid inte 45 min vid 37 °C före användning. Se till att lösningen blir genomskinlig och att det inte finns några vita fällningar före användning.
- Serumfritt medium (SFM)
- Förbeläggning av täckslipar
- För att förbereda täckbenen för cellfäste, inkubera autoklaverade 12 mm glasöverdrag med 100 μg/ml poly-D-lysin (PDL, 1 mg/ml i steril dH2O) i minst 1 h vid 37 °C. Förvara täcksläparna i samma PDL-lösning vid 4 °C tills de används.
- På dagen för primärcellskulturen samlar du PDL i ett rent koniskt rör och sköljer täcksliparna tre gånger med steril dH2O noggrant för att avlägsna rest PDL.
OBS: PDL kan förvaras vid 4 °C för återanvändning. - Överför de PDL-belagda glasöverdragen på en 24-välplatta genom att placera ett täckslip i varje brunn.
- Avlägsna överflödigt vatten och tillsätt 200-300 μL Matrigel (rekonstituerat enligt anvisningarna i produktdatabladet i serumfritt DMEM-F12) för att helt täcka täcklocken.
- Inkubera täcksliparna i Matrigel i 1 h vid 37 °C i CO2-inkubatorn .
OBS: Ta bort matrigel före cellsådd. Denna matrigel kan samlas in och lagras vid 4 °C för flera återanvändningar.
- Beredning av förplätering av odlingsfat
- Täck en 60 mm cellodlingsskål med 2 ml 100 μg/ml PDL (rekonstruera 1 mg/ml PDL-buljonglösningen i steril dH2O) genom inkubation vid 37 °C för 1 h.
- Omedelbart före cellutsäde, ta bort och samla den använda PDL i ett rent koniskt rör och förvara den vid 4 °C för flera återanvändningar. Skölj och tvätta den PDL-belagda skålen tre gånger med steril dH2O. Lufttorka odlingsfatet före cellsådd.
- Använd en 60 mm cellodlingsskål för att så celler som skördats från högst 2 hel-cerebellumvävnader.
- Förbered ytterligare kulturrätter för ytterligare lillhjärnor.
OBS: Se steg 2.1.18 och 2.1.19 för användning av förpläteringskulturen.
2. Experimentell dag 0
- Isolering och odling av musens primära GCPs
OBS: GCP-kulturmetoden ändrades från ett standardprotokoll, och det korta protokollet beskrevs kortfattat i vårt tidigare arbete6,11,12. För optimal GCP-avkastning, använd postnatala (P) dag 6 eller P7-valpar för isolering av GCP. Slutför följande dissekeringssteg 2.1.6-2.1.10 så snabbt som möjligt för optimal cellviabilitet.- Prewarm SFM, digestion blockerande medium, odlingsmedium och Opti-MEM vid 37 °C under dissekering.
- På en ren bänk, presoak alla dissekeringsapparater i 70% etanol för desinfektion.
- Fyll en 60 mm cellodlingsfat med 2-3 ml dissekeringsbuffert och kyl den på is.
- Förbered färsk rötningsbuffert enligt beskrivningen i avsnitt 1.1.5 och håll den varm vid 37 °C.
- Använd 70% etanol för att torka av valpens huvud för desinfektion.
- Halshugga valpen utan bedövning. Använd tång för att hålla huvudet och steriliserad kirurgisk sax för att skära från baksidan av skallen för att halshugga valpen. Ta försiktigt bort huden och skallen för att avslöja hjärnan med hjälp av tång.
- Använd tång för att nypa av lillhjärnan och blötlägg den snabbt i den förkylda dissekeringsbufferten som bereds i steg 2.1.3.
- Ta bort hjärnhinnorna med lillhjärnan nedsänkt i dissekeringsbufferten under ett dissekerande mikroskop. Blodkärlsberikade hjärnhinnor bör verka rosa under det dissekerande mikroskopet.
- Ta bort alla hjärnhinnor med tång.
OBS: Ett lillhjärna utan hjärnhinnor bör ha ett vitaktigt utseende. - Ta bort synliga mellanhjärnvävnader och choroidplexus från lillhjärnan.
- Överför lillhjärnan till en 35 mm odlingsskål förfylld med varm matsmältningsbuffert beredd i steg 2.1.4. Undvik att överföra överskottsförskjutningsbuffert. Skär lillhjärnan i fina bitar med hjälp av microspring sax så snabbt som möjligt.
- Inkubera omedelbart det malda lillhjärnan vid 37 °C i 15 minuter i en CO2-inkubator . Förläng inkubationstiden till 20 min om mer än 4 lillhjärnor ska bearbetas.
OBS: Efter inkubation kommer vävnaden att klumpa ihop sig. - Överför omedelbart den smälta vävnaden till botten av ett nytt sterilt 15 ml centrifugrör med hjälp av en P1000 pipettspets prewet med matsmältningsblockerande medium (undvik att överföra matsmältningsbufferten).
- Tillsätt en lämplig volym av rötningsblockerande medium (1 ml för 1 lillhjärna) för att avsluta matsmältningen och pipetten upp och ner försiktigt 30 gånger med en P1000 mikropipett för att ytterligare dissociera vävnaden till en encellsupphängning. Undvik luftbubblabildning.
- För försiktigt cellupphängningen genom en 70 μm cellsil till ett nytt sterilt centrifugrör för att avlägsna cellklumpar.
- Passera ytterligare 1 ml färskt matsmältningsblockerande medium genom cellsilen för att samla kvarvarande celler från cellsilen.
- Centrifugera filtratet vid 200 × g i 5 min vid rumstemperatur (RT). Ta bort supernatanten och återanvänd pelleten med 1 ml SFM. Upprepa det här steget två gånger. Undvik att bilda luftbubblor.
- Återanvänd pelleten i en slutlig volym av 2 ml GCP-odlingsmedium och överför cellfjädringen till den PDL-belagda 60 mm förpläteringsodlingsskålen som bereds i steg 1.3. Inkubera i 15 min vid 37 °C i en CO2 inkubator.
OBS: Överskrid inte 20 min. - Efter inkubation knackar du på odlingsfatet från sidan för att lossa de löst vidhäftande GCP-cellerna. Samla de vidhäftande GCP-cellerna i odlingsmedium genom att försiktigt pipettera med en P1000-pipett. Samla denna GCP-suspension i ett nytt 15 ml centrifugrör. Kassera 60 mm skålen.
OBS: Starkt vidhäftande astroglia- och fibroblastceller kommer att förbli fästa på 60 mm diskbotten och kommer att separeras i detta steg. Att utelämna detta steg kommer att äventyra GCP-kulturens renhet. - Räkna cellerna och fortsätt till elektroporation omedelbart.
- Dag in vitro (DIV) 0: Elektroporation för Hh-receptortransgene överuttryck: pEGFP-Smo
- För elektroporation med en 2 mm mellanrumscuvette, förbered följande plasmidcellselektroporationsblandning för varje reaktion av elektroporation: 1,2 × 106 celler och 10 μg pEGFP-mSmo (justera DNA-buljongkoncentrationen till ~2-5 μg/μL i Tris-EDTA-buffert eller steril dH2O) i 100 μL Opti-MEM.
OBS: Minska det totala cellantalet om cellerna är otillräckliga (även om detta kan minska elektroporationseffektiviteten). Justera dock inte mängden plasmid eller den totala volymen av Opti-MEM som används per cuvette. Om det totala cellantalet som krävs för experimentet överstiger 1,5 × 106 celler skalar du upp elektroporationsblandningen i enlighet därmed och utför flera elektroporationsreaktioner separat. Cuvettet kan återanvändas upp till 5 gånger. - Förbered cellsåddsplattan efter elektroporationen genom att tillsätta 0,5 ml odlingsmedium i varje brunn på den 24-brunnskulturplatta som innehåller belagda täckslipar (från steg 1.2) och håll den varm vid 37 °C i en CO2-inkubator .
- Från steg 2.1.20 pipettensering det önskade antalet celler i ett sterilt 1,5 ml mikrocentrifugerör och snurra vid 200 × g i 5 minuter vid RT. Upprepa detta steg två gånger med Opti-MEM för att säkerställa att det inte finns något restkulturmedium i röret
OBS: För varje brunn/ täckslip av en 24-brunnsplatta, elektroporat och frö 1,2-1,3 × 106 celler / brunn för att få ~ 70-75% cellkonfluens på nästa kulturdag. - Ställ in parametrarna för elektroporation enligt tabell 1.
- Pipettera elektroporationsreaktionen försiktigt för att blanda väl och använd en lång P200-spets för att överföra en exakt volym på 100 μL av blandningen till 2 mm mellanrum cuvette. Undvik att bilda bubblor.
- Placera cuvettet i cuvettekammaren.
- Tryck på elektropoktorns Ω knapp (se materialtabellen) och anteckna impedansvärdet, som ska vara ~30-35. För att säkerställa att det elektriska impedansvärdet Ω faller inom intervallet 30-35, håll dig till en exakt volym på 100 μL.
- Tryck på startknappen för att initiera pulsen.
- Registrera värdena för den uppmätta strömmen och joule som visas på läsramen.
- Ta bort cuvettet från cuvettekammaren.
- Tillsätt omedelbart 100 μL förvarnat odlingsmedium i cuvettet och återanvänd det genom att försiktigt pipettera upp och ner 2-3 gånger. Överför omedelbart cellfjädringen till 24-brunnsplattan som bereds i steg 2.2.2.
OBS: För att minimera celldöden, så cellerna omedelbart efter elektroporation. - Inkubera cellerna vid 37 °C i en CO2-inkubator . Lämna cellerna ostörta i 3 timmar för att undvika cellavlossning.
- Vid 3 h efter sådd, aspirera försiktigt och kassera hälften av det supernatantmediet för att avlägsna flytande döda celler och skräp och ersätta med samma mängd förvarnat odlingsmedium.
- Inkubera cellerna vid 37 °C i CO2-inkubatorn och fyll på hälften av mediet varannan dag.
- Observera cellerna under fluorescensmikroskopet nästa dag, dvs DIV1 (figur 1) för GFP-signal för att bestämma effektiviteten hos Smo-överuttryck.
- För stimulering av Hh-signalvägen på DIV 1 efter påfyllning av hälften av mediet, tillsätt 0,2 μM Smoothened agonist (SAG) till cellerna samtidigt som du lägger till en lika stor volym DMSO till kontrollen. Inkubera i 24 timmar före cellfixering.
OBS: Håll volymen dmso/SAG tillsatt så låg som möjligt. Här tillsattes 0,5 μL DMSO eller 0,5 μL 0,2 mM SAG per 500 μL medium per brunn, vilket är ett utspädningsförhållande på 1:1 000.
- För elektroporation med en 2 mm mellanrumscuvette, förbered följande plasmidcellselektroporationsblandning för varje reaktion av elektroporation: 1,2 × 106 celler och 10 μg pEGFP-mSmo (justera DNA-buljongkoncentrationen till ~2-5 μg/μL i Tris-EDTA-buffert eller steril dH2O) i 100 μL Opti-MEM.
3. DIV 2: Visualisering av primära cilier och undersökning av Hh-signalvägen
- Cellfixering
- Vid 24 h efterbehandling, ta bort odlingsmediet och skölj cellerna 2-3 gånger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med en engångs Pasteur pipetter samtidigt som du undviker att lossa cellerna.
- Fixera cellerna genom att tillsätta ~400 μL 4% paraformaldehyd (beredd i PBS) och inkubera vid RT i 10 min.
- Skölj och tvätta 2-3 gånger med PBS med en pasteurpipeett.
- Förvara i PBS vid 4 °C i upp till 2 månader eller fortsätt till immunstainering.
- Immunocytokemisk färgning av GCPs och primär ciliummarkör
- Tvätta cellerna två gånger i PBS med mild skakning i 5 minuter varje gång i en 24-brunnsplatta.
- Tillsätt 0,5 ml 100 mM ammoniumklorid i cellen och inkubera vid RT i 10 minuter för att släcka fixativet.
- Skölj en gång och tvätta 2-3 gånger med PBS med mild skakning i 10 min varje gång.
- Pipettera försiktigt 30 μL blockeringsbuffert (BB: 0,1% Triton X-100, 1% BSA, 2% värmeinaktiverat hästserum i PBS) på en bit parafilm för att bilda en droppe utan luftbubblor.
- Överför försiktigt täcket från brunnen till BB-droppen med den cellsådda sidan vänd nedåt. Inkubera cellerna med BB i en fuktig kammare i 1 h vid RT.
- Förbered den primära antikroppsblandningen i BB enligt tabellen. För att undersöka cellerna med primär antikropp, upprepa steg 3.2.4 och 3.2.5 och ersätta BB med den primära antikroppsblandningen. Inkubera cellerna med den primära antikroppen i 2 timmar vid RT.
- Överför täckbeskeden tillbaka till 24-brunnsplattan med den cellsådda sidan vänd uppåt. Skölj cellerna en gång och tvätta 3-4 gånger i PBS med mild skakning i 10 min varje gång.
- Förbered den sekundära antikroppsblandningen i BB enligt tabellen. För att inkubera cellerna med den sekundära antikroppen upprepar du steg 3.2.4 och 3.2.5 och ersätter BB med den sekundära antikroppsblandningen. Inkubera i mörker i 1 h på RT.
- Upprepa steg 3.2.7 för post secondary antikroppsinkubationstvätt.
- Montera täckslipet på en ren mikroskopisk glasrutschbana med monteringsmedium.
- Lufttorka rutschkanan i mörker över natten och fortsätt till konfokal avbildning13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med Opti-MEM (se tabellen över material) som universell reagens kan denna föreslagna elektroporationsmetod uppnå genomgående hög elektroporationseffektivitet vid ~80-90% (figur 1). Elektroporation effektivitet av Smo-EGFP vektorn fastställdes vid DIV 2 post elektroporation genom kvantifiering av andelen gröna fluorescenspositiva celler i alla parade box protein-6 (Pax6)-uttrycka GCP celler. Elektroporationseffektiviteten hos DMSO- och SAG-behandlade grupper föreföll jämförbar (figur 1 och tabell 2).
Dessutom visar immunostaining av den primära ciliummarkören, Arl13b, att ciliteringshastigheten för GCP vid DIV 2 av kulturen var ~ 18% i både de fordons- och SAG-behandlade grupperna (DMSO: 17,35% ± 0, 59%; SAG: 18,24% ± 0,88%). Ciliationshastigheten illustreras som procentandelen Pax6-uttryckande GCPs som bär ett primärt cilium (Arl13b-positiv) på cellytan vid DIV 2 efter elektroporation (figur 2 och tabell 3).
För att dechiffrera den primära ciliumberoende Hh-signalvägen användes en agonist av Smo, SAG, för att aktivera Hh-signalvägen. Vid aktivering av Hh-vägen berikas Smo-receptorn vid axonemen i primär cilium14. Våra resultat visar betydligt ökad Smo-EGFP lokalisering på primära cilium axoneme av Pax6-uttryckande GCP celler vid 24 h efter SAG behandling (figur 3, kvantifiering data ändras från tidigare arbete6), vilket indikerar en djupgående aktivering av den primära cilium-beroende Hh signalvägen.
Bild 1: Elektroporationsinställning och elektroporationseffektiviteten hos GCPs. (A) Elektroporationsinställning. Svart pilspets betecknar elektroporations-cuvette. (B, C) Representativa bilder visar elektroporationseffektiviteten hos Smo-EGFP-vektorn som bestäms av kvantifiering av procentandelen GFP-positiva celler i alla Pax6-uttryckande GCP-celler (tabell 2). Representativa bilder visar de gröna fluorescerande signalerna på Pax6-uttryckande (violett) GCP-celler på DIV 2 efter elektroporation efter 24 h behandling med (B) DMSO och (C) SAG. Kärnor var märkta med DAPI (blå). Skalstänger = 20 μm. Förkortningar: GCPs = granulatcellprekursorer; GFP = grönt fluorescerande protein; Pax6 = parat låda protein-6; DIV = dag in vitro; DMSO = dimetylsulfoxid; SAG = Utjämnad agonist; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindole. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 2: Procentandel av ciliation på DIV 2 av GCP primärkultur. (A, B) Representativa bilder visar procentandelen ciliation på DIV 2 av GCP primärkultur. Representativa bilder visar de primära cilia (grön) på Pax6-uttryckande (röda) GCP-celler på DIV 2 efter elektroporation efter 24 h behandling med (A) DMSO och (B) SAG. Kärnor var märkta med DAPI (blå). Det primära ciliumet (grönt) betecknas med vita pilspetsar. Skalningsstaplar = 20 μm. (C) Diagram illustrerar kvantifieringsdata för 4 oberoende experiment. Statistisk analys, Obetald student t-test. Felstaplar visar ±SEM. Förkortningar: GCP = granulatcellprekursor; Pax6 = parat låda protein-6; DIV = dag in vitro; DMSO = dimetylsulfoxid; SAG = Utjämnad agonist; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindole; n.s. = Inte signifikant; SEM = medelvärdets standardfel; Arl13b = ADP ribosyleringsfaktorliknande protein 13B. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Ökad Smo-lokalisering på det primära ciliumet av Pax6-uttryckande GCP-celler vid SAG-behandling. (A) Representativa bilder visar Smo-EGFP lokalisering (grön) på den primära cilium (röd, vit fyrkantig låda) på Pax6-uttrycka (violett) GCP-celler vid DIV 2 efter elektroporation efter 24 h behandling med DMSO och SAG. Kärnor var märkta med DAPI (blå). Skalstänger = 5 μm. (B) Diagram illustrerar kvantifieringsdata för 4 oberoende experiment. Statistisk analys, oparat studentens t-test. P ≤ 0,001. Felstaplar visar ± SEM. Totalt n för DMSO-grupp = 97, totalt n för SAG-grupp = 130. Figur 3B ändrades från 6. Förkortningar: GCP = granulatcellprekursor; Smo = Utjämnad; Pax6 = parat låda protein-6; DIV = dag in vitro; DMSO = dimetylsulfoxid; SAG = Utjämnad agonist; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindole; SEM = medelvärdets standardfel; Arl13b = ADP ribosyleringsfaktorliknande protein 13B. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Poring puls inställning | Inställning för överföringspuls | |||
| Musens primära GCPs | Primära nervceller | Musens primära GCPs | Primära nervceller | |
| Spänning | 275 V | 275 V | 20 V | 20 V |
| Längd | 1 ms | 0,5 ms | 50 ms | 50 ms |
| Intervall | 50 ms | 50 ms | 50 ms | 50 ms |
| Nej. | 2 | 2 | 5 | 5 |
| D-kurs | 10% | 10% | 40% | 40% |
| Polaritet | + | + | ± | ± |
Tabell 1: Elektroporationsparametrarna för musens primära GCPs och primära nervceller med superelektroporator NEPA21 TYP II. Förkortning: GCP = granulatcellprekursor.
| Elektroporationseffektivitet | Exp. 1 (n = 486) | Exp. 2 (n = 1314) | 3 (n = 704) | 4 (n = 476) | Genomsnitt |
| DMSO-behandlad grupp | 90.57% ± 10.12% | 96.62% ± 3.09% | 98.89% ± 0.97% | 90.72% ± 11.31% | 94.02% ± 1.36% |
| SAG-behandlad grupp | 91,8 % ± 8,69 % | 79.97% ± 2.77% | 89.35% ± 5.67% | 88.59% ± 13.54% | 87.42% ± 1.71% |
| Genomsnittlig elektroporationseffektivitet | 91.31% ± 7.99% | 88.27% ± 10.81% | 94.12% ± 6.36% | 89.65% ± 11.21% | 90.84% ± 0.84% |
Tabell 2: Elektroporationseffektivitet hos Smo-EGFP vektordeterminedbyquantifiering av gfp-positiva celler i alla Pax6-uttryckande GCP-celler. Data från fyra oberoende experiment (Exp.) visas. (Totalt n = 2980). Förkortningar: Smo = Utjämnad; GFP = grönt fluorescerande protein; GCP = granulatcellprekursor; Pax6 = parat boxprotein-6.
| Exp. 1 | Exp. 2 | Exp. 3 | Exp. 4 | genomsnitt | |
| Ciliation rate - DMSO | 18.88% ± 3.61% | 19.58% ± 7.42% | 16.60% ± 1.48% | 14.35% ± 7.99% | 17.35% ± 0.59% |
| Ciliation rate - SAG | 13.93% ± 3.39% | 17.30% ± 2.15% | 22.19% ± 10.35% | 19.56% ± 1.15% | 18.24% ± 0.88% |
Tabell 3: Andelen ciliation på DIV 2 av GCP primärkultur. Data från fyra oberoende experiment (Exp.) visas. (Totalt n för DMSO-grupp = 1169, Totalt n för SAG-grupp = 816). Förkortningar: GCP = granulatcellprekursor; DIV = dag in vitro; DMSO = dimetylsulfoxid; SAG = Utjämnad agonist.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Transfection av transgenes i primär GCP-kultur genom elektroporationsmetod är vanligtvis associerad med låg cellviabilitet och dålig transfektion effektivitet9,10. Detta dokument introducerar ett kostnadseffektivt och reproducerbart elektroporationsprotokoll som har visat hög effektivitet och livskraft. Dessutom visar vi också en enkel metod för att studera den primära cilium-beroende Hh signalvägen i primära GCP celler.
Andra vanliga elektroporationsmetoder kräver ofta kostsamma celltypspecifika elektroporationsreagenser som måste köpas från specifika tillverkare. Metoden som beskrivs här anses gynnsam eftersom den använder ett vanligt och ekonomiskt elektroporationsreagens för olika celltyper. Dessutom visade dessa data att elektroporationseffektiviteten nådde ~ 80-90%, vilket är mycket effektivt jämfört med andra elektroporations- och transfektionsmetoder9,10.
För att bibehålla högre cellviabilitet finns det några kritiska steg som man bör ta hänsyn till. Cerebellumdissektionen och dissociationsförfarandena bör slutföras inom kortast möjliga tidsfönster på 1-2 h. Ett annat kritiskt steg är att undvika bubbelbildning i plasmidcellselektroporationsblandningen före pulser under elektroporation. Efter pulser bör förvarnat odlingsmedium omedelbart läggas till i cuvettesna och cellerna sådas så snabbt som möjligt. Cellerna måste vara ostörta under de första 3 h efter cellsådd. De ovannämnda försiktighetsåtgärderna kommer att förbättra cellens livskraft upp till cirka 70-80% på den andra kulturdagen.
En anmärkningsvärd begränsning av att studera det primära ciliumet i den primära odlingsplattformen är att graden av ciliation i odlade celler i allmänhet är lägre än den som observerats in vivo. Tidigare uppgifter 6 visade att citeringshastigheten på GCP vid både E15,5 och P15 var cirka 60-80%. Däremot var in vitro-frekvensen av ciliation i primär GCP-kultur ~ 20%6. Detta är dock ett allmänt fenomen som kan urskiljas i de flesta (om inte alla) celltyper när man jämför graden av ciliation mellan in vitro - och in vivo-studier .
Denna metod är också tillämplig på andra primära kulturer såsom neurala stamceller och när och hippocampal neuronkultur, vilket kan uppnås genom att ändra elektroporationsparametern, dvs. poringpulsspänning, längd och antal pulser. För att utvidga tillämpningen av detta protokoll till ett bredare studieområde tillhandahålls de rekommenderade elektroporationsparametrarna för primära nervceller i tabell 1. Dessutom hjälper den universella elektroporationsreagensen, dvs Opti-MEM som används i detta protokoll, också till att undvika ytterligare tråkig optimeringsinsats jämfört med andra elektroporationsprotokoll som kräver optimering med avseende på reagenskompatibilitet. Detta optimerade, kostnadseffektiva elektroporation protokoll för undersökning av primära cilium och Hh signalering i primära GCP kulturer kan användas som referens förfarande för andra primära cilium-relaterade studier med primära kulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av HKBU Seed Fund och Tier-2 Start-up Grant (RG-SGT2/18-19/SCI/009), Research Grant Council-Collaborative Research Fund (CRF-C2103-20GF) till C.H.H. Hor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GCP Culture | |||
| B27 supplement | Life Technologies LTD | 17504044 | |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution | Gibco, Life Technologies | 14155063 | |
| FBS, qualified | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| GlutamMAXTM-I ,100x | Gibco, Life Technologies | 35050061 | L-glutamine substitute |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Basement membrane matrix |
| Neurobasal | Gibco, Life Technologies | 21103049 | |
| Papain,suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407 | |
| SAG | Cayman Chemical | 11914-1 | Smoothened agonist |
| IF staining | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Primary antibody mix | |||
| Anti-GFP-goat ab | Rockland | 600-101-215 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Arl13b mouse monoclonal ab | NeuroMab | 75-287 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab | Covance | PRB-278P | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Secondary antibody mix | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG | Invitrogen | A-31570 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| DAPI | Thermo Scientific | 62247 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Electroporation | |||
| CU 500 cuvette chamber | Nepagene | CU500 | |
| EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) | Nepagene | EC-002 | |
| Opti-MEM | Life Technologies LTD | 31985070 | reduced-serum medium for transfection |
| pEGFP-mSmo | Addgene | 25395 | |
| Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation | Nepagene | NEPA21 | electroporator |
References
- Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
- Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic Hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126 (14), 3089-3100 (1999).
- Lewis, P. M., Gritti-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., Mcmahon, A. P. Sonic Hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum. Developmental Biology. 270 (2), 393-410 (2004).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22 (1), 103-114 (1999).
- Bangs, F., Anderson, K. V. Primary cilia and mammalian Hedgehog signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (5), 028175 (2017).
- Hor, C. H. H., Lo, J. C. W., Cham, A. L. S., Leung, W. Y., Goh, E. L. K. Multifaceted functions of Rab23 on primary cilium- and Hedgehog signaling-mediated cerebellar granule cell proliferation. Journal of Neuroscience. 41 (32), 6850-6863 (2021).
- Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nature Medicine. 15 (9), 1062-1065 (2009).
- Spassky, N., et al. Primary cilia are required for cerebellar development and Shh-dependent expansion of progenitor pool. Developmental Biology. 317 (1), 246-259 (2008).
- Wang, T., Larcher, L., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic screening of commonly used commercial transfection reagents towards efficient transfection of single-stranded oligonucleotides. Molecules. 23 (10), 2564 (2018).
- Chicaybam, L., et al. An efficient electroporation protocol for the genetic modification of mammalian cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2017).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Chiara Manzini, M. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (23), e990 (2009).
- Mizoguchi, T., et al. Impaired cerebellar development in mice overexpressing VGF. Neurochemical Research. 44 (2), 374-387 (2019).
- Zhou, Y. Confocal imaging of nerve cells. Current Laboratory Methods in Neuroscience Research. , Springer. New York, NY. 235-247 (2014).
- Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437 (7061), 1018-1021 (2005).
