Summary
Qui, presentiamo un protocollo di elettroporazione riproducibile in vitro per la manipolazione genetica dei precursori delle cellule del granulo cerebellare primario (GCP) che è economico, efficiente e praticabile. Inoltre, questo protocollo dimostra anche un metodo semplice per lo studio molecolare delle vie di segnalazione primarie del riccio cilio-dipendenti nelle cellule GCP primarie.
Abstract
Il cilio primario è un organello di segnalazione critico che si trova su quasi tutte le cellule che trasducono gli stimoli di segnalazione hedgehog (Hh) dalla superficie cellulare. Nel precursore delle cellule del granulo (GCP), il cilio primario agisce come un centro di segnalazione cardine che orchestra la proliferazione delle cellule precursori modulando la via di segnalazione Hh. Lo studio del meccanismo di segnalazione Hh cilium-dipendente primario è facilitato dalla manipolazione genetica in vitro dei componenti del percorso per visualizzare la loro localizzazione dinamica al cilio primario. Tuttavia, la trasfezione di transgeni nelle colture primarie di GCP utilizzando i metodi di elettroporazione attualmente noti è generalmente costosa e spesso si traduce in bassa vitalità cellulare ed efficienza di trasfezione indesiderata. Questo documento introduce un protocollo di elettroporazione efficiente, economico e semplice che dimostra un'elevata efficienza di trasfezione di ~ 80-90% e una fattibilità ottimale delle celle. Questo è un metodo di modificazione genetica semplice, riproducibile ed efficiente che è applicabile allo studio della via di segnalazione primaria del riccio cilio-dipendente in colture primarie GCP.
Introduction
I GCP cerebellari sono ampiamente utilizzati per studiare il meccanismo della via di segnalazione Hh nei tipi di cellule progenitrici neuronali a causa della loro elevata abbondanza e alta sensibilità alla via di segnalazione Hh in vivo1,2,3,4. Nei GCP, il cilio primario agisce come un hub cardine di trasduzione del segnale Hh5 che orchestra la proliferazione delle cellule precursori6,7,8. La visualizzazione in vitro dei componenti di segnalazione Hh sul cilio primario è spesso difficile a causa dei loro bassi livelli basali endogeni. Quindi, la modifica transgenica dei livelli di espressione proteica e il tagging fluoroforico del gene di interesse sono approcci utili per studiare il percorso a risoluzione molecolare. Tuttavia, la manipolazione genetica delle colture primarie GCP utilizzando approcci di trasfezione basati su liposomi spesso si traduce in una bassa efficienza di trasfezione, ostacolando ulteriori indagini molecolari9. L'elettroporazione aumenta l'efficienza, ma in genere richiede reagenti di elettroporazione esorbitanti specifici del fornitore e limitati al tipo di cella10.
Questo documento introduce un metodo di elettroporazione ad alta efficienza ed economico per manipolare i componenti del percorso di segnalazione Hh nelle colture primarie GCP. Utilizzando questo protocollo di elettroporazione modificato, un transgene Smoothened marcato con proteina fluorescente verde (GFP) (pEGFP-Smo) è stato consegnato in modo efficiente ai GCP e ha raggiunto alti tassi di sopravvivenza e trasfezione cellulare (80-90%). Inoltre, come evidenziato dalla colorazione immunocitochimica, i GCP trasfettati hanno mostrato un'elevata sensibilità all'attivazione indotta da agonisti smoothened della via di segnalazione Hh trafficando EGFP-Smo alle ciglia primarie. Il presente protocollo è direttamente applicabile e vantaggioso per gli esperimenti che comportano la modificazione genetica in vitro di tipi cellulari difficili da trasfettare, come le colture cellulari primarie umane e di roditori, nonché le cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo.
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Protocol
Tutte le procedure relative agli animali sono state eseguite in conformità con le linee guida sulla manipolazione degli animali e il protocollo approvato dal Dipartimento della Salute di Hong Kong. Le licenze per esperimenti sugli animali a seguito dell'ordinanza sugli animali (controllo degli esperimenti) (Cap. 340) sono state ottenute dal Dipartimento della Salute, governo di Hong Kong. Il lavoro sugli animali è stato svolto in conformità con l'etica della sicurezza animale approvata dall'Ufficio ricerche HKBU e dal Comitato per la sicurezza del laboratorio. Fare riferimento alla Tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali utilizzati in questo protocollo.
1. Preparazione pre-esperimento
- Preparazione di terreni di coltura e tamponi
- Mezzo senza siero (SFM)
- Per preparare 50 mL di SFM, aggiungere 500 μL di 100x sostituto della L-glutammina, 500 μL di Penicillina-Streptomicina, 1 mM di piruvato di sodio e 12,5 μL di 1 M KCl (250 μM finale) a 49 mL di mezzo neurobasale.
- Dividere l'SFM in 2 aliquote da 10 mL e 40 mL in tubi conici da 50 mL e conservarli a 4 °C per un massimo di un mese.
- Mezzo di blocco della digestione: 10% FBS in SFM
- Aggiungere 1,1 mL di FBS inattivato dal calore a un'aliquota di 10 ml di SFM per preparare il mezzo di blocco della digestione.
- Terreno di coltura GCP: SFM con B27
- Per preparare il terreno di coltura GCP, aggiungere 800 μL di integratore B-27 senza siero a un'aliquota di 40 mL di SFM.
NOTA: L'SFM integrato con B-27 può essere conservato a 4 °C per un massimo di un mese. Tuttavia, i media appena preparati producono risultati ottimali.
- Per preparare il terreno di coltura GCP, aggiungere 800 μL di integratore B-27 senza siero a un'aliquota di 40 mL di SFM.
- Tampone di dissezione: EBSS con glucosio + HEPES
- Aggiungere 6 g/L di glucosio alla soluzione salina bilanciata (EBSS) di Earle priva di calcio e magnesio contenente 10 mM hePES (acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico).
- Sterilizzare la soluzione passando attraverso un filtro a siringa da 0,2 μm e conservarla a 4 °C per la conservazione a lungo termine.
- Tampone di digestione
NOTA: Preparare fresco prima dell'uso.- Preparare 2 ml di tampone digestivo per la digestione di 2-4 tessuti cerebellari e 4 ml per 4-10 tessuti. Per preparare 4 mL di tampone digestivo, sciogliere 1,5 mg di L-cisteina (concentrazione finale 200-400 μg/mL) in 4 mL di EBSS. Invertire ripetutamente il tubo fino a quando la polvere non è completamente dissolta.
- Sterilizzare la soluzione utilizzando un filtro a siringa da 0,2 μm e una siringa da 5 mL e trasferire la soluzione in una parabola sterile per colture cellulari da 35 mm.
- Aggiungere 4 μL di papaina (diluizione 1:1.000 da una concentrazione di stock di 20 unità/mg) e 40 μL di DNasi I (diluizione 1:100 da uno stock di 10 mg/mL per una concentrazione finale di 0,1 mg/mL).
- Incubare la soluzione a 37 °C in un incubatore a CO2 per almeno 30 minuti o fino all'uso.
NOTA: Questo passaggio è fondamentale per attivare la papaina. Per risultati ottimali, non superare i 45 minuti a 37 °C prima dell'uso. Assicurarsi che la soluzione diventi trasparente e che non ci siano precipitati bianchi prima dell'uso.
- Mezzo senza siero (SFM)
- Precoating coverslips
- Per preparare i coperchi per il fissaggio cellulare, incubare coperture di vetro autoclavate da 12 mm con 100 μg/mL di poli-D-lisina (PDL, 1 mg/mL in dH2O sterile) per almeno 1 ora a 37 °C. Conservare i coperchi nella stessa soluzione PDL a 4 °C fino all'uso.
- Il giorno della coltura cellulare primaria, raccogliere il PDL in un tubo conico pulito e risciacquare accuratamente le coperture tre volte con dH2O sterile per rimuovere accuratamente la PDL residua.
NOTA: Il PDL può essere conservato a 4 °C per il riutilizzo. - Trasferire le coperture in vetro rivestite pdl su una piastra a 24 pozzetti posizionando una copertura in ciascun pozzetto.
- Rimuovere l'acqua in eccesso e aggiungere 200-300 μL di Matrigel (ricostituito secondo le istruzioni nella scheda tecnica del prodotto in DMEM-F12 senza siero) per coprire completamente i coperchi.
- Incubare i coverslip nel Matrigel per 1 ora a 37 °C nell'incubatore a CO2 .
NOTA: Rimuovere il Matrigel prima della semina cellulare. Questo Matrigel può essere raccolto e conservato a 4 °C per molteplici riutilizzi.
- Preparazione del piatto di coltura preplating
- Rivestire una pala di coltura cellulare da 60 mm con 2 mL di PDL da 100 μg/mL (ricostituire la soluzione madre di PDL da 1 mg/mL in dH2O sterile) mediante incubazione a 37 °C per 1 ora.
- Immediatamente prima della semina cellulare, rimuovere e raccogliere il PDL usato in un tubo conico pulito e conservarlo a 4 °C per un riutilizzo multiplo. Risciacquare e lavare il piatto rivestito con PDL tre volte con dH2O sterile. Asciugare all'aria il piatto di coltura prima della semina cellulare.
- Utilizzare una pala di coltura cellulare da 60 mm per seminare cellule raccolte da un massimo di 2 tessuti interi del cervelletto.
- Preparare piatti di coltura aggiuntivi per cervelletti aggiuntivi.
NOTA: vedere i passaggi 2.1.18 e 2.1.19 per l'uso del piatto di coltura preplating.
2. Giorno sperimentale 0
- Isolamento e coltivazione di GCP primari di topo
NOTA: il metodo di coltura GCP è stato modificato da un protocollo standard e il breve protocollo è stato brevemente descritto nel nostro lavoro precedente6,11,12. Per una resa GCP ottimale, utilizzare cuccioli postnatali (P) giorno 6 o P7 per l'isolamento di GCP. Completare i seguenti passaggi di dissezione 2.1.6-2.1.10 il più rapidamente possibile per una vitalità cellulare ottimale.- SFM prebellico, mezzo di blocco della digestione, terreno di coltura e Opti-MEM a 37 °C durante la dissezione.
- Su un banco pulito, presupporre tutto l'apparato di dissezione in etanolo al 70% per la disinfezione.
- Riempire una capsula di coltura cellulare da 60 mm con 2-3 ml di tampone di dissezione e raffreddarla sul ghiaccio.
- Preparare un tampone di digestione fresco come descritto al punto 1.1.5 e tenerlo caldo a 37 °C.
- Utilizzare il 70% di etanolo per pulire la testa del cucciolo per la disinfezione.
- Decapitare il cucciolo senza anestesia. Usa una pinza per tenere la testa e forbici chirurgiche sterilizzate per tagliare dalla parte posteriore del cranio per decapitare il cucciolo. Rimuovere con cura la pelle e il cranio per scoprire il cervello usando una pinza.
- Utilizzare una pinza per pizzicare il cervelletto e immergerlo rapidamente nel tampone di dissezione pre-refrigerato preparato al punto 2.1.3.
- Rimuovere le meningi con il cervelletto immerso nel tampone di dissezione sotto un microscopio di dissezione. Le meningi arricchite con vasi sanguigni dovrebbero apparire rosate sotto il microscopio sezionante.
- Rimuovere tutte le meningi usando una pinza.
NOTA: Un cervelletto senza meningi dovrebbe avere un aspetto biancastro. - Rimuovere tutti i tessuti mesencefalici visibili e il plesso coroideo dal cervelletto.
- Trasferire il cervelletto in un piatto di coltura di 35 mm preriempito con tampone di digestione caldo preparato al punto 2.1.4. Evitare di trasferire il buffer di dissezione in eccesso. Tagliare il cervelletto in pezzi fini usando le forbici a microspring il più rapidamente possibile.
- Incubare immediatamente il cervelletto tritato a 37 °C per 15 minuti in un incubatore a CO2 . Estendere il tempo di incubazione a 20 minuti se devono essere lavorati più di 4 cervelletti.
NOTA: Dopo l'incubazione, il tessuto si aggregherà insieme. - Trasferire immediatamente il tessuto digerito sul fondo di un nuovo tubo centrifugo sterile da 15 ml utilizzando un prewet a punta di pipetta P1000 con mezzo di blocco della digestione (evitare il trasferimento del tampone di digestione).
- Aggiungere un volume appropriato di mezzo bloccante della digestione (1 mL per 1 cervelletto) per terminare la digestione e pipettare su e giù delicatamente 30 volte usando una micropipetta P1000 per dissociare ulteriormente il tessuto in una sospensione unicellulare. Evitare la formazione di bolle d'aria.
- Passare delicatamente la sospensione cellulare attraverso un filtro cellulare da 70 μm in un nuovo tubo centrifugo sterile per rimuovere i grumi cellulari.
- Passare un ulteriore 1 mL di mezzo bloccante della digestione fresca attraverso il filtro cellulare per raccogliere le cellule residue dal filtro cellulare.
- Centrifugare il filtrato a 200 × g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Rimuovere il surnatante e risospesciare il pellet con 1 mL di SFM. Ripetere questo passaggio due volte. Evitare di formare bolle d'aria.
- Risospesare il pellet in un volume finale di 2 mL di terreno di coltura GCP e trasferire la sospensione cellulare al piatto di coltura preplating da 60 mm rivestito con PDL preparato nella fase 1.3. Incubare per 15 minuti a 37 °C in un incubatore a CO2 .
NOTA: Non superare i 20 min. - Dopo l'incubazione, picchiettare il piatto di coltura dal lato per rimuovere le cellule GCP vagamente aderenti. Raccogliere le cellule GCP aderenti nel terreno di coltura mediante pipettaggio delicato utilizzando una pipetta P1000. Raccogliere questa sospensione GCP in un nuovo tubo centrifugo da 15 ml. Scartare il piatto da 60 mm.
NOTA: le cellule di astroglia e fibroblasti fortemente aderenti rimarranno attaccate sul fondo del piatto da 60 mm e saranno separate in questo passaggio. Omettere questo passaggio comprometterà la purezza della cultura GCP. - Contare le celle e procedere immediatamente all'elettroporazione.
- Giorno in vitro (DIV) 0: Elettroporazione per la sovraespressione transgenica del recettore Hh: pEGFP-Smo
- Per l'elettroporazione utilizzando una cuvetta gap di 2 mm, preparare la seguente miscela di elettroporazione a celle plasmidiche per ogni reazione di elettroporazione: 1,2 × 106 celle e 10 μg di pEGFP-mSmo (regolare la concentrazione di DNA stock a ~2-5 μg/μL in tampone Tris-EDTA o dH2O sterile) in 100 μL di Opti-MEM.
NOTA: ridurre il numero totale di celle se le celle sono insufficienti (anche se ciò potrebbe ridurre l'efficienza di elettroporazione). Tuttavia, non aggiustare la quantità di plasmide né il volume totale di Opti-MEM utilizzato per cuvetta. Se il numero totale di celle richiesto per l'esperimento supera 1,5 × 106 celle, scalare la miscela di elettroporazione di conseguenza ed eseguire più reazioni di elettroporazione separatamente. La cuvetta può essere riutilizzata fino a 5 volte. - Preparare la piastra di semina della cella post-elettroporazione aggiungendo 0,5 mL di terreno di coltura in ciascun pozzetto della piastra di coltura a 24 pozzetti contenente i coperchi rivestiti (dal punto 1.2) e tenerla calda a 37 °C in un incubatore a CO2 .
- Dal passaggio 2.1.20, pipettare il numero richiesto di cellule in un tubo microcentrifuga sterile da 1,5 mL e ruotare a 200 × g per 5 minuti a RT. Scartare il surnatante e risospescere il pellet cellulare in 200 μL di Opti-MEM. Ripetere questo passaggio due volte con Opti-MEM per assicurarsi che nel tubo non sia presente alcun terreno di coltura residuo
NOTA: Per ogni pozzo / coverslip di una piastra a 24 pozzetti, elettroporato e seme 1,2-1,3 × 106 celle / pozzetto per ottenere ~ 70-75% di confluenza cellulare il giorno successivo della coltura. - Impostare i parametri di elettroporazione come mostrato nella Tabella 1.
- Pipettare delicatamente la reazione di elettroporazione per miscelare bene e utilizzare una lunga punta P200 per trasferire un volume esatto di 100 μL della miscela nella cuvetta da 2 mm. Evitare di formare bolle.
- Posizionare la cuvetta nella camera della cuvetta.
- Premere il pulsante Ω dell'elettroporatore (vedere la tabella dei materiali) e prendere nota del valore di impedenza, che dovrebbe essere ~ 30-35. Per garantire che il valore di impedenza elettrica Ω rientri nell'intervallo di 30-35, aderire a un volume preciso di 100 μL.
- Premere il pulsante di avvio per avviare l'impulso.
- Registrate i valori della corrente e dei joule misurati mostrati sul fotogramma di lettura.
- Rimuovere la cuvetta dalla camera della cuvetta.
- Aggiungere immediatamente 100 μL di terreno di coltura preribalizzato nella cuvetta e risospesirla mediante un delicato pipettaggio su e giù 2-3 volte. Trasferire immediatamente la sospensione cellulare sulla piastra a 24 pozzetti preparata al punto 2.2.2.
NOTA: per ridurre al minimo la morte cellulare, seminare le cellule immediatamente dopo l'elettroporazione. - Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore a CO2 . Lasciare le cellule indisturbate per 3 ore per evitare il distacco cellulare.
- A 3 ore dopo la semina, aspirare delicatamente e scartare metà del mezzo surnatante per rimuovere le cellule morte galleggianti e i detriti e sostituirli con la stessa quantità di terreno di coltura preriscaldato.
- Incubare le cellule a 37 °C nell'incubatore a CO2 e ricostituire metà del mezzo a giorni alterni.
- Osservare le cellule al microscopio a fluorescenza il giorno successivo, cioè DIV1 (Figura 1) per il segnale GFP per determinare l'efficienza della sovraespressione di Smo.
- Per la stimolazione della via di segnalazione Hh su DIV 1 dopo aver reintegrato metà del mezzo, aggiungere 0,2 μM Smoothened agonista (SAG) alle cellule aggiungendo un volume uguale di DMSO al controllo. Incubare per 24 ore prima della fissazione cellulare.
NOTA: mantenere il volume di DMSO/SAG aggiunto il più basso possibile. Qui, sono stati aggiunti 0,5 μL DMSO o 0,5 μL di 0,2 mM SAG per 500 μL di mezzo per pozzo, che è un rapporto di diluizione di 1: 1.000.
- Per l'elettroporazione utilizzando una cuvetta gap di 2 mm, preparare la seguente miscela di elettroporazione a celle plasmidiche per ogni reazione di elettroporazione: 1,2 × 106 celle e 10 μg di pEGFP-mSmo (regolare la concentrazione di DNA stock a ~2-5 μg/μL in tampone Tris-EDTA o dH2O sterile) in 100 μL di Opti-MEM.
3. DIV 2: Visualizzazione delle ciglia primarie e studio della via di segnalazione Hh
- Fissazione cellulare
- A 24 ore dopo il trattamento, rimuovere il terreno di coltura e risciacquare le cellule 2-3 volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) utilizzando una pipetta Pasteur monouso evitando di spostare le cellule.
- Fissare le cellule aggiungendo ~ 400 μL di paraformaldeide al 4% (preparata in PBS) e incubare a RT per 10 minuti.
- Risciacquare e lavare 2-3 volte con PBS utilizzando una pipetta Pasteur monouso.
- Conservare in PBS a 4 °C per un massimo di 2 mesi o procedere all'immunocolorazione.
- Colorazione immunocitochimica dei GCP e del marcatore cilio primario
- In una piastra a 24 pozzetti, lavare le cellule due volte in PBS con un delicato scuotimento per 5 minuti ogni volta.
- Aggiungere 0,5 mL di cloruro di ammonio da 100 mM alla cellula e incubare a RT per 10 minuti per estinguere il fissativo.
- Risciacquare una volta e lavare 2-3 volte con PBS con agitazione delicata per 10 minuti ogni volta.
- Pipettare delicatamente 30 μL di tampone bloccante (BB: 0,1% Triton X-100, 1% BSA, 2% siero di cavallo inattivato dal calore in PBS) su un pezzo di parafilm per formare una goccia senza bolle d'aria.
- Trasferire delicatamente il coperchio dal pozzo sulla goccia BB con il lato con semi di cellule rivolto verso il basso. Incubare le cellule con BB in una camera umida per 1 ora a RT.
- Preparare la miscela di anticorpi primari in BB come mostrato nella Tabella dei materiali. Per sondare le cellule con anticorpo primario, ripetere i passaggi 3.2.4 e 3.2.5, sostituendo BB con la miscela di anticorpi primari. Incubare le cellule con l'anticorpo primario per 2 ore a RT.
- Usando la pinza, trasferire le coperture sulla piastra a 24 pozzetti con il lato con semi di cellule rivolto verso l'alto. Risciacquare le cellule una volta e lavare 3-4 volte in PBS con un leggero scuotimento per 10 minuti ogni volta.
- Preparare la miscela di anticorpi secondari in BB come mostrato nella Tabella dei materiali. Per incubare le cellule con l'anticorpo secondario, ripetere i passaggi 3.2.4 e 3.2.5, sostituendo BB con la miscela di anticorpi secondari. Incubare al buio per 1 ora a RT.
- Ripetere il passaggio 3.2.7 per il lavaggio post-secondario dell'incubazione degli anticorpi.
- Montare il coperchio su una slitta di vetro microscopica pulita utilizzando il mezzo di montaggio.
- Asciugare all'aria il vetrino al buio durante la notte e procedere all'imaging confocale13.
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Representative Results
Utilizzando l'Opti-MEM (vedi la Tabella dei materiali) come reagente universale, questa metodologia di elettroporazione proposta potrebbe raggiungere un'efficienza di elettroporazione costantemente elevata a ~ 80-90% (Figura 1). L'efficienza di elettroporazione del vettore Smo-EGFP è stata determinata a DIV 2 post elettroporazione quantificando la percentuale di cellule verdi positive alla fluorescenza in tutte le cellule GCP che esprimono la proteina 6 (Pax6) accoppiata. L'efficienza di elettroporazione dei gruppi trattati con DMSO e SAG è apparsa comparabile (Figura 1 e Tabella 2).
Inoltre, l'immunocolorazione del marcatore cilio primario, Arl13b, dimostra che il tasso di ciliazione di GCP a DIV 2 della coltura era ~ 18% sia nel gruppo trattato con veicolo che in quello trattato con SAG (DMSO: 17,35% ± 0,59%; SAG: 18,24% ± 0,88%). Il tasso di ciliazione è illustrato come la percentuale di GCP che esprimono Pax6 che portano un cilio primario (Arl13b-positivo) sulla superficie della cella a DIV 2 dopo l'elettroporazione (Figura 2 e Tabella 3).
Per decifrare la via di segnalazione Hh primaria dipendente dal cilio, è stato utilizzato un agonista di Smo, SAG, per attivare la via di segnalazione Hh. Dopo l'attivazione della via Hh, il recettore Smo viene arricchito all'axoneme del cilio primario14. I nostri risultati mostrano un aumento significativo della localizzazione di Smo-EGFP sull'axonema cilium primario delle cellule GCP che esprimono Pax6 a 24 ore dopo il trattamento SAG (Figura 3, dati di quantificazione modificati dal lavoro precedente6), indicando una profonda attivazione della via di segnalazione Hh primaria cilio-dipendente.
Figura 1: Configurazione dell'elettroporazione ed efficienza elettroporosa dei GCP. (A) Configurazione elettroporazione. A destra, la punta di freccia nera denota la cuvetta di elettroporazione. (B, C) Immagini rappresentative mostrano l'efficienza di elettroporazione del vettore Smo-EGFP determinata dalla quantificazione della percentuale di celle GFP-positive in tutte le celle GCP che esprimono Pax6 (Tabella 2). Immagini rappresentative raffigurano i segnali fluorescenti verdi sulle celle GCP che esprimono Pax6 (viola) su DIV 2 post elettroporazione dopo 24 ore di trattamento con (B) DMSO e (C) SAG. I nuclei sono stati etichettati con DAPI (blu). Barre di scala = 20 μm. Abbreviazioni: GCP = precursori delle cellule del granulo; GFP = proteina fluorescente verde; Pax6 = scatola accoppiata proteina-6; DIV = giorno in vitro; DMSO = dimetilsolfossido; SAG = Agonista levigato; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Percentuale di ciliazione su DIV 2 della coltura primaria GCP. (A, B) Le immagini rappresentative raffigurano la percentuale di ciliazione su DIV 2 della coltura primaria GCP. Immagini rappresentative raffigurano le ciglia primarie (verdi) sulle cellule GCP (rosse) che esprimono Pax6 su DIV 2 post elettroporazione dopo 24 ore di trattamento con (A) DMSO e (B) SAG. I nuclei sono stati etichettati con DAPI (blu). Il cilio primario (verde) è indicato da punte di freccia bianche. Barre di scala = 20 μm. (C) Il grafico illustra i dati di quantificazione di 4 esperimenti indipendenti. Analisi statistica, T-test di Unpaired Student. Le barre di errore raffigurano ±SEM. Abbreviazioni: GCP = precursore delle cellule del granulo; Pax6 = scatola accoppiata proteina-6; DIV = giorno in vitro; DMSO = dimetilsolfossido; SAG = Agonista levigato; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo; n.s. = Non significativo; SEM = errore standard della media; Arl13b = ADP ribosylation factor-like protein 13B. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Aumento della localizzazione di Smo sul cilio primario di cellule GCP che esprimono Pax6 dopo il trattamento con SAG. (A) Immagini rappresentative raffigurano la localizzazione Smo-EGFP (verde) sul cilio primario (scatola quadrata rossa e bianca) su cellule GCP che esprimono Pax6 (viola) a DIV 2 post elettroporazione dopo 24 ore di trattamento con DMSO e SAG. I nuclei sono stati etichettati con DAPI (blu). Barre di scala = 5 μm. (B) Il grafico illustra i dati di quantificazione di 4 esperimenti indipendenti. Analisi statistica, t-test dello studente spaiato. P ≤ 0,001. Le barre di errore rappresentano ± SEM. Totale n per il gruppo DMSO = 97, totale n per il gruppo SAG = 130. La Figura 3B è stata modificata da 6. Abbreviazioni: GCP = precursore delle cellule del granulo; Smo = Levigato; Pax6 = scatola accoppiata proteina-6; DIV = giorno in vitro; DMSO = dimetilsolfossido; SAG = Agonista levigato; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindolo; SEM = errore standard della media; Arl13b = ADP ribosylation factor-like protein 13B. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Impostazione dell'impulso di poring | Impostazione dell'impulso di trasferimento | |||
| GCP primari del mouse | Neuroni primari | GCP primari del mouse | Neuroni primari | |
| Voltaggio | 275 V | 275 V | 20 V | 20 V |
| Lunghezza | 1 ms | 0,5 ms | 50 ms | 50 ms |
| Intervallo | 50 ms | 50 ms | 50 ms | 50 ms |
| No. | 2 | 2 | 5 | 5 |
| Tasso D | 10% | 10% | 40% | 40% |
| Polarità | + | + | ± | ± |
Tabella 1: I parametri di elettroporazione dei GCP primari di topo e dei neuroni primari utilizzando Super Electroporator NEPA21 TYPE II. Abbreviazione: GCP = precursore della cellula del granulo.
| Efficienza elettropora | Exp. 1 (n = 486) | Exp. 2 (n = 1314) | Exp. 3 (n = 704) | Exp. 4 (n = 476) | Nella media |
| Gruppo trattato con DMSO | 90,57% ± 10,12% | 96,62% ± 3,09% | 98,89% ± 0,97% | 90,72% ± 11,31% | 94,02% ± 1,36% |
| Gruppo trattato con SAG | 91,8% ± 8,69% | 79,97% ± 2,77% | 89,35% ± 5,67% | 88,59% ± 13,54% | 87,42% ± 1,71% |
| Efficienza media di elettroporazione | 91,31% ± 7,99% | 88,27% ± 10,81% | 94,12% ± 6,36% | 89,65% ± 11,21% | 90,84% ± 0,84% |
Tabella 2: Efficienza elettroporatoria del vettore Smo-EGFP determinato mediante quantificazione della percentuale di cellule GFP-positive in tutte le celle GCP che esprimono Pax6. Vengono mostrati i dati di quattro esperimenti indipendenti (Exp.). (Totale n = 2980). Abbreviazioni: Smo = Smoothened; GFP = proteina fluorescente verde; GCP = precursore delle cellule del granulo; Pax6 = scatola accoppiata proteina-6.
| Escl. 1 | Es. 2 | Escl. 3 | Escl. 4 | Nella media | |
| Tasso di ciliazione - DMSO | 18,88% ± 3,61% | 19,58% ± 7,42% | 16,60% ± 1,48% | 14,35% ± 7,99% | 17,35% ± 0,59% |
| Tasso di ciliazione - SAG | 13,93% ± 3,39% | 17,30% ± 2,15% | 22,19% ± 10,35% | 19,56% ± 1,15% | 18,24% ± 0,88% |
Tabella 3: La percentuale di ciliazione su DIV 2 della coltura primaria GCP. Vengono mostrati i dati di quattro esperimenti indipendenti (Exp.). (Totale n per il gruppo DMSO = 1169, Totale n per il gruppo SAG = 816). Abbreviazioni: GCP = precursore delle cellule del granulo; DIV = giorno in vitro; DMSO = dimetilsolfossido; SAG = Agonista levigato.
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Discussion
La trasfezione di transgeni in coltura GCP primaria con metodo di elettroporazione è tipicamente associata a una bassa vitalità cellulare e a una scarsa efficienza di trasfezione9,10. Questo documento introduce un protocollo di elettroporazione economico e riproducibile che ha dimostrato alta efficienza e fattibilità. Inoltre, dimostriamo anche un metodo semplice per studiare la via di segnalazione Hh primaria cilium-dipendente nelle cellule GCP primarie.
Altri metodi di elettroporazione comuni spesso richiedono costosi reagenti di elettroporazione specifici per tipo di cella che devono essere acquistati da produttori specifici. Il metodo qui descritto è considerato favorevole in quanto utilizza un reagente di elettroporazione comune ed economico per diversi tipi di cellule. Inoltre, questi dati hanno mostrato che l'efficienza di elettroporazione ha raggiunto ~ 80-90%, che è altamente efficiente rispetto ad altri metodi di elettroporazione e trasfezione9,10.
Per mantenere una maggiore vitalità cellulare, ci sono alcuni passaggi critici che si dovrebbero prendere in considerazione. Le procedure di dissezione e dissociazione del cervelletto devono essere completate entro il più breve tempo possibile di 1-2 ore. Un altro passo fondamentale è quello di evitare la formazione di bolle nella miscela di elettroporazione plasmidico-cella prima degli impulsi durante l'elettroporazione. Dopo gli impulsi, il terreno di coltura prebellico deve essere aggiunto immediatamente nelle cuvette e le cellule seminate il più rapidamente possibile. Le cellule devono essere indisturbate nelle prime 3 ore di semina cellulare. Le precauzioni di cui sopra miglioreranno la vitalità cellulare fino a circa il 70-80% il secondo giorno di coltura.
Una notevole limitazione dello studio del cilio primario nella piattaforma di coltura primaria è che il tasso di ciliazione nelle cellule in coltura è generalmente inferiore a quello osservato in vivo. I dati precedenti 6 hanno mostrato che il tasso in vivo di ciliazione su GCP sia a E15,5 che a P15 era di circa il 60-80%. Al contrario, il tasso di ciliazione in vitro nella coltura primaria di GCP era ~ 20% 6. Tuttavia, questo è un fenomeno generale che è distinguibile nella maggior parte (se non in tutti) i tipi di cellule quando si confronta il tasso di ciliazione tra studi in vitro e in vivo .
In particolare, questo metodo è applicabile anche ad altre colture primarie come le cellule progenitrici neurali e la coltura di neuroni corticali e ippocampali, che è ottenibile modificando il parametro di elettroporazione, cioè la tensione dell'impulso, la lunghezza e il numero di impulsi. Per estendere l'applicazione di questo protocollo a un campo di studio più ampio, i parametri di elettroporazione raccomandati per i neuroni primari sono forniti nella Tabella 1. Inoltre, il reagente universale di elettroporazione, cioè Opti-MEM utilizzato in questo protocollo, aiuta anche a evitare ulteriori noiosi sforzi di ottimizzazione rispetto ad altri protocolli di elettroporazione che richiedono l'ottimizzazione rispetto alla compatibilità dei reagenti. Questo protocollo di elettroporazione ottimizzato ed economico per lo studio della segnalazione primaria di cilio e Hh in colture primarie di GCP potrebbe essere utilizzato come procedura di riferimento per altri studi primari relativi al cilio utilizzando colture primarie.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Questo studio è stato supportato da HKBU Seed Fund e Tier-2 Start-up Grant (RG-SGT2/18-19/SCI/009), Research Grant Council-Collaborative Research Fund (CRF-C2103-20GF) a C.H.H. Hor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GCP Culture | |||
| B27 supplement | Life Technologies LTD | 17504044 | |
| Cell strainer, 70 µm | Corning | 352350 | |
| DNase I from bovine pancreas | Roche | 11284932001 | |
| Earle’s Balanced Salt Solution | Gibco, Life Technologies | 14155063 | |
| FBS, qualified | Thermo Scientific | SH30028.02 | |
| GlutamMAXTM-I ,100x | Gibco, Life Technologies | 35050061 | L-glutamine substitute |
| L-cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | Basement membrane matrix |
| Neurobasal | Gibco, Life Technologies | 21103049 | |
| Papain,suspension | Worthington Biochemical Corporation | LS003126 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma Aldrich | P6407 | |
| SAG | Cayman Chemical | 11914-1 | Smoothened agonist |
| IF staining | |||
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | |
| Primary antibody mix | |||
| Anti-GFP-goat ab | Rockland | 600-101-215 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Arl13b mouse monoclonal ab | NeuroMab | 75-287 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Anti-Pax6 rabbit polyclonal ab | Covance | PRB-278P | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Secondary antibody mix | |||
| Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 555 donkey anti-mouse IgG | Invitrogen | A-31570 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Alexa Fluor 647 donkey anti-rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| DAPI | Thermo Scientific | 62247 | Dilution Factor: 1 : 1000 |
| Electroporation | |||
| CU 500 cuvette chamber | Nepagene | CU500 | |
| EPA Electroporation cuvette (2 mm gap) | Nepagene | EC-002 | |
| Opti-MEM | Life Technologies LTD | 31985070 | reduced-serum medium for transfection |
| pEGFP-mSmo | Addgene | 25395 | |
| Super Electroporator NEPA21 TYPE II In Vitro and In Vivo Electroporation | Nepagene | NEPA21 | electroporator |
References
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