Summary
Aqui, apresentamos um protocolo de eletroporação in vitro reprodutível para manipulação genética de precursores primários de células de grânulo cerebelar (GCPs) que é econômico, eficiente e viável. Além disso, este protocolo também demonstra um método simples para o estudo molecular de vias primárias de sinalização de Ouriço dependentes de cílios em células GCP primárias.
Abstract
O cílio primário é uma organela de sinalização crítica encontrada em quase todas as células que transduzem os estímulos de sinalização de Hedgehog (HH) da superfície celular. No precursor da célula de grânulo (GCP), o cílio primário atua como um centro de sinalização crucial que orquestra a proliferação de células precursoras modulando a via de sinalização HH. A investigação do maquinário de sinalização HH, dependente do cítio primário, é facilitada pela manipulação genética in vitro dos componentes da via para visualizar sua localização dinâmica para o círio primário. No entanto, a transfecção de transgenes nas culturas primárias dos GCPs usando os métodos de eletroporação atualmente conhecidos é geralmente cara e muitas vezes resulta em baixa viabilidade celular e eficiência de transfecção indesejável. Este artigo introduz um protocolo de eletroporação eficiente, econômico e simples que demonstra uma alta eficiência de transfecção de ~80-90% e a viabilidade celular ideal. Trata-se de um método de modificação genética simples, reprodutível e eficiente que é aplicável ao estudo da via de sinalização de Ouriço dependente do cilium primário nas culturas primárias do GCP.
Introduction
Os GCPs cerebelares são amplamente utilizados para estudar o maquinário da via de sinalização HH em tipos de células progenitoras neuronais devido à sua alta abundância e alta sensibilidade à via de sinalização HH em vivo1,2,3,4. Em GCPs, o cílio primário atua como um hub de transdução de sinal HH crucial5 que orquestra a proliferação das células precursoras6,7,8. A visualização in vitro de componentes de sinalização de HH no cílio primário é muitas vezes desafiadora devido aos seus baixos níveis basais endógenos. Assim, a modificação transgênica dos níveis de expressão proteica e a marcação fluorófora do gene de interesse são abordagens úteis para estudar o caminho na resolução molecular. No entanto, a manipulação genética das culturas primárias do GCP usando abordagens de transfecção baseadas em liposome muitas vezes resultam em baixa eficiência de transfecção, dificultando novas investigações moleculares9. A eletroporação aumenta a eficiência, mas geralmente requer reagentes de eletroporação exorbitantes específicos do fornecedor e restritos ao tipo celular10.
Este artigo introduz um método de eletroporação de alta eficiência e custo-benefício para manipular os componentes da via de sinalização HH nas culturas primárias GCP. Usando este protocolo de eletroporação modificado, um transgene smoothened smoothened (pEGFP-Smo) com marca verde foi fornecido eficientemente aos GCPs e alcançou altas taxas de sobrevivência celular e transfecção (80-90%). Além disso, como evidenciado pela coloração imunocitômica, os GCPs transfectados mostraram alta sensibilidade à ativação agonista induzida pelo HH pelo tráfico de EGFP-Smo para a cília primária. Este protocolo deve ser diretamente aplicável e benéfico para experimentos que envolvem modificação genética in vitro de tipos celulares difíceis de transfetar, como culturas de células primárias humanas e roedores, bem como células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem.
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Protocol
Todos os procedimentos relacionados aos animais foram realizados em conformidade com as diretrizes de manejo animal e o protocolo aprovado pelo Departamento de Saúde de Hong Kong. Licenças de experimentos em animais após a Portaria Animal (Controle de Experimentos) (Cap. 340) foram obtidas do Departamento de Saúde, governo de Hong Kong. O trabalho animal foi realizado em conformidade com a ética de segurança animal aprovada pelo Escritório de Pesquisa da HKBU e pelo Comitê de Segurança laboratorial. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais utilizados neste protocolo.
1. Preparação pré-experiência
- Preparação de meios de comunicação culturais e buffers
- Meio livre de soro (SFM)
- Para preparar 50 mL de SFM, adicione 500 μL de 100x L-glutamina substituto, 500 μL de Penicillin-Streptomicina, 1 mM de piruvanato de sódio e 12,5 μL de 1 M KCl (final 250 μM) a 49 mL de meio neurobásal.
- Divida o SFM em 2 alíquotas de 10 mL e 40 mL em tubos cônicos de 50 mL e armazene-os a 4 °C por até um mês.
- Meio de bloqueio de digestão: 10% FBS em SFM
- Adicione 1,1 mL de FBS inativados a calor a uma alíquota de 10 mL de SFM para preparar o meio de bloqueio de digestão.
- Meio de cultura GCP: SFM com B27
- Para preparar o meio de cultura GCP, adicione 800 μL de suplemento B-27 sem soro a uma alíquota de 40 mL de SFM.
NOTA: O SFM com suplemento B-27 pode ser armazenado a 4 °C por até um mês. No entanto, as mídias recém-preparadas produzem resultados ótimos.
- Para preparar o meio de cultura GCP, adicione 800 μL de suplemento B-27 sem soro a uma alíquota de 40 mL de SFM.
- Tampão de dissecção: EBSS com glicose + HEPES
- Adicione 6 g/L de glicose à Solução de Sal Balanceado (EBSS) sem cálcio e magnésio, contendo 10 mM HEPES (4-(2-hidroxitil)-1-ácido piperazineethanesulfônico).
- Esterilize a solução passando por um filtro de seringa de 0,2 μm e armazene-a a 4 °C para armazenamento a longo prazo.
- Tampão de digestão
NOTA: Prepare-se fresco antes do uso.- Prepare 2 mL de tampão de digestão para a digestão de 2-4 tecidos cerebelares e 4 mL para 4-10 tecidos. Para preparar 4 mL de tampão de digestão, dissolva 1,5 mg de L-cisteína (concentração final 200-400 μg/mL) em 4 mL de EBSS. Inverta o tubo repetidamente até que o pó esteja totalmente dissolvido.
- Esterilize a solução usando um filtro de seringa de 0,2 μm e uma seringa de 5 mL, e transfira a solução para um prato de cultura celular estéril de 35 mm.
- Adicione 4 μL de papain (diluição de 1:1.000 de uma concentração de estoque de 20 unidades/mg) e 40 μL de DNase I (diluição de 1:100 de um estoque de 10 mg/mL para uma concentração final de 0,1 mg/mL).
- Incubar a solução a 37 °C em uma incubadora de CO2 por pelo menos 30 min ou até usar.
NOTA: Este passo é fundamental para ativar o papain. Para obter resultados ótimos, não exceda 45 min a 37 °C antes de usar. Certifique-se de que a solução se torne transparente e que não haja precipitados brancos antes de usar.
- Meio livre de soro (SFM)
- Tampas de pré-revestimento
- Para preparar as tampas para fixação celular, incubar tampas de vidro autoclaved de 12 mm com 100 μg/mL de poli-D-lisina (PDL, 1 mg/mL em dH2O estéril) por pelo menos 1 h a 37 °C. Mantenha as tampas na mesma solução PDL a 4 °C até usar.
- No dia da cultura celular primária, colete o PDL em um tubo cônico limpo e enxágue as tampas três vezes com dH2O estéril completamente para remover pDL residual.
NOTA: O PDL pode ser armazenado a 4 °C para reutilização. - Transfira as tampas de vidro revestidas de PDL para uma placa de 24 poços colocando uma mancha de cobertura em cada poço.
- Remova o excesso de água e adicione 200-300 μL de Matrigel (reconstituído de acordo com as instruções na folha de dados do produto no DMEM-F12 sem soro) para cobrir totalmente as tampas.
- Incubar as tampas no Matrigel por 1h a 37 °C na incubadora de CO2 .
NOTA: Remova o Matrigel antes da semeadura da célula. Este Matrigel pode ser coletado e armazenado a 4 °C para múltiplos reusos.
- Preparação de prato de cultura de pré-plating
- Cubra um prato de cultura celular de 60 mm com 2 mL de 100 μg/mL PDL (reconstitua a solução de estoque PDL de 1 mg/mL em dH2O estéril) por incubação a 37 °C por 1 h.
- Imediatamente antes da semeadura da célula, remova e colete o PDL usado em um tubo cônico limpo e armazene-o a 4 °C para múltiplos reutilizações. Enxágüe e lave o prato revestido de PDL três vezes com dH2O estéril.
- Use um prato de cultura celular de 60 mm para células de sementes colhidas de um máximo de 2 tecidos de cerebelo inteiro.
- Prepare pratos de cultura adicionais para cerebelos adicionais.
NOTA: Veja as etapas 2.1.18 e 2.1.19 para o uso do prato de cultura pré-plating.
2. Dia experimental 0
- Isolamento e cultivo de GCPs primários do mouse
NOTA: O método de cultura GCP foi modificado a partir de um protocolo padrão, e o breve protocolo foi brevemente descrito em nosso trabalho anterior6,11,12. Para o rendimento ideal do GCP, use filhotes pós-natal (P) dia 6 ou P7 para o isolamento do GCP. Complete as seguintes etapas de dissecção 2.1.6-2.1.10 o mais rápido possível para a viabilidade celular ideal.- SFM pré-inaque, médio de bloqueio de digestão, meio de cultura e Opti-MEM a 37 °C durante a dissecção.
- Em um banco limpo, prensa todo o aparelho de dissecção em 70% de etanol para desinfecção.
- Encha um prato de cultura celular de 60 mm com 2-3 mL de tampão de dissecção e esfrie-o no gelo.
- Prepare o tampão de digestão fresco conforme descrito na seção 1.1.5 e mantenha aquecido a 37 °C.
- Use 70% de etanol para limpar a cabeça do filhote para desinfecção.
- Decapite o filhote sem anestesia. Use fórceps para segurar a cabeça e uma tesoura cirúrgica esterilizada para cortar da parte de trás do crânio para decapitar o filhote. Remova cuidadosamente a pele e o crânio para descobrir o cérebro usando fórceps.
- Use fórceps para beliscar o cerebelo e mergulhá-lo rapidamente no tampão de dissecção pré-refrigerado preparado na etapa 2.1.3.
- Remova as meninges com o cerebelo submerso no tampão de dissecção sob um microscópio dissecando. Meninges enriquecidos com vasos sanguíneos devem parecer rosados sob o microscópio dissecando.
- Remova todas as meninges usando fórceps.
NOTA: Um cerebelo sem meninges deve ter uma aparência esbranquiçada. - Remova quaisquer tecidos de cérebro médio visíveis e o plexo coroide do cerebelo.
- Transfira o cerebelo para um prato de cultura de 35 mm pré-preenchido com tampão de digestão quente preparado na etapa 2.1.4. Evite transferir o buffer de dissecção em excesso. Corte o cerebelo em pedaços finos usando uma tesoura de microspring o mais rápido possível.
- Incuba imediatamente o cerebelo picado a 37 °C por 15 min em uma incubadora de CO2 . Estenda o tempo de incubação para 20 min se mais de 4 cerebelos forem processados.
NOTA: Após a incubação, o tecido se agrupará. - Transfira imediatamente o tecido digerido para o fundo de um novo tubo de centrífuga estéril de 15 mL usando uma prewet de ponta de pipeta P1000 com meio de bloqueio de digestão (evite transferir tampão de digestão).
- Adicione um volume apropriado de meio de bloqueio de digestão (1 mL para 1 cerebelo) para terminar a digestão e pipeta para cima e para baixo suavemente 30 vezes usando uma micropipette P1000 para dissociar ainda mais o tecido em uma suspensão de célula única. Evite a formação de bolhas de ar.
- Passe suavemente a suspensão celular através de um coador de células de 70 μm em um novo tubo de centrífuga estéril para remover aglomerados celulares.
- Passe um adicional de 1 mL de bloqueio de digestão fresca através do coador celular para coletar células residuais do coador celular.
- Centrifugar o filtrado a 200 × g por 5 min a temperatura ambiente (RT). Remova o supernatante e resuspenda a pelota com 1 mL de SFM. Repita este passo duas vezes. Evite formar bolhas de ar.
- Resuspenque a pelota em um volume final de 2 mL de cultura GCP média e transfira a suspensão celular para o prato de cultura de pré-chapa de 60 mm revestido de PDL preparado na etapa 1.3. Incubar por 15 min a 37 °C em uma incubadora de CO2 .
NOTA: Não exceda 20 min. - Após a incubação, toque o prato de cultura do lado para desalojar as células GCP frouxamente aderentes. Colete as células GCP aderentes em meio de cultura através de pipetas suaves usando uma pipeta P1000. Colete esta suspensão GCP em um novo tubo de centrífuga de 15 mL. Descarte o prato de 60 mm.
NOTA: As células de astroglia e fibroblasto fortemente aderentes permanecerão presas no fundo da louva de 60 mm e serão separadas nesta etapa. Omitir essa etapa comprometerá a pureza da cultura GCP. - Conte as células e prossiga para eletroporação imediatamente.
- Dia in vitro (DIV) 0: Eletroporação para superexpressão transgênica do receptor Hh: pEGFP-Smo
- Para eletroporação usando um cuvette gap de 2 mm, preparar a seguinte mistura de eletroporação de células plasmidas para cada reação de eletroporação: 1,2 × 106 células e 10 μg de pEGFP-mSmo (ajuste a concentração de estoque de DNA para ~2-5 μg/μL em tampão Tris-EDTA ou dH2O estéril) em 100 μL de Opti-MEM.
NOTA: Reduza o número total de células se as células forem insuficientes (embora isso possa reduzir a eficiência da eletroporação). No entanto, não ajuste a quantidade de plasmídeo nem o volume total de Opti-MEM usado por cuvette. Se o número total de células necessários para o experimento exceder 1,5 × 106 células, aumente a mistura de eletroporação de acordo e realize múltiplas reações de eletroporação separadamente. O cuvette pode ser reutilizado até 5 vezes. - Prepare a placa de semeadura de células pós-eletroporação adicionando 0,5 mL de meio de cultura em cada poço da placa de cultura de 24 poços contendo tampas revestidas (a partir do passo 1.2) e mantenha-a aquecida a 37 °C em uma incubadora de CO2 .
- A partir do passo 2.1.20, pipeta o número necessário de células em um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL e gire a 200 × g por 5 min na RT. Descarte o supernascer e resuspense a pelota de célula em 200 μL de Opti-MEM. Repita esta etapa duas vezes com opti-MEM para garantir que nenhum meio de cultura residual esteja presente no tubo
NOTA: Para cada poço/cobertura de uma placa de 24 poços, eletroporato e semente 1.2-1.3 × 106 células/poço para obter ~70-75% de confluência celular no dia seguinte da cultura. - Defina os parâmetros de eletroporação conforme mostrado na Tabela 1.
- Pipete a reação de eletroporação suavemente para misturar bem e use uma longa ponta P200 para transferir um volume exato de 100 μL da mistura para o cuvette gap de 2 mm. Evite formar bolhas.
- Coloque a cuvette na câmara de cuvette.
- Pressione o botão Ω do eletroporador (veja a Tabela de Materiais) e anote o valor de impedância, que deve ser ~30-35. Para garantir que o valor de impedância elétrica Ω se enquadra na faixa de 30-35, adere a um volume preciso de 100 μL.
- Pressione o botão de partida para iniciar o pulso.
- Registre os valores da corrente medida e os joules mostrados no quadro de leitura.
- Remova a cuvette da câmara de cuvette.
- Adicione imediatamente 100 μL de meio de cultura pré-armado no cuvette e resuspensá-lo por tubos suaves para cima e para baixo 2-3 vezes. Transfira imediatamente a suspensão do celular para a placa de 24 poços preparada na etapa 2.2.2.
NOTA: Para minimizar a morte celular, semear as células imediatamente após a eletroporação. - Incubar as células a 37 °C em uma incubadora de CO2 . Deixe as células imperturbáveis por 3h para evitar o descolamento celular.
- Às 3h pós semeadura, aspire suavemente e descarte metade do meio supernante para remover células mortas flutuantes e detritos e substituir pela mesma quantidade de meio de cultura pré-enlouquecida.
- Incubar as células a 37 °C na incubadora de CO2 e reabastecer metade do meio a cada dois dias.
- Observe as células sob o microscópio de fluorescência no dia seguinte, ou seja, DIV1 (Figura 1) para sinal GFP para determinar a eficiência da superexpressão do Smo.
- Para a estimulação da via de sinalização HH no DIV 1 após a reposição de metade do meio, adicione 0,2 μM Agonista suave (SAG) às células, adicionando um volume igual de DMSO ao controle. Incubar por 24 horas antes da fixação celular.
NOTA: Mantenha o volume de DMSO/SAG adicionado o mais baixo possível. Aqui, 0,5 μL DMSO ou 0,5 μL de 0,2 mM SAG foi adicionado por 500 μL de médio por poço, que é uma taxa de diluição de 1:1.000.
- Para eletroporação usando um cuvette gap de 2 mm, preparar a seguinte mistura de eletroporação de células plasmidas para cada reação de eletroporação: 1,2 × 106 células e 10 μg de pEGFP-mSmo (ajuste a concentração de estoque de DNA para ~2-5 μg/μL em tampão Tris-EDTA ou dH2O estéril) em 100 μL de Opti-MEM.
3. DIV 2: Visualização de cílios primários e investigação da via de sinalização HH
- Fixação celular
- No pós-tratamento 24h, remova o meio de cultura e enxágue as células 2-3 vezes com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) usando uma pipeta Pasteur descartável enquanto evita desalojar as células.
- Fixar as células adicionando ~400 μL de 4% de paraformaldeído (preparado em PBS) e incubar em RT por 10 minutos.
- Enxágüe e lave 2-3 vezes com PBS usando uma pipeta Pasteur descartável.
- Armazene em PBS a 4 °C por até 2 meses ou proceda para imunossuagem.
- Coloração imunocitoquímica de GCPs e marcador de cílio primário
- Em uma placa de 24 poços, lave as células duas vezes em PBS com agitação suave por 5 minutos cada vez.
- Adicione 0,5 mL de cloreto de amônio de 100 mM à célula e incubar na RT por 10 minutos para saciar o fixador.
- Enxágüe uma vez e lave 2-3 vezes com PBS com agitação suave por 10 minutos cada vez.
- Pipeta suavemente 30 μL de tampão de bloqueio (BB: 0,1% Triton X-100, 1% BSA, 2% soro de cavalo inativado a calor na PBS) em um pedaço de parafilme para formar uma gotícula sem bolhas de ar.
- Transfira suavemente o deslizamento do poço para a gota BB com o lado semeado por célula voltado para baixo. Incubar as células com BB em uma câmara úmida por 1 h na RT.
- Prepare a mistura de anticorpos primários em BB, conforme mostrado na Tabela de Materiais. Para sondar as células com anticorpos primários, repita as etapas 3.2.4 e 3.2.5, substituindo BB pela mistura de anticorpos primários. Incubar as células com o anticorpo primário por 2 h na RT.
- Usando fórceps, transfira as tampas de volta para a placa de 24 poços com o lado semeado de célula voltado para cima. Enxágüe as células uma vez e lave 3-4 vezes em PBS com agitação suave por 10 minutos cada vez.
- Prepare o mix secundário de anticorpos em BB, conforme mostrado na Tabela de Materiais. Para incubar as células com o anticorpo secundário, repita as etapas 3.2.4 e 3.2.5, substituindo bb pela mistura de anticorpos secundários. Incubar no escuro por 1h no RT.
- Repita o passo 3.2.7 para lavagem pós-secundária de incubação de anticorpos.
- Monte a tampa em um slide de vidro microscópico limpo usando meio de montagem.
- Seque o escorregador no escuro durante a noite e prossiga para imagens confocal13.
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Representative Results
Utilizando o Opti-MEM (ver a Tabela de Materiais) como reagente universal, esta metodologia de eletroporação proposta poderia alcançar eficiência de eletroporação consistentemente alta em ~80-90% (Figura 1). A eficiência de eletroporação do vetor Smo-EGFP foi determinada em DIV 2 pós eletroporação por quantificação da porcentagem de células positivas de fluorescência verde em todas as células GCP que expressam proteína de caixa emparelhada-6 (Pax6). A eficiência de eletroporação dos grupos tratados com DMSO e SAG parecia comparável (Figura 1 e Tabela 2).
Além disso, a imunossuagem do marcador de cílio primário, Arl13b, demonstra que a taxa de ciliação de GCP no DIV 2 da cultura foi de ~18% tanto nos grupos tratados com veículos quanto em SAG (DMSO: 17,35% ± 0,59%; SAG: 18,24% ± 0,88%). A taxa de ciliação é ilustrada como a porcentagem de GCPs expressantes de Pax6 com um círio primário (Arl13b-positivo) na superfície celular em DIV 2 pós eletroporação (Figura 2 e Tabela 3).
Para decifrar a via de sinalização HH dependente do cítio primário, um agonista de Smo, SAG, foi usado para ativar a via de sinalização Hh. Após a ativação da via HH, o receptor Smo é enriquecido no axoneme do cílio primário14. Nossos resultados mostram um aumento significativo da localização do Smo-EGFP no axoneme cilium primário das células GCP expressas pax6 em tratamento de 24 horas pós SAG (Figura 3, dados de quantificação modificados de trabalhos anteriores6), indicando uma ativação profunda da via de sinalização HH dependente do cilium primário.
Figura 1: Configuração de eletroporação e a eficiência de eletroporação de GCPs. (A) Configuração de eletroporação. Certo, a ponta da flecha preta denota cuvette eletroporação. (B, C) Imagens representativas retratam a eficiência de eletroporação do vetor Smo-EGFP determinada pela quantificação da porcentagem de células GFP-positivas em todas as células GCP expressas por Pax6 (Tabela 2). Imagens representativas retratam os sinais fluorescentes verdes nas células GCP (violeta) expressas (violeta) em DIV 2 pós eletroporação após tratamento de 24 horas com (B) DMSO e (C) SAG. Os núcleos foram rotulados com DAPI (azul). Barras de escala = 20 μm. Abreviaturas: GCPs = precursores de células de grânulo; GFP = proteína fluorescente verde; Pax6 = proteína de caixa emparelhada-6; DIV = dia in vitro; DMSO = sulfóxido de dimetila; SAG = Agonista suavizada; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenildole. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Percentual de ciliação em DIV 2 da cultura primária GCP. (A, B) As imagens representativas retratam a porcentagem de ciliação no DIV 2 da cultura primária GCP. Imagens representativas retratam as células GCP de cilia primária (verde) em células GCP de expressões Pax6 (vermelhas) em DIV 2 pós eletroporação após tratamento de 24 h com (A) DMSO e (B) SAG. Os núcleos foram rotulados com DAPI (azul). O cílio primário (verde) é denotado por pontas de flechabra. Barras de escala = 20 μm. (C) O gráfico ilustra os dados de quantificação de 4 experimentos independentes. Análise estatística, teste t do estudante não remunerado. As barras de erro retratam ±SEM. Abreviaturas: GCP = precursor de células de grânulo; Pax6 = proteína de caixa emparelhada-6; DIV = dia in vitro; DMSO = sulfóxido de dimetila; SAG = Agonista suavizada; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenildole; n.s. = Não significativo; SEM = erro padrão da média; Arl13b = Proteína de fator de ribossinação ADP 13B. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Aumento da localização de Smo no cílio primário das células GCP expressas pax6 após o tratamento SAG. (A) Imagens representativas retratam a localização de Smo-EGFP (verde) no cúrio primário (caixa quadrada vermelha e branca) nas células GCP (violeta) expressas pax6 em eletroporção pós DIV 2 após tratamento de 24 horas com DMSO e SAG. Os núcleos foram rotulados com DAPI (azul). Barras de escala = 5 μm. (B) O gráfico ilustra os dados de quantificação de 4 experimentos independentes. Análise estatística, teste t do aluno não remunerado. P ≤ 0,001. As barras de erro retratam ± SEM. Total n para grupo DMSO = 97, total n para grupo SAG = 130. A Figura 3B foi modificada a partir de 6. Abreviaturas: GCP = precursor de células de grânulo; Smo = Suavizada; Pax6 = proteína de caixa emparelhada-6; DIV = dia in vitro; DMSO = sulfóxido de dimetila; SAG = Agonista suavizada; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenildole; SEM = erro padrão da média; Arl13b = Proteína de fator de ribossinação ADP 13B. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Configuração do pulso de porção | Configuração do pulso de transferência | |||
| GCPs primários do mouse | Neurônios primários | GCPs primários do mouse | Neurônios primários | |
| Voltagem | 275 V | 275 V | 20 V | 20 V |
| Comprimento | 1 ms | 0,5 ms | 50 ms | 50 ms |
| Intervalo | 50 ms | 50 ms | 50 ms | 50 ms |
| Não. | 2 | 2 | 5 | 5 |
| Taxa D | 10% | 10% | 40% | 40% |
| Polaridade | + | + | ± | ± |
Tabela 1: Os parâmetros de eletroporação dos GCPs primários do mouse e dos neurônios primários utilizando o Super Eletroporator NEPA21 TYPE II. Abreviação: GCP = precursor de células de grânulo.
| Eficiência de eletroporação | Exp. 1 (n = 486) | Exp. 2 (n = 1314) | Exp. 3 (n = 704) | Exp. 4 (n = 476) | Média |
| Grupo tratado com DMSO | 90,57% ± 10,12% | 96,62% ± 3,09% | 98,89% ± 0,97% | 90,72% ± 11,31% | 94,02% ± 1,36% |
| Grupo tratado com SAG | 91,8% ± 8,69% | 79,97% ± 2,77% | 89,35% ± 5,67% | 88,59% ± 13,54% | 87,42% ± 1,71% |
| Eficiência média da eletroporação | 91,31% ± 7,99% | 88,27% ± 10,81% | 94,12% ± 6,36% | 89,65% ± 11,21% | 90,84% ± 0,84% |
Tabela 2: Eficiência de eletroporação do vetor Smo-EGFP determinedbyquantification da percentagem das células GFP-positivas em todas as células GCP que expressam Pax6. Dados de quatro experimentos independentes (Exp.) são mostrados. (Total n = 2980). Abreviaturas: Smo = Suavizada; GFP = proteína fluorescente verde; GCP = precursor de células de granulo; Pax6 = proteína de caixa emparelhada-6.
| Exp. 1 | Exp. 2 | Exp. 3 | Exp. 4 | média | |
| Taxa de ciliação - DMSO | 18,88% ± 3,61% | 19,58% ± 7,42% | 16,60% ± 1,48% | 14,35% ± 7,99% | 17,35% ± 0,59% |
| Taxa de ciliação - SAG | 13,93% ± 3,39% | 17,30% ± 2,15% | 22,19% ± 10,35% | 19,56% ± 1,15% | 18,24% ± 0,88% |
Tabela 3: O percentual de ciliação em DIV 2 da cultura primária GCP. Dados de quatro experimentos independentes (Exp.) são mostrados. (Total n para grupo DMSO = 1169, Total n para grupo SAG = 816). Abreviaturas: GCP = precursor de células de grânulo; DIV = dia in vitro; DMSO = sulfóxido de dimetila; SAG = Agonista suavizada.
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Discussion
A transfecção de transgenes na cultura GCP primária pelo método de eletroporação é tipicamente associada à baixa viabilidade celular e à baixa eficiência de transfecção9,10. Este artigo introduz um protocolo de eletroporação econômico e reprodutível que demonstrou alta eficiência e viabilidade. Além disso, também demonstramos um método simples de estudar a via de sinalização HH dependente do círio primário nas células GCP primárias.
Outros métodos comuns de eletroporação geralmente requerem reagentes de eletroporação caros do tipo celular que devem ser comprados de fabricantes específicos. O método descrito aqui é considerado favorável, pois utiliza um reagente de eletroporação comum e econômico para diferentes tipos de células. Além disso, esses dados mostraram que a eficiência da eletroporação atingiu ~80-90%, o que é altamente eficiente em comparação com outros métodos de eletroporação e transfecção9,10.
Para manter maior viabilidade celular, existem alguns passos críticos que se deve levar em consideração. Os procedimentos de dissecção e dissociação do cerebelo devem ser concluídos no menor espaço de tempo possível de 1-2 h. Outro passo crítico é evitar a formação de bolhas na mistura de eletroporação de células plasmidas antes dos pulsos durante a eletroporação. Após os pulsos, o meio de cultura pré-armado deve ser adicionado imediatamente nas cuvetas e nas células semeadas o mais rápido possível. As células devem não ser perturbadas nas primeiras 3h de semeadura de células postais. As precauções acima mencionadas aumentarão a viabilidade celular em aproximadamente 70-80% no segundo dia de cultura.
Uma limitação notável de estudar o cílio primário na plataforma de cultura primária é que a taxa de ciliação em células cultivadas é geralmente menor do que a observada in vivo. Dados anteriores 6 mostraram que a taxa in vivo de ciliação em GCP tanto no E15.5 quanto no P15 foi de aproximadamente 60-80%. Em contraste, a taxa in vitro de ciliação na cultura GCP primária foi de ~20%6. No entanto, este é um fenômeno geral que é perceptível na maioria (se não todos) tipos de células ao comparar a taxa de ciliação entre estudos in vitro e in vivo .
Notavelmente, este método também é aplicável a outras culturas primárias, como células progenitoras neurais e cultura de neurônios corticais e hipocampais, que é alcançável modificando o parâmetro de eletroporação, ou seja, porção de tensão de pulso, comprimento e número de pulsos. Para estender a aplicação deste protocolo a um campo de estudo mais amplo, os parâmetros de eletroporação recomendados para neurônios primários são fornecidos na Tabela 1. Além disso, o reagente de eletroporação universal, ou seja, opti-MEM usado neste protocolo também ajuda a evitar um esforço adicional de otimização tediosa em comparação com outros protocolos de eletroporação que requerem otimização em relação à compatibilidade do reagente. Este protocolo de eletroporação otimizado e econômico para a investigação da sinalização primária do cílio e hh nas culturas primárias de GCP poderia ser usado como procedimento de referência para outros estudos primários relacionados ao círio utilizando culturas primárias.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse para declarar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo HKBU Seed Fund e Tier-2 Start-up Grant (RG-SGT2/18-19/SCI/009), Research Grant Council-Collaborative Research Fund (CRF-C2103-20GF) para C.H.H. Hor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GCP Culture | |||
| B27 supplement | Life Technologies LTD | 17504044 | |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution | Gibco, Life Technologies | 14155063 | |
| FBS, qualified | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| GlutamMAXTM-I ,100x | Gibco, Life Technologies | 35050061 | L-glutamine substitute |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Basement membrane matrix |
| Neurobasal | Gibco, Life Technologies | 21103049 | |
| Papain,suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407 | |
| SAG | Cayman Chemical | 11914-1 | Smoothened agonist |
| IF staining | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Primary antibody mix | |||
| Anti-GFP-goat ab | Rockland | 600-101-215 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Arl13b mouse monoclonal ab | NeuroMab | 75-287 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab | Covance | PRB-278P | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Secondary antibody mix | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG | Invitrogen | A-31570 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| DAPI | Thermo Scientific | 62247 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Electroporation | |||
| CU 500 cuvette chamber | Nepagene | CU500 | |
| EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) | Nepagene | EC-002 | |
| Opti-MEM | Life Technologies LTD | 31985070 | reduced-serum medium for transfection |
| pEGFP-mSmo | Addgene | 25395 | |
| Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation | Nepagene | NEPA21 | electroporator |
References
- Chang, C. H., et al. Atoh1 controls primary cilia formation to allow for SHH-triggered granule neuron progenitor proliferation. Developmental Cell. 48 (2), 184-199 (2019).
- Dahmane, N., Ruizi Altaba, A. Sonic Hedgehog regulates the growth and patterning of the cerebellum. Development. 126 (14), 3089-3100 (1999).
- Lewis, P. M., Gritti-Linde, A., Smeyne, R., Kottmann, A., Mcmahon, A. P. Sonic Hedgehog signaling is required for expansion of granule neuron precursors and patterning of the mouse cerebellum. Developmental Biology. 270 (2), 393-410 (2004).
- Wechsler-Reya, R. J., Scott, M. P. Control of neuronal precursor proliferation in the cerebellum by Sonic Hedgehog. Neuron. 22 (1), 103-114 (1999).
- Bangs, F., Anderson, K. V. Primary cilia and mammalian Hedgehog signaling. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 9 (5), 028175 (2017).
- Hor, C. H. H., Lo, J. C. W., Cham, A. L. S., Leung, W. Y., Goh, E. L. K. Multifaceted functions of Rab23 on primary cilium- and Hedgehog signaling-mediated cerebellar granule cell proliferation. Journal of Neuroscience. 41 (32), 6850-6863 (2021).
- Han, Y. G., et al. Dual and opposing roles of primary cilia in medulloblastoma development. Nature Medicine. 15 (9), 1062-1065 (2009).
- Spassky, N., et al. Primary cilia are required for cerebellar development and Shh-dependent expansion of progenitor pool. Developmental Biology. 317 (1), 246-259 (2008).
- Wang, T., Larcher, L., Ma, L., Veedu, R. N. Systematic screening of commonly used commercial transfection reagents towards efficient transfection of single-stranded oligonucleotides. Molecules. 23 (10), 2564 (2018).
- Chicaybam, L., et al. An efficient electroporation protocol for the genetic modification of mammalian cells. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 99 (2017).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Chiara Manzini, M. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (23), e990 (2009).
- Mizoguchi, T., et al. Impaired cerebellar development in mice overexpressing VGF. Neurochemical Research. 44 (2), 374-387 (2019).
- Zhou, Y. Confocal imaging of nerve cells. Current Laboratory Methods in Neuroscience Research. , Springer. New York, NY. 235-247 (2014).
- Corbit, K. C., et al. Vertebrate Smoothened functions at the primary cilium. Nature. 437 (7061), 1018-1021 (2005).
